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一种 利用 肠杆菌属 菌株 PS08 水培 麦草 方法 及其 应用
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摘要
申请专利号:

CN201811081372.6

申请日:

20180917

公开号:

CN109122266A

公开日:

20190104

当前法律状态:

有效性:

审查中

法律详情:
IPC分类号: A01G31/00,A01G7/06,A01C1/00,C12N1/20 主分类号: A01G31/00,A01G7/06,A01C1/00,C12N1/20
申请人: 南京农业大学
发明人: 蔡庆生,赵会会,娄来清,胡朝阳,任凯迪,孟继荣
地址: 210095 江苏省南京市卫岗1号
优先权: CN201811081372A
专利代理机构: 南京正联知识产权代理有限公司 代理人: 王素琴
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法律状态
申请(专利)号:

CN201811081372.6

授权公告号:

法律状态公告日:

法律状态类型:

摘要

本发明公开了一种利用肠杆菌属(Enterobacter?sp)菌株Ps08水培黑麦草的方法及其应用。对一年生黑麦草种子表面进行消毒和清洗后,使用漂浮法进行种子萌发,六天后,对幼苗进行营养液培养,每三天更换一次培养液,七天后进行镉处理,将Ps08菌悬液喷施于植物根附近,共喷施四次,每盆加菌悬液5?ml,并培养处理十天。在水培条件下,在一年生黑麦草根部附近喷施Ps08能显著促进一年生黑麦草的生长,提高一年生黑麦草体内的叶绿素含量,同时使丙二醛含量降低,促进了一年生黑麦草对重金属镉的吸收积累量。

权利要求书

1.一种利用肠杆菌属菌株Ps08水培黑麦草的方法,其特征在于:所述方法的具体步骤如下:选取饱满的一年生黑麦草种子,用10%HO对种子表面进行消毒处理,15min后,用去离子水清洗三遍,漂浮法进行种子萌发,六天后,选取生长一致的幼苗移栽至1L塑料杯中进行营养液培养(1/4Hoagland营养液,pH6.5),每三天更换一次培养液,七天后进行镉(20μmol·L,CdCl2.5HO)处理,以加无菌水为对照,另设肠杆菌属菌株Ps08菌悬液喷施于植物根附近为处理,移苗后第二天和第五天分别喷施一次,镉处理后的第三天和第六天分别喷施一次,共喷施四次,每盆加菌悬液5ml,在28℃下培养处理十天,每组处理设置3个重复。2.如权利要求1所述的一种利用肠杆菌属菌株Ps08水培黑麦草的方法,其特征在于:所述肠杆菌属菌株Ps08菌悬液的制备方法为:将肠杆菌属菌株Ps08活化后接入液体LB培养基中,30℃、160r·min摇床培养24h,用离心机在3000r·min室温条件下离心10min后,无菌水悬浮清洗两遍,最后再用无菌水重悬菌体,制备成OD600=1的菌悬液。3.如权利要求1所述的一种利用肠杆菌属菌株Ps08水培黑麦草的方法的应用,其特征在于:所述肠杆菌属菌株Ps08应用于在水培条件下提高一年生黑麦草对镉的富集中。4.如权利要求1所述的一种利用肠杆菌属菌株Ps08水培黑麦草的方法的应用,其特征在于:所述肠杆菌属菌株Ps08应用于在水培条件下促进一年生黑麦草的生长中。

说明书

技术领域

本发明涉及微生物技术领域,具体涉及一种利用肠杆菌属菌株Ps08水培黑麦草的方法及其应用。

背景技术

随着经济的发展,重金属对环境的污染已成为全球面临的一个严峻的环境问题。其中镉具有很强的毒性,通过呼吸、饮食和饮水等途径进入人体后,可在人体的肝、肾、甲状腺和胰腺等脏器内积累,引起病变,严重时还有致癌、致畸、致突变作用。

传统的治理重金属污染的方法主要有化学处理法、吸附分离法、离子交换法、膜分离法等,但这些方法存在费用高、工艺复杂和产生二次污染等问题。近年来,生物方法尤其是植物和微生物修复法,由于具有成本低廉、效率高、无二次污染等优点,在重金属污染治理领域正发挥着越来越大的作用。

发明内容

说明:本发明中使用的肠杆菌属菌株Ps08已在非专利文献(赵会会,方志刚,马睿,娄来清,蔡庆生;耐镉根际促生菌的筛选及其对一年生黑麦草镉吸收积累的影响;草地学报;2017年3期.)中被公开,公众可向该非专利文献的作者获得肠杆菌属菌株Ps08。

本发明的一个目的在于提供了一种利用肠杆菌属菌株Ps08水培一年生黑麦草的方法。

本发明的另一目的在于提供一种利用肠杆菌属菌株Ps08在水培一年生黑麦草中的应用。

本发明采用的技术方案为:

一种利用肠杆菌属菌株Ps08水培黑麦草的方法,所述方法的具体步骤如下:

选取饱满的一年生黑麦草种子,用10%H2O2对种子表面进行消毒处理,15 min后,用去离子水清洗三遍,漂浮法进行种子萌发,六天后,选取生长一致的幼苗移栽至1L塑料杯中进行营养液培养(1/4Hoagland营养液,pH6.5),每三天更换一次培养液,七天后进行镉(20 μmol·L-1,CdCl2 2.5H2O)处理,以加无菌水为对照,另设肠杆菌属菌株Ps08菌悬液喷施于植物根附近为处理,移苗后第二天和第五天分别喷施一次,镉处理后的第三天和第六天分别喷施一次,共喷施四次,每盆加菌悬液5 ml,在28℃下培养处理十天,每组处理设置3个重复。

进一步地,所述肠杆菌属菌株Ps08菌悬液的制备方法为:将肠杆菌属菌株Ps08菌株活化后接入液体LB培养基中,30℃、160 r·min-1摇床培养24 h,用离心机在3000 r·min-1室温条件下离心10 min后,无菌水悬浮清洗两遍,最后再用无菌水重悬菌体,制备成OD600=1的菌悬液。

进一步地,所述肠杆菌属菌株Ps08应用于在水培条件下提高黑麦草对镉的富集中。

进一步地,所述肠杆菌属菌株Ps08应用于在水培条件下促进黑麦草的生长中。

本发明所述的有益效果为:(1)Ps08能促进一年生黑麦草的生长,并提高其地上部分和地下部分的生物量;(2)Ps08使得一年生黑麦草的总根长、根平均直径、总根表面积、总根体积均有显著增加;(3)Ps08对镉处理下一年生黑麦草叶片内光合色素含量的下降起到显著的缓解作用,增强一年生黑麦草的光合作用,提高其对镉的耐受性;(4)Ps08能显著缓解一年生黑麦草植株体内的膜脂过氧化作用。

附图说明

为了使本发明的内容更容易被清楚地理解,下面根据具体实施例并结合附图,对本发明作进一步详细的说明。

图1:镉胁迫下Ps08菌株处理对一年生黑麦草株高、鲜重和干重的影响。数据为平均值±标准误(n=3),不同处理间的不同字母表示差异显著(P<0.05)。

图2:镉胁迫下Ps08菌株处理对一年生黑麦草总根长、根平均直径、总根表面积和总根体积的影响。数据为平均值±标准误(n=3),不同处理间的不同字母表示差异显著(P<0.05)。

图3:镉胁迫下Ps08菌株处理对一年生黑麦草叶片叶绿素含量的影响。数据为平均值±标准误(n=3),不同处理间的不同字母表示差异显著(P<0.05)。

图4:镉胁迫下Ps08菌株处理对一年生黑麦草叶和根内丙二醛含量影响。数据为平均值±标准误(n=3),不同处理间的不同字母表示差异显著(P<0.05)。

图5:镉胁迫下Ps08菌株处理对一年生黑麦草镉浓度和积累总量的影响。数据为平均值±标准误(n=3),不同处理间的不同字母表示差异显著(P<0.05)。

具体实施方式

材料与方法

1.1 供试材料

1.1.1 种子材料:一年生黑麦草品种牧瑶(IdyII),来源于北京正道生态科技公司;

1.1.2 供试菌株:肠杆菌属菌株Ps08。

1.2 培养基

1.2.1 LB培养基:蛋白陈10 g,酵母粉5 g,NaCl 10 g,去离子水1000 ml,pH=7.0。

1.3 试剂及配方

1.3.1 10%过氧化氢(H2O2)溶液

1.3.2 Hoagland营养液:硝酸钾101.10 g·L-1,四水硝酸钙236.16 g·L-1,磷酸二氢铵115.08 g·L-1,七水硫酸镁246.49 g·L-1,微量元素液2 ml:氯化钾1.864 g·L-1、硼酸0.773 g·L-1、硫酸锰0.169 g·L-1、七水硫酸锌0.228 g·L-1、钼酸钠0.060 g·L-1、五水硫酸铜0.062 g·L-1,铁盐溶液:七水硫酸亚铁5.57 g·L-1、乙二胺四乙酸二钠(EDTA.Na)7.45 g·L-1、蒸馏水各500 ml。

1.3.3 20 mmol·L-1的乙二胺四乙酸(EDTA)溶液

1.3.4 5% 三氯乙酸(TCA)溶液

1.3.5 0.67% 硫代巴比妥酸(TBA)溶液

1.3.6 HNO3-HClO4(V:V=85:15)

1.4 试验设计

1.4.1 菌悬液的制备

将肠杆菌属菌株Ps08活化后接入液体LB培养基中,30℃、160 r·min-1摇床培养24 h。用离心机在3000 r·min-1室温条件下离心10 min后,无菌水悬浮清洗两遍,最后再用无菌水重悬菌体,制备成OD600=1的菌悬液备用。

1.4.2 水培试验

进行消毒处理,15 min后,选取饱满的一年生黑麦草种子,用10%H2O2对种子表面用去离子水清洗三遍。漂浮法进行种子萌发,六天后,选取生长一致的幼苗移栽至1L塑料杯中进行营养液培养(1/4Hoagland营养液,pH6.5),每三天更换一次培养液。七天后进行镉(20 μmol·L-1,CdCl2·2.5H2O)处理,以加无菌水为对照(CK),另设Ps08菌悬液喷施于植物根附近为处理。移苗后第二天和第五天分别喷施一次,镉处理后的第三天和第六天分别喷施一次,共喷施四次,每盆加菌悬液5 ml。在28℃下培养处理十天。每组处理设置3个重复,实验于南京农业大学生命科学学院C2016室(温室)中进行。

测定指标与方法

2.1 生长参数的测定

首先测定各处理条件下一年生黑麦草的株高。然后小心取出植株样品,先用20 mmol·L-1的乙二胺四乙酸(EDTA)溶液洗脱根系上的重金属离子,再用去离子水对植株根系进行反复地冲洗后,用滤纸把水吸干。将植株地上部分以及地下部分分开后,分别测定其鲜重,然后将一年生黑麦草鲜样置于105℃的烘箱里杀青30 min后,60℃下烘48 h,测定植物干重(保存备用)。

2.2 根系形态特征扫描分析

根系形态特征:釆用爱普生根系扫描仪(EU-88、爱普生)直接扫描分析。

2.3 叶绿素含量的测定

取新鲜植物叶片,去离子水清洗干净后用滤纸吸干,剪碎后称取0.2 g放入15 mL的试管中,加入10 mL 95%乙醇提取液,至于黑暗条件下,静置提取48 h,待叶片发白后,取上清液于比色皿中,空白对照为95%的乙醇,用分光光度计分别在665 nm、649 nm﹑470 nm条件下测定不同色素的吸光值。计算公式如下:

Chla= 13.95A665-6.88A649

Chlb= 24.96A649-7.32A665

Car=(1000A470-2.05Ca-114.8Cb)/245

叶绿素含量(mg·g-1)=(C*V*N)/W*1000

注:C为色素含量(mg·L-1);V为提取液体积(mL);N为稀释倍数;W为样品鲜重。

2.4 丙二醛含量的测定

取新鲜植物的叶和根,去离子水冲洗干净后用滤纸吸干。分别称取0.3 g,加5% TCA 5 mL于研钵中,将研磨后的匀浆在3000 r·min-1下离心10 min。取上清2 mL,加0.67% TBA 2 mL,混合后在100℃水浴上煮沸30 min,冷却后再次离心。在450 nm、532 nm、600 nm处测定上清的吸光值。

计算出丙二醛的浓度,计算公式如下:

C(μmol·L-1)=6.45(A532-A600)-0.56A450。

然后将单位鲜样组织内的丙二醛含量(μmol·g-1)进行计算分析。

2.5 重金属含量的测定

先将消煮管用去离子水清洗干净,再用10%的HNO3溶液浸泡24 h,清水冲洗干净后用去离子水润洗,置于烘箱内烘干备用。取本章2.1中测定过干重的一年生黑麦草地上部分和地下部分样品于消煮管内,加入8 ml HNO3-HClO4(V:V=85:15)的混合液浸泡植物样品,进行冷消煮12 h,再用消煮炉消煮至干,用2.5%的HNO3溶液定容至10 mL,70℃水浴溶解30 min后,用电感耦合等离子体发射光谱仪(ICP-AES)测定一年生黑麦草地上部分和地下部分的镉离子浓度。

2.6 数据处理

本实验利用Excel 2007进行数据整理,SPSS 20.0进行方差分析,采用Duncan法进行显著性分析。

3 结果与分析

3.1 镉胁迫下Ps08对一年生黑麦草生长参数的影响

植物的生长参数是衡量植物生长状况直观有效的指标。水培试验中,在一年生黑麦草根附近喷施植物根际菌Ps08后,黑麦草整体长势良好,在初期镉胁迫下所表现出来的矮化、生长缓慢以及叶色浅等症状得到了一定的缓解。由图1可知,在镉胁迫下一年生黑麦草的株高以及生物量相比空白对照组均在一定程度上受到抑制,而镉胁迫下接种Ps08后各项指标与单一镉胁迫处理相比均有提高。同镉对照组相比,Ps08处理组一年生黑麦草:株高增加了3.36%,地上部分鲜重和根部鲜重分别高出44.25%和62.24%,地上部分干重和根部干重分别高出48.59%和37.68%,均达到显著差异(P<0.05)。试验结果表明Ps08对一年生黑麦草的生长有一定的促进作用,主要促进了一年生黑麦草的生长,并提高其地上部分和根部的生物量。

3.2 镉胁迫下Ps08对一年生黑麦草根系形态指标的影响

植物根系的总长度、平均直径、总表面积以及总体积是衡量植物根系性状的主要指标。由图2可知,在镉胁迫下一年生黑麦草根系的总长度、平均直径、总表面积以及总体积相比空白对照组明显降低,而镉胁迫下接种Ps08后各指标相比镉对照组均有所增加。同镉对照组相比,Ps08处理组一年生黑麦草:总根长增加21.33%,根平均直径增加30.24%,总根表面积增加50.45%,总根体积增加20.27%,均达到显著差异(P<0.05)。由此说明,Ps08能在一定程度上促进一年生黑麦草根系的生长。

3.3 镉胁迫下Ps08对一年生黑麦草叶绿素含量的影响

Ps08能够促进植物的生长,缓解重金属对植物的毒害作用,也可从叶绿素含量这一指标来验证。由图3可知,在镉胁迫下一年生黑麦草叶片内叶绿素含量相比空白对照组明显降低,而镉胁迫下接种Ps08后,一年生黑麦草的叶绿素含量比单一镉胁迫下增加了27.24%,差异显著(P<0.05)。结果表明,接种Ps08能够对镉处理下一年生黑麦草叶片内光合色素含量的下降起到显著的缓解作用,增强一年生黑麦草的光合作用,提高其对镉的耐受性。

3.4 镉胁迫下Ps08对一年生黑麦草丙二醛含量的影响

植物在逆境胁迫条件下体内产生的活性氧能够直接或间接地引起植物质膜中不饱和脂肪酸产生过氧化作用,丙二醛是膜脂过氧化的产物,被广泛用来测量膜脂过氧化损伤水平的指标。从图4可以看出,在镉胁迫下,一年生黑麦草地上部分(叶)和根系内的丙二醛含量相比空白对照组显著的升高(P<0.05)。同镉对照组相比,Ps08处理组一年生黑麦草:地上部分(叶)中丙二醛含量下降了20.28%,根系内丙二醛含量下降了11.87%,均达到显著差异(P<0.05)。由此可见,接种Ps08后能显著缓解一年生黑麦草植株体内的膜脂过氧化作用。

3.5 镉胁迫下Ps08对一年生黑麦草镉吸收积累量的影响

图5是以Ps08为调控措施,一年生黑麦草地上以及地下部分对镉的吸收积累的影响。试验结果显示,同镉对照组相比,Ps08处理组一年生黑麦草:地上部分镉含量增加了11.14%,差异显著(P<0.05);根系部分镉含量减少了8.64%;地上部分镉积累量增加了65.34%,差异显著(P<0.05);根系部分镉积累量增加了25.48%,差异显著(P<0.05)。结果说明Ps08的处理能够提高一年生黑麦草体内镉的积累量,同时从图中也可以看出一年生黑麦草对重金属镉的积累主要集中在地下部分,减少重金属往地上部分的运输,从而提高其对镉的耐性,促进植物生长。

4 结论

水培条件下,在一年生黑麦草根部附近喷施肠杆菌属菌株Ps08能显著促进一年生黑麦草的生长,提高一年生黑麦草体内的叶绿素含量,同时使丙二醛含量降低,减轻了镉对细胞膜的损伤,维持镉胁迫下植物的正常生理活动,从而提高了一年生黑麦草的抗逆性。同时植物根系的总表面积以及总根长显著增加(P<0.05)。

本发明专利中肠杆菌属菌株Ps08明显促进了一年生黑麦草对重金属镉的吸收积累量,缓解了镉对一年生黑麦草幼苗的毒害。

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