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皇马与维戈塞尔塔历史交战: 一種培養表面多脂植物外植體的方法.pdf

摘要
申請專利號:

维戈塞尔塔vs皇家社会 www.vmyqew.com.cn CN201610576639.3

申請日:

20160720

公開號:

CN106106169B

公開日:

20181106

當前法律狀態:

有效性:

審查中

法律詳情:
IPC分類號: A01H4/00 主分類號: A01H4/00
申請人: 中國林業科學研究院林業研究所
發明人: 張冰玉,蘇曉華,常英英,黃秦軍
地址: 100091 北京市海淀區香山路東小府1號
優先權: CN201610576639A
專利代理機構: 北京中政聯科專利代理事務所(普通合伙) 代理人: 陳超
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法律狀態
申請(專利)號:

CN201610576639.3

授權公告號:

法律狀態公告日:

法律狀態類型:

摘要

本發明屬于生物技術領域,尤其是植物組織培養技術領域,公開了一種用于對表面多脂植物的外植體進行處理的溶脂混合液、采用該溶脂混合液對表面多脂植物的外植體進行處理的方法、以及一種培養楊樹等表面多脂植物外植體的方法。本發明將溶脂混合液用于溶解表面多脂植物外植體表面的樹脂,結合酒精及次氯酸鈉消毒處理,能夠有效清除表面多脂植物外植體表面的細菌及真菌,使外植體保持充足的活力。

權利要求書

1.一種用于對歐洲黑楊外植體進行處理的溶脂混合液,其為0.1%的吐溫20和10%的乙酸乙酯的水溶液。2.采用權利要求1所述的溶脂混合液對歐洲黑楊外植體進行處理的方法,其中包括采用溶脂混合液對外植體分別進行預處理和二次處理的步驟,所述預處理為采用溶脂混合液處理外植體2-3分鐘,用無菌水沖洗外植體1次,所述二次處理為采用溶脂混合液再次處理外植體2-3分鐘,用無菌水沖洗外植體2次。3.一種培養歐洲黑楊外植體的方法,其包括以下步驟:(1)外植體采集植株的培養;(2)外植體的選擇;(3)外植體的消毒滅菌:①外植體的清洗;②溶脂混合液預處理:采用溶脂混合液對外植體進行預處理2-3分鐘,用無菌水沖洗外植體1次;③溶脂混合液二次處理:采用溶脂混合液對外植體再次進行處理2-3分鐘,用無菌水沖洗外植體2次;④外植體的酒精滅菌;⑤外植體的次氯酸鈉滅菌;⑥無菌水清洗;(4)外植體的培養;其中所述溶脂混合液為0.1%的吐溫20和10%的乙酸乙酯的水溶液。4.根據權利要求3所述的方法,其中所述外植體采集植株的培養為將冬眠植株的穗條剪成15厘米的長度,插入營養缽中,移入溫室內進行培養,期間進行日常的肥水管理和病蟲害防治,所述的外植體為半木質化的新發枝條。5.根據權利要求3所述的方法,其中所述外植體的清洗為切取半木質化的枝條,在流水中沖洗0.5個小時。6.根據權利要求3所述的方法,其中所述溶脂混合液預處理為將外植體浸泡于溶脂混合液中,處理3分鐘,無菌水沖洗1次,所述二次處理為采用溶脂混合液再次對外植體浸泡處理3分鐘,無菌水沖洗2次。7.根據權利要求3所述的方法,其中所述的酒精滅菌為將無菌水沖洗后的外植體,在超凈工作臺內放入75%的酒精中消毒30秒,所述的次氯酸鈉滅菌為采取次氯酸鈉消毒的方式進行消毒處理,時間為8-10分鐘,并用無菌水沖洗三次。8.根據權利要求3所述的方法,其中在對外植體進行培養之前,還包括在無菌條件下將外植體材料上與消毒劑接觸過的界面進行切除的步驟。9.根據權利要求3所述的方法,其中所述外植體的培養是將消毒滅菌后的外植體接種在添加有100mg/L兩性霉素B和50mg/L硫酸鏈霉素的MS啟動培養基中。10.根據權利要求3所述的方法,其中所述外植體培養的環境條件為光周期16h/8h、光照強度2500Lux、溫度27℃/21℃。

說明書

技術領域

本發明涉及生物技術領域,尤其是植物組織培養技術領域,具體涉及一種培養表面多脂植物外植體的方法。

背景技術

楊樹屬于楊柳科(Salicacae)楊屬(Populus L.)植物,為多年生木本喬木。楊樹不僅是重要的造林綠化樹種和工業用材樹種,而且還是多年生林木基因工程的模式樹種。因此,獲得大量無菌的外植體是進行楊樹組織快繁和基因工程研究的前提和基礎。

在常規的植物組織培養中,外植體的消毒方法一般是先用自來水沖洗去除表面泥土,用酒精消毒30秒到1分鐘,再用10%次氯酸鈉或0.1%生汞消毒幾分鐘到十幾分鐘,無菌水沖洗后進行接種。

楊樹樹種的冬眠芽在萌發時分泌大量樹脂,新生枝條、頂芽及側芽表面也覆蓋樹脂。因此,對于楊樹等表面多脂植物的全外植體而言,目前常規的采用水溶性消毒液進行消毒滅菌的方式,無法溶解外植體表面的樹脂,常常導致外植體消毒不徹底、污染率較高或者消毒過度致使外植體死亡等情況發生。然而,針對表面多脂植物有效的消毒滅菌方式尚無報道,因此亟待開發一種針對楊樹等表面多脂植物的高效安全消毒方法。

發明內容

本發明針對現有技術中存在的上述缺陷,為改善常規消毒滅菌方式無法徹底溶解楊樹等外植體表面樹脂的不足,提供了一種新的培養表面多脂植物外植體的方法,該方法不僅能溶解楊樹等外植體表面的樹脂,還能有效清除楊樹等表面多脂植物外植體表面的細菌及真菌,使外植體保持充足的活力。

為此,本發明一方面提供了一種用于對表面多脂植物的外植體進行處理的溶脂混合液,其為0.1%的吐溫20和10%的乙酸乙酯的水溶液,其中表面多脂植物優選為楊樹,更加優選為歐洲黑楊。

本發明另一方面提供了采用本發明所述的溶脂混合液對表面多脂植物的外植體進行處理的方法,其中包括采用溶脂混合液對外植體分別進行預處理和二次處理的步驟,所述預處理為采用溶脂混合液處理外植體2-3分鐘,用無菌水沖洗外植體1次,所述二次處理為采用溶脂混合液再次處理外植體2-3分鐘,用無菌水沖洗外植體2次,表面多脂植物優選為楊樹,更加優選為歐洲黑楊。

本發明再一方面提供了一種培養表面多脂植物外植體的方法,其包括以下步驟:

1、外植體采集植株的培養。

2、外植體的選擇。

3、外植體的消毒滅菌:

(1)外植體的清洗;

(2)溶脂混合液預處理:采用溶脂混合液對外植體進行預處理2-3分鐘,用無菌水沖洗外植體1次;

(3)溶脂混合液二次處理:采用溶脂混合液對外植體再次進行處理2-3分鐘,用無菌水沖洗外植體2次;

(4)外植體的酒精滅菌;

(5)外植體的次氯酸鈉滅菌;

(6)無菌水清洗。

4、外植體的培養。

其中,所述溶脂混合液為0.1%的吐溫20和10%的乙酸乙酯的水溶液,表面多脂植物優選為楊樹,更加優選為歐洲黑楊。

在本發明進一步優選的實施方案中,所述外植體采集植株的培養為將冬眠植株的穗條剪成15厘米的長度,插入營養缽中,移入溫室內進行培養,期間進行日常的肥水管理和病蟲害防治,所述的外植體為半木質化的新發枝條。

在本發明進一步優選的實施方案中,所述外植體的清洗為切取半木質化的枝條,在流水中沖洗0.5個小時。

在本發明進一步優選的實施方案中,所述溶脂混合液預處理為將外植體浸泡于溶脂混合液中,處理3分鐘,無菌水沖洗1次,所述二次處理為采用溶脂混合液再次對外植體處理3分鐘,無菌水沖洗2次。

在本發明進一步優選的實施方案中,所述的酒精滅菌為將無菌水沖洗后的外植體,在超凈工作臺內放入75%的酒精中消毒30秒,所述的次氯酸鈉滅菌為采取次氯酸鈉消毒的方式進行消毒處理,時間為8-10分鐘,并用無菌水沖洗三次。

在本發明進一步優選的實施方案中,在對外植體進行培養之前,還包括在無菌條件下將外植體材料上與消毒劑接觸過的界面進行切除的步驟。

在本發明進一步優選的實施方案中,所述外植體的培養是將消毒滅菌后的外植體接種在添加有100mg/L兩性霉素B和50mg/L硫酸鏈霉素的MS啟動培養基中。

在本發明進一步優選的實施方案中,所述外植體培養的環境條件為光周期16h/8h、光照強度2500Lux、溫度27℃/21℃。

由上述描述可知,與現有技術相比,本發明具備如下優點。

1、本發明提供了一種用于對表面多脂植物的外植體進行處理的溶脂混合液,其能有效溶解楊樹等表面多脂植物外植體表面的樹脂。

2、本發明提供了一種采用溶脂混合液對楊樹等表面多脂植物的外植體進行處理的方法,其中包括采用溶脂混合液對外植體分別進行預處理和二次處理的步驟,其能有效溶解楊樹等表面多脂植物外植體表面的樹脂。

3、本發明提供了一種培養楊樹等表面多脂植物外植體的方法,其通過采用溶脂混合液對楊樹等表面多脂植物的外植體進行處理,不僅能溶解楊樹等表面多脂植物外植體表面的樹脂,還能有效清除楊樹等表面多脂植物外植體表面的細菌及真菌,使外植體保持充足的活力。

附圖說明

圖1:歐洲黑楊半木質化新發枝條及其表面分泌的樹脂。

圖2:不同處理方式下,歐洲黑楊莖段外植體生長及染菌情況。

A:采用常規滅菌方法處理的莖段細菌污染情況;

B:采用常規滅菌方法處理的莖段真菌污染情況;

C:采用溶脂混合液處理15min導致外植體生活力降低;

D:采用溶脂混合液二次處理的外植體效果最佳。

具體實施方式

下面通過實施例對本發明作進一步的詳細說明,旨在用于說明本發明而非限定本發明。應當指出,對于本領域技術人員而言,在不脫離本發明原理的前提下,還可以對本發明進行若干改進和修飾,這些改進和修飾也同樣落入本發明的?;し段е?。

實施例1:歐洲黑楊外植體的培養

1、外植體采集植株的培養

將冬眠的歐洲黑楊無性系N08穗條剪成15cm長度,插入直徑6cm的營養缽中,營養土為草炭土、珍珠巖和河沙混合配比(6:2:2),放置于控溫自動化日光溫室中,溫度25-28℃,期間進行日常的肥水管理和病蟲害防治。

2、外植體的選擇

扦插30天后,選取生長健壯、無病蟲害、腋芽飽滿的歐洲黑楊半木質化新發枝條,具體形態如附圖1所示。剪去幼嫩的尖端及葉片,保留2mm葉柄,作為外植體。

3、外植體的消毒滅菌

(1)清洗

用流動的自來水進行外植體的清洗,時間為30分鐘,之后用濾紙吸干表面水分,放入超凈臺中。

(2)溶脂混合液預處理

無菌條件下,用高溫消毒后的醫用手術剪刀將外植體剪成2-3cm的莖段,確保每個莖段有1-2個飽滿的腋芽;將莖段放入大滅菌后的玻璃培養皿中,倒入30-50ml溶脂混合液(0.1%的吐溫20和10%的乙酸乙酯的水溶液),預處理3分鐘,期間不停搖動,之后無菌水沖洗1次,無菌濾紙吸干。

(3)溶脂混合液二次處理

采用上述溶脂混合液對外植體再次處理3分鐘,無菌水沖洗外植體2次。

(4)酒精滅菌

將上述莖段移入無菌培養皿中,加入75%的酒精,輕輕晃動,約30秒后,迅速取出。

(5)次氯酸鈉滅菌

將上述莖段移入無菌培養皿中,倒入50-80ml 10%的次氯酸鈉溶液,消毒8-10分鐘,期間輕輕晃動2-3次。

(6)無菌水清洗

將上述莖段移入無菌培養皿中,用無菌水沖洗外植體3次,用滅菌的濾紙吸干外植體表面的水分。

4、外植體的培養

將上述處理的莖段置于無菌培養皿中,用滅菌過的醫用手術剪刀,將與消毒劑接觸過的莖段兩端界面切除1-1.5mm,之后接種在添加有100mg/L兩性霉素B和50mg/L硫酸鏈霉素的MS啟動培養基中。

將培養瓶移入組織培養箱,設置培養箱的培養條件為光周期16h/8h,光照強度2500Lux,培養溫度為27℃/21℃。

5、外植體培養結果的統計分析

培養10天后,統計歐洲黑楊外植體污染情況。30天后,統計外植體成活及生長狀況。由表1可見,溶脂混合液的不同處理方式以及不同處理時間對歐洲黑楊外植體的污染率和成活率具有不同的影響。溶脂混合液處理能有效去除歐洲黑楊枝條及腋芽表面分泌的楊樹樹脂,從而使枝條與殺菌劑有效接觸,增加了殺菌劑的殺菌效果。但長時間接觸,會使有機試劑進入植物的維管系統,對外植體造成毒害。從表1的數據可以進一步看出,采用溶脂混合液先處理3分鐘,無菌水清洗后,再次采用溶脂混合液處理3分鐘,然后采用無菌水沖洗2次的二次處理方法效果最佳。

表1溶脂混合液處理對歐洲黑楊外植體污染率和成活率的影響

不同處理方式下,歐洲黑楊莖段外植體生長及染菌情況如附圖2所示。

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