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维戈塞尔塔毕尔巴鄂竞技: 中藥組合物在制備抗71型腸道病毒的藥物中的用途.pdf

摘要
申請專利號:

维戈塞尔塔vs皇家社会 www.vmyqew.com.cn CN201110079938.3

申請日:

20110331

公開號:

CN102716245B

公開日:

20140528

當前法律狀態:

有效性:

有效

法律詳情:
IPC分類號: A61K36/78,A61K36/896,A61K36/88,A61P25/00,A61P31/14,A61P31/22 主分類號: A61K36/78,A61K36/896,A61K36/88,A61P25/00,A61P31/14,A61P31/22
申請人: 麗珠醫藥集團股份有限公司,國家中藥現代化工程技術研究中心
發明人: 曹暉,管軼,曾永清,陶德勝
地址: 519020 廣東省珠海經濟特區拱北桂花北路132號
優先權: CN201110079938A
專利代理機構: 北京瑞恒信達知識產權代理事務所(普通合伙) 代理人: 曹津燕
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法律狀態
申請(專利)號:

CN201110079938.3

授權公告號:

法律狀態公告日:

法律狀態類型:

摘要

本發明提供一種中藥組合物在制備抗71型腸道病毒的藥物中的用途。該中藥組合物能夠有效抑制71型腸道病毒,進而有效預防和/或治療由該病毒引起的多種疾病。

權利要求書

1.一種中藥組合物在制備抗71型腸道病毒的藥物或者在制備治療由71型腸道病毒引起的疾病的藥物中的用途,該中藥組合物是由以下原料藥制成的:魚腥草9.3重量%--46.7重量%、忍冬藤9.3重量%--37.3重量%、板藍根4.7重量%--35.0重量%、貫眾2.3重量%--28.0重量%、山豆根2.3重量%--23.3重量%、白芷2.3重量%--23.3重量%、重樓2.3重量%--23.3重量%、青蒿2.3重量%--23.3重量%、川射干2.3重量%--23.3重量%。2.根據權利要求1所述的用途,其特征在于,所述藥組合物中九種原料藥的重量百分比為:魚腥草14.0重量%--35.0重量%、忍冬藤11.7重量%--23.3重量%、板藍根9.3重量%--21.0重量%、貫眾7.0重量%--18.7重量%、山豆根4.7重量%--11.7重量%、白芷4.7重量%--11.7重量%、重樓4.7重量%--11.7重量%、青蒿4.7重量%--11.7重量%、川射干4.7重量%--11.7重量%。3.根據權利要求1所述的用途,其特征在于,所述藥組合物中九種原料藥的重量百分比為:魚腥草21.4重量%、忍冬藤17.9重量%、板藍根14.3重量%、貫眾10.7重量%、山豆根7.1重量%、白芷7.1重量%、重樓7.1重量%、青蒿7.2重量%、川射干7.2重量%。4.根據權利要求1至3中任一項所述的用途,其特征在于,所述由71型腸道病毒引起的疾病選自手足口病、皰疹性咽峽炎、無菌性腦膜炎和腦炎中的一種或多種。5.根據權利要求1至3中任一項所述的用途,其特征在于,所述中藥組合物為顆粒劑。

說明書

技術領域

本發明涉及一種中藥組合物在制備抗71型腸道病毒的藥物中的用途,具體涉及一種包含魚腥草、忍冬藤、板藍根和山豆根的中藥組合物在制備抗71型腸道病毒的藥物中的用途。

背景技術

1969年,美國在中樞神經系統疾病嬰兒的糞便標本中分離出71型腸道病毒(EV71)。根據國際病毒分類委員會(ICTV)的最新分類,人腸道病毒被分為A、B、C、D和新腸道病毒(未分型)五類。之后腸道病毒原有的血清型又被重新歸類,其中71型腸道病毒(EV71)被歸為人腸道病毒A型。

EV71可經消化道和呼吸道傳播,其傳染性和毒力強,神經毒性僅次于脊髓灰質炎病毒。部分患者可排毒數周,病毒可在污水中存活較長時間。各年齡人群均可感染該病毒,成人和大年齡兒童主要為隱性感染,發病者主要為學齡前兒童,重癥感染多見于嬰幼兒。常在局部地方引起爆發感染,暴發原因不確定。EV71引起的臨床表現多樣:以手足口病、皰疹性咽峽炎等多見,少數可表現為無菌性腦膜炎及腦炎,重癥患兒病死率為10%-25%。

目前,對EV71感染尚缺乏有效的抗病毒藥物,對由其引發疾病的預防和治療的重點是研制開發有效的預防性疫苗,已有滅活疫苗、減毒疫苗、多肽或蛋白疫苗、DNA疫苗等多種嘗試,但至今尚無EV71疫苗上市。因此,急需開發可以安全、有效的抗71型腸道病毒的藥物。

發明內容

因此,本發明的目的是提供一種能夠有效抑制71型腸道病毒的藥物,進而成功預防和/或治療由該病毒引起的多種疾病。

一方面,本發明提供一種中藥組合物在制備抗71型腸道病毒的藥物中或者在制備治療或預防由71型腸道病毒引起的疾病的藥物中的用途,該中藥組合物是由以下原料藥制成的:魚腥草、忍冬藤、板藍根和山豆根。優選地,所述藥組合物中四種原料藥的重量百分比為:魚腥草4.7重量%--70.0重量%、忍冬藤4.7重量%--46.7重量%、板藍根2.3重量%--42.0重量%、山豆根1.2重量%--35.0重量%。

優選地,所述中藥組合物還包括其它清熱解毒類中藥;優選地,所述其它清熱解毒類中藥選自貫眾、白芷、穿心蓮、蒲公英、青黛、紅藤、重樓、青蒿、川射干、鴉膽子、薄荷、桔梗和甘草。

優選地,所述中藥組合物是由以下原料藥制成的:魚腥草、忍冬藤、板藍根、山豆根、貫眾和白芷。優選地,所述藥組合物中六種原料藥的重量百分比為:魚腥草4.7重量%--58.4重量%、忍冬藤4.7重量%--46.7重量%、板藍根2.3重量%--42.0重量%、山豆根1.2重量%--35.0重量%、貫眾1.9重量%--37.3重量%、白芷1.2重量%--35.0重量%。

優選地,所述中藥組合物是由以下原料藥制成的:魚腥草、忍冬藤、板藍根、山豆根、貫眾、白芷、重樓、青蒿和川射干。優選地,所述藥組合物中九種原料藥的重量百分比為:魚腥草9.3重量%--46.7重量%、忍冬藤9.3重量%--37.3重量%、板藍根4.7重量%--35.0重量%、貫眾2.3重量%--28.0重量%、山豆根2.3重量%--23.3重量%、白芷2.3重量%--23.3重量%、重樓2.3重量%--23.3重量%、青蒿2.3重量%--23.3重量%、川射干2.3重量%--23.3重量%。更優選地,所述藥組合物中九種原料藥的重量百分比為:魚腥草14.0重量%--35.0重量%、忍冬藤11.7重量%--23.3重量%、板藍根9.3重量%--21.0重量%、貫眾7.0重量%--18.7重量%、山豆根4.7重量%--11.7重量%、白芷4.7重量%--11.7重量%、重樓4.7重量%--11.7重量%、青蒿4.7重量%--11.7重量%、川射干4.7重量%--11.7重量%。最優選地,所述藥組合物中九種原料藥的重量百分比為:魚腥草21.4重量%、忍冬藤17.9重量%、板藍根14.3重量%、貫眾10.7重量%、山豆根7.1重量%、白芷7.1重量%、重樓7.1重量%、青蒿7.2重量%、川射干7.2重量%。

在上述用途中,所述中藥組合物優選為顆粒劑。

另一方面,本發明提供一種中藥組合物在抗71型腸道病毒或者治療或預防由71型腸道病毒引起的疾病中的用途,該中藥組合物是由以下原料藥制成的:魚腥草、忍冬藤、板藍根和山豆根。優選地,所述藥組合物中四種原料藥的重量百分比為:魚腥草4.7重量%--70.0重量%、忍冬藤4.7重量%--46.7重量%、板藍根2.3重量%--42.0重量%、山豆根1.2重量%--35.0重量%。

優選地,所述中藥組合物還包括其它清熱解毒類中藥;優選地,所述其它清熱解毒類中藥選自貫眾、白芷、穿心蓮、蒲公英、青黛、紅藤、重樓、青蒿、川射干、鴉膽子、薄荷、桔梗和甘草。

優選地,所述中藥組合物是由以下原料藥制成的:魚腥草、忍冬藤、板藍根、山豆根、貫眾和白芷。優選地,所述藥組合物中六種原料藥的重量百分比為:魚腥草4.7重量%--58.4重量%、忍冬藤4.7重量%--46.7重量%、板藍根2.3重量%--42.0重量%、山豆根1.2重量%--35.0重量%、貫眾1.9重量%--37.3重量%、白芷1.2重量%--35.0重量%。

優選地,所述中藥組合物是由以下原料藥制成的:魚腥草、忍冬藤、板藍根、山豆根、貫眾、白芷、重樓、青蒿和川射干。優選地,所述藥組合物中九種原料藥的重量百分比為:魚腥草9.3重量%--46.7重量%、忍冬藤9.3重量%--37.3重量%、板藍根4.7重量%--35.0重量%、貫眾2.3重量%--28.0重量%、山豆根2.3重量%--23.3重量%、白芷2.3重量%--23.3重量%、重樓2.3重量%--23.3重量%、青蒿2.3重量%--23.3重量%、川射干2.3重量%--23.3重量%。更優選地,所述藥組合物中九種原料藥的重量百分比為:魚腥草14.0重量%--35.0重量%、忍冬藤11.7重量%--23.3重量%、板藍根9.3重量%--21.0重量%、貫眾7.0重量%--18.7重量%、山豆根4.7重量%--11.7重量%、白芷4.7重量%--11.7重量%、重樓4.7重量%--11.7重量%、青蒿4.7重量%--11.7重量%、川射干4.7重量%--11.7重量%。最優選地,所述藥組合物中九種原料藥的重量百分比為:魚腥草21.4重量%、忍冬藤17.9重量%、板藍根14.3重量%、貫眾10.7重量%、山豆根7.1重量%、白芷7.1重量%、重樓7.1重量%、青蒿7.2重量%、川射干7.2重量%。

其中,上述由71型腸道病毒引起的疾病選自手足口病、皰疹性咽峽炎、無菌性腦膜炎和腦炎中的一種或多種。

本發明經過大量實驗發現,由魚腥草、忍冬藤、板藍根和山豆根為原料制成的中藥組合物,具有明顯的抗71型腸道病毒作用,進而可以成功預防和/或治療由該病毒引起的多種疾病,包括手足口病、皰疹性咽峽炎、無菌性腦膜炎和腦炎等。

此外,本發明還發現,由以下原料藥制成的中藥組合物也具有一定的抗71型腸道病毒作用:板藍根14.0重量%--37.3重量%、連翹4.7重量%--25.7重量%、廣藿香3.7重量%--11.7重量%、石膏3.3重量%--25.7重量%、蘆根3.7重量%--25.7重量%、地黃3.7重量%--14.0重量%、石菖蒲3.7重量%--14.0重量%、郁金3.7重量%--14.0重量%、知母3.7重量%--14.0重量%。

可見,本發明提供的中藥組合物,以天然植物作為原料藥,對71型腸道病毒具有明顯的抑制作用,由其制備而成的藥物或添加劑,具有毒性小、作用強、安全有效等優點,為由71型腸道病毒引起的疾病的預防和治療開辟了新的途徑,具有重要的社會價值、經濟價值和廣闊的應用前景。

附圖說明

以下,結合附圖來詳細說明本發明的實施方案,其中:

SC:四川方;GB:國標方;negative:陰性對照;positive:陽性對照;d2、d3或d4(D2、D3或D4):第2日、第3日或第4日;sc5:5mg/ml?SC;sc10:10mg/ml?SC;sc20:20mg/ml?SC;gb10:10mg/ml?GB;gb20:20mg/mlGB;gb40:40mg/ml?GB;

圖1顯示SC對Vero細胞活力的影響;

圖2顯示GB對Vero細胞活力的影響;

圖3顯示加入四川方抗EV71病毒時的鏡下細胞變化;

圖4顯示加入國標方抗EV71病毒時的鏡下細胞變化;

圖5為加入四川方后病毒繁殖的瓊脂凝膠電泳圖;

圖6為加入國標方后病毒繁殖的瓊脂凝膠電泳圖;

圖7顯示加入四川方后對病毒繁殖的Real-time?PCR檢測結果(以20倍于TCID50EV71病毒進行檢測);

圖8顯示加入國標方后對病毒繁殖的Real-time?PCR檢測結果(以20倍于TCID50EV71病毒進行檢測)。

具體實施方式

下面結合具體實施方式對本發明進行進一步的詳細描述,給出的實施例僅為了闡明本發明,而不是為了限制本發明的范圍。

實施例1

本實施例提供了中藥組合物(四川方)的原料藥處方及其制備方法,具體如下。

原料藥:魚腥草21.4重量%、忍冬藤17.9重量%、板藍根14.3重量%、貫眾10.7重量%、山豆根7.1重量%、白芷7.1重量%、重樓7.1重量%、青蒿7.2重量%、川射干7.2重量%。

取以上九味處方量。首先將魚腥草加水煎煮10~40分鐘,濾過,濾液濃縮至相對密度為1.05-1.20的清膏,放冷,加乙醇使含醇量為50~80%,靜置24~48小時,濾過,濾液回收乙醇,濃縮得到相對密度為1.05-1.25的清膏,備用;忍冬藤等3味,加水煎煮2次,每次2小時,濾過,濾液濃縮至相對密度為1.40時,過濾,濾液再濃縮至相對密度為1.45的清膏,加入上述魚腥草清膏,混勻,繼續濃縮至相對密度為1.10以上的稠膏,取稠膏、蔗糖細粉按照1∶3~8的比例進行制粒,分裝,即得。

實施例2

本實施例提供了中藥組合物(國標方)的原料藥處方及其制備方法,具體如下。

原料藥:板藍根30.1重量%、連翹10.8重量%、石膏13.4重量%、知母5.8重量%、蘆根14.2重量%、地黃7.5重量%、廣藿香6.6重量%、石菖蒲5.8重量%、郁金5.8重量%。

取以上九味處方量。首先將知母粉碎成最粗粉,加80~90%乙醇加熱回流提取3次,每次3小時,過濾,濾液減壓回收乙醇并濃縮,得到相對密度為1.10(50℃)的清膏,備用。板藍根等8味,加水煎煮三次(同時收集揮發油),第一次1小時,第二和三次各0.5小時,過濾,濾液濃縮,得到相對密度為1.16(50℃)的清膏,加入上述知母清膏,混合均勻,濃縮,得到相對密度為1.28~1.30(55~60℃)的清膏。取清膏,加蔗糖粉適量,制成顆粒,干燥,加入上述收集的揮發油和食用香料適量,混勻,制成顆粒,分裝,即得。

實施例3抗EV71病毒的體外實驗

本實施例測試了實施例1和2制備的中藥組合物在體外抗EV71病毒效果,具體如下。

一、材料和方法

1.材料

1.1實驗藥物:

國標方KBD-GB(國藥準字Z20010127):4.3g生藥/ml浸膏

四川方KBD-SC(國藥準字Z51020073):4.7g生藥/ml浸膏

1.2細胞:Vero細胞(非洲綠猴腎細胞)香港大學新發傳染病國家重點實驗室提供。

1.3病毒:EV71/120F1/Shenzhen/2009,香港大學新發傳染病國家重點實驗室提供。

1.4實驗室的基本條件:實驗全程在生物安全二級實驗室完成。

二、實驗方法

2.1觀察細胞病變效應(CPE),測定病毒對Vero細胞的半數感染劑量(TCID50)

將Vero細胞接種于96孔板,每孔100μl,37℃、5%CO2培養24小時細胞長成單層。加入一系列10倍稀釋的9個濃度的病毒培養液,每個濃度8孔,設細胞對照,37℃、5%CO2孵箱培養。72小時后觀察CPE。用Read-Muench法計算病毒的半數感染劑量(TCID50)。

2.2MTT法測定待檢藥物對細胞的毒性反應

將Vero細胞接種于96孔板,每孔100μl,37℃、5%CO2培養24小時,細胞長成單層。吸去上清,加入不同稀釋濃度的待檢藥物,每個濃度8孔,設細胞對照。37℃、5%CO2孵箱培養,72小時后加入MTT染色3小時,吸去液體加入DMSO溶解半小時,酶聯檢測儀測定OD570nm吸收值。根據細胞活力確定藥物的最大無毒濃度。

2.3拍攝顯微鏡下細胞的改變

將Vero細胞接種于24孔板,每孔1ml,37℃、5%CO2培養24小時,細胞長成單層,藥物從最大無毒濃度進行10倍稀釋,共3個濃度,每個濃度2孔,每孔1ml,37℃、5%CO2培養24小時,吸去藥物,加入20倍于TCID50的病毒120μl,1小時后吸去病毒,再加入1ml藥物,37℃、5%CO2孵箱培養。分別于培養第2日、3日和4日采用顯微鏡觀察并拍攝細胞形態,其中陰性對照生理鹽水,陽性對照為達菲處理。

2.4PCR和Real-time?PCR檢測病毒的繁殖量

將Vero細胞接種于24孔板,每孔1ml,37℃、5%CO2培養24小時,細胞長成單層,藥物從最大無毒濃度進行10倍稀釋,共3個濃度,每個濃度2孔,每孔1ml,37℃、5%CO2培養24小時,吸去藥物,加入20倍于TCID50的病毒120μl,1小時后吸去病毒,再加入1ml藥物,37℃、5%CO2孵箱培養。24、48和72小時取上清提取RNA,用PCR和Real-time?PCR檢測病毒的繁殖量。

三、實驗結果

3.1病毒TCID50的測定:病毒EV71/120F1/Shenzhen/2009的TCID50為105.125/ml。

3.2藥物毒性的測定:

四川方KBD-SC(Z51020073)的最大無毒濃度為20mg/ml,參見圖1;

國標方KBD-GB(Z20010127)的最大無毒濃度為40mg/ml,參見圖2。

3.3顯微鏡下細胞的改變

四川方抗EV71病毒的鏡下細胞改變見圖3。顯微鏡下可以看到藥物濃度在5mg/ml,10mg/ml和20mg/ml時,病毒感染的第三日都有為數不少的活細胞。藥物濃度為20mg/ml時,部分活細胞的形態異常,不排除為藥物對細胞的毒性作用。

國標方抗EV71病毒的鏡下細胞改變見圖4。顯微鏡下可以看到藥物濃度在10mg/ml和20mg/ml時,病毒感染的第三日都有活細胞。藥物濃度為40mg/ml時,沒有活細胞,為藥物對細胞的毒性作用。

3.4PCR檢測24、48及72小時病毒的繁殖量

采用瓊脂糖凝膠電泳檢測加入四川方時的病毒繁殖,結果見圖5,顯示四川方對EV71病毒的繁殖有一定的抑制作用。其中,PCR產物的電泳條帶越濃顯示病毒繁殖量越大,此實驗結果顯示藥物濃度為5mg/ml、10mg/ml和20mg/ml時,在病毒感染的第三日、第四日都可以抑制病毒的繁殖。

采用瓊脂凝膠電泳檢測加入國標方時的病毒繁殖,結果見圖6。照片顯示國標方對EV71病毒的繁殖有一定的抑制作用。其中,PCR產物的電泳條帶越濃顯示病毒繁殖量越大。此實驗結果顯示藥物濃度為10mg/ml和20mg/ml時,在病毒感染的第三日,第四日都可以抑制病毒的繁殖。藥物濃度為40mg/ml時,是藥物對細胞的毒性作用而抑制病毒的繁殖。

3.5Real-time?PCR定量檢測病毒的繁殖量

Real-time?PCR檢測加入四川方時的病毒繁殖。Real-time?PCR的結果(參見圖7和表1)顯示不同濃度的四川方都能抑制EV71病毒的繁殖。5mg/ml、10mg/ml和20mg/ml濃度的藥物在病毒感染后的第四日同樣有明顯的抑制病毒繁殖的能力。

表1?Real-time?PCR檢測加入四川方時的病毒拷貝數

Real-time?PCR檢測加入國標方時的病毒繁殖。Real-time?PCR的結果(參見圖8和表2)顯示不同的濃度國標方在早期都能抑制EV71病毒的繁殖。10mg/ml和20mg/ml濃度的藥物在病毒感染后的第四天同樣有明顯的抑制病毒繁殖的能力。40mg/ml的濃度時,為藥物對細胞的毒性反應而抑制病毒的繁殖。

表2?Real-time?PCR檢測加入國標方時的病毒拷貝數

四、結論

上述實驗結果表明,四川方KBD-SC和國標方KBD-GB在EV71病毒感染的早期均可以有效地抑制病毒繁殖,其中四川方KBD-SC的毒性反應高于國標方KBD-GB。

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中藥 組合 制備 71 腸道病毒 藥物 中的 用途
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