• / 25
  • 下載費用:30 金幣  

维戈塞尔塔vs标准列日: 關白附總生物堿及關附壬素的新用途.pdf

摘要
申請專利號:

维戈塞尔塔vs皇家社会 www.vmyqew.com.cn CN201210203325.0

申請日:

20120619

公開號:

CN102697774A

公開日:

20121003

當前法律狀態:

有效性:

有效

法律詳情:
IPC分類號: A61K31/407,A61K36/714,A61P43/00,A61P9/06,A61K125/00 主分類號: A61K31/407,A61K36/714,A61P43/00,A61P9/06,A61K125/00
申請人: 中國藥科大學,吉林敖東洮南藥業股份有限公司
發明人: 王廣基,湯依群,董秀華,孫建國,于鵬,劉靜涵,劉建平,楊春華,劉巍,朱天全,徐靜,孫申國,程志國,汪旻暉
地址: 210009 江蘇省南京市童家巷24號
優先權: CN201210203325A
專利代理機構: 北京市浩天知識產權代理事務所 代理人: 劉云貴;雒純丹
PDF完整版下載: PDF下載
法律狀態
申請(專利)號:

CN201210203325.0

授權公告號:

法律狀態公告日:

法律狀態類型:

摘要

本發明提供了一種關白附總生物堿的制備方法,以及其在制備慢鈉離子通道阻斷劑和制備抗心率失常藥物中的應用。研究表明,關白附總生物堿和鹽酸關附甲素均對豚鼠心室肌慢鈉電流具有抑制作用。特別是關附壬素在制備藥物代謝酶抑制劑中的應用。本發明還提供了關附甲素在制備慢鈉離子通道阻斷劑中的應用。

權利要求書

1.關附壬素在制備藥物代謝酶抑制劑中的應用。2.如權利要求1所述的應用,其特征在于所述藥物代謝酶為細胞色素P450酶系中的一種或幾種。3.如權利要求2所述的應用,其特征在于所述藥物代謝酶為CYP2D6。4.一種關白附總生物堿,其特征在于所述總生物堿由如下方法制備:步驟1:取關白附藥材,在10-30℃下用50-95%乙醇冷浸提取,回收溶劑,得浸膏;步驟2:取步驟1得到的浸膏,以鹽酸水溶液捏溶,將酸溶液低溫冷藏,除去上層的脂溶性雜質,取酸水液;步驟3:取步驟2得到的酸水液,用乙酸乙酯萃取,酸水母液加氨水調節pH=8-11;步驟4:將步驟3中經氨水堿化的溶液迅速用乙酸乙酯萃取,取乙酸乙酯層,回收溶劑,真空干燥,得關白附總生物堿。5.如權利要求4所述的關白附總生物堿,其特征在于:步驟2中鹽酸水溶液為0.5-1.5mol/l;和/或步驟3中:酸水母液加氨水調節pH=9。6.如權利要求4或5所述的關白附總生物堿,其特征在于所述關白附總生物堿還可以按常規工藝制成關白附總堿鹽。7.如權利要求4-6任一所述的關白附總生物堿在制備慢鈉離子通道阻斷劑中的應用。8.一種關白附總生物堿的制備方法,其特征在于該方法包括如下步驟:步驟1:取關白附藥材,在10-30℃下用50-95%乙醇冷浸提取,回收溶劑,得浸膏;步驟2:取步驟1得到的浸膏,以鹽酸水溶液捏溶,將酸溶液低溫冷藏,除去上層的脂溶性雜質,取酸水液;步驟3:取步驟2得到的酸水液,用乙酸乙酯萃取,酸水母液加氨水調節pH=8-11;步驟4:將步驟3中經氨水堿化的溶液迅速用乙酸乙酯萃取,取乙酸乙酯層,回收溶劑,真空干燥,得關白附總生物堿。9.如權利要求8所述的制備方法,其特征在于:步驟2中鹽酸水溶液為0.5-1.5mol/l;和/或步驟3中:酸水母液加氨水調節pH=9。10.一種關附甲素在制備慢鈉離子通道阻斷劑中的應用。

說明書

技術領域

本發明涉及關白附總生物堿及關附壬素的新用途。具體涉及關白附總生物堿在制備慢鈉離子通道阻斷劑及抗心律失常藥物中的應用。?

背景技術

關白附為中藥毛莨科黃花烏頭Aconitum?coreanum(Levl,)Rapaics的塊根,為常見中藥之一,主治心痛血痹,具有祛風,燥濕,化痰,止痛作用,民間用藥療效好。其化學成份主要有關附庚素(Guanfu?base?G,GFG),關附甲素(Guanfu?base?A,GFA),關附壬素(Guanfu?base?I,GFI)等,三者均為二萜類生物堿。現代藥理學研究表明關附甲素、關附庚素、關附壬素等具有抗心律失常、抗炎和鎮痛作用。但由于關附甲素提取得率為0.1%左右,提取工藝周期較長,原料藥損耗大,未能充分利用關白附資源。?

近年來研究長QT綜合癥(L-QT,易誘發室性心律失常,暈厥和猝死的一系列綜合癥)及其他心律失常發生機制的新靶點,有實驗表明,心臟鈉離子通道基因SCN5A的突變,造成慢鈉電流反復開發,延緩電流衰減,使動作電位平臺期延長,引起L-QT。這種變化在慢頻率下尤其明顯,是LQT3發生的重要原因,也是誘發其他心律失常的重要原因。?

發明內容

本發明目的之一在于提供關白附總生物堿的制備方法。?

本發明目的之二在于提供關白附總生物堿在制備慢鈉離子通道阻斷劑中的應用。?

本發明目的之三在于提供關附甲素在制備慢鈉離子通道阻斷劑中的應用。?

本發明目的之四在于提供關附壬素在抑制藥物代謝酶活性新用途。?

本發明的目的是通過如下技術方案實現的。?

一種關白附總生物堿的制備方法,該方法包括如下步驟:?

步驟1:取關白附藥材,有機溶劑提取,回收溶劑,得提取物浸膏;?

步驟2:取步驟1得到的浸膏,以酸溶液捏溶,將酸溶液低溫冷藏,取酸水層;?

步驟3:取步驟2得到的酸水液,以有機溶劑萃取,酸水母液加堿液調節pH至堿性;?

步驟4:將步驟3中堿化的溶液用有機溶劑萃取,取有機溶劑層,回收溶劑,得關白附總生物堿。?

優選的,所述步驟1中有機溶劑為正丁醇、異丙醇、乙醇、乙酸乙酯、丙酮、石油醚、乙醚中的任意一種;?

所述提取方法為冷浸提??;?

所述步驟2中的酸溶液為鹽酸、硝酸、硫酸、磷酸、甲酸、醋酸、丁酸中的一種或幾種;?

所述步驟3和4中的有機溶劑為正丁醇、乙酸乙酯、甲酸乙酯、甲酸乙酯、氯仿、丙酮、石油醚、乙醚中的任意一種;?

所述步驟3中的堿液為氨水、碳酸鈉、碳酸氫鈉中的一種或幾種。?

優選的,關白附總生物堿的制備方法包括如下步驟:?

步驟1:取關白附藥材,在10-30℃下用50-95%乙醇冷浸提取,回收溶劑,得浸膏;?

步驟2:取步驟1得到的浸膏,以鹽酸水溶液捏溶,將酸溶液低溫冷藏,除去上層的脂溶性雜質,取酸水液;?

步驟3:取步驟2得到的酸水液,用乙酸乙酯萃取,酸水母液加氨水調節pH=8-11;?

步驟4:將步驟3中經氨水堿化的溶液迅速用乙酸乙酯萃取,取乙酸乙酯層,回收溶劑,真空干燥,得關白附總生物堿。?

更有選的參數為:步驟2中鹽酸水溶液為0.5-1.5mol/l;和/或步驟3中:酸水母液加氨水調節pH=9。?

更優選的,關白附總生物堿的制備方法包括如下步驟:?

步驟1:取關白附藥材,粉碎,在10-30℃下用2-8倍量50-95%乙醇冷浸提取2-4次,每次12-36小時,合并提取液,回收溶劑,得浸膏;?

步驟2:取步驟1得到的浸膏,以1-3倍量0.5-1.5mol/l的鹽酸水溶液捏溶,將酸溶液低溫冷藏12-24小時,除去上層的脂溶性雜質,取酸水液;?

步驟3:取步驟2得到的酸水液,用乙酸乙酯萃取2-4次,酸水母液加氨水調節pH=8-11;?

步驟4:將步驟3中經氨水堿化的溶液迅速用乙酸乙酯萃取2-4次,取乙酸乙酯層,回收溶劑,真空干燥,得關白附總生物堿。?

進一步優選的,關白附總生物堿的制備方法包括如下步驟:?

步驟1:取關白附藥材,粉碎成10-20目粗粉,在25℃下用5倍量85%乙醇冷浸提取4次,每次24小時,合并提取液,回收溶劑,得浸膏;?

步驟2:取步驟1得到的浸膏,以1倍量1mol/l的鹽酸水溶液捏溶,將酸溶液于2℃低溫冷藏12-24小時,除去上層的脂溶性雜質,取酸水液;?

步驟3:取步驟2得到的酸水液,用乙酸乙酯萃取2次,酸水母液加氨水調節pH=9;?

步驟4:將步驟3中經氨水堿化的溶液迅速用乙酸乙酯萃取4次,取乙酸乙酯層,回收溶劑,真空干燥,得關白附總生物堿。?

或,步驟1:取關白附藥材,粉碎成10-20目粗粉,在10℃下用3倍量95%乙醇冷浸提取2次,每次36小時,合并提取液,回收溶劑,得浸膏;?

步驟2:取步驟1得到的浸膏,以3倍量0.5mol/l的鹽酸水溶液捏溶,將酸溶液于2℃低溫冷藏12-24小時,除去上層的脂溶性雜質,取酸水液;?

步驟3:取步驟2得到的酸水液,用乙酸乙酯萃取4次,酸水母液加氨水調節pH=8;?

步驟4:將步驟3中經氨水堿化的溶液迅速用乙酸乙酯萃取2次,取乙酸乙酯層,回收溶劑,真空干燥,得關白附總生物堿。?

或,步驟1:取關白附藥材,粉碎成10-20目粗粉,在30℃下用8倍量75%乙醇冷浸提取3次,每次12小時,合并提取液,回收溶劑,得浸膏;?

步驟2:取步驟1得到的浸膏,以2倍量1.5mol/l的鹽酸水溶液捏溶,?將酸溶液于2℃低溫冷藏12-24小時,除去上層的脂溶性雜質,取酸水液;?

步驟3:取步驟2得到的酸水液,用乙酸乙酯萃取2次,酸水母液加氨水調節pH=11;?

步驟4:將步驟3中經氨水堿化的溶液迅速用乙酸乙酯萃取4次,取乙酸乙酯層,回收溶劑,真空干燥,得關白附總生物堿。?

上述關白附總生物堿還可以按常規工藝制成關白附總堿鹽。?

本發明關白附總生物堿和總堿鹽可以按常規的制劑工藝制成藥劑學可接受的任意常規劑型,例如肌肉注射劑,靜脈注射劑、粉針劑、膠囊劑、顆粒劑或片劑。?

本發明關白附總生物堿在制備慢鈉離子通道阻斷劑中的應用;所述關白附總生物堿可以是游離堿或無機酸鹽的形式。?

一種關附甲素在制備慢鈉離子通道阻斷劑中的應用;所述關附甲素可以是游離堿或無機酸鹽的形式。?

一種關附壬素在制備抑制藥物代謝酶藥物中的應用。?

所述藥物代謝酶優選為細胞色素P450酶系中的一種或幾種;進一步優選為CYP2D6。?

本發明所述藥物代謝酶CYP2D6所代謝的藥物化合物及其鹽的分子結構特征為:在化合物分子結構中距離氧化位點5~7A處有一個氮原子。包括抗抑郁藥如阿米替林、丙咪嗪、氯米帕明、地昔帕明、去甲替林、氟西汀、帕羅西汀、頑發克星等;β受體阻滯劑如卡維地洛、普萘洛爾、美托洛爾、阿普洛爾、丁呋洛爾、噻嗎洛爾、布尼洛爾等;抗精神病藥如氯丙嗪、奮乃靜、瑞斯哌東、托哌酮等;抗高血壓藥如胍喹啶、吲哚拉明、烏拉地爾等;抗心絞痛藥如派克昔林、特羅地林等;鎮痛藥如曲馬多;止咳平喘藥如可待因、右美沙芬等;抗心律失常藥如恩卡尼、司巴丁、氟卡尼、普羅帕酮、美西律、茚丙胺。所述關附壬素可以是游離堿或無機酸鹽的形式;優選為鹽酸鹽或硫酸鹽。?

本發明所述關附甲素和關附壬素可以從市場購買,也可以從關白附中提取分離或通過化學合成的方法得到,其結構式如下:?

關附甲素(GFA):R1=R3=-Ac;R2=H?

關附壬素(GFI):R1=-Ac;R2=R3=H?

附圖說明

圖1關白總堿對晚鈉電流的抑制曲線?

圖2關白總堿對豚鼠心室肌晚鈉電流抑制IC50=0.439mmol/L?

圖3鹽酸關附甲素對晚鈉電流的抑制曲線?

圖4鹽酸關附甲素對豚鼠心室肌晚鈉電流抑制IC50=0.580mmol/L?

圖5鹽酸關附壬素對CYP2D6代謝能力的影響?

圖6關白附總堿鹽對大鼠房顫時間(s)的影響?

圖7關白附總堿鹽對大鼠ERP的影響?

圖8關白附總堿鹽對犬起搏閾的影響?

圖9關白附總堿鹽對犬房顫持續時間的影響?

具體實施方式

實驗例1:關白附總生物堿鹽抗心律失常的藥理研究?

1.實驗材料:關白附總生物堿鹽,按本發明實施例3制備;鹽酸利多卡因注射液,山東省泅水希爾康制藥有限公司;實驗用大鼠由上海斯萊克動物中心提供和家兔由中國藥科大學動物室提供。?

2.關白附總堿鹽對電刺激家兔心臟誘發的心律失常的?;ぷ饔?

2.1實驗方法?

家兔12只,體重2.4±0.6kg,分為兩組,每組6只,雌雄各半,一組為關白附總堿組,另一組為利多卡因組。烏拉坦1.2g/kg耳緣iv麻醉,在人工呼吸下開胸暴露心臟,并用顧氏心動杠桿連于壓力換能器,從JL-3型三道生理儀描記心臟舒縮曲線。將刺激電極置于心尖部(正極)與房室交界處左側(負極)并連于DGQ-2型刺激器,以波寬1ms、頻率20Hz的方法刺激10s,每隔2min刺激一次,逐次增加刺激強度(mV)。測得兔心致室顫值作為對照值。然后由兔耳靜脈分別注入關白附總堿或利多卡因,不同劑量給藥相隔10min,于每次給藥后5min測定致顫閾,與給藥前進行比較。?

2.2實驗結果?

實驗結果見表1。?

表1??關白附總堿鹽對兔心電致顫閾值的影響(N=6)(X±S)?

*P<0.05,**P<0.01(與給藥前比較)?

結果表明iv關白附總堿鹽2、4、8mg/kg均能提高兔心致室顫閡值,且隨劑量增大而作用加強;iv關白附總堿鹽4、8mg/kg能顯著提高兔心致室顫值(P<0.05,P<0.01)。說明關白附總生物堿鹽對電刺激兔心引起的室顫有明顯提高致顫閾作用。?

3.關白附總堿鹽對烏頭堿誘發大鼠室性心律失常的?;ぷ饔?

3.1實驗方法?

大鼠40只,體重202±16g,雌雄各半,隨機分為5組,用1.2g/kg烏拉坦ip麻醉后,分別由尾靜脈給以關白附總堿鹽4、8、16mg/kg及利多卡因15mg/kg。對照組iv等量生理鹽水。2分鐘后用WSQ-A型微量輸液器由頸外靜脈恒速注入烏頭堿溶液(1μg/ml,0.2ml/min),并由心電示波器監視出現室早,室速,室顫時記錄烏頭堿的用量。?

3.2實驗結果?

結果見表2。?

表2??iv關白附總堿對烏頭堿誘發大鼠室性心律失常的?;ぷ饔?

*p<0.05,**p<0.01(與對照組比較)?

結果表明中,關白附總生物堿鹽能增加烏頭堿誘發室早,室速,室顫的劑量,其作用隨關白附總堿鹽劑量的加大而增加;其中高劑量(8、16mg/g)的關白附總堿鹽能明顯增加烏頭堿誘發室早,室速,室顫的劑量(P<0.05,P<0.01),說明iv關白附總堿鹽對烏頭堿誘發的室性心律失常有明顯的?;ぷ饔?。?

實驗例2關白附總生物堿和鹽酸關附甲素對心肌慢鈉離子通道阻斷作用的研究?

1?實驗方法?

1.1心肌細胞分離?

正常豚鼠(雌雄不限,250±20g)擊暈,迅速開胸取出心臟,放入4℃的無鈣臺氏液中,修剪后通過主動脈把心臟掛在Langendorff裝置上,以37°C的無鈣臺氏液恒溫灌流,流速6~8mL/min。灌流約5min,洗凈淤血后換含酶無鈣臺氏液灌流約10~15min,待心肌呈現膨脹疏松且半透明狀時,剪下左心室,在KB液中用玻璃滴管輕輕吹打,過濾,即可得到橫紋清晰,表面光潔的棒狀單個心室肌細胞,保存在KB液中。所有實驗用溶?液均用95%O2+5%CO2飽和。?

1.2全細胞膜片鉗記錄方法?

在室溫下吸取細胞保存液數滴加于2mL細胞培養皿中,置于倒置顯微鏡(Nikon)載物臺上,待細胞靜置貼壁,用細胞外液灌流清洗細胞。電極選用硬質玻璃經微電極拉制儀(HEKA)二次拉制而成,經過熱拋光后,電極充以內液入水后電阻值為4-6MΩ,選取橫紋清晰、邊緣整齊、表面無顆粒、無收縮的細胞,調節三維操縱器使電極尖端移向細胞表面,輕施負壓,形成高阻封接后,補償快電容并給更大負壓吸破細胞膜形成全細胞記錄模式。補償慢電容和串聯電阻,使電容瞬跡減至最小。維持電位-90mV,去極化到+20mV保持50ms,引出快鈉電流,快鈉電流完全失活后的電流為慢鈉電流。使用局部灌流給藥系統給藥,記錄空白細胞外液,含關白附總堿(按本發明實施例1制備)或鹽酸關附甲素0.1mmol/L,0.3mmol/L和1mmol/L時的電流,以空白電流與給藥電流的差值與空白電流的比值作為抑制率,用Hill方程y=Vmax*x^n/(k^n+x^n)擬合濃度與抑制率的關系,得出半數抑制濃度IC50。?

1.3實驗溶液配制?

無鈣臺氏液:稱量適量的各種溶質,用超純水配制成含NaCl、KCl、MgCl2、葡萄糖、HEPES、?;撬岱直鷂?37mmol/L、5.4mmol/L、1.2mmol/L、10mmol/L、10mmol/L、10mmol/L的溶液,用NaOH調節pH為7.40。?

含酶無鈣臺氏液:在無鈣臺氏液中加入牛血清白蛋白和膠原酶Ⅱ型,使其濃度分別為1mg/mL,0.3mg/mL,用NaOH調節pH為7.40。?

KB液:稱量適量的各種溶質,用超純水配制成含KOH、KCl、KH2PO4、谷氨酸、MgCl2、?;撬?、EGTA、HEPES、葡萄糖分別為70mmol/L、KCl?40mmol/L、20mmol/L、50mmol/L、3mmol/L、20mmol/L、0.5mmol/L、10mmol/L、10mmol/L的溶液,用KOH調節pH為7.40。?

電極內液:稱量適量的各種溶質,用超純水配制成含CsF、CsCl、MgCl2、NaCl、Na2-ATP、EGTA、HEPSE分別為110mmol/L、20mmol/L、3mmol/L、10mmol/L、5mmol/L、10mmol/L、5mmol/L的溶液,以CsOH?調節pH到7.2。?

細胞外液:無鈣臺氏液加入CsCl、CoCl2、CaCl2使其濃度分別為5mmol/L、3mmol/L、1mmol/L。?

2實驗結果?

結果見圖1-4。?

結果顯示,關白附總生物堿和鹽酸關附甲素對豚鼠心室肌慢鈉電流抑制強度分別為IC50=0.439mmol/L(相對分子質量以465計算),IC50=0.580mmol/L。?

實驗例3關白附總生物堿制備工藝研究?

1關白附乙醇冷浸提取與乙醇加熱回流提取方法比較?

1.1實驗方法?

冷浸法:將粉碎成10~20目的關白附顆粒500克,用1000ml95%乙醇25℃浸泡24小時,浸出,第二次再加1000ml95%乙醇25℃浸泡12小時,浸出,第三次加1000ml95%乙醇25℃浸泡4小時,浸出,合并浸出液,過濾,濾液減壓回收乙醇得稠醇浸膏,加少量蒸餾水,放置冰箱,冷卻過濾,除去色素等雜質,用石油醚萃取數次,以除去其中脂溶性成分,再用氯仿萃取,氯仿萃取液用無水碳酸鈉脫水過濾后回收氯仿至干,95%乙醇轉溶,加鹽酸至pH=3,然后加入晶種,放置析晶,用95%乙醇重結晶得關白附總生物堿鹽0.098g,氯仿萃取后的溶液,正丁醇萃取,減壓回收正丁醇后95%乙醇轉溶,放置冰箱析晶,經Molisch反應,TLC對照,鑒定為糖類物質得0.83g。?

回流法:將粉碎成10~20目關白附顆粒500克,分別用95%乙醇1000ml,800ml,600ml于60℃±2℃水浴上熱浸提取2小時,1小時,0.5小時,合并提取液,回收乙醇得稠醇浸膏,加少量蒸餾水,放置冰箱,冷卻過濾,除去樹脂狀色素等雜質,用石油醚萃取數次,以除去其中脂溶性成分,再用氯仿萃取,氯仿萃取液用無水碳酸鈉脫水,過濾后回收氯仿至干,95%乙醇轉溶后,加鹽酸至pH=3,加晶種,放置析晶,用95%乙醇重結晶,得0.10g關白附總生物堿鹽。氯仿萃取后的溶液,正丁醇萃取,減壓回收正丁醇后用95%乙醇轉溶,放置冰箱析晶,經Molisch反應,TLC對照,?鑒定為糖類物質,得1.50g。?

1.2實驗結果?

結果見表3。?

表3??兩種提取工藝方法的比較?

??提取方法 ??關白附總生物堿鹽得率% ??糖類得率% ??冷浸法 ??0.0196 ??0.166 ??回流法 ??0.0200 ??0.500

結果表明:冷浸與回流提取提,鹽酸關附甲素得率較接近;但是回流提取,糖類物質得率高達0.5%,還有其它水溶性雜質,不僅影響了生物堿分離,還給后處理帶來麻煩,因此提取關白附總生物堿鹽應采用冷浸法為宜。

2乙醇冷浸提取工藝研究?

2.1儀器與藥品:?

安捷侖Agilent?1100高效液相色譜儀(四元梯度泵,DAD檢測器);梅特勒-托利多(METTLER)AE-240雙量程電子分析天平;BüchiRotavaporR-114型旋轉蒸發儀。?

關附甲素對照品從中國藥品生物制品檢定所購買,關白附藥材由遼寧、吉林購買。

甲醇,乙腈,庚烷磺酸鈉為色譜純。?

水為純凈水。?

其他試劑均為分析純。?

2.2關附甲素含量測定方法的建立?

(1)色譜條件:?

以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑;以1.5mg/mL庚烷磺酸鈉水溶液(含0.2%三乙胺,用磷酸調pH=5.0)為流動相A,以乙腈為流動相B;洗脫程序見表4;流速1ml/min;檢測波長:205nm;柱溫:25℃;分析時間40min;理論塔板數按關附甲素峰計算應不低于20000。?

表4??洗脫程序?

?時間(分鐘) ??流動相A(%) ??流動相B(%) ?0~16min ??80→76 ??20→24 ?16~22min ??76→70 ??24→30 ?22~38min ??70→66 ??30→34 ?38~40min ??66 ??34 ?梯度洗脫完成后平衡10min ??80 ??20

(2)線性范圍:

精密稱取鹽酸關附甲素對照品適量,以流動相(A:B=3:1)溶解配制成濃度為1mg/ml的溶液;按上述色譜條件分析,以對照品峰面積為縱坐標(y),對照品濃度為橫坐標(x),得回歸方程y=6.38×103x+1.29×102,r=0.9998,線形范圍為0.5-2.5mg/ml。?

(3)對照品溶液的制備:?

精密稱取鹽酸關附甲素對照品適量,以流動相(A:B=3:1)溶解配制成濃度為1mg/ml的溶液,即得。?

2.2實驗方法?

選取乙醇濃度(%,A)、冷浸次數(B)、冷浸時間(天,C)、乙醇用量(V/W,D)四個因素進行考察,每個因素選取三個水平,采用L9(34)正交表進行試驗,正交表頭設計見表5。得到的浸膏以400ml?0.1mol/lHCl溶液溶解,用乙酸乙酯萃取3次,取水層,用氨水調pH=9,用乙酸乙酯萃取3次,取乙酸乙酯層,減壓回收,抽干至發泡無乙酯。真空干燥箱干燥,得到關白附總生物堿提取物,測定關附甲素的含量。?

表5??正交實驗表頭設計?

2.3實驗結果?

結果見表6?

表6??正交實驗結果?

比較各因素R值大小,可以看出哪個因素在提取工藝中占主要地位。按R值大小,各因素主次順序為:A>C>D>B。結合方差分析結果,因素A最為顯著,因素C稍次之,因素B、D均為不顯著因素。從正交試驗的觀點來看,只選取有顯著意義因素的最好水平搭配,確定最佳工藝,不顯著?因素原則上可以根據實驗條件(如節約藥材、溶劑、時間、能源等)酌情確定一個。因此,在本實驗中最佳結合方案為:A2B?1C3D1,即關白附藥材的最佳提取工藝為用較大粒度的藥材粉末在25℃的溫度下用5倍量85%的乙醇提取4次,每次冷浸24h。?

3除雜方法研究?

3.1實驗方法:關白附經乙醇冷浸提取后,除了含有生物堿外,還有大量的脂溶性色素,樹脂、油脂等,2%鹽酸水溶液捏溶后酸水液,呈粘稠性醬色。為了除去脂溶性雜質,進行了以下試驗:?

方法一:將酸水液直接過濾,除去色素、樹脂、油脂等。?

方法二:采用酸水液2℃低溫冷藏使脂溶性成分漂浮分層,時間約為12~24小時。?

3.2實驗結果?

結果見表7。結果表明采用酸水液2℃低溫冷藏的方法更好。?

表7??酸水部位生物堿除去色素,樹脂和油脂方法的比較?

4堿化工藝研究?

4.1實驗方法?

藥材粉末在25℃的溫度下用5倍量85%的乙醇冷浸提取4次,每次冷浸24h,減壓回收乙醇至無醇味,得醇浸膏,用鹽酸溶液捏溶,乙酸乙酯萃取3次,酸水層分別用氨水調至pH=9,NaOH溶液調至pH=10、pH=11,分別迅速用乙酸乙酯萃取3次,減壓回收乙酸乙酯至發泡,分別測定關附甲素含量。?

4.2實驗結果?

結果見表8。?

表8??堿化工藝研究結果?

? ??pH=9(氨水) ?pH=10(NaOH) ?pH=11(NaOH) 含量(mg/g) ??17.38 ?16.78 ?16.53

結果表明,用氨水調節pH=9,關附甲素含量最高,并且具有很好的穩定性,最終堿化條件確定為用氨水調節pH=9。?

5關白附總生物堿精制工藝研究?

5.1實驗方法?

選取酸水用量(V/W,A)、酸值(mol/L,B)、酸水層萃取次數(次,C)、堿水層萃取次數(次,D)四個因素進行考察,每個因素選取三個水平,采用L9(34)正交表進行試驗,轉移率作為定量指標進行實驗。正交設計表頭見表9。?

表9??正交設計表頭設計?

5.2實驗結果?

結果見表10。?

表10??正交試驗結果?

結果表明,因素D最為顯著,因素B稍次之,因素A、C均為不顯著因素。因此,在本實驗中最佳結合方案為:A1B1C1D3,即關白附總生物堿提取物的最佳精制工藝為用藥材醇浸膏以1倍量1mol/L的鹽酸溶液捏溶,用乙酸乙酯萃取2次,酸水層用氨水調至pH=9,迅速用乙酸乙酯萃取4次,?乙酸乙酯層減壓回收乙酸乙酯,至發泡,減壓干燥既得關白附總生物堿提取物。?

6藥材粉碎粒度研究?

6.1實驗方法?

將關白附粉碎成10~20目,60~80目兩種粒度,采用冷浸和定時攪拌冷浸,提取時間為48小時,重復3次,提取液含量經HPLC測定。?

6.2實驗結果?

結果見表11。?

表1195%乙醇提取不同粒度關白附中的關附甲素的含量?

實驗結果表明,關白附提取最佳粒度為10~20目,最佳提取方式為冷浸并定時攪拌。?

實施例4人肝微粒體實驗考察鹽酸關附壬素對CYP2D6單底物代謝能力的影響?

1實驗材料和儀器:?

1.1實驗材料?

混合人肝微粒體(HLM)購自瑞德肝臟疾病研究(上海)有限公司,由10名捐獻者的肝臟制得,其CYP1A2、CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6、?CYP3A4、CYP2E1活性由瑞德鑒定,含蛋白濃度10mg/500μl。?

氫溴酸右美沙芬(dextromethorphan?hydrobromide)左氧氟沙星(levofloxacin)購自中國藥品生物制品檢定所。關附壬素標準品購于中國藥品生物制品檢定所。?

Na2HPO4·12H2O、NaH2PO4·2H2O、KCl、MgCl2·6H2O購自南京化學試劑廠;甲醇(色譜純)、乙腈(色譜純)、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP+)、6-磷酸葡萄糖(G-6-P)、6-磷酸葡萄糖脫氫酶(G6PDH)購自Sigma公司。其余試劑均為市售分析純。?

微粒體緩沖液(PBS):0.1M??KCl-磷酸鹽緩沖液,含:0.1M?KCl、0.1M?Na2HPO4、0.1M?NaH2PO4;pH=7.4。?

NADPH能量再生系統:臨用新配,含:10mM?G-6-P、0.5mM?NADP+、10mM?MgCl2、1U/mL?G6PDH。?

1.2儀器?

美國熱電公司Finnigan高效液相色譜-四極桿串聯質譜聯用儀(含Finnigan?Surveyor高效液相色譜系統、Finnigan?TSQ?Quantum?Discovery?max質譜系統、電噴霧離子源、Xcalibur1.2工作站及LCQuan數據處理軟件)。?

GENIE?VORTEX-2渦旋混合裝置;EPPENDORF高速冷凍離心機;Milli-Q?Gradient?A1超純水機(Millipore?Inc,USA)。?

2實驗方法:?

選取0,0.2,0.8,2,10,50,100μmol/L個濃度的鹽酸關附壬素與人肝微粒體,及右美沙芬/5μmol/L于37℃與人肝微粒體(終濃度為0.2mg/mL)在37℃恒溫水浴中預熱5min,然后加入NADPH能量再生系統啟動反應。優化孵育時間為20min。整個反應體系中有機溶劑的含量控制在≤1%。0℃冰浴終止反應后,用含內標(左氧氟沙星,200ng/mL)的甲醇溶液(1:1,v/v)直接沉淀蛋白,充分振蕩3min,20000rpm離心10min后定量轉移50μL上清液,以5μL進樣。同時設立不加鹽酸關附壬素(以溶劑二甲基亞砜代替)的空白對照。?

3實驗結果?

實驗結果見圖5。結果顯示,鹽酸關附壬素的IC50為22μM,表明鹽?酸關附壬素可以有效地抑制CYP2D6酶的活力。?

實驗例5關白附總堿鹽抗大鼠房顫作用觀察?

1實驗目的?

采用ACh-CaCl2致大鼠房顫模型,研究關白附總堿鹽的抗房顫作用,實驗結果顯示,關白附總堿鹽預防性給予,可以明顯降低房顫持續時間,有效抑制QRS波群的展寬。實驗以決奈達隆作為陽性對照。關白附總堿鹽在ACh-CaCl2致大鼠房顫模型上抗房顫作用確切。?

2實驗材料?

2.1實驗動物?

成年SD大鼠,雄性,清潔級,由上海西普爾—必凱實驗動物有限公司提供。合格證號:SCXK(滬)2008-0016。溫度20-24℃,濕度50%的環境下飼養,照明12小時。自由飲水,進食。?

2.2試劑及儀器?

決奈達隆,純品;?

關白附總堿鹽,按實施例3制備;?

乙酰膽堿,純品,Sigma;?

其余試劑:國產,分析純,市售;?

BL-420F生物機能實驗系統:成都泰盟科技有限公司。?

3實驗分組及操作?

實驗設正常對照組和造模,治療組。正常組大鼠10只,ip生理鹽水7天。其余大鼠10%水合氯醛麻醉大鼠(0.3ml/100g),尾靜脈注射ACh-CaCl2混合液(0.1gCaCl2+6.6ugACh/10mlH2O,0.1ml/100g),每天一次,第四天,將大鼠隨機分成①模型組、②關白附總堿鹽低劑量組(2mg/kg)、③關白附總堿鹽中劑量組(6mg/kg)、④關白附總堿鹽高劑量組(18mg/kg)和決奈達隆組(30mg/kg)。藥效對照組設6mg/kg劑量。所有藥物均po給藥3天,觀察藥效。?

4實驗方法?

10%水合氯醛麻醉大鼠(0.3ml/100g),麻醉后記錄II導聯心電圖。于?II導聯下尾靜脈注射ACh-CaCl2混合液(0.1g?CaCl2+6.6ugACh/10mlH2O,0.1ml/100g),記錄房顫持續時間。第二、三天重復以上操作。第四天,各治療組在開始造模前3h,灌胃給予相應劑量的治療藥物,尾靜脈注射ACh-CaCl2混合液,給藥劑量和體積同前三天,記錄房顫時間。重復以上操作至第七天。各組大鼠造模,治療完成后,處死大鼠,速取心臟于冰凍的K-H液中清洗,分離左心房,取右心室肌,運用生物機能實驗系統測量誘發心房動作電位的閾值以及心房的有效不應期。?

5實驗結果?

實驗數據采用均值±標準差(x±s)表示(n=6),?

5.1關白附總堿鹽對抗房顫作用?

實驗結果見表12,圖6。結果表明:大鼠尾靜脈注射ACH-Cacl2混合液,隨造模時間延長,大鼠房顫時間明顯延長,給予關白附總堿鹽后,依濃度縮短大鼠房顫時間。?

表12.關白附總堿鹽對大鼠房顫時間(s)的影響(x±s,n=6)?

5.2關白附總堿鹽對房顫大鼠ERP的影響?

實驗分別測定了各組大鼠左心房ERP數值,作為衡量房顫后大鼠心電重構的初步指標,實驗結果如表13,圖7。結果表明:模型大鼠心房和心室肌ERP明顯縮短,提示多次房顫刺激后,大鼠心肌細胞電重構,形成房顫基質,關白附總堿鹽能有效抑制心肌細胞的電重構,維持心電穩定。?

表13??關白附總堿鹽對大鼠ERP的影響(x±s,n=6)?

綜上,關白附總堿鹽三個劑量(2,6,18mg/kg)po(口服)給藥,可對抗大鼠房顫,縮短房顫持續時間,改善房顫引起的心房電重構,三個劑量給予,結果顯示有明顯的量效關系??狗坎饔萌非?。?

實驗例6關白附總堿鹽對心房快速起搏導致的犬房顫的治療作用(乙酰膽堿合并)?

1實驗方法?

成年比格犬,雌雄不限,體重10-20kg。靜脈注射戊巴比妥鈉溶液麻醉(3%的溶液,10ml/kg)。根據情況適量追加麻醉劑。麻醉后仰臥固定。剪去頸部和胸前被毛。正中切開頸部,做氣管插管連接呼吸機機械通氣(呼吸頻率16次/分,潮氣量12ml/kg,呼吸比3:5)。分離右側迷走神經,切斷,在近心端插入一對電極連接電刺激器。正中切開胸骨上方組織,貼胸骨左緣前斷第3,4肋,暴露心包。剪開心包縫制心包吊籃,暴露心臟。在右心房表面鉤入一對使用4×6縫合針制成的電極,連接電刺激器。每隔半小時使用0.1ms,20Hz的連續刺激,0.05V遞增的強度刺激右心房測定起搏閾。起搏閾是指在正常狀態下使用20Hz,1ms的50次串刺激可起搏心房的電壓。頸靜脈滴注乙酰膽堿200μg/mL,0.2ml/min,然后以2倍起搏閾刺激引發房顫,測定房顫持續時間.在起搏閾和致顫閾穩定后分別灌胃給關白附總堿鹽(按實施例3制備)(4mg/kg,8mg/kg)和決萘達?。?0mg/kg)。給藥后每0.5小時測定起搏閾和致顫閾及房顫持續時間。?

2實驗結果?

結果見圖8-9。?

實驗結果表明,關白附總堿鹽4,8mg/kg預防性給予,心電異位起搏閾增高,提示心房電穩定性增高,房顫持續時間明顯縮短,表明藥物抗房顫作用。?

實驗例7關白附總堿鹽對心房快速起搏導致的犬房顫的治療作用(刺激迷走神經合并)?

1實驗方法?

成年比格犬,雌雄不限,體重10-20kg。靜脈注射戊巴比妥鈉溶液麻醉(3%的溶液,10ml/kg)。根據情況適量追加麻醉劑。麻醉后仰臥固定。剪去頸部和胸前被毛。正中切開頸部,做氣管插管連接呼吸機機械通氣(呼吸頻率16次/分,潮氣量12ml/kg,呼吸比3:5)。分離右側迷走神經,切斷,在近心端插入一對電極連接電刺激器。正中切開胸骨上方組織,貼胸骨左緣前斷第3,4肋,暴露心包。剪開心包縫制心包吊籃,暴露心臟。在右心房表面鉤入一對使用4×6縫合針制成的電極,連接電刺激器。每隔半小時使用0.1ms,20Hz的連續刺激,0.05V遞增的強度刺激右心房測定起搏閾。使用0.1ms,5V,5-20Hz的脈沖刺激迷走神經,使R-R間期超過1s,同時使用0.1ms,20Hz,50次的串刺激引發房顫,強度以0.05V遞增,以50次刺激結束后有持續房顫時的電壓為致顫閾。在起搏閾和致顫閾穩定后分別灌胃給關白附總堿鹽(按本發明實施例3制備)(4mg/kg)和決萘達?。?0mg/kg)。給藥后每小時測定起搏閾和致顫閾。?

2實驗結果?

結果見表14。?

表14??關白附總堿對起搏閾和致顫閾的影響?

實驗結果表明,關白附總堿鹽4mg/kg預防性給予,心電異位起搏閾增高69.3%,提示心房電穩定性增高,作用與決奈相近。由于電穩定作用,引起房顫的刺激強度需增加86%以上,表明藥物抗房顫作用。從藥物起效時間看,關白附總堿鹽起效時間需要2小時-3小時,比決奈稍慢,但持續時間較長.?

實施例?

實施例1?

關白附總生物堿的制備方法包括如下步驟:?

步驟1:取關白附藥材,粉碎成20目粗粉,在25℃下用5倍量85%乙醇冷浸提取4次,每次24小時,合并提取液,回收溶劑,得浸膏;?

步驟2:取步驟1得到的浸膏,以1倍量1mol/l的鹽酸水溶液捏溶,將酸溶液于2℃低溫冷藏24小時,除去上層的脂溶性雜質,取酸水液;?

步驟3:取步驟2得到的酸水液,用乙酸乙酯萃取2次,酸水母液加氨水調節pH=9;?

步驟4:將步驟3中經氨水堿化的溶液迅速用乙酸乙酯萃取4次,取乙酸乙酯層,回收溶劑,真空干燥,得關白附總生物堿。?

實施例2?

關白附總生物堿的制備方法包括如下步驟:?

步驟1:取關白附藥材,粉碎成20目粗粉,在10℃下用3倍量95%乙醇冷浸提取2次,每次36小時,合并提取液,回收溶劑,得浸膏;?

步驟2:取步驟1得到的浸膏,以3倍量0.5mol/l的鹽酸水溶液捏溶,?將酸溶液于2℃低溫冷藏24小時,除去上層的脂溶性雜質,取酸水液;?

步驟3:取步驟2得到的酸水液,用乙酸乙酯萃取4次,酸水母液加氨水調節pH=8;?

步驟4:將步驟3中經氨水堿化的溶液迅速用乙酸乙酯萃取2次,取乙酸乙酯層,回收溶劑,真空干燥,得關白附總生物堿。?

實施例3?

關白附總生物堿的制備方法包括如下步驟:?

步驟1:取關白附藥材,粉碎成20目粗粉,在25℃下用5倍量85%乙醇冷浸提取4次,每次24小時,合并提取液,回收溶劑,得浸膏;?

步驟2:取步驟1得到的浸膏,以1倍量1mol/l的鹽酸水溶液捏溶,將酸溶液于2℃低溫冷藏24小時,除去上層的脂溶性雜質,取酸水液;?

步驟3:取步驟2得到的酸水液,用乙酸乙酯萃取2次,酸水母液加氨水調節pH=9;?

步驟4:將步驟3中經氨水堿化的溶液迅速用乙酸乙酯萃取4次,取乙酸乙酯層,回收溶劑,真空干燥,得關白附總生物堿。?

步驟5:將步驟4得到的總生物堿用乙醇溶解,加鹽酸調節pH=3,靜置,抽濾,析晶,即得關白附總生物堿鹽。?

實施例4?

關白附總生物堿鹽的制備方法包括如下步驟:?

步驟1:取關白附藥材,粉碎成20目粗粉,在30℃下用8倍量75%乙醇冷浸提取3次,每次12小時,合并提取液,回收溶劑,得浸膏;?

步驟2:取步驟1得到的浸膏,以2倍量1.5mol/l的鹽酸水溶液捏溶,將酸溶液于2℃低溫冷藏12小時,除去上層的脂溶性雜質,取酸水液;?

步驟3:取步驟2得到的酸水液,用乙酸乙酯萃取2次,酸水母液加氨水調節pH=11;?

步驟4:將步驟3中經氨水堿化的溶液迅速用乙酸乙酯萃取4次,取乙酸乙酯層,回收溶劑,真空干燥,得關白附總生物堿;?

步驟5:將步驟4得到的總生物堿用乙醇溶解,加鹽酸調節pH=3,靜置,抽濾,析晶,即得關白附總生物堿鹽。?

實施例5?

關白附總生物堿鹽片劑的制備:?

將實施例5制備的關白附總堿鹽、SMCC?90(含98%的MCC?102和2%的微粉硅膠)、磷酸氫鈣二水合物、膠態二氧化硅、硬脂酸鎂按重量比為50:72:25:3:0.75的比例,先將原料藥與膠態二氧化硅預混,然后加入稀釋劑SMCC?90和磷酸氫鈣二水合物,最后加入潤滑劑硬脂酸鎂,混勻,壓片,即得關白附總堿鹽片劑。?

所述片劑日服用劑量為90-150mg/65kg。?

實施例6?

關白附總生物堿的制備方法包括如下步驟:?

步驟1:取關白附藥材,粉碎成20目粗粉,在10℃下用3倍量乙酸乙酯冷浸提取2次,每次36小時,合并提取液,回收溶劑,得浸膏;?

步驟2:取步驟1得到的浸膏,以3倍量0.5mol/l的醋酸水溶液捏溶,將酸溶液于2℃低溫冷藏12小時,除去上層的脂溶性雜質,取酸水液;?

步驟3:取步驟2得到的酸水液,用丙酮萃取4次,酸水母液加氨水調節pH=8;?

步驟4:將步驟3中經氨水堿化的溶液迅速用乙酸乙酯萃取2次,取乙酸乙酯層,回收溶劑,真空干燥,得關白附總生物堿。?

關 鍵 詞:
關白附總 生物堿 關附壬素 用途
  專利查詢網所有資源均是用戶自行上傳分享,僅供網友學習交流,未經上傳用戶書面授權,請勿作他用。
關于本文
本文標題:關白附總生物堿及關附壬素的新用途.pdf
鏈接地址://www.vmyqew.com.cn/p-6882275.html
關于我們 - 網站聲明 - 網站地圖 - 資源地圖 - 友情鏈接 - 網站客服客服 - 聯系我們

[email protected] 2017-2018 www.vmyqew.com.cn網站版權所有
經營許可證編號:粵ICP備17046363號-1 
 


收起
展開