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维戈塞尔塔对毕尔: 一種體外抗鴨病毒性肝炎轉移因子的制備方法.pdf

摘要
申請專利號:

维戈塞尔塔vs皇家社会 www.vmyqew.com.cn CN201210136303.7

申請日:

20120504

公開號:

CN102697808A

公開日:

20121003

當前法律狀態:

有效性:

失效

法律詳情:
IPC分類號: A61K35/14,A61K35/28,A61K38/00,A61P37/04,A61P31/14 主分類號: A61K35/14,A61K35/28,A61K38/00,A61P37/04,A61P31/14
申請人: 鄭州后羿制藥有限公司
發明人: 吳紅云,郭俊清
地址: 451162 河南省鄭州市鄭州航空港區新港大道東側
優先權: CN201210136303A
專利代理機構: 鄭州睿信知識產權代理有限公司 代理人: 牛愛周
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法律狀態
申請(專利)號:

CN201210136303.7

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法律狀態公告日:

法律狀態類型:

摘要

本發明涉及一種體外抗鴨病毒性肝炎轉移因子的制備方法,利用體外淋巴細胞培養方式,經過鴨肝炎病毒的誘導制備抗鴨病毒性肝炎轉移因子。本發明是以雞脾臟或外周血液為基礎原料,制備單層淋巴細胞,經植物血凝素和鴨肝炎病毒誘導培養單層淋巴細胞,從而促進體外產生大量抗鴨肝炎病毒特異轉移因子。該轉移因子能夠有效的抑制鴨病毒性肝炎病毒,使正常的機體免受鴨病毒性肝炎的感染,起到根本的預防作用。本發明方法方法具有簡單、易操作等特點。

權利要求書

1.一種體外抗鴨病毒性肝炎轉移因子的制備方法,其特征在于:以雞脾臟或外周血液為基礎原料,制備單層淋巴細胞,經植物血凝素和鴨肝炎病毒誘導培養單層淋巴細胞,從而促進體外產生大量抗鴨肝炎病毒特異轉移因子,具體步驟如下:1)淋巴細胞的制備:首先選擇健康雞,在無菌的條件下采取雞脾臟或雞抗凝血,制成單層淋巴細胞;2)淋巴細胞的培養:淋巴細胞進行傳代培養,以單層形式傳代,備用;3)病毒的接種:將鴨肝炎病毒接種于9-10日齡雞胚的尿囊腔內,37℃培養72-120h增殖病毒,將尿囊液收集,然后經過超聲波破碎處理后離心,留沉淀,根據病毒的粒子大小利用密度梯度高速離心,得到較為純病毒;4)轉移因子的制備:經過植物血凝素和鴨肝炎病毒誘導培養單層淋巴細胞,即得抗鴨病毒性肝炎轉移因子。2.根據權利要求1所述的一種體外抗鴨病毒性肝炎轉移因子的制備方法,其特征是:步驟1)所述雞脾細胞制備過程中胰酶濃度要求0.22-0.25%,pH為7.3-7.6,用量為組織體積量的5-7倍。3.根據權利要求1所述的一種體外抗鴨病毒性肝炎轉移因子的制備方法,其特征是:步驟4)所述促進雞脾臟細胞或血淋巴細胞分化增殖的植物凝血素使用濃度為60-180mg/L。

說明書

技術領域

本發明涉及一種體外抗鴨病毒性肝炎轉移因子的制備方法,屬于免疫學領域。

背景技術

鴨病毒性肝炎是由鴨肝炎病毒(DVH)引起的雛鴨一種急性高度致死性傳染病,這種病的特點是發病急、病程短、傳染快、發病率與死亡率都比較高的疾病,給養殖業帶來重大經濟損失。

轉移因子(TF,Transfer?Factor)又稱傳輸因子,可以作為細胞免疫促進劑,是T淋巴細胞釋放的一種能夠轉移致敏信息的低分子量多肽-核苷酸復合物,這種物質將供體的某種特定的細胞免疫功能特異地轉移給受體正常的淋巴細胞,參與機體的免疫反應,提高受體的細胞免疫功能;同時促進B淋巴細胞分泌作用,能夠誘導免疫細胞釋放干擾素和白介素,從而增強受體的抵抗力,這種轉移因子分子量小、無毒、活性強、無抗原性、不起過敏反應等優點,對于治療動物病毒性疾病、細胞免疫減弱或缺陷病以及惡性腫瘤、真菌性疾病時,可以起輔助治療作用。

盡管目前已經有一些抗鴨病毒性肝炎的藥品和制劑,但由于現有的藥品制劑針對性不強,療效有限,而且治療性的制劑多是在發病之后才應用的,不能起到根本的治療作用。

目前已報道的轉移因子的提取方法大多關于非特異性轉移因子的制備方法,而且多是體內轉移因子免疫法的制備方法。

發明內容

本發明的目的是提供一種體外抗鴨病毒性肝炎轉移因子的制備方法。

本發明所采用的技術方案如下:一種體外抗鴨病毒性肝炎轉移因子的制備方法,以雞脾臟或外周血液為基礎原料,制備單層淋巴細胞,經植物血凝素(Phytohemagglutinin,PHA)和鴨肝炎病毒誘導培養單層淋巴細胞,從而促進體外產生大量抗鴨肝炎病毒特異轉移因子。

本發明制備方法的具體步驟如下:

1)淋巴細胞的制備:首先選擇健康雞,在無菌的條件下采取雞脾臟或抗凝血,制成單層淋巴細胞;

2)淋巴細胞的培養:淋巴細胞進行傳代培養,以單層形式傳代,備用;

3)病毒的接種:將鴨肝炎病毒接種于9-10日齡雞胚的尿囊腔內,37℃培養72-120h增殖病毒,將尿囊液收集,然后經過超聲波破碎處理后離心,留沉淀,根據病毒的粒子大小利用密度梯度高速離心,得到較為純病毒;

4)轉移因子的制備:經過植物血凝素和鴨肝炎病毒誘導培養單層淋巴細胞,即得抗鴨病毒性肝炎轉移因子。

步驟1)所述雞脾細胞制備過程中胰酶濃度要求0.22-0.25%,pH為7.3-7.6,用量為組織體積量的5-7倍。

步驟4)所述促進雞脾臟細胞或血淋巴細胞分化增殖的植物凝血素使用濃度為60-180mg/L。

本發明關于體外制備的抗鴨病毒性肝炎轉移因子能夠高效的抑制鴨病毒性肝炎病毒,?;ふ;逑赴饈苧疾《拘愿窩椎母腥?,達到根本上預防的作用。這種通過傳代培養可以生產出大量的產品,出產率高,成本低,可以節約大量的人力、物力,可避免產品攜帶外援病毒及其他病源微生物。這制備方法具有簡單、易操作、生產成本低等特點。

具體實施方式

????結合具體實施例對本發明的內容作進一步的說明。

實施例1

一種體外抗鴨病毒性肝炎轉移因子的制備方法,本實施例是以雞外周血液為基礎原料,制備單層淋巴細胞,經植物血凝素和鴨肝炎病毒誘導培養單層淋巴細胞,從而促進體外產生大量抗鴨肝炎病毒特異轉移因子,具體步驟如下:

1.抗凝血的采集:選擇健康無傳染病雞,采血部位消毒,用50mL的無菌注射器,心臟采集抗凝血,加入濃度為1mg/mL的肝素鈉5mL;

2.淋巴細胞分離:抗凝血與淋巴細胞分離液(購買北京普利生物有限公司,按使用說明操作)按1:1的比例加入消毒后的離心管中,淋巴細胞分離液加到離心管的底部,3000r/min離心15min,收集中間的白色層;然后用pH7.0的Hanks液反復清洗淋巴細胞4次,5000r/min,離心10min,收集沉淀,用含30%的犢牛血清DMEM(購買Invitrogen?Corporation,按使用說明操作)80mL充分混勻,然后分裝于100mL的細胞培養瓶中,置于5%?CO2,37℃恒溫箱中培養,經2天的培養,淋巴細胞貼壁生長形成單層;

3.淋巴細胞的培養:單層淋巴細胞進行傳代培養,首先將長成單層淋巴細胞層用0.22%的胰酶37℃短時間消化,吹打分散,加入pH7.0的Hanks液終止,再洗3遍,取1/3加入到干凈培養瓶,5%?CO2,37℃恒溫培養,每天觀察一次,長成單層為止;

4.病毒的接種:將鴨肝炎病毒接種于9日齡雞胚的尿囊腔中,37℃培養72h增殖病毒,將尿囊液收集,然后經過超聲波破碎處理后離心,留沉淀,根據病毒的粒子大小利用密度梯度高速離心,得到較為純病毒;

5.誘導培養:當單層淋巴細胞長成后,更換成維持液(含5%犢牛血清DMEM),同時加入濃度為60mg/L的植物血凝素,鴨肝炎病毒(濃度為1280血凝單位/mL)進行誘導培養;經過3天的誘導培養,然后將細胞瓶經過微振蕩,將培養液移置于離心管中離心,收集上清液;

6.轉移因子的制備:上清液利用超聲波細胞破碎儀(工作狀態:破碎3s停3s,?400W,10?min)破碎后,離心取上清,經0.22um濾膜過濾,濾液經過截留分子量為6000道爾頓的中空纖維膜超濾,利用正向壓力超濾,收集濾液再次過濾除菌,分裝,即得抗鴨病毒性肝炎轉移因子。

實施例2

一種體外抗鴨病毒性肝炎轉移因子的制備方法,本實施例是以雞外周血液為基礎原料,制備單層淋巴細胞,經植物血凝素和鴨肝炎病毒誘導培養單層淋巴細胞,從而促進體外產生大量抗鴨肝炎病毒特異轉移因子,具體步驟如下:

1.抗凝血的采集:選擇健康無傳染病雞,采血部位消毒,用50mL的無菌注射器,心臟采集抗凝血,加入濃度為1mg/mL的肝素鈉5mL;

2.淋巴細胞分離:抗凝血與淋巴細胞分離液(購買北京普利生物有限公司,按使用說明操作)按1:1的比例加入消毒后的離心管中,淋巴細胞分離液加到離心管的底部,2500r/min離心20min,收集中間的白色層;然后用pH7.2的Hanks液反復清洗淋巴細胞4次,4000r/min,離心10min,收集沉淀,用含30%的犢牛血清DMEM(購買Invitrogen?Corporation,按使用說明操作)80mL充分混勻,然后分裝于100mL的細胞培養瓶中,置于5%?CO2,37℃轉瓶機中培養,經3天的培養,淋巴細胞貼壁生長形成單層;

3.淋巴細胞的培養:單層淋巴細胞進行傳代培養,首先將長成單層淋巴細胞層用0.25%的胰酶37℃消化2?min,吹打分散,加入pH7.2的Hanks液終止,再洗2遍,取1/3加入到干凈培養瓶,5%?CO2,37℃恒溫培養,每天觀察一次,長成單層為止;

4.病毒的接種:將鴨肝炎病毒接種于10日齡雞胚的尿囊腔中,37℃培養96h增殖病毒,將尿囊液收集,然后經過超聲波破碎處理后離心,留沉淀,根據病毒的粒子大小利用密度梯度高速離心,得到較為純病毒;

5.誘導培養:當單層淋巴細胞長成后,更換成維持液(含5%犢牛血清DMEM),同時加入濃度為180mg/L的植物血凝素,鴨肝炎病毒(濃度為1280血凝單位/mL)進行誘導培養,經過3天的誘導培養,然后將細胞瓶經過微振蕩,將培養液移置于離心管中離心,收集上清液;

6.轉移因子的制備:上清液經過超聲波細胞破碎儀(工作狀態:破碎3s停3s,300W,10?min)破碎后,離心取上清,經0.22um濾膜過濾,濾液經過截留分子量為6000道爾頓的中空纖維膜超濾,利用正向壓力超濾,收集濾液再次過濾除菌,分裝,即得抗鴨病毒性肝炎轉移因子。

實施例3

一種體外抗鴨病毒性肝炎轉移因子的制備方法,本實施例主要包括雞脾臟制備單層淋巴細胞、添加植物血凝素和病毒誘導等步驟,具體步驟如下:

1.?脾臟的采集:選取健康無傳染病的雞,在無菌條件下摘取脾臟,然后用滅菌生理鹽水沖洗表面的血液及內臟表面液體,用酒精消毒表面,剔除臟器表面脂肪組織和筋膜,用無菌眼科剪和眼科鑷從脾臟內部取部分組織,置于30mL的燒杯中,然后將其剪碎成直徑小于0.1cm的塊,再用pH7.2的Hanks液清洗3次碎組織中的血液及雜質,盡可能保證組織干凈;

????2.?脾細胞制備:上述碎組織中加入5倍量的pH為7.3、濃度0.22%的胰酶液,放入37℃的水浴鍋中消化20min???,每5?min搖動一次,以便組織充分消化,直到組織變成透明,周邊發毛為止,說明消化完全,可以取出燒杯,吸取胰液,加入預熱維持液pH7.2的Hanks液,用吸管吹打70次充分使組織分散,然后經過濾留取濾液;

3.?淋巴細胞的培養:采用血球計數板進行計數,取濾液10uL,稀釋100倍,然后顯微鏡下觀察,與血細胞計數規則一樣,確定稀釋倍數;將用DMEM液稀釋后的濾液分裝于細胞培養瓶中,培養條件:5%?CO2、37℃恒溫箱上培養,每天觀察兩次,在顯微鏡下觀察是否形成單層細胞,確定傳代培養;

4.病毒的接種:將鴨肝炎病毒接種于9日齡雞胚的尿囊腔中,37℃培養120h增殖病毒,將尿囊液收集,然后經過超聲波破碎處理后離心,留沉淀,根據病毒的粒子大小利用密度梯度高速離心,得到較為純病毒;

5.誘導培養:傳代培養成單層淋巴細胞后,更換營養液為維持液,同時加入濃度為100mg/L植物血凝素和鴨肝炎病毒(濃度為1280血凝單位/mL),進行2天的誘導培養;

6.轉移因子的制備:利用超聲波細胞破碎儀(工作狀態:破碎3s停3s,?400W,10?min)破碎后,離心取上清,過濾,再經過截留分子量為6000道爾頓的中空纖維膜超濾,利用正向壓力超濾,收集濾液再次過濾除菌,分裝,即為抗鴨病毒性肝炎轉移因子。

實施例4

一種體外抗鴨病毒性肝炎轉移因子的制備方法,本實施例主要包括雞脾臟制備單層淋巴細胞、添加植物血凝素和病毒誘導等步驟,具體步驟如下:

1.?脾臟的采集:選取健康無傳染病的雞,在無菌條件下摘取脾臟,然后用滅菌生理鹽水沖洗表面的血液及內臟表面液體,用酒精消毒表面,剔除臟器表面脂肪組織和筋膜,用無菌眼科剪和眼科鑷從脾臟內部取部分組織,置于30mL的燒杯中,然后將其剪碎成直徑小于0.1cm的塊,再用pH7.0的Hanks液清洗3次碎組織中的血液及雜質,盡可能保證組織干凈;

????2.?脾細胞制備:上述碎組織中加入7倍量的pH為7.6、濃度0.25%的胰酶液,放入37℃的水浴鍋中消化30min???,每5?min搖動一次,以便組織充分消化,直到組織變成透明,周邊發毛為止,說明消化完全,可以取出燒杯,吸取胰液,加入預熱維持液pH7.0的Hanks液,用吸管吹打90次充分使組織分散,然后經過濾留取濾液;

3.淋巴細胞的培養:采用血球計數板進行計數,取濾液10uL,稀釋100倍,然后顯微鏡下觀察,與血細胞計數規則一樣,確定稀釋倍數;將用DMEM液稀釋后的濾液分裝于細胞轉瓶中,培養條件:5%?CO2、37℃恒溫箱上培養,每天觀察兩次,在顯微鏡下觀察是否形成單層細胞,確定傳代培養;

4.病毒的接種:將鴨肝炎病毒接種于10日齡雞胚的尿囊腔中,37℃培養120h增殖病毒,將尿囊液收集,然后經過超聲波破碎處理后離心,留沉淀,根據病毒的粒子大小利用密度梯度高速離心,得到較為純病毒;

5.誘導培養:傳代培養成單層淋巴細胞后,更換營養液為維持液,同時加入濃度為140mg/L植物血凝素和鴨肝炎病毒(濃度為1280血凝單位/mL),進行2天的誘導培養;

6.轉移因子的制備:利用超聲波細胞破碎儀(工作狀態:破碎3s停3s,?400W,10?min)破碎后,離心取上清,過濾,再經過截留分子量為6000道爾頓的中空纖維膜超濾,利用正向壓力超濾,收集濾液再次過濾除菌,分裝,即為抗鴨病毒性肝炎轉移因子。

實驗例1:動物?;な匝?

????取300只12日齡健康雛鴨,隨機分成對照、試驗、空白三組,每組100只,在新環境中適應三天,自由采食,攻毒劑量為1.0??108CFU/只,攻毒后第三天試驗組開始接種抗鴨病毒性肝炎轉移因子,每只肌注0.2ml/只,每天一次,對照組注射生理鹽,空白全程生理鹽水,觀察臨床癥狀和死亡率作為指標反應本品的臨床應用效果。結果顯示:對照組發病率100%和死亡率100%,空白組沒有變化,試驗組發病率25%,而死亡率3%。

實驗例2:動物安全試驗

取健康小白鼠150只,隨機分成空白、注射組、口服三組,每組50只,空白口服和注射蒸餾水2?ml/只,注射組注射本品5?ml/只,口服組灌服本品5?ml/只,觀察小白鼠的變化。結果顯示三組都無異常變化,說明本品安全,無不良反應。

實驗例3:皮膚刺激性試驗

取30只小白兔,分成對照、皮下注射、皮內注射2組,采用脫毛劑對家兔脊柱兩側被毛脫去,保證皮膚的完整性,然后注射本品1?ml/只,對照組注射生理鹽水,分成單次給藥、多次給藥觀察皮膚的變化。結果顯示,注射生理鹽水的10只中,有5只發生紅腫,一天消腫,試驗組中各有3只發生,12小時內全部消腫。

實驗例4

本實驗例采用各種常規方法對發明的抗鴨病毒性肝炎轉移因子的檢測:?

1、多肽含量的測定:用Folin-酚法或分光光度法測定多肽,以鴨外周血液為基礎原料多肽含量0.46g/L,以鴨脾臟為原料制備的轉移因子多肽含量0.39g/L。

2、蛋白質的測定:采用20%磺基水楊酸方法,提取液沒有發生渾濁和沉淀現象,呈陰性,不含蛋白質。

3、無菌檢測:根據《中華人民共和國獸藥典2011版》進行檢測,沒有細菌生長。

4、核糖含量測定:利用分光光度法測定,以鴨外周血液為基礎原料核糖含量0.34g/L,以鴨脾臟為原料制備的轉移因子核糖含量0.43g/L。

5、外觀及pH值測定:黃色澄明液體,酸度值為7.0-7.3之值。

通過以上實驗例,我們可以得到本發明所提取的抗鴨病毒肝炎轉移因子不僅能安全高效的抑制鴨病毒性肝炎病毒,還能夠?;ふ;逑赴饈苧疾《拘愿窩椎母腥?,提高機體的免疫力。本品的體外制備方法是可行的,這種發明方法不僅操作簡便,減小工作強度,生產成本低,應在臨床上廣泛推廣。?

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一種 體外 病毒性肝炎 轉移因子 制備 方法
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