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皇家马德里vs维戈塞尔塔比赛时间: N甲基胡椒乙胺或其鹽在制備預防和/或治療腦病藥物中的應用.pdf

摘要
申請專利號:

维戈塞尔塔vs皇家社会 www.vmyqew.com.cn CN201210155470.6

申請日:

20120518

公開號:

CN102697766B

公開日:

20130821

當前法律狀態:

有效性:

有效

法律詳情:
IPC分類號: A61K31/343,A61P9/10,A61P25/00 主分類號: A61K31/343,A61P9/10,A61P25/00
申請人: 廣州軍區廣州總醫院
發明人: 李茹冰,李健,吳新榮,孫智平,陳新,季波,袁進,黃濤陽
地址: 510010 廣東省廣州市流花路111號
優先權: CN201210155470A
專利代理機構: 廣州嘉權專利商標事務所有限公司 代理人: 譚英強
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法律狀態
申請(專利)號:

CN201210155470.6

授權公告號:

法律狀態公告日:

法律狀態類型:

摘要

本發明公開了N-甲基胡椒乙胺或其鹽在制備預防和/或治療腦病藥物中的應用,尤其涉及N-甲基胡椒乙胺或其藥學上可接受的鹽在制備治療和/或預防腦損傷疾病或腦血管疾病的藥物中的應用。本發明通過藥理研究發現,N-甲基胡椒乙胺鹽用作制備治療腦血管疾病藥物應用時,對于腦缺血與腦再灌注損傷均有良好的治療作用。本發明的研究從腦生理功能、神經細胞生化及病理形態學等方面表明N-甲基胡椒乙胺或其鹽是一個治療效果好、毒副反應低的化合物,療效優于現有的相關腦血管病藥物,有可能發展成為預防和/或治療腦損傷、腦血管疾病、對抗腦缺血和再灌注損傷及外傷性腦水腫的新藥。

權利要求書

1.N-甲基胡椒乙胺或其藥學上可接受的鹽在制備預防和/或治療腦病藥物中的應用;所述腦病為腦損傷疾病或腦血管疾病。2.根據權利要求1所述的應用,其特征在于:腦血管疾病為腦缺血、腦缺血/再灌注損傷中的至少一種。3.根據權利要求1所述的應用,其特征在于:腦血管疾病為腦出血。4.根據權利要求1所述的應用,其特征在于:N-甲基胡椒乙胺的藥學上可接受的鹽為N-甲基胡椒乙胺鹽,包括有機酸鹽、無機酸鹽。5.根據權利要求4所述的應用,其特征在于:有機酸包括乙酸、檸檬酸、乳酸、琥珀酸、馬來酸、富馬酸、葡萄糖醛酸、三氟乙酸、甲磺酸、甲苯磺酸、酒石酸;無機酸包括鹽酸、氫溴酸、硝酸、硫酸、磷酸。6.根據權利要求4所述的應用,其特征在于:N-甲基胡椒乙胺鹽為N-甲基胡椒乙胺鹽酸鹽。7.根據權利要求1~6任一項所述的應用,其特征在于:N-甲基胡椒乙胺或其藥學上可接受的鹽與藥物上可接受的載體和/或稀釋劑混合,組成一種藥物組合物。8.根據權利要求7所述的應用,其特征在于:所述藥物組合物與其他藥物合用在制備預防和/或治療腦損傷疾病藥物的應用。9.根據權利要求7所述的應用,其特征在于:所述藥物組合物與其他藥物合用在制備預防和/或治療腦血管疾病藥物的應用。

說明書

技術領域

本發明涉及N-甲基胡椒乙胺或其鹽的一種新用途,具體涉及N-甲基胡椒乙胺或其鹽在制備預防和/或治療腦病藥物中的應用。

背景技術

腦?。╡ncephalopathy)指任何腦器質性損害,系由遺傳、先天性腦發育不全、腦外傷、腦腫瘤、腦出血、腦梗阻、感染、化學藥物中毒等原因引起的大腦神經組織損傷的疾病。常見的腦病可以分為三大類:一是遺傳、先天發育不良造成的小兒腦癱,智力低下等;二是外傷造成的急性腦損傷后遺癥、腦血管病造成的腦中風后遺癥等;三是因中樞神經纖維損傷導致腦神經細胞衰老退化的慢性退行性疾病,包括老年癡呆癥、腦萎縮、帕金森病等。

縱觀各種腦病,由于神經信息傳導通道(腦路)——神經纖維的堵塞,造成神經各種信息的傳導不暢,致使腦神經細胞功能缺失,是腦病的病變本質。例如:中風是指由于腦血管堵塞或破裂導致神經纖維傳導功能的損傷、堵塞、斷裂,進而使神經細胞變性、損傷或死亡,出現偏癱、失語等感覺、運動功能障礙;胎兒腦神經纖維發育受阻、不能促進神經細胞的分化成熟,新生兒缺血、缺氧,就造成以中樞性運動功能障礙為主的腦性癱瘓;大腦黑質神經元數量減少,合成多巴胺不足,就會導致帕金森??;信息傳導通道--神經纖維的衰老與凋亡加劇,導致腦細胞的衰老(腦組織萎縮),就形成了老年性癡呆。

目前,國內外越來越多的報道指出早期治療缺血性腦血管疾病的重要性,特別在發病3~6小時內??鼓瘟?包括肝素和口服抗凝劑)長時期用于防止血栓的擴延和進展性腦血管病、短暫性腦缺血發作、椎—基底動脈血栓形成和預防腦栓塞再發,其療效仍不確定,如使用不當,可增加顱內和全身出血的危險。降纖治療仍處于研究階段,降纖至何種程度,如何減少出血并發癥的問題,尚待解決,其療效也有待進一步評價。在介入治療方面,據報道,頸動脈內膜切除術對防治短暫性腦缺血性發作已取得肯定療效,對頸內動脈閉塞70%以上者,療效相對較好。雖然這些介入性治療,已引起越來越多的重視,但資料不多,包括顱內外血管經皮腔內血管成形術、血管內支架置入或與溶栓治療結合,尚處于研究階段,缺乏成熟經驗。

顱腦創傷排全身創傷發生率第二位,但致死率和致殘率卻位居第一。顱腦創傷病人通常存在意識喪失、運動神經功能障礙、記憶功能障礙和精神功能異常。為了挽救病人的生命,改善他們的生存狀態,臨床醫師常常使用各種腦?;ひ┪?,期盼能夠促進病人腦功能的恢復。但目前部分常用藥物臨床療效極差,有的甚至有害。

腦?;ぜ烈殉晌苯裱芯康娜鵲?,在理論上有一定的依據,但迄今尚未找到經臨床研究證明確定有效的制劑。

長期以來,臨床上出現了大量所謂腦?;ひ┪?,此類藥物的選擇使用也存在著很大的盲目性。國外學者已經采用循證醫學方法,將200多種腦?;ひ┪鎘糜謚瘟萍斃月源瓷瞬∪?,但未能發現任何一種臨床有特效的藥物。

根據上述研究結果,結合我國的基本國情和臨床診治實際情況,《中國顱腦創傷病人腦?;ひ┪鎦瘟浦改稀范砸韻?0類藥物提出如下意見:對超大劑量激素、鎂制劑和超大量白蛋白提出了強烈不推薦使用的意見;而常規劑量按藥典使用。對尼莫地平、谷氨酸受體拮抗劑、自由基清除劑、緩激肽拮抗劑和線粒體功能?;ぜ斂煌萍鍪褂?。因多種肽類腦神經營養藥物治療顱腦創傷病人的療效缺乏一級臨床循證醫學證據,建議慎重使用。對經長期臨床應用證明無不良反應,且價格便宜,藥理作用明確的三磷酸腺苷、輔酶A、維生素B6和維生素C,建議推薦使用。

因此,臨床上強烈盼望新型有效的腦?;ひ┪锏某魷?,用于預防和治療腦病。

N-甲基胡椒乙胺或其鹽,其化學結構通式(1)如下所示,式中X為H、有機酸、無機酸、有機堿或堿金屬。有機酸包括乙酸、檸檬酸、乳酸、琥珀酸、馬來酸、富馬酸、葡萄糖醛酸、三氟乙酸、甲磺酸、甲苯磺酸、酒石酸;無機酸包括鹽酸、氫溴酸、硝酸、硫酸、磷酸;有機堿包括銨、葡甲胺、氨基葡萄糖、精氨酸、賴氨酸、鳥氨酸、組氨酸;堿金屬包括鈉、鉀、鈣、鎂、鋅、鋇、鋰。

(1)

目前尚未有N-甲基胡椒乙胺或其鹽應用于腦?;ぜ?、用于預防和/或治療腦病的報導,通過N-甲基胡椒乙胺或其鹽已知的性質無法推斷其是否具有預防和/或治療腦病的作用。

發明內容

本發明的目的在于提供N-甲基胡椒乙胺或其鹽在制備預防和/或治療腦病藥物中的應用。

本發明解決上述問題的技術方案為:

N-甲基胡椒乙胺或其藥學上可接受的鹽在制備預防和/或治療腦病藥物中的應用。

優選的,N-甲基胡椒乙胺或其藥學上可接受的鹽在制備預防和/或治療腦損傷疾病藥物中的應用。

優選的,N-甲基胡椒乙胺或其藥學上可接受的鹽在制備預防和/或治療腦血管疾病藥物中的應用。

優選的,腦血管疾病為腦缺血、腦缺血/再灌注損傷中的至少一種。

優選的,腦血管疾病為腦出血。

優選的,N-甲基胡椒乙胺的藥學上可接受的鹽為N-甲基胡椒乙胺鹽,包括有機酸鹽、無機酸鹽、有機堿鹽或無機堿鹽。

優選的,有機酸包括乙酸、檸檬酸、乳酸、琥珀酸、馬來酸、富馬酸、葡萄糖醛酸、三氟乙酸、甲磺酸、甲苯磺酸、酒石酸;無機酸包括鹽酸、氫溴酸、硝酸、硫酸、磷酸;有機堿包括銨、葡甲胺、氨基葡萄糖、精氨酸、賴氨酸、鳥氨酸、組氨酸;無機堿鹽包括鈉、鉀、鈣、鎂、鋅、鋇、鋰鹽。

優選的,N-甲基胡椒乙胺鹽為N-甲基胡椒乙胺鹽酸鹽、N-甲基胡椒乙胺氫溴酸鹽、N-甲基胡椒乙胺草酸鹽、N-甲基胡椒乙胺琥珀酸鹽、N-甲基胡椒乙胺馬來酸鹽。

優選的,N-甲基胡椒乙胺鹽為N-甲基胡椒乙胺鹽酸鹽。N-甲基胡椒乙胺鹽酸鹽也稱鹽酸N-甲基胡椒乙胺,其分子式為C10H13O2N·HCl,分子量為215.5,其化學結構式如下:

。

優選的,N-甲基胡椒乙胺或其藥學上可接受的鹽與藥物上可接受的載體和/或稀釋劑混合,組成一種藥物組合物。

優選的,所述藥物組合物與其他藥物合用在制備預防和/或治療腦損傷疾病藥物的應用。

優選的,所述藥物組合物與其他藥物合用在制備預防和/或治療腦血管疾病藥物的應用。

本發明所述腦缺血/再灌注損傷(cerebral?ischemia-reperfusion?injury)是指腦缺血致腦細胞損傷、恢復血液再灌注后,其缺血性損傷反而進一步加重的現象。

本發明的N-甲基胡椒乙胺或其藥學上可接受的鹽使用時,可以制成水劑、粉針、片劑或膠囊等,分別采用靜脈注射、肌肉注射或口服的方法。根據不同的動物及實驗模型,用量為0.1~80mg/kg。

本發明的N-甲基胡椒乙胺可由胡椒乙胺經和苯甲醛縮合后,得至的N-芐叉基胡椒鹽再與硫酸二甲酯反應形成。

本發明所述N-甲基胡椒乙胺或其藥學上可接受的鹽用于制備預防和/或治療哺乳動物腦病藥物。所述哺乳動物包括人。

本發明通過在體動物實驗表明N-甲基胡椒乙胺對腦缺血及缺血/再灌注損傷引起的腦梗塞有顯著治療作用。

本發明通過實驗表明N-甲基胡椒乙胺和N-甲基胡椒乙胺鹽能降低血管通透性,抗脂質過氧化,?;な芩鵡韻赴?,從而發揮治療缺血性腦血管疾病作用。

本發明還從神經生化、神經病理學和行為學三個方面,觀察和研究N-甲基胡椒乙胺鹽對膠原酶所誘導的大鼠腦出血模型的?;ぷ饔?。

本發明提供了鹽酸N-甲基胡椒乙胺在腦缺血再灌注所致小鼠血管性癡呆?;し矯嫻撓τ?。

本發明還通過在體動物實驗表明N-甲基胡椒乙胺單獨和聯合用藥對大鼠腦缺血和腦損傷有顯著?;ぷ饔?。

本發明提供了注射用鹽酸N-甲基胡椒乙胺在腦?;し矯嫻撓τ?。

本發明的有益效果是:

本發明通過藥理研究發現,N-甲基胡椒乙胺鹽用作制備治療腦血管疾病藥物應用時,對于腦缺血與腦再灌注損傷均有良好的治療作用。本發明的研究從腦生理功能、神經細胞生化及病理形態學等方面表明N-甲基胡椒乙胺或其鹽是一個治療效果好、毒副反應低的化合物,療效優于現有的相關腦血管病藥物,有可能發展成為預防和/或治療腦損傷、腦血管疾病、對抗腦缺血和再灌注損傷及外傷性腦水腫的新藥。

具體實施方式

下面結合具體的實施例對本發明作進一步的說明,但并不局限如此。

實施例1

本實施例涉及N-甲基胡椒乙胺及鹽酸N-甲基胡椒乙胺對培養腦神經細胞的作用實驗。

1、實驗材料

普通級Sprague?Dawley大鼠18只,體重250~280g;多聚賴氨酸為Sigma公司產品;DMEM培養基為Gibco公司產品;其余試劑均為分析純。

2、神經細胞原代培養

將懷孕15d大鼠水合氯醛麻醉,75%乙醇消毒胸腹部,在無菌條件下取出胎鼠,剝出,分離兩側皮層組織,用手術刀切成糜狀,移入含0.125%胰蛋白酶的磷酸緩沖液中消化30?min(37℃)后棄去消化液,加入含10%胎牛血清,10%馬血清,100U/ml青霉素,100U/ml鏈霉素的DMED培養液,用小口徑吸管反復吹打分散,200目細胞篩過濾后,以DMEM調整細胞濃度至105個/m1,接種至預先涂有0.0l%多聚賴氨酸的培養皿中,每皿2?m1,置CO2培養箱中37℃孵育,于培養第3天在培養液中加入細胞分裂抑制劑阿糖胞普儲備液以抑制非神經元細胞的過度增殖,作用48h后換新鮮培養液,以后每周換液2次,每次更換半量液。

3、NMDA誘導神經細胞損傷

細胞培養至14d后,隨機分六組:(1)正常對照組;(2)N-甲基-D-門冬氨酸(NMDA)(50mmol/L)組;(3)NMDA+N-甲基胡椒乙胺(50mmol/L)組;(4)NMDA+鹽酸N-甲基胡椒乙胺(10mmol/L)組;(5)NMDA+鹽酸N-甲基胡椒乙胺(100mmol/L)組;?(6)NMDA+神經節苷脂(Ganglioside,GM)(50mmol/L)組。將(3)組~(6)組所用的N-甲基胡椒乙胺、鹽酸N-甲基胡椒乙胺、神經節苷脂分別與低血清DMEM(5%胎牛血清,5%馬血清,30?mmol/L?HEPES)混合配制成含藥低血清DMEM;實驗各組分別換含不同藥物的低血清DMEM,其中,1)組和2)組使用不含藥物的低血清DMEM,實驗各組繼續培養6h后除1)組外均加終濃度為50mmol/L?的NMDA,繼續孵育12h后觀察細胞形態,計數200個細胞,計算細胞死亡率。

4、結果

4.1對培養神經細胞形態變化的影響

正常神經細胞培養至14d時,生長良好,胞體呈錐形、梭形或三角形,突觸粗而長,呈樹根狀交織成網;當細胞在僅含50mmol/L?NMDA的培養基中孵育12h時,細胞出現腫脹、輪廓模糊,神經元突觸斷裂、消失、甚至細胞崩解;當細胞同時與10、100mmol/L鹽酸N-甲基胡椒乙胺孵育,則細胞損傷程度明顯減輕,細胞形態基本保持完整,但細胞密度有所降低,仍可見突觸斷裂等現象;表明鹽酸N-甲基胡椒乙胺對NMDA誘導的大鼠神經細胞損傷有顯著的?;ぷ饔?。50mmol/L神經節苷脂的?;ぷ饔糜?0mmol/L鹽酸N-甲基胡椒乙胺相當。

4.2?對培養神經細胞死亡率影響

各組對培養神經細胞死亡率的影響結果見表1,由表可知,神經細胞在含50mmol/L?NMDA的培養基中孵育12h后,臺盼藍染色著色細胞明顯增多(NMDA組49%?vs正常對照組8.9%,P<0.001),提示細胞死亡率增加;于培養基中加入N-甲基胡椒乙胺、鹽酸N-甲基胡椒乙胺、GM可明顯降低細胞死亡率,與NMDA組相比有顯著差異??杉?,N-甲基胡椒乙胺、鹽酸N-甲基胡椒乙胺對NMDA誘導的大鼠腦神經細胞損傷有?;ぷ饔?,其中,鹽酸N-甲基胡椒乙胺的?;ばЧ任災?,與神經節苷脂作用相當。故N-甲基胡椒乙胺、鹽酸N-甲基胡椒乙胺對腦神經細胞有顯著的?;ぷ饔?。

實施例2

本實施例涉及N-甲基胡椒乙胺及鹽酸N-甲基胡椒乙胺對閉合性腦外傷小鼠的作用實驗。

1、實驗儀器

跳臺實驗自動記錄儀,中國醫學科學院藥物所儀電室;熒光分光光度計,日本HITACHI公司;酶標儀。

2、實驗動物

清潔級昆明種小鼠,體重20~22g。

3、實驗

取小鼠70只,隨機分為七組:1)正常對照組;2)模型組;?3)N-甲基胡椒乙胺2mg/kg(藥物使用時以5%葡萄糖注射液稀釋至合適濃度,下同)組;4)鹽酸N-甲基胡椒乙胺?1?mg/kg組;5)鹽酸N-甲基胡椒乙胺2?mg/kg組;6)鹽酸N-甲基胡椒乙胺4?mg/kg組;7)ATP?(三磷酸腺苷二鈉)4mg/kg組;每組10只。

將2)組~7)組小鼠禁食16小時后造成小鼠閉合性腦外傷模型,3)組~7)組分別靜脈給藥,24小時后所有組剝取鼠腦,稱量濕重,70℃烘干24小時,稱干重,計算腦含水量;腦含水量高于正常值表示腦部水腫,各組對閉合性腦外傷小鼠腦水腫的影響結果見表2。

由表2可知,由模型組與正常對照組比較,可知閉合性腦外傷造成小鼠腦嚴重水腫,給予不同劑量的鹽酸N-甲基胡椒乙胺、N-甲基胡椒乙胺或ATP后,小鼠腦水腫有不同程度的減輕,鹽酸N-甲基胡椒乙胺作用且呈劑量依賴性。N-甲基胡椒乙胺作用優于ATP??杉?,N-甲基胡椒乙胺及鹽酸N-甲基胡椒乙胺對閉合性腦外傷小鼠有治療作用。

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實施例3

本實施例涉及鹽酸N-甲基胡椒乙胺對血管性癡呆小鼠的神經?;ぷ饔檬笛?。

藥品及實驗儀器:鹽酸N-甲基胡椒乙胺:用時以5%葡萄糖注射液稀釋至合適濃度。跳臺實驗自動記錄儀,中國醫學科學院藥物所儀電室產品;熒光分光光度計,日本HITACHI公司產品;酶標儀。

實驗動物:清潔級昆明種小鼠,體重20~22g。

1、鹽酸N-甲基胡椒乙胺對腦缺血再灌注小鼠學習記憶功能障礙的改善作用

將小鼠50只,隨機分為五組:假手術組,模型組,鹽酸N-甲基胡椒乙胺?1?mg/kg組、2?mg/kg組、4?mg/kg組,每組10只。

禁食16小時后建立小鼠缺血再灌注致癡呆模型,具體操作如下:小鼠以戊巴比妥鈉(60?mg/kg,ip)麻醉后,仰臥位固定,頸正中切口,分離雙側頸總動脈,并穿以零號絲線,雙側頸總動脈阻斷血流10?min,然后恢復血流10?min,如此重復3次,縫合皮膚。置小鼠于正常飼養條件。假手術組只分離雙側頸總動脈。

缺血再灌注后10?min,尾靜脈注射藥物,缺血再灌注24h后,第2次給藥。給藥半小時后進行跳臺實驗。將待測小鼠放入跳臺儀中,適應環境3?min,然后向底部柵板通電,觀察小鼠跳上高臺時間(反應時間)和5?min內小鼠由高臺跳下受到電擊的次數(訓練期錯誤次數)。24?h后,再次給藥,然后進行第2次跳臺實驗測定記憶獲得功能。將小鼠放于實驗儀高臺上,底部柵板同時通電,記錄小鼠跳下高臺的時間(潛伏期)和5?min內受到電擊次數(重測期錯誤次數)。每次缺血再灌注后給藥方法:除假手術組和模型組外其余組小鼠尾靜脈注射不同濃度鹽酸N-甲基胡椒乙胺。各組對腦缺血再灌注小鼠學習記憶功能的影響結果見表3。

結果如表3所示,由模型組與假手術組結果對比可知,重復腦缺血再灌注可以使小鼠出現明顯的學習記憶障礙,反應時間延長,錯誤次數增加,潛伏期縮短。而鹽酸N-甲基胡椒乙胺對缺血再灌注引起的學習記憶障礙有改善作用,減少反應時間,延長潛伏期,減少測試期和重測期錯誤次數,與模型組比較有顯著性差異(*P<0.05或**P<0.01)。

2、鹽酸N-甲基胡椒乙胺對腦缺血再灌注小鼠腦SOD活性、MDA和GSH含量的影響

小鼠缺血再灌注方法和給藥方式同上,缺血再灌注完成后,斷頭處死,于0℃下取出大腦用磷酸緩沖液制成勻漿,鄰苯三酚自氧化法測定SOD的活性,TBA法測定MDA的含量,DTNB法測定GSH的含量,考馬斯亮藍定量蛋白質。各檢測指標見表4。

由表4可知,由模型組與假手術組結果對比可知,重復腦缺血再灌注可以使小鼠腦勻漿SOD活性下降,MDA含量升高,GSH含量降低。而給予不同劑量鹽酸N-甲基胡椒乙胺可抑制缺血再灌注小鼠腦組織MDA的升高,增加GSH的含量,提高SOD的活性,與模型組比較有顯著性差異(P<0.05或P<0.01)。

實施例4

本實施例涉及鹽酸N-甲基胡椒乙胺用于治療感染性腦水腫的在體動物實驗。

將體重200~220g的SD大鼠30只,隨機分成3組:生理鹽水對照組(NS,n=10);百日咳菌液模型組(PB,n=10);鹽酸N-甲基胡椒乙胺預處理百日咳菌液組(JBTA,n=10)。

大鼠頸正中切口,分離左頸總動脈,頸外動脈,頸內動脈及分支,結扎翼腭動脈和枕動脈。夾閉頸外動脈后,用1ml注射器4.5號針頭于左頸總動脈穿刺向左頸內動脈注射百日咳菌液0.2ml/kg(百日咳菌液由北京生物制品研究所提供的滅活菌液,含菌10.8×109/ml),15s內注射完畢。NS組則用同法注射等量的無菌生理鹽水。鹽酸N-甲基胡椒乙胺組在注百日咳菌液前48h每天靜脈注射0.5mg/kg,連續2d。各組大鼠注菌或生理鹽水4h后斷頭處死。

檢測各組大鼠腦的腦含水量及鈉、鉀離子的含量,檢測結果見表5。采用ELISA法與Griess法分別測大鼠腦組織勻漿中IL-1β、TNF-α和NO含量,檢測結果見表6。

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由表5可知,鹽酸N-甲基胡椒乙胺預處理后能顯著降低百日咳菌液腦水腫大鼠的腦含水量及鈉離子的含量,增加鉀離子含量。表明鹽酸N-甲基胡椒乙胺預處理對大鼠感染性腦水腫有?;ぷ饔?。

由表6可知,鹽酸N-甲基胡椒乙胺預處理組IL-1β、TNFα及NO含量顯著降低(P<0.01)。

可見,PB組注菌后4h大鼠腦含水量增加、Na+含量增加,K+含量降低,表明已成功的建立了大鼠感染性腦水腫模型;同時腦組織中IL-1β、TNF-α及NO的含量增加,與相應NS對照組比較差異有極顯著性(P<0.01)??杉廡┮蜃佑敫腥拘閱運墜叵得芮?,上述因子的大量生成可能加重感染性腦損傷。而大鼠經鹽酸N-甲基胡椒乙胺預處理后再制成感染性腦水腫模型,與未作預處理的大鼠感染性腦水腫模型比較,預處理后腦組織的IL-1β、TNF-α及NO的含量明顯下降,同時腦含水量,Na+含量降低,K+含量增加,與模型組比較,差異有極顯著性(P<0.01)。說明鹽酸N-甲基胡椒乙胺可減少IL-1β、TNF-α及NO的生成量,對感染性腦水腫大鼠有?;ぷ饔?。

實施例5

本實施例涉及鹽酸N-甲基胡椒乙胺聯合臨床常用腦病藥物用于治療感染性腦水腫的在體實驗。

感染性腦水腫模型同實施例4。研究鹽酸N-甲基胡椒乙胺和特異性L-型鈣離子通道阻斷劑尼莫地平對感染性腦水腫腦含水量和伊文思藍(EB)含量的影響,旨在為臨床治療提供實驗和理論依據。

健康SD大鼠90只,體重200~220g,隨機分為4組:(1)生理鹽水對照(NS)組,20只;(2)百日咳菌液(PB)組,30只;(3)尼莫地平治療(Nim)組,20只;(4)?鹽酸N-甲基胡椒乙胺預處理后尼莫地平治療(鹽酸N-甲基胡椒乙胺+Nim)組,20只。各組又分為30min、4h和24h?3個時間組。

注菌后5min內向靜脈內注入尼莫地平(Nim治療組,0.25mg/kg體重),24h尼莫地平治療組每8h重復注射1次相同劑量;鹽酸N-甲基胡椒乙胺預處理后尼莫地平治療組于實驗前48?h和24h向靜脈內注入鹽酸N-甲基胡椒乙胺(0.5mg/kg,共2次),預處理后再進行尼莫地平治療。鹽水組同菌液組操作一樣,在同樣時間內注射等體積的生理鹽水。注菌或注生理鹽水后10min內從舌下靜脈注入2%的伊文思蘭(EB,0.2mL/100g體重)。各組動物觀察至規定時間后斷頭處死,迅速取腦,去除皮質表面的軟腦膜及凝血塊,取左側大腦半球后1/3全層腦組織標本(約0.1~0.2g,包括灰質和白質),行干濕法測定腦組織水分含量及伊文思蘭(EB)含量測定、腦組織電鏡檢查。

各個時間組感染性腦水腫腦組織含水量與EB含量的均數、標準差、方差分析及其相關分析結果見下表7。結果顯示,應用尼莫地平治療后注菌側腦組織含水量和EB含量明顯低于百日咳菌液組腦組織含水量和EB含量(P<0.05),以4h治療組療效最佳。鹽酸N-甲基胡椒乙胺預處理后尼莫地平治療組腦組織含水量與EB含量在30min時間組無明顯改變,在4和24h組則明顯降低(P<0.05),與單獨尼莫地平治療組比較差異有顯著性(P<0.01)。菌液組各時間亞組腦組織含水量與EB的含量呈高度正相關(r>0.90,P<0.05)。

?

電鏡檢查結果表明:4?h菌液組內皮細胞明顯腫脹,腦血管周圍間隙增寬,膠質細胞足突明顯腫脹;胞漿結構模糊,線粒體水腫,細胞器脹腫。24?h菌液組除上述改變外,主要表現為神經細胞核濃聚固縮,出現“暗黑細胞”,說明24?h菌液組發生神經元遲發性壞死。

尼莫地平是一種選擇性較強的二氫吡啶類有機鈣拮抗劑,易于透過血腦屏障(BBB),一方面選擇性作用于腦血管,對腦血管具有選擇性擴張作用,解除腦血管痙攣、改善腦微循環和?;BB;另一方面,尼莫地平特異性阻斷神經細胞膜上L-型鈣離子通道,恢復Ca2+-ATP酶的活性,減輕腦損傷時Ca2+內流,從而減輕腦水腫。本研究發現4h和24h?鹽酸N-甲基胡椒乙胺預處理后尼莫地平治療組腦組織水分含量和EB的含量則明顯下降,作用優于單用尼莫地平組。說明鹽酸N-甲基胡椒乙胺預處理后尼莫地平治療組對于遲發性腦水腫有防治作用,即L-型鈣離子通道阻滯劑(如尼莫地平)與鹽酸N-甲基胡椒乙胺聯合應用,可從不同的環節阻斷細胞外Ca2+內流,對大鼠百日咳菌液所致的感染性腦水腫有治療的作用。

實施例6

本實施例涉及鹽酸N-甲基胡椒乙胺對局部腦缺血大鼠的?;ぷ饔檬笛?。

實驗試劑:尼莫地平注射液,山東新華制藥股份有限公司產品,規格:10?mg/50?ml,TUNEL試劑盒:南京建成生物工程開發公司。

實驗動物:普通級SD大鼠60只,體重250~280g。

1、局部腦缺血模型制作

動物隨機分為假手術組,模型組,尼莫地平組(Nim,1?mg/kg),鹽酸N-甲基胡椒乙胺組(0.5、1、2mg/kg),每組10只。各組小鼠禁食16小時后,水合氯醛(350?mg/kg,ip)麻醉,分離右側頸總動脈,夾閉頸內、頸總動脈,頸外動脈近心端及遠心端結扎,中間剪斷。將頸外動脈游離端拉至與頸內動脈成一條直線,將栓線(選用直徑0.24尼龍線,長度5.0cm)由頸外動脈插入至顱內,遇輕微阻力時停止,插入深度約為2?cm。結扎頸外動脈開口,并打開頸總動脈動脈夾,消毒縫合傷口,造成右側大腦中動脈局灶性缺血模型(MACO);假手術組僅進行右側頸總動脈、頸內動脈、頸外動脈的分離(以上實驗均在23~25℃進行)。各組動物手術完成30?min后除假手術組、模型組外分別給予相應藥物。

2、神經行為評分和TTC染色測定梗死面積

24小時后觀察并記錄大鼠的行為障礙:(1)提鼠尾觀察前肢屈曲情況,如雙前肢對稱伸向地面,計為0分,如手術對側前肢出現腕屈曲計為1分,肘屈曲計為2分,肩內旋計為3分,既有腕屈曲和/或肘屈曲,又有肩內旋者,計為4分。(2)將動物置于平地面上,分別推雙肩向對側移動,檢查阻力。如雙側阻力對等且有力,計為0分,如向手術對側推動時阻力下降者,根據下降程度不同分為輕、中、重三度,分別計為l,2和3分。(3)將動物雙前肢置一金屬網上,觀察雙前肢的肌張力。雙前肢肌張力對等且有力者計為0分。同樣根據手術對側肌張力下降程度不同計為1,2和3分。(4)動物有不停地向一側轉圈者,計為1分。根據標準評分,滿分為11分,分數越高,表示動物行為障礙越嚴重。

行為評分后處死大鼠,取腦,去掉嗅球、小腦和低位腦干,冠狀切成5片,腦片用紅四氮唑(TTC)染色,正常組織經染色后呈紅色,梗塞組織呈白色,染色后照相,用中國航空航天大學病理圖像分析軟件求梗塞面積比。

各組對局部腦缺血大鼠神經行為、腦梗死面積的影響結果見表8所示。由表可知,缺血24小時后,大鼠表現出明顯的行為障礙,大鼠腦組織也出現明顯的灶狀缺血壞死區,達到全腦的25%左右;給予不同劑量的鹽酸N-甲基胡椒乙胺(0.5、1、2mg/kg),動物行為障礙有不同程度的減輕,大鼠腦缺血區也有明顯縮小。

病理觀察:?經TTC染色后的腦片置10%福爾馬林中固定,經脫水、浸蠟、包埋、切片等步驟后,制成8?μm厚的組織切片,甲苯胺藍染色,在光學顯微鏡下進行檢查,并進行細胞計數。計數的方法:選擇每只大鼠視交叉與漏斗柄連線中點處的病理切片,以固定范圍的皮層下基底節為觀察對象,以細胞核消失、細胞體暗染的壞死神經元為計數對象,用細胞計數器,計算壞死神經元數占總神經元數的百分比。

數據用x±SD表示,組內給藥前后、組間均以參比差值法(ANOVA)進行統計學處理。檢測結果見表9。

病理檢查結果:?MCAO后24?h,模型組的大鼠患側半球MCA供血區蒼白、無光澤,腦病理切片顯示,于MCA閉塞側腦組織有嚴重損傷的壞死中心區和輕中度損傷的半影區及其以外的外周區,其中半影區對缺血性變化較為敏感,在模型組大鼠表現為大量神經元周圍間隙擴大,出現散在的暗染神經元,神經細胞出現不同程度的皺縮。對側腦組織未見病理改變。給予鹽酸N-甲基胡椒乙胺組動物有不同程度的減輕。我們以相同切面的腦片半影區來進行細胞計數。由表9可見,鹽酸N-甲基胡椒乙胺治療組皮層、紋狀體神經元壞死百分比明顯減少,與模型組比較差異顯著(P<0.05或P<0.01)。

實施例7

本實施例涉及鹽酸N-甲基胡椒乙胺用于治療腦缺血再灌注損傷疾病的動物實驗。

采用小鼠線栓法制作局灶性腦缺血再灌注損傷模型,缺血2h,再灌24h,證明鹽酸N-甲基胡椒乙胺對缺血再灌注損傷腦的?;ぷ饔?。

將小鼠用10%水合氯醛(350?mg/kg)腹腔注射麻醉,靜注給予1mg/kg,5mg/kg鹽酸N-甲基胡椒乙胺或20u/kg的輔酶A(CoA),按實施例6所述方法制作大腦中動脈缺血。術后2h將尼龍線從頸內動脈中拔出,直至頭端達頸總動脈分叉處,再灌注24h。假手術組除不插線外,其余步驟同上。再灌注24h后存活的小鼠斷頭取腦,迅速置-20℃冷凍箱中5?min后取出,在操作臺上迅速由前向后切厚度為2.0mm的冠狀切片,將切片立即置于1%的TTC磷酸鹽緩沖液中,避光常溫孵育30?min。每隔10?min翻動腦片使均勻接觸到染色液,掃描觀察染色結果。各組對腦缺血模型小鼠腦梗死面積的影響見表10。

腦梗死體積觀察:由于TTC是脂溶性光敏感復合物,是呼吸鏈中吡啶-核苷結構酶系統的質子受體,與正常組織中的脫氫酶反應而呈紅色,而缺血組織內脫氫酶活性下降,不能反應,故不會產生變化呈蒼白。因此,假手術組(A)腦組織無梗塞,由表10可知,手術組(B)缺血側腦組織有明顯梗塞現象,腦片梗塞區占整個冠面的百分比為26.7±2.2(%),鹽酸N-甲基胡椒乙胺治療組(C)可顯著縮小缺血側腦組織梗塞面積,與手術組相比有非常顯著差異(P<0.01),5mg/kg鹽酸N-甲基胡椒乙胺組效果優于CoA組??杉?,鹽酸N-甲基胡椒乙胺對小鼠腦缺血/再灌注損傷引起的腦梗塞有顯著?;ぷ饔?。

實施例8

本實施例涉及鹽酸N-甲基胡椒乙胺對大鼠腦出血?;ぷ饔?。

實驗動物:Wistar大鼠,雌雄各半,體重180~250g,術前12h禁食,自由飲水。

1、實驗動物分組

動物隨機分成五組:1)假手術(sham)24h組;2)腦出血(Intracerebral?Haemorrhage,ICH)+生理鹽水組(模型組);3)ICH?+鹽酸N-甲基胡椒乙胺(2mg/kg)組,稱為高劑量組(h);4)ICH+鹽酸N-甲基胡椒乙胺(0.5mg/kg)組,稱為低劑量組(1);5)ICH+尼莫地平(Nim,0.5mg/kg)組。后四個組又分為4h,8h,12h,24h四個時間點亞組。生理鹽水、鹽酸N-甲基胡椒乙胺和尼莫地平于ICH造模前30min經大鼠尾靜脈給藥,每日一次?;郝⑸?,藥液總量控制在1?m1/200g體重:生理鹽水也按1?m1/200g體重給予。每組Wistar大鼠7只。

2、大鼠ICH模型的建立

本實施例參照Rosenberg等報道的方法。本發明選用的鼠腦出血模型是膠原酶誘導模型,此模型是目前國內外最為常用的腦出血模型之一。該模型中采用的膠原酶是一種金屬蛋白酶,可降解間質和基底膜膠原,將其注入腦內后,能降解血管壁的膠原,從而造成出血。此模型在某些方面的病理如腦水腫、組織學和行為學等與臨床很接近,而且該模型注入腦內的液體量較少,幾乎沒有藥液本身的壓迫占位效應。

具體操作步驟如下:實驗鼠經水合氯醛(350mg/kg)腹腔麻醉后,仰臥位固定于立體定位儀上,并按照包新民等報道的定位方法使大鼠前囟和后囟在同一平面。用碘酒局部消毒,頭皮正中切口,剪開骨膜,暴露前囟,于前囟后1mm,中線向左旁開3mm用五號針頭鉆一直徑大約為1?mm的小孔,深達硬腦膜。用固定于立體定位儀上的微量注射器沿鉆孔進針,進針深度為5.8mm(即尾狀核位置),緩慢注射膠原酶VI?0.5U。注射時間為3min,注射完后留針5min再退針,然后縫合皮膚,回籠飼養。假手術組只插針,不注射藥物,其余操作一樣。

統計學處理:各組測定值用均數±標準差(x±SD)表示,用SPSS統計軟件作單因素方差分析(one-way?ANOVA),顯著性水平P<0.05。

3、觀察指標及結果

3.1?ICH大鼠神經病學評分

動物蘇醒后,各組均按照Bedersog等的神經缺損分級評分標準(稍加改進)立即進行神經功能缺失評分。ICH模型大鼠神經病學評分標準見表11。

?

3分及以上動物入選本實驗,術后動物分籠飼養,正常進食進水。室溫控制在20~25℃,以后于造模后4h、8h、12h、24h進行評分。神經病學評分結果見表12。

結果:假手術組各時間點神經功能缺損評分均為0分;模型組動物麻醉清醒后立即評分均為3分或4分,一方面說明ICH大鼠造模成功,另一方面說明ICH造成了極為明顯的大鼠神經功能缺損。由表12可知,隨著時間的推移,各組ICH大鼠神經功能評分逐漸下降,而給藥組評分的下降快于模型組。在ICH后12h、24h大劑量鹽酸N-甲基胡椒乙胺給藥組與模型組、小劑量鹽酸N-甲基胡椒乙胺組相應時點的神經缺損評分比有顯著性差異(P<0.05)。ICH后12h、24h時點,尼莫地平組與模型組相應時點的神經缺損評分比有顯著性差異(P<0.05)。上述結果提示鹽酸N-甲基胡椒乙胺2?mg/kg靜脈給藥能夠改善ICH后神經缺損評分,其作用優于0.5mg/kg的尼莫地平產生的作用。

3.2腦含水量(BWC)測定

觀察鹽酸N-甲基胡椒乙胺對大鼠腦出血后4h、8h、12h、24h腦含水量的影響,各組動物在預定的時間點,經水合氯醛麻醉后,迅速斷頭取腦,將取出的腦組織放在已經用生理鹽水濕潤過的濾紙上,以防止水分蒸發。去除軟腦膜和血跡,以進針孔為中心,切取前半部分腦組織,精密稱重(精確到0.1mg)。取腦到稱完重量時間控制在5min內。然后置于95℃恒溫烘箱24h,再稱取干重。按Blliot公式計算腦含水量:BWC=(濕重一干重)/濕重×100%。結果見表13。

由13可知,大鼠腦出血后其腦含水量在4h、8h、12h、24h時點與假手術組比明顯上升,并具有顯著性差異(P<0.05),而且腦含水量隨著時間的進程不斷增加,并在腦出血后24小時達到一個高峰。治療組ICH大鼠腦含水量與模型組比,各個時點均不同程度降低。這些結果表明,鹽酸N-甲基胡椒乙胺2mg/kg給藥能夠降低ICH后大鼠腦水腫的嚴重程度,其治療效果與0.5mg/kg的尼莫地平的作用相似。??

3.3組織病理學觀察

觀察鹽酸N-甲基胡椒乙胺對大鼠腦出血病理形態的影響。隨機選取各組動物,于預定的時間點以水合氯醛深度麻醉,迅速斷頭取腦,切取含血腫的腦組織片(約5mm),立即放入10%甲醛液中,固定24h后經乙醇梯度脫水,二甲苯透明,浸蠟,包埋,切片(5μm),HE染色,封片。光鏡觀察病變區及附近腦組織病理改變。

結果:腦出血后大鼠腦組織出現明顯的病理改變,第4、8、12小時的切片可見到明顯的出血灶,病灶周圍組織疏松水腫,伴有少許炎癥細胞浸潤;第24小時的切片可見到病灶周圍組織仍然疏松水腫,炎癥細胞浸潤更為嚴重。預先給予大劑量鹽酸N-甲基胡椒乙胺治療ICH大鼠能夠明顯減輕腦出血后組織水腫和炎癥細胞浸潤;而預先給予小劑量鹽酸N-甲基胡椒乙胺或尼莫地平也能不同程度減輕上述病變。

3.4對腦組織中NE的影響

各組大鼠經水合氯醛麻醉后,快速斷頭取腦,切取針孔周圍腦組織,精密稱重后,用生理鹽水作為勻漿介質,在冰浴環境中以玻璃勻漿器制成10%的組織勻漿。取上清液ELISA法測定NE活性,檢測結果見表14。

由表14可知,模型組(ICH)與假手術組相比,大鼠腦出血后腦組織NE活性明顯增加(P<0.01);鹽酸N-甲基胡椒乙胺高劑量能顯著降低大鼠腦出血后腦組織的NE活性(P<0.01)。

3.5對大腦組織中N0的影響

各組大鼠經水合氯醛麻醉后,快速斷頭取腦,切取針孔周圍腦組織,精密稱重后,用生理鹽水作為勻漿介質,在冰浴環境中以玻璃勻漿器制成10%的組織勻漿,取上清液以硝酸還原酶法測定N0含量,檢測結果見表15。

由表15可知,模型組(ICH)與假手術組相比,大鼠腦出血后腦組織NO含量明顯增加(P<0.01),鹽酸N-甲基胡椒乙胺高劑量能降低大鼠腦出血后腦組織NO的含量(P<0.01)。

實施例9

本實施例涉及鹽酸N-甲基胡椒乙胺聯合其他藥物用于治療腦缺血實驗。

模型制備、給藥方法及指標檢測同實施例6。鹽酸N-甲基胡椒乙胺聯合NGF(注射用鼠神經生長因子)、Vit?B6(維生素B6)治療腦缺血。鹽酸N-甲基胡椒乙胺劑量1mg/kg?iv,大鼠腦損傷后即刻肌肉注射NGF?250U,Vit?B6劑量0.2mg/kg?iv。聯合用藥對局部腦缺血大鼠的影響結果見表16。由表16可知,鹽酸N-甲基胡椒乙胺與其他藥物合用效果更佳。

實施例10

本實施例涉及注射用鹽酸N-甲基胡椒乙胺用于治療缺血再灌注性腦血管疾病的在體動物實驗。

本實施例注射用鹽酸N-甲基胡椒乙胺凍干制劑處方及工藝如下:

處方(5ml/瓶×1000瓶):?

鹽酸N-甲基胡椒乙胺原料藥????10.0g

甘露醇???????????????100.0g

將以上原料溶于注射用水中,同時用鹽酸調節pH至3,用注射用水定容至5000ml,得鹽酸N-甲基胡椒乙胺制劑,分裝成1000瓶,5ml/瓶。???

將配制、分裝好的鹽酸N-甲基胡椒乙胺制劑放入凍干箱樣品室內→-30℃預凍→-15℃升華干燥→25℃再干燥→自動壓塞→蓋鋁蓋→壓蓋→質檢。

成品按注射用鹽酸N-甲基胡椒乙胺質量標準檢驗,應符合規定。

模型制備及給藥方法同實施例7,實驗各組腦缺血模型小鼠的梗死面積結果見表17。由表17可知,鹽酸N-甲基胡椒乙胺(凍干制劑)對小鼠腦缺血/再灌注損傷引起的腦梗塞有顯著?;ぷ饔?,且作用優于ATP及依達拉奉。

本發明選用通過膠原酶誘導產生的大鼠腦內出血模型為研究對象,以目前臨床治療腦出血常用藥尼莫地平為對比參照,研究了鹽酸N-甲基胡椒乙胺對腦出血的?;ぷ饔?。通過對比觀察給藥后ICH大鼠行為學變化、病理學、腦含水量改變,證明了鹽酸N-甲基胡椒乙胺對腦出血具有?;ぷ饔?。

本發明另外的動物試驗結果也表明鹽酸N-甲基胡椒乙胺(2mg/kg)能降低膠原酶所引起的ICH大鼠出血側腦BBB通透性的增加程度;可以阻止膠原酶所引起的ICH大鼠出血側腦內SOD含量的降低和MDA含量的升高;能降低膠原酶所引起的ICH大鼠出血側腦內TNF-Q表達和MPO含量的增加。表明鹽酸N-甲基胡椒乙胺可能通過?;CH后大鼠BBB、提高組織清除自由基的能力以及抗多形核粒細胞的聚集、釋放炎癥介質等機制實現對膠原酶引起的大鼠ICH具有?;ぷ饔?。

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甲基 胡椒 乙胺 制備 預防 治療 藥物 中的 應用
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