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西班牙人vs维戈塞尔塔视频: 含低聚半乳糖和單糖的減乳糖乳產品以及生產方法.pdf

摘要
申請專利號:

维戈塞尔塔vs皇家社会 www.vmyqew.com.cn CN201580017534.8

申請日:

20150306

公開號:

CN106455600A

公開日:

20170222

當前法律狀態:

有效性:

審查中

法律詳情:
IPC分類號: A23C9/12,A23C9/13,A23C9/18,A23C21/02,C12P19/04,C12N9/10,C12N9/38 主分類號: A23C9/12,A23C9/13,A23C9/18,A23C21/02,C12P19/04,C12N9/10,C12N9/38
申請人: 阿拉食品公司
發明人: 科林·A·雷,阿里·奧斯曼
地址: 丹麥維比
優先權: 14158189.2
專利代理機構: 北京安信方達知識產權代理有限公司 代理人: 王瑋瑋;鄭霞
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法律狀態
申請(專利)號:

CN201580017534.8

授權公告號:

法律狀態公告日:

法律狀態類型:

摘要

本發明涉及一種在低溫下利用具有高水平轉半乳糖基活性的β?半乳糖苷酶生產含低聚半乳糖(GOS)的乳產品的方法。此外,本發明涉及所得乳產品,這些乳產品包含GOS和單糖甜味劑,這些單糖甜味劑的特征在于葡萄糖與半乳糖間的重量比為至少2:1。

權利要求書

1.一種生產pH為至少5.0的含低聚半乳糖的乳產品的方法,該方法包括以下步驟:a)提供具有轉半乳糖基活性的酶,b)提供含有量為至多10%(w/w)的乳糖的乳源性組合物,該乳源性組合物具有至少5.0的pH,c)在至多10℃的溫度下使該乳源性組合物與該酶接觸,持續時間足以發生低聚半乳糖(GOS)的合成,d)使至少一些該酶失活和/或將其移除,e)任選地,將該含GOS的乳源性組合物轉化為粉末,f)任選地,例如以液體形式或以粉末形式包裝該含GOS的乳源性組合物。2.根據權利要求1所述的方法,其中該酶的轉半乳糖基活性與水解酶活性間的比例為至少1。3.根據權利要求1或2所述的方法,其中該酶選自下組,該組由以下各項組成:-相對于具有從SEQIDNO1的位置1(Val)至1142(Ile)的序列的多肽具有至少80%序列一致性的多肽,-相對于具有從SEQIDNO1的位置1(Val)至887(Thr)的序列的多肽具有至少80%序列一致性的多肽,和-相對于具有從SEQIDNO1的位置1(Val)至965(Leu)的序列的多肽具有至少80%序列一致性的多肽。4.根據以上權利要求中任一項所述的方法,其中該乳源性組合物包含總量在固體基礎上為至少25%(w/w)的非脂乳固體。5.根據以上權利要求中任一項所述的方法,其中該乳源性組合物具有相對于該組合物的總重量在2%-30%(w/w)范圍內的固體含量。6.根據以上權利要求中任一項所述的方法,其中該乳源性組合物為選自下組的組合物,該組由以下各項組成:全脂乳、低脂乳、脫脂乳、酪乳、復配乳粉、煉乳、UHT乳、乳清、乳清滲透物和奶油。7.根據以上權利要求中任一項所述的方法,其中步驟d)包括該酶的熱失活。8.根據以上權利要求中任一項所述的方法,其中步驟d)包括將從步驟c)獲得的該含GOS的乳源性組合物加熱至至少140℃持續至少0.1秒,例如像至少1秒。9.根據以上權利要求中任一項所述的方法,該方法包括將該含GOS的乳源性組合物轉化為粉末的步驟e)。10.根據以上權利要求中任一項所述的方法,該方法包括包裝該含GOS的乳源性組合物的步驟f)。11.一種pH為至少5.0的液體乳產品,該液體乳產品包含-至少0.9%(w/w)GOS,-至多1.5%(w/w)乳糖,-總含量為至多3.0%(w/w)的單糖,和-之間的重量比為至少2:1的葡萄糖和半乳糖。12.根據權利要求11所述的液體乳產品,該液體乳產品包含至少1.0%(w/w)GOS。13.根據權利要求11或12所述的液體乳產品,該液體乳產品包含至多1.0%(w/w)乳糖。14.根據權利要求11-13中任一項所述的液體乳產品,該液體乳產品具有總含量為至多2.0%(w/w)的單糖。15.根據權利要求11-14中任一項所述的液體乳產品,該液體乳產品具有總量在0.8%-2.0%(w/w)范圍內的葡萄糖和總量在0.2%-0.6%(w/w)范圍內的半乳糖。16.根據權利要求11-15中任一項所述的液體乳產品,該液體乳產品具有之間的重量比為至少3:1的葡萄糖和半乳糖。17.根據權利要求11-16中任一項所述的液體乳產品,該液體乳產品包含失活的β-半乳糖苷酶。18.根據權利要求11-17中任一項所述的液體乳產品,該液體乳產品包含總量為至少0.5%(w/w)的GOS-DP3+。19.根據權利要求11-18中任一項所述的液體乳產品,其中GOS-DP4+與GOS-DP3間的重量比為至少0.15。20.根據權利要求11-19中任一項所述的液體乳產品,其中GOS-DP5與GOS-DP3間的重量比為至少0.01。21.根據權利要求11-20中任一項所述的液體乳產品,該液體乳產品在生產后7天,在儲存期間保持在25℃的溫度下時具有至多60mg/100g蛋白質的糠氨酸值。22.根據權利要求11-21中任一項所述的液體乳產品,該液體乳產品包含至少0.20mmol可用NH-基團/g乳清蛋白。23.根據權利要求11-22中任一項所述的液體乳產品,其中該液體乳產品是無菌的。24.一種粉末狀乳產品,包含根據權利要求11-23中任一項所述的液體乳產品的固體。25.一種生產食物產品的方法,該方法包括以下步驟:i)提供根據權利要求11-23中任一項所述的含GOS的液體乳產品和/或根據權利要求24所述的含GOS的粉末狀乳產品,ii)任選地,提供一種或多種另外的成分,iii)將該含GOS的乳產品和任選地還有該一種或多種另外的成分轉化為該食物產品,并且iv)任選地,包裝該食物產品。26.一種食物產品,包含根據權利要求11-23中任一項所述的含GOS的液體乳產品和/或根據權利要求24所述的含GOS的粉末狀乳產品。27.根據權利要求26所述的食物產品,其中該食物產品是以下中的一種或多種:-酸化乳制品-奶酪-飲料,和-固體凝聚產品。28.一種具有以下的β-半乳糖苷酶-至多0.6的T-值,和/或-之間的比例至少為1的轉半乳糖基活性與水解酶活性,在生產減乳糖乳產品中的用途,以降低最終乳產品中的美拉德反應水平和/或延長最終乳產品的保質期。29.根據權利要求28所述的用途,其中該乳產品是經過UHT處理的低乳糖乳或無乳糖乳。

說明書

發明領域

本發明涉及一種在低溫下利用具有高水平轉半乳糖基活性的β-半乳糖苷酶生產含低聚半乳糖(GOS)的乳產品的方法。此外,本發明涉及所得乳產品,這些乳產品包含GOS和單糖甜味劑,這些單糖甜味劑的特征在于葡萄糖與半乳糖間的重量比為至少2:1。

背景技術

低聚半乳糖(GOS)長期以來一直被認為是健康促進劑,它充當哺乳動物腸胃系統內多種有益菌株的生長因子。GOS的攝取已經與降低的患上腹瀉和其他腸胃感染的風險以及強化的免疫系統相關聯。參見例如麥克法蘭(Macfarlane)等人(消化藥理學與治療學(Aliment Pharmacol Ther)24,701–714)。

GOS已被用作嬰兒配方產品的功能性食品成分,且已被建議用于多種不同食品應用中。

最初在脫脂乳中直接生產GOS的嘗試先前報道在羅德里格斯-科里納斯(Rodrigues-Colinas)2012(羅德里格斯-科里納斯等人;農業化學和食品化學雜志(J.Agric.Food Chem.)2012,60,6391-6398)中,但GOS的最高收率僅為約0.7%(w/w),對應于約15%的總碳水化合物。

類似的方法描述在利用兩種不同孵育溫度(4℃和40℃)的羅德里格斯-科里納斯(Rodrigues-Colinas)2014(羅德里格斯-科里納斯等人;食品化學(Food Chemistry)145(2014),388-394)中?;竦昧稅ê哿縂OS-DP4在內的僅為0.8%(w/w)的GOS含量。

WO 2013/182,686還建議在乳和酸奶中合成GOS。然而,WO 2013/182,686既沒有提供關于此類含GOS乳的化學組成的具體細節,也沒有提供在合成期間使用低溫。

發明內容

諸位發明人對用于制備長保質期產品的含GOS乳產品特別感興趣,這些長保質期產品是諸如長保質期液體乳產品或長保質期粉末狀乳產品。

諸位發明人已經發現,GOS含量為至少0.9%(w/w)、單糖含量為至多3.0%(w/w),且葡萄糖與半乳糖間的重量比為至少2:1的液體乳產品尤其適合用于制備長保質期產品,且已經看到此類產品具有改進的穩定性和感官性質的跡象。

因此,本發明的一個方面涉及pH為至少5.0的液體乳產品,該液體乳產品包含:

-至少0.9%(w/w)GOS,

-至多3%(w/w)乳糖,和

-之間的重量比為至少2:1的葡萄糖和半乳糖。

例如,該液體乳產品可具有總含量為至多3.0%(w/w)的單糖。

在本發明的上下文中,術語“低聚半乳糖”或“GOS”是指具有化學計量式(Gal)iGlc或(Gal)j的低聚糖,其中i=1-8且j=2-9。GOS通常作為具有不同聚合度和不同鍵聯結構的各種GOS分子的混合物而存在。該混合物可包括直鏈GOS分子和支鏈GOS分子兩者。乳糖不被視為GOS分子。

附圖簡要說明

圖1示出已經在8℃下用BIF917酶處理24小時的脫脂乳樣品中碳水化合物的分布。

發明詳細說明

本發明的一個寬泛方面涉及pH為至少5.0的液體乳產品,該液體乳產品包含:

-至少0.9%(w/w)GOS,

-至多3%(w/w)乳糖。

例如,該液體乳產品可另外包含總量為至少0.1%(w/w)的葡萄糖和半乳糖。

該液體乳產品可另外具有之間的重量比為至少2:1的葡萄糖與半乳糖。

諸位發明人已發現,上述液體乳產品提供改進的甜味/可消化碳水化合物卡路里的乳產品。

在本發明的一些優選實施例中,該液體乳產品具有總含量為至多3.0%(w/w)的單糖。

該液體乳產品可以例如通過本文所述方法獲得。

有時,此外優選的是,該液體乳產品尚未在其整個處理過程中加熱至高于10℃的溫度持續超過30分鐘,且優選地不持續超過15分鐘。

在本發明的一些優選實施例中,該液體乳產品具有至多5100EU脂多糖(LPS)/升,且任選地甚至更少含量的脂多糖。例如,該液體乳產品可以具有至多1000EU LPS/升含量的脂多糖。該液體乳產品可以例如具有至多200EU LPS/升含量的脂多糖。

與革蘭氏陽性菌相反,革蘭氏陰性菌的外膜包含脂多糖(LPS),所述脂多糖為內毒素。單個細菌細胞包含約3.5x 106個LPS分子。LPS是一種復雜的、帶負電的分子,它由以下項組成:稱為O-特異性鏈的遠側多糖鏈、核心多糖和稱為脂質A的脂質部分。LPS充當內毒素,導致在動物和人類體內誘導強烈的炎癥反應,且參與若干疾病如敗血癥的發展。LPS的毒性部分是脂質A部分,它由兩個磷酸化的葡糖胺殘基和至少6個脂肪酸組成。這兩個磷酸酯基團對LPS的生物活性至關重要。如果摻入革蘭氏陰性菌細胞膜的外部葉狀結構中,LPS分子是相對無毒的,因為脂質A部分或多或少地被收起來。然而,當分裂中的或垂死的細菌自發地將LPS釋放到哺乳動物循環中時,它可與若干蛋白質相互作用,這些蛋白質是諸如白蛋白、乳鐵蛋白、高密度脂蛋白(HDL)、低密度脂蛋白(LDL)和細菌通透性增加蛋白(BPI)。就此而言,LPS結合蛋白(LBP)是最重要的蛋白。LBP-LPS復合物在從髓系細胞(巨噬細胞、單核細胞和多形核白細胞)的膜釋放后結合至CD 14(‘分化簇14’)。CD 14需要輔助受體復合物toll樣受體4/髓樣分化-2復合物(TLR4/MD-2)來在細胞中起始細胞信號轉導級聯。這個級聯促進NF-KB的核轉運和促炎性細胞因子如腫瘤壞死因子α(TNFcc)的轉錄。TNFcc和其他促炎性細胞因子誘導血管滲透性、增強的血流和向LPS源的中性粒細胞募集以及全身性反應如發燒。在高濃度下,LPS通過過度刺激TLR4信號傳導而變得有毒,導致過量的炎癥反應,這導致不良反應如敗血性休克。已將對LPS或其他細菌抗原(例如鞭毛蛋白或T細胞表位)的異常免疫反應與炎性腸病(IBD)和壞死性小腸結腸炎(NEC)聯系起來。NEC主要影響早產兒,且被認為是由對出生后寄居腸道的共生生物的未成熟免疫反應引起。

早產兒可能具有受損的LPS感知,因為他們錯過了來自TLR4誘導的信號傳導途徑的必要分子,且因此新生兒在微生物寄居未成熟腸時易患NEC,因為脊椎動物所遇到的LPS的最豐富來源之一是他們的腸道寄居微生物群。這些腸道微生物群在成年宿主中不會引發病理性炎癥?;褂屑O蟊礱?,LPS在誘導全身性炎癥中起到重要作用。因為新生兒在他們生命的頭幾個月期間具有較高的腸上皮滲透性,所以病原性物質跨過上皮屏障并在兒童體內誘導炎癥的幾率較高。

生乳可以包含大量革蘭氏陰性菌。出于健康安全考慮,在食品中,包括革蘭氏陰性菌在內的細菌通過巴氏滅菌和消毒技術而被殺死。遺憾的是,殺死革蘭氏陰性菌不會造成革蘭氏陰性菌的膜完全降解,且LPS分子大體上保持完好,且因此被釋放到組合物中。此外,在食品組合物加工期間,LPS因食品加工技術引起的剪切力而從細菌壁釋放。LPS在100℃下具有熱穩定性,且可以在食物產品加工期間存活。

在本發明的一些優選實施例中,該液體乳產品包含已經用于乳內GOS生產中的失活β-半乳糖苷酶。失活β-半乳糖苷酶可以是例如熱致失活的β-半乳糖苷酶。在本發明的上下文中,術語“失活酶”意指該酶已被變性、改性或降解,且已喪失其β-半乳糖苷酶活性。

在本發明的一些實施例中,該液體乳產品具有總含量為至多15%(w/w)的碳水化合物。該液體乳產品可具有總含量為至多10%(w/w)的碳水化合物。該液體乳產品可例如具有總含量為至多5%(w/w)的碳水化合物??商媧?,該液體乳產品可具有總含量為至多3%(w/w)的碳水化合物。例如,在施加酶前初始乳糖濃度已經減少約30%-35%的液體乳產品中可為這種情況。

在本發明的上下文中,術語“碳水化合物”涵蓋小型碳水化合物(如單糖和二糖)以及較大的糖(如多糖和低聚糖)兩者。

在本發明的上下文中,當稱組合物包含、含有或具有X%(w/w)的具體組分時,除非另外說明,否則該具體組分的重量百分比是相對于該組合物的總重量來計算。

該液體乳產品可例如具有總含量在1%-15%(w/w)范圍內的碳水化合物。例如,該液體乳產品可以具有總含量在2%-10%(w/w)范圍內,如在3%-8%(w/w)范圍內的碳水化合物??商媧?,該液體乳產品可以具有總含量在4%-6%(w/w)范圍內,如約5%(w/w)的碳水化合物。

在本發明的一些低碳水化合物實施例中,優選的是該液體乳產品具有總含量在1%-4%(w/w)范圍內,如在2%-3%(w/w)范圍內的碳水化合物。

在本發明的一些實施例中,該液體乳產品具有總含量為至多10%(w/w)的單糖和二糖。該液體乳產品可具有總含量為至多8%(w/w)的單糖和二糖。該液體乳產品可例如具有總含量為至多5%(w/w),如至多3%(w/w)的單糖和二糖??商媧?,該液體乳產品可具有總含量為至多2%(w/w),如至多1%(w/w)的單糖和二糖。

該液體乳產品可例如具有總含量在0.1%-10%(w/w)范圍內的單糖和二糖。例如,該液體乳產品可以具有總含量在1%-8%(w/w)范圍內,如在1.5%-6%(w/w)范圍內的單糖和二糖??商媧?,該液體乳產品可以具有總含量在2%-4%(w/w)范圍內,如約3%(w/w)的單糖和二糖。

在本發明的一些優選實施例中,該液體乳產品具有總含量為至多3%(w/w)的乳糖。該液體乳產品可具有總含量為至多2.5%(w/w)的乳糖。該液體乳產品可例如具有總含量為至多2.0%(w/w)的乳糖??商媧?,該液體乳產品可具有總含量為至多1.5%(w/w)的乳糖。

該液體乳產品可例如具有總含量為至多1.0%(w/w),如至多0.5%(w/w)的乳糖??商媧?,該液體乳產品可具有總含量為至多0.2%(w/w),如至多0.1%(w/w)的乳糖。

該液體乳產品可例如具有總含量在0.05%-3%(w/w)范圍內的乳糖。例如,該液體乳產品可以具有總含量在0.1%-2%(w/w)范圍內,如在0.2%-1.5%(w/w)范圍內的乳糖??商媧?,該液體乳產品可以具有總含量在0.3%-1.0%(w/w)范圍內,如約0.4%(w/w)的乳糖。

乳糖濃度(相對于總DP2的%)可例如通過高效陰離子交換色譜外加脈沖安培檢測器(HPAEC-PAD)來測定。這種方法可量化乳中的乳糖濃度(mg/L),且還可以量化乳糖相對于總二糖(DP2)的%。相對于總DP2的乳糖%的量化在量化GOS混合物中的乳糖中是重要的,因為利用傳統HPLC方法,乳糖與其他二糖(包括轉半乳糖基的二糖)在相同峰中共洗脫。例如,可使用由GS50梯度泵、具有金工作電極的ED50電化學檢測器、LC25色譜爐和AS50自動取樣機組成的戴安(Dionex)系統??墑褂沒詒∧ば鴕趵胱詠換皇髦腃arboPac PA-1分析柱(4mm×250mm)進行分離,該柱連接至CarboPac PA1防護罩(4mm×50mm)。將該柱維持在25℃下;用梯度洗脫,以1ml/min的流速進行洗脫。

優選使用以下4種洗脫液:A:8mM NaOH;B:125mM NaOH;C:125mM NaOH和400mM(乙酸鈉);D:8mM乙酸鈉。這四種洗脫液以梯度模式混合,以便在洗脫的最初幾分鐘內存在痕量NaOH。4-5分鐘后,NaOH和乙酸鈉的濃度逐步升高,以允許洗脫二糖、三糖、四糖等。所有氫氧化鈉溶液的pH>8,且大部分>10。乙酸鈉溶液單獨具有約8的pH。

在這些條件下,乳糖作為與其他二糖分開的峰被洗脫,這允許利用標準校準曲線和適當的DP2標準物對其進行量化。所有色譜分析都應該一式兩份地進行。

待分析的GOS-DP2餾分可通過制備型凝膠過濾法與總碳水化合物群體分離。在本發明的一些實施例中,該液體乳產品具有總含量為至多10%(w/w)的半乳糖和葡萄糖。該液體乳產品可具有總含量為至多10%(w/w)的半乳糖和葡萄糖。該液體乳產品可例如具有總含量為至多5%(w/w),如至多3%(w/w)的半乳糖和葡萄糖??商媧?,該液體乳產品可具有總含量為至多2%(w/w),如至多1%(w/w)的半乳糖和葡萄糖。

該液體乳產品可例如具有總含量在0.1%-10%(w/w)范圍內的半乳糖和葡萄糖。例如,該液體乳產品可以具有總含量在0.3%-8%(w/w)范圍內,如在0.5%-6%(w/w)范圍內的半乳糖和葡萄糖??商媧?,該液體乳產品可以具有總含量在1%-3%(w/w)范圍內,如約2%(w/w)的半乳糖和葡萄糖。

通常,該液體乳產品包含至少一些葡萄糖和半乳糖。例如,該液體乳產品通常包含至少0.1%(w/w)葡萄糖和至少0.1%(w/w)半乳糖。

在本發明的一些優選實施例中,該液體乳產品包含總量在0.5%-3%(w/w)范圍內的葡萄糖和總量在0.1%-1.0%范圍內的半乳糖。例如,該液體乳產品可包含總量在0.8%-2.0%(w/w)范圍內的葡萄糖和總量在0.2%-0.6%(w/w)范圍內的半乳糖。

在本發明的一些優選實施例中,該液體乳產品具有總含量為至多3.0%(w/w)的單糖。該液體乳產品可具有總含量為至多2.5%(w/w)的單糖。該液體乳產品可例如具有總含量為至多2.0%(w/w),如至多1.5%(w/w)的單糖??商媧?,該液體乳產品可具有總含量為至多1.0%(w/w),如至多0.5%(w/w)的單糖。

該液體乳產品可例如具有總含量在0.1%-3.0%(w/w)范圍內的單糖。例如,該液體乳產品可以具有總含量在0.2%-2.5%(w/w)范圍內,如在0.5%-2.0%(w/w)范圍內的單糖??商媧?,該液體乳產品可以具有總含量在0.1%-2.0%(w/w)范圍內,如約1.5%(w/w)的單糖。

諸位發明人已發現,本發明的具有相對低含量單糖的液體乳產品對于涉及高溫加熱或甚至將液體乳產品轉化為粉末的使用尤其有利,且提供比具有更高含量的單糖的含GOS乳產品具有更好的長期穩定性的產品。不受理論的約束,據信,更高水平的單糖引起更多的美拉德(Maillard)反應,它是由減少糖類和含伯氨基的蛋白質(例如通過賴氨酸殘基)起始的不令人希望的鏈反應。美拉德反應會降低乳產品的營養價值,且會破壞它的顏色和味道。

在本發明的一些實施例中,該液體乳產品具有總含量為至多3%(w/w)的半乳糖。該液體乳產品可具有總含量為至多2.5%(w/w)的半乳糖。該液體乳產品可例如具有總含量為至多2.0%(w/w)的半乳糖??商媧?,該液體乳產品可具有總含量為至多1.5%(w/w)的半乳糖。

在本發明的一些優選實施例中,該液體乳產品具有總含量為至多1.0%(w/w)的半乳糖。該液體乳產品可具有總含量為至多0.5%(w/w)的半乳糖。該液體乳產品可例如具有總含量為至多0.4%(w/w),如至多0.3%(w/w)的半乳糖??商媧?,該液體乳產品可具有總含量為至多0.2%(w/w),如至多0.1%(w/w)的半乳糖。

該液體乳產品可例如具有總含量在0.05%-3%(w/w)范圍內的半乳糖。例如,該液體乳產品可以具有總含量在0.1%-2%(w/w)范圍內,如在0.2%-1.5%(w/w)范圍內的半乳糖??商媧?,該液體乳產品可以具有總含量在0.3%-1.0%(w/w)范圍內,如約0.4%(w/w)的半乳糖。

該液體乳產品優選地具有總含量為至少0.9%(w/w),且優選地至少1.0%(w/w)的GOS。該液體乳產品可具有總含量為至少1.2%(w/w)的GOS。該液體乳產品可例如具有總含量為至少1.4%(w/w)的GOS??商媧?,該液體乳產品可具有總含量為至少2.0%(w/w)的GOS。

在本發明的一些優選實施例中,該液體乳產品具有總含量為至少2.2%(w/w)的GOS。該液體乳產品可具有總含量為至少2.4%(w/w)的GOS。該液體乳產品可例如具有總含量為至少2.6%(w/w),如至少2.8%(w/w)的GOS??商媧?,該液體乳產品可具有總含量為至少3.0%(w/w),如至少3.5%(w/w)的GOS。

該液體乳產品可例如具有總含量在0.9%-10%(w/w)范圍內的GOS??商媧?,該液體乳產品可具有總含量在1%-10%(w/w)范圍內的GOS。例如,該液體乳產品可以具有總含量在1.0%-8.0%(w/w)范圍內,如在1.2%-6.0%(w/w)范圍內的GOS??商媧?,該液體乳產品可以具有總含量在1.4%-5.0%(w/w)范圍內,如約2%(w/w)的GOS。

優選的是該液體乳產品包含大量聚合度(DP)為3和更高的GOS。DP為3的GOS分子(DP3)為三糖,DP為4的GOS分子(DP4)為四糖,以此類推。

因此,優選的是該液體乳產品包含總量為至少0.5%(w/w)的GOS-DP3+。在本發明的上下文中,術語“GOS-DPx+”意指具有DPx或更高的GOS分子的總和。例如,術語“DP3+”意指具有DP3、DP4、DP5、DP6等的GOS分子的總和。

該液體乳產品優選地具有總含量為至少0.9%(w/w),且甚至更優選地至少1.0%(w/w)的GOS-DP3+。該液體乳產品可具有總含量為至少1.2%(w/w)的GOS-DP3+。該液體乳產品可例如具有總含量為至少1.4%(w/w)的GOS-DP3+??商媧?,該液體乳產品可具有總含量為至少2.0%(w/w)的GOS-DP3+。

據信,相對高含量的GOS并且尤其是GOS-DP3+相對于現有技術的液體乳產品增加液體乳產品的益生效果。

在本發明的一些優選實施例中,該液體乳產品具有總含量為至少2.2%(w/w)的GOS-DP3+。該液體乳產品可具有總含量為至少2.4%(w/w)的GOS-DP3+。該液體乳產品可例如具有總含量為至少2.6%(w/w),如至少2.8%(w/w)的GOS-DP3+??商媧?,該液體乳產品可具有總含量為至少3.0%(w/w),如至少3.5%(w/w)的GOS-DP3+。

該液體乳產品可例如具有總含量在0.5%-10%(w/w)范圍內的GOS-DP3+。例如,該液體乳產品可以具有總含量在1.0%-8.0%(w/w)范圍內,如在1.2%-6.0%(w/w)范圍內的GOS-DP3+??商媧?,該液體乳產品可以具有總含量在1.4%-5.0%(w/w)范圍內,如約2%(w/w)的GOS-DP3+。

在本發明的上下文中,術語“GOS-DPx”意指具有DPx的GOS分子的總和。例如,術語“DP3”意指具有DP3的GOS分子的總和,但不包括具有更高或更低DP的GOS。

在本發明的一些優選實施例中,該液體乳產品具有之間的重量比為至少0.15的GOS-DP4+和GOS-DP3。

GOS-DP4+與GOS-DP3間比例較高的液體乳產品通常比GOS-DP4+與GOS-DP3間比例較低的液體乳產品包含更廣泛的各種各樣的GOS-DP4種類、GOS-DP5種類、GOS-DP6種類和GOS-DP7種類,且因此,據信提供更好、更多樣的益生效果,且據信以比只有GOS-DP2和GOS-DP3更慢的速率發酵。據信,每個DP簇內的高度多樣化的聚合度和高度多樣化的種類對更多的益生菌菌株和胃腸道健康微生物群物種內的物種提供更寬的功效。

在本發明的其他優選實施例中,該液體乳產品具有之間的重量比為至少0.2的GOS-DP4+和GOS-DP3。例如,GOS-DP4+與GOS-DP3間的重量比可為至少0.25。

在本發明的其他優選實施例中,該液體乳產品具有之間的重量比為至少0.30的GOS-DP4+和GOS-DP3。甚至更優選地,GOS-DP4+與GOS-DP3間的重量比可為至少0.4。

在本發明的一些優選實施例中,該液體乳產品具有之間的重量比在0.15-2范圍內的GOS-DP4+和GOS-DP3。

在本發明的其他優選實施例中,該液體乳產品具有之間的重量比在0.2-1范圍內的GOS-DP4+和GOS-DP3。甚至更優選地,GOS-DP4+與GOS-DP3間的重量比可在0.25-1.0的范圍內。

在本發明的其他優選實施例中,該液體乳產品具有之間的重量比可在0.30-0.8范圍內的GOS-DP4+和GOS-DP3。甚至更優選地,GOS-DP4+與GOS-DP3間的重量比可在0.4-0.6的范圍內。

在本發明的一些優選實施例中,該液體乳產品具有之間的重量比為至少0.01的GOS-DP5和GOS-DP3。

在本發明的其他優選實施例中,該液體乳產品具有之間的重量比為至少0.02的GOS-DP5和GOS-DP3。例如,GOS-DP5與GOS-DP3間的重量比可為至少0.03。

在本發明的其他優選實施例中,該液體乳產品具有之間的重量比為至少0.04的GOS-DP5和GOS-DP3。甚至更優選地,GOS-DP5與GOS-DP3間的重量比可為至少0.5。

在本發明的一些優選實施例中,該液體乳產品具有之間的重量比在0.01-0.2范圍內的GOS-DP5和GOS-DP3。

在本發明的其他優選實施例中,該液體乳產品具有之間的重量比在0.02-0.15范圍內的GOS-DP5和GOS-DP3。甚至更優選地,GOS-DP5與GOS-DP3間的重量比可在0.03-0.1的范圍內。

在本發明的其他優選實施例中,該液體乳產品具有之間的重量比可在0.03-0.09范圍內的GOS-DP5和GOS-DP3。GOS-DP5與GOS-DP3間的重量比可例如在0.04-0.08的范圍內。

在本發明的一些優選實施例中,該液體乳產品具有之間的重量比為至少3:1,且優選地至少3.0:1.0的葡萄糖和半乳糖。例如,葡萄糖與半乳糖間的重量比可為至少3.5:1.0。葡萄糖與半乳糖間的重量比可例如為至少4.0:1.0,諸如至少4.5:1.0??商媧?,葡萄糖與半乳糖間的重量比可為至少5.0:1.0,諸如至少6.0:1.0。

蛋白質是液體乳產品中的重要營養組分,且在本發明的一個實施例中,該液體乳產品包含總量在1%-10%(w/w)范圍內的蛋白質。例如,該液體乳產品可包含總量在2%-8%(w/w)范圍內的蛋白質。例如,該液體乳產品可包含總量在2.5%-6%(w/w)范圍內的蛋白質??商媧?,該液體乳產品可包含總量在3.0%-5%(w/w)范圍內的蛋白質。

蛋白質的總量優選地根據ISO 8968-3:2004(氮含量的測定分塊-消化法(Determination of nitrogen content Block-digestion method))來測定。

酪蛋白通常為乳產品中的主要蛋白質,且在本發明的一個實施例中,該液體乳產品包含總量在0.5%-8%(w/w)范圍內的酪蛋白。例如,該液體乳產品可包含總量在1%-6%(w/w)范圍內,且優選地在2.0%-5%(w/w)范圍內,且甚至更優選地在2.5%-4%(w/w)范圍內的酪蛋白。

酪蛋白通常為乳中的主要蛋白質,且在本發明的一些實施例中,該液體乳產品包含總量在0.5%-8%(w/w)范圍內的酪蛋白。例如,該液體乳產品可包含總量在1%-6%(w/w)范圍內,且優選地在2.0%-5%(w/w)范圍內,且甚至更優選地在2.5%-4%(w/w)范圍內的酪蛋白。

除酪蛋白以外,液體乳產品通常包含天然乳清蛋白,諸如β-乳球蛋白、α-乳白蛋白、血清白蛋白、免疫球蛋白等。在本發明的一些優選實施例中,該液體乳產品包含總量在0.2%-4%(w/w)范圍內的乳清蛋白。例如,該液體乳產品可包含總量在0.4%-3%(w/w)范圍內,且優選地在0.5%-2%(w/w)范圍內,且甚至更優選地在0.6%-1.5%(w/w)范圍內的乳清蛋白。

在本發明的一些優選實施例中,該液體乳產品在生產后7天,在儲存期間保持在25℃的溫度下時具有至多60mg/100g蛋白質的糠氨酸值。優選地,該液體乳產品在生產后7天,在儲存期間保持在25℃的溫度下時具有至多55mg/100g蛋白質的糠氨酸值。甚至更優選地,該液體乳產品在生產后7天,在儲存期間保持在25℃的溫度下時可具有至多50mg/100g蛋白質的糠氨酸值。

在本發明的其他優選實施例中,該液體乳產品在生產后7天,在儲存期間保持在25℃的溫度下時具有至多40mg/100g蛋白質的糠氨酸值。優選地,該液體乳產品在生產后7天,在儲存期間保持在25℃的溫度下時具有至多30mg/100g蛋白質的糠氨酸值。甚至更優選地,該液體乳產品在生產后7天,在儲存期間保持在25℃的溫度下時可具有至多20mg/100g蛋白質的糠氨酸值。

在本發明的一些優選實施例中,該液體乳產品包含至少0.20mmol可用NH2-基團/g乳清蛋白。

每g乳清蛋白的可用NH2-基團的量可如F.希瓦利埃(Chevalier)等人(國際乳品期刊(International Dairy Journal)11(2001)145–152)中所述來測定。乳清相可通過酪蛋白的酸沉降從乳產品中分離,并且隨后用0.1mol/L磷酸鹽緩沖液(pH 6.5)透析乳清相。

例如,該液體乳產品可包含至少0.25mmol可用NH2-基團/g乳清蛋白。優選地,該液體乳產品包含至少0.25mmol可用NH2-基團/g乳清蛋白。該液體乳產品可例如包含至少0.30mmol可用NH2-基團/g乳清蛋白。

在本發明的其他優選實施例中,該液體乳產品包含至少0.35mmol可用NH2-基團/g乳清蛋白。例如,該液體乳產品可包含至少0.40mmol可用NH2-基團/g乳清蛋白。優選地,該液體乳產品包含至少0.45mmol可用NH2-基團/g乳清蛋白。該液體乳產品可例如包含至少0.50mmol可用NH2-基團/g乳清蛋白。

脂肪也是液體乳產品中的重要營養組分,且此外可為脂溶性維生素的載體。在本發明的一個實施例中,該液體乳產品包含總量在0.01%-40%(w/w)范圍內的脂肪。例如,該液體乳產品可包含總量在0.1%-20%(w/w)范圍內的脂肪??商媧?,該液體乳產品可包含總量在0.5%-5%(w/w)范圍內的脂肪。例如,該液體乳產品可包含總量在1%-4%(w/w)范圍內的脂肪。

本發明還允許低脂肪液體乳產品。因此,在本發明的一個實施例中,該液體乳產品包含總量在0.01%-1.0%(w/w)范圍內的脂肪。例如,該液體乳產品可包含總量在0.05%-0.6%(w/w)范圍內的脂肪??商媧?,該液體乳產品可包含總量在0.1%-0.4%(w/w)范圍內的脂肪。

該液體乳產品的脂肪優選地包含乳脂或甚至由其組成。然而,在本發明的一些實施例中,脂肪還包括植物性脂肪。有用植物性脂肪的非限制性實例包括玉米油、芝麻油、大豆油、亞麻籽油、葡萄籽油、菜籽油、橄欖油、花生油、葵花油、紅花油、棕櫚油、棕櫚仁油、椰子油及其組合。

在本發明的上下文中,術語脂肪和油可互換使用。

固體脂肪含量可根據ISO 8292-1&2:2008或ISO 1736:2008(奶粉和乳產品-脂肪含量的測定-重量分析法(參考方法)(Dried milk and milk products-Determination of fat content-Gravimetric method(Reference method)))來測定。

該液體乳產品此外可包含通常存在于反芻動物乳中的礦物質,且該液體乳產品還可補充有另外的礦物質。

在本發明的一些實施例中,該液體乳產品的鈉含量為至多300mg/100g液體乳產品,優選地至多200mg/100g液體乳產品,且甚至更優選地至多100mg/100g液體乳產品,例如像在30-60mg/100g液體乳產品的范圍內。

在本發明的一些優選實施例中,該液體乳產品的固體含量相對于該產品的總重量優選為至多25%(w/w)。例如,該液體乳產品可具有至多20%(w/w)的固體含量。該液體乳產品的固體含量可例如為至多15%(w/w)??商媧?,該液體乳產品的固體含量可例如為至多10%(w/w)。

例如,該液體乳產品可具有至多20%(w/w)的固體含量。該液體乳產品的固體含量可例如為至多15%(w/w)??商媧?,該液體乳產品的固體含量可例如為至多10%(w/w)。

在本發明的一些優選實施例中,該液體乳產品具有相對于該液體乳產品的總重量在2%-30%(w/w)范圍內的固體含量。優選地,該液體乳產品可具有在4%-20%(w/w)范圍內的固體含量。甚至更優選地,該液體乳產品可具有相對于該乳產品的總重量在6%-16%(w/w)范圍內,例如像在7%-14%(w/w)范圍內的固體含量。

該液體乳產品的pH可為弱酸性、中性或堿性。pH優選地為至少5,且優選地至少6,諸如約7。在本發明的一些優選實施例中,該液體乳產品的pH在5.0-9的范圍內。例如,該液體乳產品的pH可在6.0-8的范圍內。該液體乳產品的pH可例如在6.5-7.5的范圍內。除非另外提出,否則本文所述的所有pH值都是在10℃下測定。

在本發明的一些實施例中,該液體乳產品是未通過添加預先生產的低聚半乳糖而被濃縮的液體乳產品。

在本發明的一個優選實施例中,該液體乳產品的pH在5.0-8的范圍內,該液體乳產品包含:

-至少1.0%(w/w)GOS,

-至多1%(w/w)乳糖,

-總含量為至多3.0%(w/w)的單糖,和

-總量在3%-6%(w/w)范圍內的碳水化合物。

在本發明的其他優選實施例中,例如可通過本文所定義方法獲得的液體乳產品的pH在5.0-8的范圍內,且包含:

-至少1.0%(w/w)GOS,

-至多1%(w/w)乳糖,

-總含量為至多3.0%(w/w)的單糖,

-總量在3%-6%(w/w)范圍內的碳水化合物,和

-之間的重量比為至少2:1,且優選地至少3:1的葡萄糖和半乳糖。

在本發明的又其他優選實施例中,例如可通過本文所定義方法獲得的液體乳產品的pH在5.0-8的范圍內,且包含:

-至少1.0%(w/w)GOS,

-至多1%(w/w)乳糖,

-總含量為至多3.0%(w/w)的單糖,

-總量在3%-6%(w/w)范圍內的碳水化合物,和

-總量在0.8%-2.0%(w/w)范圍內的葡萄糖和總量在0.2%-0.6%(w/w)范圍內的半乳糖。

在本發明的一個優選實施例中,例如可通過本文所定義方法獲得的液體乳產品的pH在5.0-8的范圍內,該液體乳產品包含:

-至少1.0%(w/w)GOS,

-總含量為至少0.9%(w/w)的GOS-DP3+

-至多1%(w/w)乳糖,

-總含量為至多3.0%(w/w)的單糖,和

-總量在3%-6%(w/w)范圍內的碳水化合物。

在本發明的其他優選實施例中,例如可通過本文所定義方法獲得的液體乳產品的pH在5.0-8的范圍內,且包含:

-至少1.0%(w/w)GOS,

-總含量為至少0.9%(w/w)的GOS-DP3+,

-至多1%(w/w)乳糖,

-總含量為至多3.0%(w/w)的單糖,

-總量在3%-6%(w/w)范圍內的碳水化合物,和

-之間的重量比為至少2:1,且優選地至少3:1的葡萄糖和半乳糖。

在本發明的又其他優選實施例中,例如可通過本文所定義方法獲得的液體乳產品的pH在5.0-8的范圍內,且包含:

-至少1.0%(w/w)GOS,

-總含量為至少0.9%(w/w)的GOS-DP3+

-至多1%(w/w)乳糖,

-總含量為至多3.0%(w/w)的單糖,

-總量在3%-6%(w/w)范圍內的碳水化合物,和

-總量在0.8%-2.0%(w/w)范圍內的葡萄糖和總量在0.2%-0.6%(w/w)范圍內的半乳糖。

這樣一種液體乳產品的脂肪和蛋白質組成優選地類似于正常低脂乳,例如像脫脂乳的脂肪和蛋白質組成,主要不同是本發明液體乳產品可包含失活酶。

該液體乳產品的視覺外觀可例如類似于低脂乳或脫脂乳的視覺外觀,或者調味低脂乳或脫脂乳的視覺外觀。

在本發明的一些優選實施例中,該液體乳產品是無菌的,例如通過UHT處理或殺死所有微生物的類似處理獲得。在本發明的上下文中,術語“無菌”意指所討論的產品不含任何活微生物。

在本發明的一些優選實施例中,該液體乳產品在生產后儲存在25℃時具有至少180天的保質期,優選地在生產后儲存在25℃時具有至少240天的保質期,且甚至更優選地在生產后儲存在25℃時具有至少360天的保質期。這樣一種長保質期液體乳可例如已經經受UHT處理或類似熱處理并且經受纖溶酶失活。

本發明的又一個方面涉及含液體乳產品的固體的粉末狀乳產品。例如,粉末狀乳產品可基本上由液體乳產品的固體和水組成。

在本發明的一些優選實施例中,該粉末狀乳產品包含量為90%-97%(w/w)的液體乳產品的固體和量為3%-10%(w/w)的水。

這樣一種粉末狀乳產品可通過噴霧干燥液體乳產品獲得。

在本發明的一些優選實施例中,該粉末狀乳產品包含固體含量為12%(w/w)的如本文所述的液體乳產品的固體。這意味著關于液體乳產品的固體組分的濃度的實施例可以通過用在液體乳產品語境中提到的固體組分的濃度乘以8.3(=100%/12%)的系數而轉換為粉末狀乳產品的固體的組成。

因此,如果固體含量為12%(w/w)的液體乳產品包含

-至少1.0%(w/w)GOS,

-至多3%(w/w)乳糖,

-總量為至少0.1%(w/w)的葡萄糖和半乳糖,和

-之間的重量比為至少3:1的葡萄糖和半乳糖,

那么相應的粉末狀乳產品的固體將包含

-相對于固體總重量至少8.3%(w/w)的GOS,

-相對于固體總重量至多25%(w/w)的乳糖,

-相對于固體總重量的總量為至少0.8%(w/w)的葡萄糖和半乳糖,和

-之間的重量比為至少3:1的葡萄糖和半乳糖。

將10g粉末狀乳產品溶解在90g脫礦質水中時獲得的pH為至少5.0,且可與在液體乳產品語境中描述的相同。

該液體或粉末狀乳產品優選地存在于密封容器中。

諸位發明人已發現,上述液體乳產品可在乳中通過低溫、酶促GOS合成而直接生產,GOS的收率出乎意料的高。

因此,本發明的另一個方面涉及一種生產含低聚半乳糖的乳產品的方法,該方法包括以下步驟:

a)提供具有轉半乳糖基活性的酶,

b)提供含有相對于固體總重量的量為至多10%(w/w)的乳糖的乳源性組合物,該乳源性組合物具有至少5的pH,

c)在至多10℃的溫度下使該乳源性組合物與該酶接觸,持續時間足以發生低聚半乳糖(GOS)的合成,

d)使至少一些該酶失活和/或將其移除,

e)任選地,將從步驟d)獲得的該含GOS的乳源性組合物轉化為粉末,

f)任選地,例如以液體形式或以粉末形式包裝該含GOS的乳源性組合物。

諸位發明人已出乎意料地發現,有可能在酶處理期間利用低溫在乳中生產高收率的GOS。

該方法可以幾種變體實現。

在本發明的一些實施例中,該方法包括步驟a)、b)、c)和d)。

在本發明的其他實施例中,該方法包括步驟a)、b)、c)、d)和e)。

在本發明的仍其他實施例中,該方法包括步驟a)、b)、c)、d)、e)和f)。

在本發明的其他實施例中,該方法包括步驟a)、b)、c)、d)和f),但不包括步驟e)。

在本發明的仍其他實施例中,該方法包括步驟a)、b)、c)、d)和f),但不包括步驟e)。

步驟優選地以字母表次序進行。然而,步驟a)和b)可以次序a)、b)和次序b)、a)兩者進行。

用于本發明的酶具有轉半乳糖基活性,意味著它能夠將供體底物如乳糖的半乳糖基基團轉移至并非水的受體分子。優選地,該酶對具有β(1-4)構象的半乳糖基鍵聯有活性。這有效地將該酶歸入β-半乳糖苷酶的IUBMB EC 3.2.1.23類。

在本發明的一些優選實施例中,該酶具有之間的比例為至少1的轉半乳糖基活性和水解酶活性,意味著對于每個分成半乳糖和葡萄糖的乳糖分子,約1個乳糖分子分成葡萄糖和轉移至非水受體的半乳糖基基團。

酶的轉半乳糖基活性與水解酶活性間的比例優選地根據WO 2013/182686的方法4來測定。

例如,該酶的轉半乳糖基活性與水解酶活性間可具有至少2的比例。該酶的轉半乳糖基活性與水解酶活性間可例如具有至少3的比例??商媧?,該酶的轉半乳糖基活性與水解酶活性間可具有至少4的比例。

甚至更高的比例可以是優選的,因此,該酶的轉半乳糖基活性與水解酶活性間可具有至少5的比例。該酶的轉半乳糖基活性與水解酶活性間可例如具有至少7的比例??商媧?,該酶的轉半乳糖基活性與水解酶活性間可具有至少10的比例。

如上所述的,第一酶除β-半乳糖苷酶活性以外還具有轉半乳糖基化活性。也可以優選的是,該第一酶具有至多0.9的T-值。

在本發明的上下文中,術語β-半乳糖苷酶的“轉半乳糖基化活性”是指該酶將半乳糖基基團從供體分子如乳糖分子轉移至非水分子如另一乳糖分子的能力。

T-值是利用乳糖作為半乳糖基供體和受體兩者的β-半乳糖苷酶的轉半乳糖基化功效的替代量度。β-半乳糖苷酶的T-值的測定是根據實例4中所述分析和公式來進行。利用以下公式計算T-值:

T-值=所產生的半乳糖量:所用的乳糖量

所產生的半乳糖量和所用的乳糖量都應該以mol為單位,以測定T-值。

對于每mol使用的乳糖,沒有任何轉半乳糖基化活性的乳糖酶將產生一mol半乳糖,且將具有1的T-值。具有極高轉半乳糖基化活性的β-半乳糖苷酶將使用來自乳糖的幾乎所有半乳糖基基團來進行轉半乳糖基化作用而非生成半乳糖,且因此將具有接近0的T-值。

優選的是,該酶具有至多0.6的T-值。在本發明的一些實施例中,該酶的T-值為至多0.5,優選地至多0.4,且甚至更優選地至多0.3。例如,該酶的T-值可為至多0.2。優選地,該酶的T-值可為至多0.1。甚至更優選的是,該酶的T-值可為至多0.05。

有用酶的非限制性實例可見于專利申請WO 2001/90317A2、WO 2013/182686A1、WO 2011/120993A1中,出于所有目的將這些專利申請全部通過引用而并入本文。

在本發明的一些優選實施例中,該酶選自下組,該組由以下各項組成:

-相對于具有從SEQ ID NO 1的位置1(Val)至1142(Ile)的序列的多肽具有至少80%序列一致性的多肽,

-相對于具有從SEQ ID NO 1的位置1(Val)至887(Thr)的序列的多肽具有至少80%序列一致性的多肽,和

-相對于具有從SEQ ID NO 1的位置1(Val)至965(Leu)的序列的多肽具有至少80%序列一致性的多肽。

已發現,來自兩歧雙歧桿菌(Bifidobacterium bifidum)DSM20215的成熟胞外乳糖的截短體(SEQ ID NO 1-對應于從UniProt-序列UPI00001B62C5的位置33(Val)到位置1752(Gly)的序列,www.uniprot.org)具有高水平的轉半乳糖基活性。

在本發明的上下文中,術語“序列一致性”涉及兩個具有相等長度的氨基酸序列之間或兩個具有相等長度的核酸序列之間的一致性程度的定量度量。如果有待比較的兩個序列不具有相等長度,必須將它們比對以盡可能最好地配合。序列一致性可以被計算為

(Nref-Ndif)*100)/(Nref),

其中Ndif是對齊時這兩個序列中不一致的殘基的總數,并且其中Nref是序列之一中的殘基的數目。因此,DNA序列AGTCAGTC將與序列AATCAATC具有75%的序列一致性(Ndif=2并且Nref=8)??瘴槐凰闋饕桓齷蚨喔鎏囟ú謝牟灰恢灤?,即DNA序列AGTGTC將與DNA序列AGTCAGTC具有75%的序列一致性(Ndif=2并且Nref=8)??梢岳縭褂檬實鋇腂LAST程序,諸如由美國國家生物技術信息中心(NCBI)提供的BLASTp算法來計算序列一致性。

在本發明的其他優選實施例中,該酶的氨基酸序列相對于SEQ ID NO.1的肽具有至少80%的序列一致性。例如,第一酶的氨基酸序列相對于SEQ ID NO.2的肽可具有至少90%,優選地至少95%,且甚至更優選地至少97.5%的序列一致性。在一些情況下,第一酶的氨基酸序列相對于SEQ ID NO.2的肽可具有至少99%的序列一致性。

在本發明的一些優選實施例中,該酶是相對于具有從SEQ ID NO 1的位置1(Val)至887(Thr)的序列的多肽具有至少90%序列一致性的多肽。優選地,該酶是相對于具有從SEQ ID NO 1的位置1(Val)至887(Thr)的序列的多肽具有至少95%序列一致性的多肽。甚至更優選地,該酶是相對于具有從SEQ ID NO 1的位置1(Val)至887(Thr)的序列的多肽具有至少98%序列一致性的多肽。

在本發明的一些優選實施例中,該酶是具有從位置1(Val)至887(Thr)的序列的多肽。

在本發明的一些優選實施例中,該酶是相對于具有從SEQ ID NO 1的位置1(Val)至1142(Ile)的序列的多肽具有至少90%序列一致性的多肽。優選地,該酶是相對于具有從SEQ ID NO 1的位置1(Val)至1142(Ile)的序列的多肽具有至少95%序列一致性的多肽。甚至更優選地,該酶是相對于具有從SEQ ID NO 1的位置1(Val)至1142(Ile)的序列的多肽具有至少98%序列一致性的多肽。

在本發明的一些優選實施例中,該酶是具有從位置1(Val)至1142(Ile)的序列的多肽。

在本發明的一些優選實施例中,該酶是相對于具有從SEQ ID NO 1的位置1(Val)至965(Leu)的序列的多肽具有至少90%序列一致性的多肽。優選地,該酶是相對于具有從SEQ ID NO 1的位置1(Val)至965(Leu)的序列的多肽具有至少95%序列一致性的多肽。甚至更優選地,該酶是相對于具有從SEQ ID NO 1的位置1(Val)至965(Leu)的序列的多肽具有至少98%序列一致性的多肽。

在本發明的一些優選實施例中,該酶是具有從SEQ ID NO 1的位置1(Val)至965(Leu)的序列的多肽。

步驟b)中所提供的乳源性組合物優選地為液體組合物。

在本發明的上下文中,術語“乳源性組合物”意指含酪蛋白和/或乳清蛋白且另外含乳糖和礦物質的組合物。

在本發明的上下文中,短語“Y和/或X”意指“Y”或“X”或“Y和X”。沿著相同的邏輯線,短語“n1、n2、…、ni-1和/或ni”意指“n1”或“n2”或…或“ni-1”或“ni”或組分n1、n2、...ni-1和ni的任何組合。

在本發明的一些優選實施例中,該乳源性組合物包含總量在固體基礎上為至少25%(w/w),優選地至少50%(w/w),甚至更優選地至少75%(w/w),諸如在固體基礎上為至少90%(w/w)的非脂乳固體。

在本發明的一些實施例中,該乳源性組合物包含總量在固體基礎上為100%(w/w)的非脂乳固體。

在本發明的一些優選實施例中,該乳源性組合物具有相對于該組合物的總重量在2%-30%(w/w)范圍內,優選地在4%-20%(w/w)范圍內,且甚至更優選地在6%-16%(w/w)范圍內,例如像相對于該組合物的總重量在7%-14%(w/w)范圍內的固體含量。

該乳源性組合物通常包含總量相對于非脂乳固體的總量在5%-80%(w/w)范圍內的乳糖。

該乳源性組合物相對于該組合物的總重量可例如包含總量為至多10%(w/w)的乳糖。優選地,該乳源性組合物包含總量為至多7%(w/w)的乳糖。例如,該乳源性組合物相對于該組合物的總重量可包含總量為至多5%(w/w),諸如至多3%(w/w)的乳糖。

除受GOS合成影響的酶和碳水化合物以外,該乳源性組合物可包含相同濃度的與液體乳產品相同的組分。因此,各種組分和它們在液體乳產品的語境中描述的濃度范圍可按相同濃度范圍存在于該乳源性組合物中。

該乳源性組合物可例如為選自下組的組合物,該組由以下各項組成:全脂乳、低脂乳、脫脂乳、酪乳、復配乳粉、煉乳、UHT乳、乳清、乳清滲透物和奶油。

在本發明的一些優選實施例中,該乳源性組合物為選自下組的組合物,該組由以下各項組成:全脂乳、低脂乳、脫脂乳、酪乳、復配乳粉、煉乳、UHT乳和奶油。

在本發明的另一個實施例中,步驟a)的乳源性組合物包含至多40%w/w乳脂。這樣一種乳源性組合物的實例為攪打奶油。

在本發明的又一個實施例中,步驟a)的乳源性組合物包含至多20%w/w乳脂。這樣一種乳源性組合物的實例為含約18%w/w乳脂的淡奶油/稀奶油。

在本發明的又一實施例中,步驟a)的乳源性組合物包含至多4%w/w乳脂。這樣一種乳源性組合物的實例為通常含2%-4%w/w乳脂,且優選地約3%w/w乳脂的全脂乳。

在本發明的又一實施例中,步驟a)的乳源性組合物包含至多2%w/w乳脂。這樣一種乳源性組合物的實例為通常含0.7%-2%w/w乳脂,且優選地1%-1.5%w/w乳脂的半脫脂乳。

在本發明的一個另外的實施例中,步驟a)的乳源性組合物包含至多0.7%w/w乳脂。這樣一種乳源性組合物的實例為通常包含0.1%-0.7%w/w乳脂,且優選地0.3%-0.6%w/w乳脂,諸如約0.5%w/w乳脂的脫脂乳。

在本發明的一個優選實施例中,步驟a)的乳源性組合物包含至多0.1%w/w乳脂。

該乳源性組合物另外可包含一種或多種食品成分。此類食品成分的實例為甜味劑、調味劑、pH緩沖劑、穩定劑、著色劑、抗氧化劑、乳化劑、礦物質和維生素。

甜味劑可以包括碳水化合物甜味劑,例如像蔗糖、果糖、麥芽糖和/或甘露糖,將它們添加到已經存在于乳源性組合物中的乳糖里。

可替代地或另外地,甜味劑可以包括一種或多種糖醇,例如像山梨醇、甘露醇和/或木糖醇。

可替代地或另外地,甜味劑可以包括一種或多種高強度甜味劑,例如像阿斯巴甜、安賽蜜、三氯蔗糖、糖精、阿力甜和/或紐甜。

步驟c)包括使該乳源性組合物與該酶接觸,意味著該酶和乳源性組合物被布置成這樣,使得該酶能夠將該乳源性組合物的乳糖轉化為GOS。

在本發明的一些優選實施例中,將該酶簡單混合于該乳源性組合物中,且因此將形成所形成的含GOS的乳源性組合物的活性或失活形式部分。

在本發明的其他優選實施例中,將該酶附接至固體相,可使該固體相與該乳源性組合物接觸,并且隨后再次從該乳源性組合物移除。在此類實施例中,含GOS的乳源性組合物不含酶或只含痕量酶。

該乳源性組合物在步驟c)期間的溫度優選地在0℃-10℃的范圍內。例如,該乳源性組合物在步驟c)期間的溫度可在2℃-8℃的范圍內。該乳源性組合物在步驟c)期間的溫度可例如在3℃-6℃的范圍內。

如應被技術人員領會到的,將乳源性組合物的溫度帶到10℃以上的極小、短暫的溫度波動是可接受的,只要它們不為增加的細菌生長或新陳代謝提供基礎。

步驟c)的接觸持續時間取決于若干因素,包括使用多少酶和應將多少乳糖轉化為GOS。

該酶與該乳源性組合物間的接觸持續時間可例如為至多48小時。優選地,該酶與該乳源性組合物間的接觸持續時間為至多24小時。甚至更優選地,該酶與該乳源性組合物間的接觸持續時間為至多12小時。

例如,該酶與該乳源性組合物間的接觸持續時間可例如在0.1-48小時范圍內。該酶與該乳源性組合物間的接觸持續時間可例如在1-24小時范圍內??商媧?,該酶與該乳源性組合物間的接觸持續時間可在1-16小時范圍內,諸如在6-14小時范圍內。

當將該酶與該乳源性組合物混合時,該乳源性組合物可在不影響所得乳產品的感官性質的情況下包含多少酶存在上限。

在本發明的一些優選實施例中,該酶以1-10000ppm范圍內的量添加至該乳源性組合物中。例如,該酶可以1-1000ppm范圍內的量添加至該乳源性組合物中。該酶可例如以1-100ppm范圍內的量添加至該乳源性組合物中。

然而,如果該酶在與該乳源性組合物接觸時形成酶反應器的一部分,可利用極高的酶活性,且在此類情況中,該酶與該乳源性組合物間的接觸持續時間可例如在0.1-2小時范圍內。例如,該酶與該乳源性組合物間的接觸持續時間可在0.2-1.5小時范圍內??商媧?,該酶與該乳源性組合物間的接觸持續時間可在0.1-1小時范圍內,諸如在0.2-0.8小時范圍內。

優選地,該酶與該乳源性組合物間的接觸持續時間足以轉化該乳源性組合物的至少20%乳糖,從而將該乳源性組合物中乳糖的起始量減少至80%(w/w)。例如,如果步驟a)中所提供的乳源性組合物的乳糖含量為3.0%,因此優選的是,在步驟c)的酶處理后至少20%已被轉化,且留下至多80%(對應2.4(w/w)乳糖)。

例如,該酶與該乳源性組合物間的接觸持續時間可足以轉化該乳源性組合物的至少40%乳糖。該酶與該乳源性組合物間的接觸持續時間可例如足以轉化該乳源性組合物的至少60%乳糖??商媧?,該酶與該乳源性組合物間的接觸持續時間可例如足以轉化該乳源性組合物的至少70%乳糖。

甚至更高水平的乳糖轉化可以是優選的,因此,該酶與該乳源性組合物間的接觸持續時間可足以轉化該乳源性組合物的至少80%乳糖。例如,該酶與該乳源性組合物間的接觸持續時間可例如足以轉化該乳源性組合物的至少90%乳糖??商媧?,該酶與該乳源性組合物間的接觸持續時間可例如足以轉化該乳源性組合物的至少95%乳糖。

在本發明的一些優選實施例中,該酶與該乳源性組合物間的接觸持續時間足以轉化該乳源性組合物的20%-90%范圍內的乳糖。該酶與該乳源性組合物間的接觸持續時間可例如足以轉化該乳源性組合物的30%-70%范圍內的乳糖??商媧?,該酶與該乳源性組合物間的接觸持續時間可足以轉化該乳源性組合物的40%-60%范圍內的乳糖。

諸位發明人已發現,當試圖轉化含GOS的乳源性組合物的殘留乳糖時,單糖含量顯著增加,導致所得液體和粉末狀乳產品具有較差的穩定性。

因此,該酶與該乳源性組合物間的接觸持續時間優選地足以轉化該乳源性組合物的至多70%乳糖。

例如,該酶與該乳源性組合物間的接觸持續時間可足以轉化該乳源性組合物的至多60%乳糖。該酶與該乳源性組合物間的接觸持續時間可例如足以轉化該乳源性組合物的至多50%乳糖??商媧?,該酶與該乳源性組合物間的接觸持續時間可例如足以轉化該乳源性組合物的至多45%乳糖。

該方法優選地包括使至少一些酶失活和/或將其移除,從而顯著減少β-半乳糖苷酶(水解酶活性兼轉半乳糖基活性)。優選地,步驟d)包括完全地或至少幾乎完全地使酶失活和/或將其移除。

諸位發明人已發現,僅冷卻酶并不停止其酶活性,且含活性酶的液體乳產品在低溫下的延長儲存將導致合成的GOS降解,且導致單糖含量增加。

該酶可例如通過熱失活而失活,例如通過將含GOS的乳源性組合物加熱至至少90℃的溫度持續至少10分鐘。例如,可將含GOS的乳源性組合物加熱至至少95℃的溫度持續至少10分鐘。

熱失活也可以包括例如從80℃開始的低溫。β-半乳糖苷酶可例如通過將含GOS的乳源性組合物加熱至至少80℃的溫度持續至少2分鐘而失活。例如,可將含GOS的乳源性組合物加熱至至少85℃的溫度持續至少5分鐘??商媧?,可將含GOS的乳源性組合物加熱至至少80℃的溫度持續至少10分鐘。

可替代地或另外地,步驟d)可包括將從步驟c)獲得的該含GOS的乳源性組合物加熱至至少140℃持續至少0.1秒,例如像至少1秒。

加熱處理步驟也可以包括高溫處理,該高溫處理包括將含GOS的乳源性組合物加熱至至少140℃的溫度持續至多5秒。例如,高溫處理可包括將含GOS的乳源性組合物加熱至140℃-160℃范圍內的溫度持續0.5-5秒范圍內的持續時間。高溫處理可例如包括將含GOS的乳源性組合物加熱至150℃-180℃范圍內的溫度持續0.1-1秒范圍內的持續時間??商媧?,高溫處理可包括將含GOS的乳源性組合物加熱至160℃-180℃范圍內的溫度持續0.1-0.5秒范圍內的持續時間。

可替代地或另外地,該酶可通過使含GOS的乳源性組合物經受壓力失活而失活。

優選地,失活提供該酶的至少90%的β-半乳糖苷酶活性的降低。例如,失活可提供該酶的至少95%的β-半乳糖苷酶活性的降低。失活可例如提供該酶的至少99%的β-半乳糖苷酶活性的降低??商媧?,失活可提供該酶的至少99.9%的β-半乳糖苷酶活性的降低。

已經受步驟d)的含GOS的乳源性組合物優選地具有至多1LAU/kg的β-半乳糖苷酶活性。例如,它可具有至多0.1LAU/kg的β-半乳糖苷酶活性。已經受步驟d)的含GOS的乳源性組合物可例如具有至多0.01LAU/kg的β-半乳糖苷酶活性??商媧?,已經受步驟d)的含GOS的乳源性組合物可例如具有至多0.001LAU/kg的β-半乳糖苷酶活性。

β-半乳糖苷酶活性(以單位LAU計)的測定優選地利用WO 2013/182686中所述的方法3來進行。包括可干擾分析的酪蛋白膠束的顆粒物優選地通過過濾移除。

除用于GOS合成的β-半乳糖苷酶的失活以外,此類溫度處理還降低內源性乳酶如纖溶酶及其酶原纖溶酶原的活性。

酶失活步驟應優選地使經處理液體的纖溶酶和纖溶酶原的組合活性相對于未經處理液體的活性降低至少60%,優選地至少65%,且甚至更優選地至少70%。

組合活性是液體乳產品中纖溶酶的活性加上可從將纖溶酶原轉化為纖溶酶所獲得的活性的量度。根據WO 2012/010699A1的實例I中所述分析G來測定組合活性。

本發明的一些實施例要求甚至更低水平的組合纖溶酶和纖溶酶原活性,且對于此類實施例,酶失活步驟應優選地使經處理液體的纖溶酶和纖溶酶原的組合活性相對于未經處理液體的活性降低至少80%,優選地至少85%,且甚至更優選地至少90%。

在本發明的優選實施例中,酶失活步驟應使經處理液體的纖溶酶和纖溶酶原的組合活性相對于未經處理液體的活性降低至少95%,優選地至少97.5%,且甚至更優選地至少99%。

在本發明的一些實施例中,該液體乳產品的纖溶酶和纖溶酶原的組合活性為至多8.000微單位/mL,優選地至多5.000微單位/mL,且甚至更優選地至多3.000微單位/mL。

在本發明的上下文中,一單位(U)的纖溶酶活性是在25℃、pH 8.9下,利用Chromozyme PL(對甲苯磺?;?Gly-Pro-Lys-4-苯基重氮酸乙酸酯)作為底物,每分鐘可產生1微摩爾對硝基苯胺的纖溶酶活性。

在本發明的其他優選實施例中,該液體乳產品的纖溶酶和纖溶酶原的組合活性為至多2.500微單位/mL,優選地至多1.000微單位/mL,且甚至更優選地至多750微單位/mL。甚至優選的是,該液體乳產品的纖溶酶和纖溶酶原的組合活性為至多600微單位/mL,優選地至多400微單位/mL,且甚至更優選地至多200微單位/mL。

在本發明的一些優選實施例中,將從步驟d)獲得的含GOS的乳源性組合物轉化為粉末。

這種轉化可例如通過常見的干燥技術例如像冷凍干燥或噴霧干燥來進行。

在本發明的一些實施例中,步驟d)構成噴霧干燥方法的一部分,意味著通常用于噴霧干燥方法的預加熱和/或加熱有助于酶的熱失活。

在本發明的其他實施例中,熱失活包括獨立步驟d)和步驟e)中的后續噴霧干燥,在這種情況下,噴霧干燥可有助于酶的另外的熱失活。

可利用常用于乳產品的噴霧干燥的相同參數進行噴霧干燥。入口空氣的溫度可例如在150℃-200℃范圍內,諸如在160℃-180℃范圍內。

在本發明的一些優選實施例中,最后例如以液體或粉末形式包裝含GOS的乳源性組合物。

在這種情況下,液體或粉末形式的含GOS的乳源性組合物組成該液體或粉末狀乳產品。

步驟f)的包裝可例如為無菌包裝,即液體或粉末狀乳相關產品在無菌條件下包裝。例如,無菌包裝可以通過使用無菌填充系統來進行,并且它優選地涉及將乳填充到一個或多個無菌容器中。

包裝通常在室溫或室溫以下進行。因此,包裝過程中液體或粉末狀乳產品的溫度通常為至多30℃,優選地至多25℃,且甚至更優選地至多20℃。

包裝過程中液體或粉末狀乳產品的溫度可例如在0℃-30℃范圍內。

當前優選的是,包裝過程中液體或粉末狀乳產品的溫度在1℃-10℃范圍內。液體乳產品可例如被包裝在消費者會購買的容器中。此類容器的有用但非限制性實例為瓶、罐、袋、小袋或小囊。

同樣,粉末狀乳產品可被包裝在消費者會購買的容器中。此類容器的有用但非限制性實例為罐、袋、小袋或小囊。

本發明的又一個方面涉及一種生產食物產品(包括飲料和固體食品兩者)的方法,該方法包括以下步驟:

i)提供含GOS的液體乳產品和/或含GOS的粉末狀乳產品,

ii)任選地,提供一種或多種另外的成分,

iii)將該含GOS的乳產品和任選地還有一種或多種另外的成分轉化為該食物產品,并且

iv)任選地,包裝該食物產品。

將乳產品和其他成分轉化為食物產品的一般方法為本領域技術人員所熟知。

本發明的另一個方面涉及一種含有含GOS的乳產品的食物產品。例如,該食物產品可以是通過上述生產食物產品的方法可獲得的。

在本發明的一些實施例中,該食物產品是酸化乳制品。酸化乳制品可例如為酸奶或酸奶油。如果酸化乳制品是酸奶,它可以是凝固型酸奶、攪拌型酸奶或飲用型酸奶。

在本發明的一些實施例中,該食物產品是奶酪。奶酪可例如是白奶酪、黃奶酪、新鮮奶酪(奶油奶酪)或加工奶酪。

在本發明的一些實施例中,該食物產品是飲料。例如,飲料可為風味乳、液體代餐或乳清飲料。

在本發明的一些實施例中,該食物產品是固體食物產品。例如,固體食物產品可以為蛋白棒、代餐或乳面食。

本發明的又一個方面涉及如本文所定義的β-半乳糖苷酶,該β-半乳糖苷酶優選地具有:

-至多0.6的T-值,和/或

-之間的比例至少為1的轉半乳糖基活性與水解酶活性,

在生產減乳糖乳產品中的用途,以降低最終乳產品中的美拉德反應水平和/或延長最終乳產品的保質期。

該用途可例如涉及生產作為經過UHT處理的低乳糖乳或無乳糖乳的乳產品。在本發明的上下文中,術語“低乳糖乳”涉及含至多1g乳糖/100g乳的乳,且無乳糖乳涉及含至多0.1g乳糖/100g乳,且優選地至多0.01g乳糖/100g乳的乳。

實例

實例1根據本發明的液體乳產品的生產

將3個10mL含5%(w/w)乳糖的巴氏滅菌脫脂乳樣品加熱至4℃、6℃和8℃,并與10微升含BIF917的酶溶液混合(BIF917及其制備描述在WO2013/182686中)。

在用酶孵育20和24小時后取1mL子樣品。

將卡瑞(Carrez)試劑1&2以足以使得所有固體凝聚的量添加至子樣品中。利用標準濾紙過濾后續雙相混合物,并利用一次性PTFE微過濾器(0.45微米)再次過濾。此時,使澄清溶液經受加熱,以使任何剩余的蛋白質變性,經受離子交換固相萃取。然后將糖類的最終澄清溶液放在HPLC小瓶中并分析。

使用的HPLC方法如下:

系統:安捷倫(Agilent)

柱安捷倫HiPlex Na聚合離子交換柱

洗脫液:MilliQ水

柱:溫度:85℃

流速:0.2mL/min

壓力:21巴(對這種柱而言最大為25)

檢測器:RID,在35℃下

量化是基于峰面積和已知的乳糖濃度?;辜撲懔慫刑塹南煊ο凳?。先前已經利用來自英國卡博森斯(Carbosynth UK)的單糖以及DP2、DP3和DP4低聚糖的分析標準物測定了低聚糖的保留時間。

結果:

子樣品都包含大量的GOS,且很明顯,盡管孵育溫度較低,BIF917仍保留其轉半乳糖基活性。

出乎意料地,所有樣品中的GOS收率都高于1.0%(w/w)(且相對于碳水化合物的總量高于20%(w/w)),且單糖的總量低于2.2%(w/w)(相對于碳水化合物的總量為43%(w/w))。

圖1中示出了與在8℃下孵育的樣品有關的結果??梢鑰吹?,24h子樣品中的GOS收率為約1.4%(w/w)(相對于碳水化合物的總量為約27%(w/w)),且單糖的總量為約2.1%(w/w)(相對于碳水化合物的總量為42%(w/w))。

下表中示出了樣品在20h和24h后的詳細碳水化合物組成:

表1 20h乳樣品和24h乳樣品的碳水化合物組成的表征

值得注意的是,考慮到該乳是在8℃下通過合成產生,該乳包含出乎意料高的GOS含量和高含量的GOS-DP3+餾分。此外,葡萄糖與半乳糖間的比例出乎意料的高。

諸位發明人已觀察到,通過延長用酶孵育的持續時間可甚至進一步降低乳糖水平,同時維持GOS-DP3+的總含量>1.0%(w/w),并且維持葡萄糖與半乳糖間的重量比為至少3:1。此外,他們已觀察到,在較低溫度如4℃下孵育也提供具有與在8℃下孵育獲得的同樣吸引人的特性的液體乳產品。

已經評估了如上所述制備的乳樣品的感官性質,且據報道,嘗起來比基于乳糖完全水解的減乳糖乳更像乳且更不甜。

諸位發明人還看到以下跡象:由上述方法產生的產品提供具有更好長期穩定性的產品,例如,歸因于更為有利的碳水化合物譜,且歸因于酶促加工是在至多10℃而不是現有技術中視為正常范圍的40℃-45℃下進行的事實。

實例2根據本發明的經過UHT處理的液體乳產品或粉末狀乳產品的生產

在控溫罐中將100kg巴氏滅菌脫脂乳(5%乳糖,0.1%乳脂)加熱至8℃,并與100g用于實例1的含BIF917的相同酶溶液混合。允許將該混合物在儲罐中、在嚴格溫度控制下孵育24小時,并且然后經受熱處理(95℃持續10分鐘),以使BIF917酶失活。隨后將所獲得的含GOS的乳冷卻至5℃。

通過標準噴霧干燥,利用180℃的入口空氣溫度將50kg含GOS的乳轉化為含GOS的乳粉。該含GOS的乳粉含約4%(w/w)水。

使50kg含GOS的乳在143℃下經UHT處理2秒,并且隨后無菌地填充在1L燒瓶中。

將經過UHT處理的含GOS的乳和含GOS的乳粉兩者的包裝樣品儲存在25度下,并針對化學穩定性和感官性質變化進行測試。

實例3與現有技術比較

已將實例1中所獲得的結果與通過羅德里格斯-科里納斯(Rodrigues-Colinas)2014所獲得的那些進行比較,并將比較數據呈現在表2中。

表2實例1的乳樣品與羅德里格斯-科里納斯(Rodriguez-Colinas)2014中所獲得的含GOS的乳樣品相比的在20h和24h后的詳細碳水化合物組成(濃度數據已從g/mL轉換為g/100g,假定乳密度為1.03g/mL)。

羅德里格斯-科里納斯(Rodriguez-Colinas)等人獲得的GOS(包括GOS-DP2)的最大收率為0.8%(w/w),對應于約15%的總碳水化合物,并獲得它,且仍然有2.4%(w/w)乳糖留在乳樣品中,因此沒有資格成為低乳糖乳。應當指出的是,如果羅德里格斯-科里納斯(Rodriguez-Colinas)等人嘗試通過進一步的酶促作用來降低表2中描述的乳的乳糖水平(生物乳糖酶,4℃),那么將降低GOS的濃度,且將顯著增加單糖的含量。

此外,值得注意的是,羅德里格斯-科里納斯(Rodriguez-Colinas)2014的Glc/Gal比為1.8,即明顯小于2:1。此外,羅德里格斯-科里納斯(Rodriguez-Colinas)2014的乳樣品只含痕量GOS-DP4,且不含GOS-DP5或GOS-DP6。實例4β-半乳糖苷酶T-值的測定

根據下文給出的分析和公式測定β-半乳糖苷酶的T-值。

分析:

制備3.3mL由待測試的β-半乳糖苷酶、10mM檸檬酸鈉、1mM檸檬酸鎂、1mM檸檬酸鈣、Milli-Q水(密理博(Millipore),美國)組成且具有6.5的pH的酶溶液。該酶溶液應包含量足以在本分析條件下在1小時內使用33%(w/w)外加乳糖的β-半乳糖苷酶。該酶溶液的溫度應為37℃。

在時間=T0時,向該酶溶液中添加82.5mg乳糖一水合物(關于生物化學,德國默克(Merck Germany))并與之混合,并且隨后該混合物在37℃下孵育4小時。在T0后恰好1小時,收集100微升樣品,并用Milli-Q水以1:5稀釋,并通過加熱至95℃持續10min來失活。將失活混合物保持在–20℃下,直到進行表征。

表征:

所產生的半乳糖的量(以mol計)和所使用的乳糖的量(以mol計)的測定可利用任何合適的分析技術來進行。例如,可通過HPLC,根據里奇蒙(Richmond)等人(通過高效液相色譜法分離乳制品中的碳水化合物(Separation of Carbohydrates in Dairy Products by High Performance Liquid Chromatography),乳制品科學期刊(J.of Dairy Science),65(8),1394-1400,1982)和西姆斯(Simms)等人(通過高效液相色譜法分離乳糖、乳糖酸和乳糖酸乳糖(Separations of lactose,lactobionic and lactobionolactose by high performance liquid chromatography).色譜法期刊(J.of Chromatography),667,67-73.,1994)所述的方法來分析經稀釋的混合物。

合適的分析技術的另一個實例為ISO 5765-2:2002(IDF 79-2:2002)“奶粉、干冰混合物和加工奶酪–乳糖含量的測定–第2部分:利用乳糖的半乳糖部分的酶催化方法(Dried milk,dried ice-mixes and processed cheese–Determination of lactose content–Part 2:Enzymatic method utilizing the galactose moiety of the lactose)”。

T-值的計算:

根據以下公式,利用從該分析的經稀釋混合物的表征獲得的數據計算T-值:

實例-BIF917酶的T-值:

利用WO 2013/182686的BIF917酶進行上述分析。

通過分析型HPLC,針對被轉化(即被使用)的乳糖和所生成的半乳糖分析從該分析所獲得的經稀釋混合物。HPLC裝置來自沃特斯(Waters),且配備有差示折射計(RI-檢測器)和BioRad Aminex HPX-87C柱(300x 7.8mm,125-0055)。用0.05g/L乙酸鈣、0.3mL/min.的流速和20微升的注射體積進行糖類等度洗脫。

通過自動化軟件對所獲得的數據進行了適當基線校正,單獨地確定峰并進行整合。通過使用乳糖一水合物(關于生物化學,默克,德國)、D-(+)-葡萄糖一水合物(關于生物化學,默克歐洲實驗室(Merck Eurolab),法國)和D-(+)-半乳糖(≥99%,西格瑪-奧德里奇(Sigma-Aldrich),意大利)的外部標準物進行量化。

從量化數據計算每個時間T的乳糖轉化和半乳糖形成。在時間T=1h時,收集的100微升樣品中29%的乳糖已經轉化,這對應于2.3微摩爾乳糖。在時間T=1時,收集的100微升樣品中已經形成0.5微摩爾半乳糖。因此,T-值可計算為0.5微摩爾/2.3微摩爾=0.2。

還通過酶催化方法ISO 5765-2,針對被轉化(即被使用)的乳糖和所生成的半乳糖分析從該分析所獲得的經稀釋混合物。使用來自拜發(R-Biopharm)的寶靈曼(Boehringer Mannheim)乳糖/D-半乳糖測試試劑盒(目錄號10 176303 035),并根據方案進行測試。酶催化方法確認BIF917酶的T-值為0.2。

實例-常規乳糖酶的T-值:

利用可商購獲得的常規乳糖酶Lactozym Pure 2600L(諾維信(Novozymes),丹麥)進行上述分析。如針對BIF917酶所述的分析從該分析獲得的經稀釋混合物。三糖和四糖不以可檢測的量存在,且觀察到等量的葡萄糖和半乳糖。相應的T-值為1。

還測定了來自大腸桿菌(Escherichia coli)(產品編號:G6008,西格瑪-奧德里奇,德國)和米曲霉(Aspergillus oryzae)(產品編號:G5160,西格瑪-奧德里奇,德國)的可商購獲得的β-半乳糖苷酶的T-值,且兩種酶都具有約1.0的T-值。

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含低聚 半乳糖 單糖 乳糖 產品 以及 生產 方法
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