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埃瓦尔VS维戈塞尔塔: 制備具有保肝作用藥物的菊苣香豆素及其提取純化方法.pdf

摘要
申請專利號:

维戈塞尔塔vs皇家社会 www.vmyqew.com.cn CN201210223147.8

申請日:

20120702

公開號:

CN102697827A

公開日:

20121003

當前法律狀態:

有效性:

有效

法律詳情:
IPC分類號: A61K36/28,A61P1/16 主分類號: A61K36/28,A61P1/16
申請人: 新疆農業大學
發明人: 朱金芳,韓海霞
地址: 830052 新疆維吾爾自治區烏魯木齊市南昌路42號新疆農業大學食品與藥品學院
優先權: CN201210223147A
專利代理機構: 烏魯木齊合縱專利商標事務所 代理人: 湯建武;周星瑩
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法律狀態
申請(專利)號:

CN201210223147.8

授權公告號:

法律狀態公告日:

法律狀態類型:

摘要

一種制備具有保肝作用藥物的菊苣香豆素及其提取純化方法,該菊苣香豆素,其特征在于采用紫外分光光度法,以秦皮乙素為對照品,在350nm處測定,菊苣香豆素純度達到90%。本發明的技術效果:首次以毛菊苣或菊苣為原料,采用乙醇提取技術,大孔吸附樹脂富集技術,減壓蒸發技術,超聲波提取技術,制備型高效液相色譜純化技術,真空冷凍干燥技術相結合,得到了一種純度高、安全、有效、質量可控并具有保肝作用的菊苣香豆素,可應用于制備具有保肝作用的藥物或保健品。

權利要求書

1.一種制備具有保肝作用藥物的菊苣香豆素,其特征在于采用紫外分光光度法,以秦皮乙素為對照品,在350?nm處測定,菊苣香豆素純度達到90%;其中,該菊苣香豆素是通過以下方法得到的:將毛菊苣或/和菊苣藥材粉末用乙醇水溶液浸泡,?超聲波破壁,加熱回流提取,提取液過濾,減壓蒸發除去乙醇,加蒸餾水溶解,用大孔樹脂吸附法除去多糖、有機酸雜質,富集菊苣香豆素,減壓蒸發揮盡乙醇,得菊苣香豆素粗品,用甲醇溶解,超聲波提取助溶,溶液過濾,制備型高效液相色譜純化,收集的純化液經減壓蒸發,真空冷凍干燥得菊苣香豆素粉末。2.根據權利要求1所述的菊苣香豆素,其特征在于所述菊苣藥材主要來源于菊苣屬植物毛菊苣或/和菊苣。3.根據權利要求1或2所述的菊苣香豆素,其特征在于將所述毛菊苣或/和菊苣藥材粉末用體積濃度為50%至80%的乙醇水溶液浸泡6小時至12小時,?超聲波破壞細胞壁15分鐘至30分鐘,頻率為30?kHz至50kHz,加熱回流提取2次至3次,每次1小時至3小時,提取液經過濾,旋轉蒸發除去乙醇,加蒸餾水溶解。4.根據權利要求1或2或3所述的菊苣香豆素,其特征在于所用樹脂采用D-101或AB-8或NKA-9大孔吸附樹脂,上樣濃度為10μg·mL至50μg·mL,最大上樣量為35倍柱體積,上樣速度0.05?BV·min至0.15?BV·min,?然后依次用2BV至10?BV的蒸餾水以0.05?BV·min至0.15?BV·min的流速洗脫,6BV至10?BV的體積濃度為30%乙醇水溶液以0.02?BV·min至0.1?BV·min的流速洗脫,棄去洗脫液,再用6BV至10?BV的體積濃度為70%至80%乙醇水溶液以0.02?BV·min至0.1?BV·min的流速洗脫,收集洗脫液,從而除去多糖、有機酸等雜質,60℃減壓蒸發揮盡乙醇,得菊苣香豆素粗品。5.根據權利要求1或2或3或4所述的菊苣香豆素,其特征在于所述制備型高效液相色譜純化技術所用樣品為大孔吸附樹脂富集后的菊苣香豆素粗品,將該菊苣香豆素粗品,用甲醇溶解,配制成0.5?mg·mL至5?mg·mL的溶液,超聲波提取10?min?至20?min,頻率為30?kHz?至50?kHz,用0.45μm的膜過濾后注入制備型高效液相色譜儀,進樣量5?mL?至10?mL,采用ODS色譜柱,流動相為乙腈-水或甲醇-水,梯度洗脫,流速20?mL·min至50?mL·min,檢測波長350?nm,根據紫外檢測器的監測結果,收集菊苣香豆素中具有保肝作用的主要有效成分秦皮甲素和秦皮乙素,收集的純化液經減壓蒸發揮干有機溶劑后,真空冷凍干燥,得到純度達到90%的菊苣香豆素。6.一種制備具有保肝作用藥物的菊苣香豆素的提取純化方法,其特征在于采用紫外分光光度法,以秦皮乙素為對照品,在350?nm處測定,菊苣香豆素純度達到90%;其中,該菊苣香豆素是通過以下方法得到的:將毛菊苣或/和菊苣藥材粉末用乙醇水溶液浸泡,?超聲波破壁,加熱回流提取,提取液過濾,減壓蒸發除去乙醇,加蒸餾水溶解,用大孔樹脂吸附法除去多糖、有機酸雜質,富集菊苣香豆素,減壓蒸發揮盡乙醇,得菊苣香豆素粗品,用甲醇溶解,超聲波提取助溶,溶液過濾,制備型高效液相色譜純化,收集的純化液經減壓蒸發,真空冷凍干燥得菊苣香豆素粉末。7.根據權利要求6所述的菊苣香豆素的提取純化方法,其特征在于所述菊苣藥材主要來源于菊苣屬植物毛菊苣(Cichorium?glafulosum?boiss.et?Huet)或/和菊苣(Cichorium?intybus?L.)。8.根據權利要求6或7所述的菊苣香豆素的提取純化方法,其特征在于將所述毛菊苣或/和菊苣藥材粉末用體積濃度為50%至80%的乙醇水溶液浸泡6小時至12小時,?超聲波破壞細胞壁15分鐘至30分鐘,頻率為30?kHz至50kHz,加熱回流提取2次至3次,每次1小時至3小時,提取液經過濾,旋轉蒸發除去乙醇,加蒸餾水溶解。9.根據權利要求6或7或8所述的菊苣香豆素的提取純化方法,其特征在于所用樹脂采用D-101或AB-8或NKA-9大孔吸附樹脂,上樣濃度為10μg·mL至50μg·mL,最大上樣量為35倍柱體積,上樣速度0.05?BV·min至0.15?BV·min,?然后依次用2BV至10?BV的蒸餾水以0.05?BV·min至0.15?BV·min的流速洗脫,6BV至10?BV的體積濃度為30%乙醇水溶液以0.02?BV·min至0.1?BV·min的流速洗脫,棄去洗脫液,再用6BV至10?BV的體積濃度為70%至80%乙醇水溶液以0.02?BV·min至0.1?BV·min的流速洗脫,收集洗脫液,從而除去多糖、有機酸等雜質,60℃減壓蒸發揮盡乙醇,得菊苣香豆素粗品。10.根據權利要求6或7或8或9所述的菊苣香豆素的提取純化方法,其特征在于所述制備型高效液相色譜純化技術所用樣品為大孔吸附樹脂富集后的菊苣香豆素粗品,將該菊苣香豆素粗品,用甲醇溶解,配制成0.5?mg·mL至5?mg·mL的溶液,超聲波提取10?min?至20?min,頻率為30?kHz?至50?kHz,用0.45μm的膜過濾后注入制備型高效液相色譜儀,進樣量5?mL?至10?mL,采用ODS色譜柱,流動相為乙腈-水或甲醇-水,梯度洗脫,流速20?mL·min至50?mL·min,檢測波長350?nm,根據紫外檢測器的監測結果,收集菊苣香豆素中具有保肝作用的主要有效成分秦皮甲素和秦皮乙素,收集的純化液經減壓蒸發揮干有機溶劑后,真空冷凍干燥,得到純度達到90%的菊苣香豆素。

說明書

技術領域

本發明涉及植物提取物純化物及其應用于藥物或保健品的技術領域,是一種制備具有保肝作用藥物的菊苣香豆素及其提取純化方法。

背景技術

在中國菊苣屬植物有毛菊苣(Cichorium?glafulosum?boiss.et?Huet)和菊苣(Cichorium?intybus?L.)2個品種,為維吾爾習用藥材(維吾爾語名:卡森)。菊苣喜溫耐寒,對土壤要求不嚴,在中國西北、華北及東北等地均有分布,主要分布于中國新疆的南部(劉勇民.維吾爾藥志(上)[M].烏魯木齊.新疆人民出版社,1999:47)。中國新疆地區維吾爾醫主要用菊苣的地上部分入藥,味微苦,咸,性涼,具有清肝利膽,健胃消食,利尿消腫之功,用于濕熱黃疸,胃痛食少,水腫尿少(李鵬,趙紅,吳遠芳,?等,菊苣的生藥鑒定[?J?].?農墾醫學,2001,?23?(3)?:?149-151)。菊苣作為一種寶貴的植物資源在保健食品、醫藥及天然飼料添加劑等領域有較高的利用價值,研究開發前景廣闊(吳洪新,呼天明.菊苣系列產品的開發研究評述[J].西北農林科技大學,2006,34(2):34-38)。

菊苣主要含有香豆素、倍半萜、三萜、糖類等成分(Seto?M,?Miyase?T,?Umehara?K,?et?al.Sesquiterpene?lactones?from?Cichorium?endivia?L.?and?C.?intybus?L.?and?cytotoxic?activity?[?J?].?Chem?Pharm?Bull,?1988,?36?(7)?:?2423-2429.),香豆素中的秦皮甲素、秦皮乙素具有保肝作用(Gilani?AH,?Janbaz?KH,?Shah?BH.?Esculetin?prevents?liver?damage?induced?by?paracetamol?and?CCl4?[J].?Pharmacol?Res,1998,?37?(1)?:?31-35.)。

據統計,我國發病率及死亡率最高的疾病中,肝病名列榜首,大中城市中脂肪肝的發病率已達10%。維吾爾藥清熱卡森沖劑、護肝布祖熱顆粒、炎消迪娜爾糖漿均是以菊苣為主要原料生產的抗肝炎及保肝制劑,長期臨床實踐證明,菊苣具有明顯的抗肝炎及保肝療效(中華人民共和國藥典委員會.中華人民共和國衛生部藥品標準維吾爾藥分冊[M].烏魯木齊.新疆科技衛生出版社,1999:136、159、189;買買提哈斯木·艾爾肯米吉提.維藥清熱卡森顆粒治療脂肪肝41?例觀察[J].中國民族醫藥雜志,2000,6(7):11-12)。

????近幾年來,雖然中國新疆各維吾爾藥生產企業及各地區維吾爾醫醫院以毛菊苣作為主要藥材生產了幾十種制劑,但由于這些制劑普遍存在生產工藝落后(只進行水提,所含雜質多、服用量大),無具體控制菊苣質量的含量測定方法和質量控制指標,且功能主治過于寬泛使臨床上很難明確定位等問題,故無法達到國家新藥標準的要求,更無法打入國際市場,大大影響了菊苣的利用及推廣。目前對菊苣有效部位的研究主要采用乙醇、乙酸乙脂、正丁醇、正己烷、石油醚、氯仿等有機溶劑提取純化,這些傳統的提純方法存在耗能、耗時、成本高、純度低、污染大并造成有機溶劑殘留等缺點(杜海燕,原思通,江佩芬.菊苣的化學成分研究.中國中藥雜志,1998,23(11):682;鄭紅梅,王大光.菊苣正己烷提取物對血糖、血脂的影響[J].中國中醫藥信息雜志,2000,4(7):38-39;徐雅梅,呼天明.菊苣根提取物的抑菌活性研究[J].西北植物學報,?2006,?26(3):0615-0619)。

發明內容

本發明提供了一種制備具有保肝作用藥物的菊苣香豆素及其提取純化方法,其克服了上述現有技術的不足,其首次以毛菊苣或菊苣為原料,采用乙醇提取技術、大孔吸附樹脂富集技術、減壓蒸發技術、超聲波提取技術、制備型高效液相色譜純化技術、真空冷凍干燥技術相結合,得到了純度高、安全、有效、質量可控并具有保肝作用的菊苣香豆素,可應用于制備具有保肝作用的藥物或保健品。

本發明的技術方案之一是按以下技術措施來實現的:一種制備具有保肝作用藥物的菊苣香豆素,其采用紫外分光光度法,以秦皮乙素為對照品,在350?nm處測定,菊苣香豆素純度達到90%;其中,該菊苣香豆素是通過以下方法得到的:將毛菊苣或/和菊苣藥材粉末用乙醇水溶液浸泡,?超聲波破壁,加熱回流提取,提取液過濾,減壓蒸發除去乙醇,加蒸餾水溶解,用大孔樹脂吸附法除去多糖、有機酸雜質,富集菊苣香豆素,減壓蒸發揮盡乙醇,得菊苣香豆素粗品,用甲醇溶解,超聲波提取助溶,溶液過濾,制備型高效液相色譜純化,收集的純化液經減壓蒸發,真空冷凍干燥得菊苣香豆素粉末。

下面是對上述技術方案之一的進一步優化或/和選擇:

所述菊苣藥材主要來源于菊苣屬植物毛菊苣(Cichorium?glafulosum?boiss.et?Huet)或/和菊苣(Cichorium?intybus?L.)。

將所述毛菊苣或/和菊苣藥材粉末用體積濃度為50%至80%的乙醇水溶液浸泡6小時至12小時,?超聲波破壞細胞壁15分鐘至30分鐘,頻率為30?kHz至50kHz,加熱回流提取2次至3次,每次1小時至3小時,提取液經過濾,旋轉蒸發除去乙醇,加蒸餾水溶解。

所用樹脂采用D-101或AB-8或NKA-9大孔吸附樹脂,上樣濃度為10μg·mL-1至50μg·mL-1,最大上樣量為35倍柱體積,上樣速度0.05?BV·min-1至0.15?BV·min-1,?然后依次用2BV至10?BV的蒸餾水以0.05?BV·min-1至0.15?BV·min-1的流速洗脫,6BV至10?BV的體積濃度為30%乙醇水溶液以0.02?BV·min-1至0.1?BV·min-1的流速洗脫,棄去洗脫液,再用6BV至10?BV的體積濃度為70%至80%乙醇水溶液以0.02?BV·min-1至0.1?BV·min-1的流速洗脫,收集洗脫液,從而除去多糖、有機酸等雜質,60℃減壓蒸發揮盡乙醇,得菊苣香豆素粗品。

所述制備型高效液相色譜純化技術所用樣品為大孔吸附樹脂富集后的菊苣香豆素粗品,將該菊苣香豆素粗品,用甲醇溶解,配制成0.5?mg·mL-1至5?mg·mL-1的溶液,超聲波提取10?min?至20?min,頻率為30?kHz?至50?kHz,用0.45μm的膜過濾后注入制備型高效液相色譜儀,進樣量5?mL?至10?mL,采用ODS色譜柱,流動相為乙腈-水或甲醇-水,梯度洗脫,流速20?mL·min-1至50?mL·min-1,檢測波長350?nm,根據紫外檢測器的監測結果,收集菊苣香豆素中具有保肝作用的主要有效成分秦皮甲素和秦皮乙素,收集的純化液經減壓蒸發揮干有機溶劑后,真空冷凍干燥,得到純度達到90%的菊苣香豆素。

本發明的技術方案之二是按以下技術措施來實現的:一種制備具有保肝作用藥物的菊苣香豆素的提取純化方法,其采用紫外分光光度法,以秦皮乙素為對照品,在350?nm處測定,菊苣香豆素純度達到90%;其中,該菊苣香豆素是通過以下方法得到的:將毛菊苣或/和菊苣藥材粉末用乙醇水溶液浸泡,?超聲波破壁,加熱回流提取,提取液過濾,減壓蒸發除去乙醇,加蒸餾水溶解,用大孔樹脂吸附法除去多糖、有機酸雜質,富集菊苣香豆素,減壓蒸發揮盡乙醇,得菊苣香豆素粗品,用甲醇溶解,超聲波提取助溶,溶液過濾,制備型高效液相色譜純化,收集的純化液經減壓蒸發,真空冷凍干燥得菊苣香豆素粉末。

下面是對上述技術方案之一的進一步優化或/和選擇:

所述菊苣藥材主要來源于菊苣屬植物毛菊苣(Cichorium?glafulosum?boiss.et?Huet)或/和菊苣(Cichorium?intybus?L.)。

將所述毛菊苣或/和菊苣藥材粉末用體積濃度為50%至80%的乙醇水溶液浸泡6小時至12小時,?超聲波破壞細胞壁15分鐘至30分鐘,頻率為30?kHz至50kHz,加熱回流提取2次至3次,每次1小時至3小時,提取液經過濾,旋轉蒸發除去乙醇,加蒸餾水溶解。

所用樹脂采用D-101或AB-8或NKA-9大孔吸附樹脂,上樣濃度為10μg·mL-1至50μg·mL-1,最大上樣量為35倍柱體積,上樣速度0.05?BV·min-1至0.15?BV·min-1,?然后依次用2BV至10?BV的蒸餾水以0.05?BV·min-1至0.15?BV·min-1的流速洗脫,6BV至10?BV的體積濃度為30%乙醇水溶液以0.02?BV·min-1至0.1?BV·min-1的流速洗脫,棄去洗脫液,再用6BV至10?BV的體積濃度為70%至80%乙醇水溶液以0.02?BV·min-1至0.1?BV·min-1的流速洗脫,收集洗脫液,從而除去多糖、有機酸等雜質,60℃減壓蒸發揮盡乙醇,得菊苣香豆素粗品。

所述制備型高效液相色譜純化技術所用樣品為大孔吸附樹脂富集后的菊苣香豆素粗品,將該菊苣香豆素粗品,用甲醇溶解,配制成0.5?mg·mL-1至5?mg·mL-1的溶液,超聲波提取10?min?至20?min,頻率為30?kHz?至50?kHz,用0.45μm的膜過濾后注入制備型高效液相色譜儀,進樣量5?mL?至10?mL,采用ODS色譜柱,流動相為乙腈-水或甲醇-水,梯度洗脫,流速20?mL·min-1至50?mL·min-1,檢測波長350?nm,根據紫外檢測器的監測結果,收集菊苣香豆素中具有保肝作用的主要有效成分秦皮甲素和秦皮乙素,收集的純化液經減壓蒸發揮干有機溶劑后,真空冷凍干燥,得到純度達到90%的菊苣香豆素。

本發明的技術效果:首次以毛菊苣或菊苣為原料,采用乙醇提取技術,大孔吸附樹脂富集技術,減壓蒸發技術,超聲波提取技術,制備型高效液相色譜純化技術,真空冷凍干燥技術相結合,得到了一種純度高、安全、有效、質量可控并具有保肝作用的菊苣香豆素,可應用于制備具有保肝作用的藥物或保健品。

具體實施方式

本發明不受下述實施例的限制,可依據本發明的技術方案和實際情況來確定具體的實施方式。

實施例1:該制備具有保肝作用藥物的菊苣香豆素采用紫外分光光度法,以秦皮乙素為對照品,在350?nm處測定,菊苣香豆素純度達到90%;其中,該菊苣香豆素是通過以下方法得到的:將毛菊苣或/和菊苣藥材粉末用乙醇水溶液浸泡,?超聲波破壁,加熱回流提取,提取液過濾,減壓蒸發除去乙醇,加蒸餾水溶解,用大孔樹脂吸附法除去多糖、有機酸雜質,富集菊苣香豆素,減壓蒸發揮盡乙醇,得菊苣香豆素粗品,用甲醇溶解,超聲波提取助溶,溶液過濾,制備型高效液相色譜純化,收集的純化液經減壓蒸發,真空冷凍干燥得菊苣香豆素粉末。

實施例2:與實施例1的不同之處在于:實施例2的菊苣藥材主要來源于菊苣屬植物毛菊苣(Cichorium?glafulosum?boiss.et?Huet)或/和菊苣(Cichorium?intybus?L.)。

實施例3:與實施例1至實施例2的不同之處在于:實施例3將所述毛菊苣或/和菊苣藥材粉末用體積濃度為50%至80%的乙醇水溶液浸泡6小時至12小時,?超聲波破壞細胞壁15分鐘至30分鐘,頻率為30?kHz至50kHz,加熱回流提取2次至3次,每次1小時至3小時,提取液經過濾,旋轉蒸發除去乙醇,加蒸餾水溶解。采用超聲波提取技術,打破了細胞壁的屏障作用,增加并加速了植物細胞內有效成分向溶劑中的擴散。

實施例4:與實施例1至實施例3的不同之處在于:實施例4所用樹脂采用D-101或AB-8或NKA-9大孔吸附樹脂,上樣濃度為10μg·mL-1至50μg·mL-1,最大上樣量為35倍柱體積,上樣速度0.05?BV·min-1至0.15?BV·min-1,?然后依次用2BV至10?BV的蒸餾水以0.05?BV·min-1至0.15?BV·min-1的流速洗脫,6BV至10?BV的體積濃度為30%乙醇水溶液以0.02?BV·min-1至0.1?BV·min-1的流速洗脫,棄去洗脫液,再用6BV至10?BV的體積濃度為70%至80%乙醇水溶液以0.02?BV·min-1至0.1?BV·min-1的流速洗脫,收集洗脫液,從而除去多糖、有機酸等雜質,60℃減壓蒸發揮盡乙醇,得菊苣香豆素粗品。經過以上大孔吸附樹脂富集后得到的粗品中菊苣香豆素純度可達40%(w/w)。

實施例5:與實施例1至實施例4的不同之處在于:實施例5所述制備型高效液相色譜純化技術所用樣品為大孔吸附樹脂富集后的菊苣香豆素粗品,將該菊苣香豆素粗品,用甲醇溶解,配制成0.5?mg·mL-1至5?mg·mL-1的溶液,超聲波提取10?min?至20?min,頻率為30?kHz?至50?kHz,用0.45μm的膜過濾后注入制備型高效液相色譜儀,進樣量5?mL?至10?mL,采用ODS色譜柱,流動相為乙腈-水或甲醇-水,梯度洗脫,流速20?mL·min-1至50?mL·min-1,檢測波長350?nm,根據紫外檢測器的監測結果,收集菊苣香豆素中具有保肝作用的主要有效成分秦皮甲素和秦皮乙素,收集的純化液經減壓蒸發揮干有機溶劑后,真空冷凍干燥,得到純度達到90%的菊苣香豆素。

實施例6:該制備具有保肝作用藥物的菊苣香豆素按下述步驟得到:將菊苣藥材粉末用體積濃度為50%乙醇浸泡6?h,?超聲波破壞細胞壁15?min,頻率為30?kHz,加熱回流提取2次,每次1h,提取液經過濾,旋轉蒸發除去乙醇,加蒸餾水溶解。采用超聲波提取技術,打破了細胞壁的屏障作用,增加并加速了植物細胞內有效成分向溶劑中的擴散。用D-101大孔吸附樹脂,上樣濃度為10μg·mL-1,最大上樣量為35?BV(35倍柱體積),上樣速度0.05?BV·min-1,?然后依次用2?BV的蒸餾水以0.05?BV·min-1的流速洗脫,6?BV的體積濃度為30%乙醇水溶液以0.02?BV·min-1的流速洗脫,棄去洗脫液,再用6?BV的體積濃度為70%乙醇水溶液以0.02?BV·min-1的流速洗脫,收集洗脫液,從而除去多糖、有機酸等雜質,60℃減壓蒸發揮盡乙醇,得菊苣香豆素粗品。將菊苣香豆素粗品,用甲醇溶解,配制成0.5?mg·mL-1的溶液,超聲波提取10?min,頻率為30?kHz,用0.45μm的膜過濾后注入制備型高效液相色譜儀,進樣量5?mL,采用ODS色譜柱,流動相為乙腈-水或甲醇-水,梯度洗脫,流速20?mL·min-1,檢測波長350?nm,根據紫外檢測器的監測結果,收集菊苣香豆素中具有保肝作用的主要有效成分秦皮甲素和秦皮乙素,收集的純化液經減壓蒸發揮干有機溶劑后,真空冷凍干燥,得到菊苣香豆素。

實施例7:該制備具有保肝作用藥物的菊苣香豆素按下述步驟得到:將毛菊苣藥材粉末用體積濃度為80%乙醇水溶液浸泡8?h,?超聲波破壞細胞壁20?min,頻率為40?kHz,加熱回流提取3次,每次2h,提取液經過濾,旋轉蒸發除去乙醇,加蒸餾水溶解。采用超聲波提取技術,打破了細胞壁的屏障作用,增加并加速了植物細胞內有效成分向溶劑中的擴散。用AB-8大孔吸附樹脂,上樣濃度為20μg·mL-1,最大上樣量為35?BV(35倍柱體積),上樣速度0.06?BV·min-1,?然后依次用10?BV的蒸餾水以0.15?BV·min-1的流速洗脫,10?BV的體積濃度為30%乙醇水溶液以0.1?BV·min-1的流速洗脫,棄去洗脫液,再用10?BV的體積濃度為80%乙醇水溶液以0.1?BV·min-1的流速洗脫,收集洗脫液,從而除去多糖、有機酸等雜質,60℃減壓蒸發揮盡乙醇,得菊苣香豆素粗品。將菊苣香豆素粗品,用甲醇溶解,配制成2?mg·mL-1的溶液,超聲波提取15?min,頻率為35?kHz,用0.45μm的膜過濾后注入制備型高效液相色譜儀,進樣量10?mL,采用ODS色譜柱,流動相為乙腈-水或甲醇-水,梯度洗脫,流速50?mL·min-1,檢測波長350?nm,根據紫外檢測器的監測結果,收集菊苣香豆素中具有保肝作用的主要有效成分秦皮甲素和秦皮乙素,收集的純化液經減壓蒸發揮干有機溶劑后,真空冷凍干燥,得到菊苣香豆素。

實施例8:該制備具有保肝作用藥物的菊苣香豆素按下述步驟得到:將菊苣藥材粉末用體積濃度為70%乙醇水溶液浸泡12?h,?超聲波破壞細胞壁25?min,頻率為35?kHz,加熱回流提取2.5次,每次1.5?h,提取液經過濾,旋轉蒸發除去乙醇,加蒸餾水溶解。采用超聲波提取技術,打破了細胞壁的屏障作用,增加并加速了植物細胞內有效成分向溶劑中的擴散。用NKA-9大孔吸附樹脂,上樣濃度為35μg·mL-1,最大上樣量為35?BV(35倍柱體積),上樣速度0.15?BV·min-1,?然后依次用8?BV的蒸餾水以0.15?BV·min-1的流速洗脫,8?BV的體積濃度為30%乙醇水溶液以0.1?BV·min-1的流速洗脫,棄去洗脫液,再用8?BV的體積濃度為80%乙醇水溶液以0.1?BV·min-1的流速洗脫,收集洗脫液,從而除去多糖、有機酸等雜質,60℃減壓蒸發揮盡乙醇,得菊苣香豆素粗品。將菊苣香豆素粗品,用甲醇溶解,配制成5?mg·mL-1的溶液,超聲波提取20?min,頻率為50?kHz,用0.45μm的膜過濾后注入制備型高效液相色譜儀,進樣量10?mL,采用ODS色譜柱,流動相為乙腈-水或甲醇-水,梯度洗脫,流速50?mL·min-1,檢測波長350?nm,根據紫外檢測器的監測結果,收集菊苣香豆素中具有保肝作用的主要有效成分秦皮甲素和秦皮乙素,收集的純化液經減壓蒸發揮干有機溶劑后,真空冷凍干燥,得到純度達到90%的菊苣香豆素。

實施例9:該制備具有保肝作用藥物的菊苣香豆素按下述步驟得到:將毛菊苣藥材粉末用體積濃度為60%乙醇水溶液浸泡8?h,?超聲波破壞細胞壁30min,頻率為50kHz,加熱回流提取2次,每次3h,提取液經過濾,旋轉蒸發除去乙醇,加蒸餾水溶解。采用超聲波提取技術,打破了細胞壁的屏障作用,增加并加速了植物細胞內有效成分向溶劑中的擴散。用AB-8大孔吸附樹脂,上樣濃度為25μg·mL-1,最大上樣量為35?BV(35倍柱體積),上樣速度0.08?BV·min-1,?然后依次用6?BV的蒸餾水以0.08?BV·min-1的流速洗脫,6?BV的體積濃度為30%乙醇水溶液以0.03?BV·min-1的流速洗脫,棄去洗脫液,再用6?BV的體積濃度為70%乙醇水溶液以0.03?BV·min-1的流速洗脫,收集洗脫液,從而除去多糖、有機酸等雜質,60℃減壓蒸發揮盡乙醇,得菊苣香豆素粗品。將菊苣香豆素粗品,用甲醇溶解,配制成5?mg·mL-1的溶液,超聲波提取20?min,頻率為50?kHz,用0.45μm的膜過濾后注入制備型高效液相色譜儀,進樣量10?mL,采用ODS色譜柱,流動相為乙腈-水或甲醇-水,梯度洗脫,流速50?mL·min-1,檢測波長350?nm,根據紫外檢測器的監測結果,收集菊苣香豆素中具有保肝作用的主要有效成分秦皮甲素和秦皮乙素,收集的純化液經減壓蒸發揮干有機溶劑后,真空冷凍干燥,得到菊苣香豆素。

實施例10:該制備具有保肝作用藥物的菊苣香豆素按下述步驟得到:將菊苣藥材粉末用體積濃度為70%乙醇水溶液浸泡12?h,?超聲波破壞細胞壁30min,頻率為40kHz,加熱回流提取2次,每次1.5h,提取液經過濾,旋轉蒸發除去乙醇,加蒸餾水溶解。采用超聲波提取技術,打破了細胞壁的屏障作用,增加并加速了植物細胞內有效成分向溶劑中的擴散。用NKA-9大孔吸附樹脂,上樣濃度為50μg·mL-1,最大上樣量為35?BV(35倍柱體積),上樣速度0.15?BV·min-1,?然后依次用10?BV的蒸餾水以0.15?BV·min-1的流速洗脫,?10?BV的體積濃度為30%乙醇水溶液以0.1?BV·min-1的流速洗脫,棄去洗脫液,再用10?BV的體積濃度為80%乙醇水溶液以0.1?BV·min-1的流速洗脫,收集洗脫液,從而除去多糖、有機酸等雜質,60℃減壓蒸發揮盡乙醇,得菊苣香豆素粗品。將菊苣香豆素粗品,用甲醇溶解,配制成5?mg·mL-1的溶液,超聲波提取20?min,頻率為40?kHz,用0.45μm的膜過濾后注入制備型高效液相色譜儀,進樣量7?mL,采用ODS色譜柱,流動相為乙腈-水或甲醇-水,梯度洗脫,流速25?mL·min-1,檢測波長350?nm,根據紫外檢測器的監測結果,收集菊苣香豆素中具有保肝作用的主要有效成分秦皮甲素和秦皮乙素,收集的純化液經減壓蒸發揮干有機溶劑后,真空冷凍干燥,得到菊苣香豆素。

在本發明中:除另有說明外,百分比%一般是指質量百分比。?BV為倍柱體積。?

下面是對上述實施例所得菊苣香豆素中香豆素的測定:

以秦皮乙素為對照品,采用紫外分光光度法測定菊苣香豆素中香豆素的含量。

1?溶液的制備

對照品溶液的制備??精密稱取秦皮乙素對照品適量,加無水乙醇制成每1?mL含秦皮乙素0.25?mg的溶液,搖勻,即得。

供試品溶液的制備??精密稱取菊苣香豆素提取純化液2?mL,置25?mL容量瓶中,用無水乙醇定容后作為供試品溶液。

2?檢測波長的選擇

取上述對照品溶液,在910?nm~190?nm波長范圍內進行波長掃描,確定對照品溶液的最大吸收波長為350?nm,并以此作為其測定波長。

3?線性關系的考察

分別精密吸取秦皮乙素對照品溶液0.2、0.6、1.0、1.4、1.8?mL,分別置10?mL量瓶中,用無水乙醇稀釋至刻度,搖勻,在350?nm波長處測定吸收度,以吸收度為縱坐標,濃度為橫坐標,進行線性回歸,得回歸方程,?Y=0.0384X-0.0343,R2=0.9989,結果表明秦皮乙素在0.005~0.045?mg·mL-1范圍內線性良好。

4?穩定性試驗?

取供試品溶液分別于配制后0,2,4,6,8,24,72?h于最大波長處測定吸光度,計算RSD為0.67%(n=7),表明供試品溶液在72?h內穩定。

5?重復性試驗?

精密稱取同一批號的供試品6份,按供試品溶液的制備和測定法進行操作,求得RSD=1.66%(n=6),表明該法重復性較好。

6?回收率試驗?

采用加樣回收法,取重復性實驗項下的已知含量的供試品,精密吸取1?mL,再準確加入一定量的對照品溶液,混勻,定容至25?mL,于最大波長處測定吸光度,結果見表1。平均回收率為100.28%,RSD為1.97%。

表1??回收率試驗結果

樣品含量(μg) 對照品加入量(μg) 測量值(μg) 回收率(%) 302.84 250.00 550.23 98.96% 302.84 250.00 560.15 102.92% 302.84 250.00 557.48 101.86% 302.84 300.00 606.98 101.38% 302.84 300.00 596.72 97.96% 302.84 300.00 602.37 99.84% 302.84 350.00 644.54 97.63% 302.84 350.00 650.71 99.39% 302.84 350.00 661.95 102.60%

7?菊苣香豆素粗品中香豆素含量

????將菊苣香豆素粗品,60℃真空干燥得黃棕色粉末,稱取0.2g,加入150mL無水乙醇超聲使溶解,精密吸取1mL定容至25mL,測定香豆素含量。

表2?本發明所得菊苣香豆素粗品中香豆素含量的平均值范圍

實施例 取樣量(mg) 香豆素含量(mg) 香豆素百分含量 (%) 1至10 200 91.87至96.36 45.93至48.18

8?菊苣香豆素凍干粉末中香豆素含量

稱取菊苣香豆素中香豆素凍干粉末0.1g,加入150mL無水乙醇超聲使溶解,精密吸取1mL定容至25mL,測定香豆素含量

表3?本發明所得菊苣香豆素中香豆素含量的平均值范圍

實施例 取樣量(mg) 香豆素含量(mg) 香豆素百分含量 (%) 1至10 100 91.49至95.41 91.49至95.41

下面是對上述實施例所得菊苣香豆素保肝作用的試驗:

1?對四氯化碳所致小鼠急性肝損傷的影響

取體重18±2g的昆明種小鼠60只,雌雄各半,隨機分成生理鹽水組,模型組,本發明所得菊苣香豆素原料大、中、小劑量組,及聯苯雙酯(200?mg·kg-?1)陽性對照藥組,每組10只。給藥7天,末次給藥1?h后除生理鹽水組外,模型及給藥各組小鼠均腹腔注射0.1%的四氯化碳橄欖油溶液?10?ml.kg?-1?,24小時后采集血液,離心后分離血清測定谷丙轉氨酶(ALT)、谷草轉氨酶(AST)。結果表明:菊苣香豆素可以降低四氯化碳引起的血清?ALT和AST升高?,對化學性肝臟損傷有?;ぷ饔?。詳見表4。

表4??本發明所得菊苣香豆素對四氯化碳所致小鼠急性肝損傷的影響(`x±s,n=10)

組別 劑量(g.kg-1) ALT(U.L-1) AST(U.L-1) 正常 ? 52.75±12.28 80.30±15.99 模型 ? 132.73±30.94 157.54±37.06 聯苯雙酯 0.2 61.19 ±16.22** 119.62±31.05** 本發明菊苣香豆素大劑量 2 74.93±20.61** 109.98±27.58** 本發明菊苣香豆素中劑量 1 86.24±22.49** 120.09±32.11** 本發明菊苣香豆素小劑量 0.5 103.01±20.40* 129.45±35.99*

注:*與模型組比P﹤0.05,**與模型組比P﹤0.01

2?對酒精所致大鼠慢性肝損傷的影響

取體重200±20?g的Wistar大鼠60只,雌雄各半,,隨機分成生理鹽水組,模型組,本發明所得菊苣香豆素原料大、中、小劑量組,及聯苯雙酯(140?mg·kg-?1)陽性對照藥組,每組10只。除生理鹽水組外,模型組給予56°紅星二鍋頭(15?ml?.kg-?1)?灌胃,給藥組給予?56°紅星二鍋頭(15?ml?.kg-?1)和藥物共同灌胃,各組大鼠每日早晨給藥?1?次,自由進食及飲水,共6周,于末次灌胃之后禁食12?h,采集血液,離心后分離血清測定谷丙轉氨酶(ALT)、谷草轉氨酶(AST)。結果表明:菊苣香豆素可以降低酒精所致的血清?ALT和AST升高?,對酒精性慢性肝臟損傷有?;ぷ饔?。詳見表5。

表5??本發明所得菊苣香豆素對酒精所致大鼠慢性肝損傷的影響(`x±s,n=10)

組別 劑量(g.kg-1) ALT(U.L-1) AST(U.L-1) 正常 ? 60.01±13.34 94.62±19.43 模型 ? 167.67±25.96 246.01±36.14 聯苯雙酯 0.14 107.06±22.19** 156.49±29.49** 本發明菊苣香豆素大劑量 1.4 118.66±20.54** 151.04±28.49** 本發明菊苣香豆素中劑量 0.7 133.21±25.62** 174.53±36.69** 本發明菊苣香豆素小劑量 0.35 146.25±23.51* 218.77±30.22*

注:*與模型組比P﹤0.05,**與模型組比P﹤0.01

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制備 具有 作用 藥物 菊苣香豆素 及其 提取 純化 方法
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