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维戈塞尔塔VS比利亚雷亚尔历史: FRA1與XPA復合物在細胞周期調控中的應用.pdf

摘要
申請專利號:

维戈塞尔塔vs皇家社会 www.vmyqew.com.cn CN201811083462.9

申請日:

20180918

公開號:

CN109122581A

公開日:

20190104

當前法律狀態:

有效性:

審查中

法律詳情:
IPC分類號: A01K67/027,G01N33/68,C12Q1/02 主分類號: A01K67/027,G01N33/68,C12Q1/02
申請人: 南通市第二人民醫院
發明人: 袁媛
地址: 226000 江蘇省南通市港閘區興隆街43號
優先權: CN201811083462A
專利代理機構: 代理人:
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法律狀態
申請(專利)號:

CN201811083462.9

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法律狀態公告日:

法律狀態類型:

摘要

本發明公開了一種Fra?1與XPA復合物在細胞周期調控中的應用,通過過量的光照射SD大鼠構建RLD模型,檢測Fra?1與XPA的表達、定位變化與相互作用、RGC表達cyclin?D1的變化及上述變化與RGC凋亡的關系,初步分析Fra?1與XPA結合與RGC再進入細胞周期后發生凋亡的關系,接著在原代大鼠RGC中,驗證Fra?1與XPA的相互作用,并分析上述復合物的形成調節cyclin?D1表達的機制,在此基礎上,分析光損傷細胞模型中XPA與Fra?1結合調節cyclin?D1的表達對RGC凋亡的影響,最后構建大鼠RLD模型,分析靶向干預RGC中Fra?1與XPA的相互作用對RGC凋亡及RLD預后的影響。

權利要求書

1.一種Fra-1與XPA復合物在細胞周期調控中的應用,其特征在于:包括以下步驟:步驟一:通過過量的光照射SD大鼠構建RLD模型,檢測Fra-1與XPA的表達、定位變化與相互作用、RGC表達cyclinD1的變化及上述變化與RGC凋亡的關系,初步分析Fra-1與XPA結合與RGC再進入細胞周期后發生凋亡的關系;步驟二:接著在原代大鼠RGC中,驗證Fra-1與XPA的相互作用,并分析上述復合物的形成調節cyclinD1表達的機制;步驟三:在此基礎上,分析光損傷細胞模型中XPA與Fra-1結合調節cyclinD1的表達對RGC凋亡的影響;步驟四:最后構建大鼠RLD模型,分析靶向干預RGC中Fra-1與XPA的相互作用對RGC凋亡及RLD預后的影響。2.根據權利要求1所述的一種Fra-1與XPA復合物在細胞周期調控中的應用,其特征在于:所述步驟一中Fra-1為原癌基因,定位于染色體11q13,長度為1.7kb的成熟mRNA,編碼271個氨基酸組,相對分子量為29×10。3.根據權利要求1所述的一種Fra-1與XPA復合物在細胞周期調控中的應用,其特征在于:所述步驟一中XPA為NER過程中不可缺少的蛋白,XPA基因含有六個外顯子。4.根據權利要求1所述的一種Fra-1與XPA復合物在細胞周期調控中的應用,其特征在于:所述步驟一中RGC為RGC32,RGC32基因定位于13q14.11,全長1126個bp,編碼137個氨基酸,有5個外顯子和4個內含子。5.根據權利要求1所述的一種Fra-1與XPA復合物在細胞周期調控中的應用,其特征在于:所述步驟一在大鼠RLD模型中,用westernblot方法檢測Fra-1、XPA、cyclinD1、activecaspase-3的表達情況;免疫共沉淀、免疫熒光檢測Fra-1與XPA之間的相互作用變化及定位變化;免疫熒光、TUNEL檢測RGC凋亡;分析Fra-1、XPA的表達變化、相互作用以及cyclinD1表達變化與RGC凋亡之間的關系。6.根據權利要求1所述的一種Fra-1與XPA復合物在細胞周期調控中的應用,其特征在于:所述步驟二在體外,利用GSTpull-down分析Fra-1和XPA的相互作用,在工具細胞中利用截短突變質粒外轉分析Fra-1和XPA相互作用的結構域及機制以及對cyclinD1表達的影響。7.根據權利要求1所述的一種Fra-1與XPA復合物在細胞周期調控中的應用,其特征在于:所述步驟三建立大鼠原代RGC光損傷模型,westernblot方法檢測Fra-1、XPA、cyclinD1、activecaspase-3的蛋白表達情況;核漿分離的方法檢測XPA的核轉位情況;免疫共沉淀方法檢測Fra-1與XPA之間的相互作用,流式細胞儀檢測損傷后RGC的細胞周期;TUNEL方法檢測RGC的凋亡情況;分析Fra-1、XPA的表達變化、相互作用以及cyclinD1表達變化對RGC凋亡的影響。8.根據權利要求1所述的一種Fra-1與XPA復合物在細胞周期調控中的應用,其特征在于:所述步驟四構建Fra-1、XPA慢病毒干預載體,視網膜下注射,westernblot及免疫熒光檢測干預效果;建立大鼠RLD模型,檢測cyclinD1的表達;用TUNEL方法檢測大鼠視網膜RGC的凋亡情況;分析干預XPA-Fra-1復合物的形成對cyclinD1的表達變化以及對RGC凋亡的影響。

說明書

技術領域

本發明涉及編碼蛋白在細胞周期調控中的應用技術領域,具體為一種Fra-1與XPA復合物在細胞周期調控中的應用。

背景技術

細胞周期(cell cycle)是指細胞從一次分裂完成開始到下一次分裂結束所經歷的全過程,分為間期與分裂期兩個階段。

生命是從一代向下一代傳遞的連續過程,因此是一個不斷更新、不斷從頭開始的過程。細胞的生命開始于產生它的母細胞的分裂,結束于它的子細胞的形成,或是細胞的自身死亡。通常將子細胞形成作為一次細胞分裂結束的標志,細胞周期是指從一次細胞分裂形成子細胞開始到下一次細胞分裂形成子細胞為止所經歷的過程。在這一過程中,細胞的遺傳物質復制并均等地分配給兩個子細胞。

Cyclin D1,即G1/S-特異性周期蛋白-D1,是一個由人類CCND1基因所編碼的蛋白質。Cyclin D1的基因屬于高度保守的細胞周期家族。該家族在整個細胞周期中蛋白豐度具有周期性變化。

目前XPA-Fra-1復合物的形成對cyclin D1的表達變化以及對RGC凋亡的影響是在自然情況下完成的,現擬證明RGC中Fra-1與XPA形成復合物,通過調節cyclin D1的轉錄,促進RGC再進入細胞周期,誘導RGC凋亡,因此,亟待一種改進的技術來解決現有技術中所存在的這一問題。

發明內容

本發明的目的在于提供一種Fra-1與XPA復合物在細胞周期調控中的應用,證明了RGC中Fra-1與XPA形成復合物,通過調節cyclin D1的轉錄,促進RGC再進入細胞周期,誘導RGC凋亡,從而分析干預XPA-Fra-1復合物的形成對cyclin D1的表達變化以及對RGC凋亡的影響,以解決上述背景技術中提出的問題。

為實現上述目的,本發明提供如下技術方案:一種Fra-1與XPA復合物在細胞周期調控中的應用,包括以下步驟:

步驟一:通過過量的光照射SD大鼠構建RLD模型,檢測Fra-1與XPA的表達、定位變化與相互作用、RGC表達cyclin D1的變化及上述變化與RGC凋亡的關系,初步分析Fra-1與XPA結合與RGC再進入細胞周期后發生凋亡的關系;

步驟二:接著在原代大鼠RGC中,驗證Fra-1與XPA的相互作用,并分析上述復合物的形成調節cyclin D1表達的機制;

步驟三:在此基礎上,分析光損傷細胞模型中XPA與Fra-1結合調節cyclin D1的表達對RGC凋亡的影響;

步驟四:最后構建大鼠RLD模型,分析靶向干預RGC中Fra-1與XPA的相互作用對RGC凋亡及RLD預后的影響。

優選的,步驟一中Fra-1為原癌基因,定位于染色體11q13,長度為1.7kb的成熟mRNA,編碼271個氨基酸組,相對分子量為29×103。

優選的,步驟一中XPA為NER過程中不可缺少的蛋白,XPA基因含有六個外顯子。

優選的,步驟一中RGC為RGC32,RGC32基因定位于13q14.11,全長1126個bp,編碼137個氨基酸,有5個外顯子和4個內含子。

優選的,步驟一在大鼠RLD模型中,用western blot方法檢測Fra-1、XPA、cyclin D1、activecaspase-3的表達情況;免疫共沉淀、免疫熒光檢測Fra-1與XPA之間的相互作用變化及定位變化;免疫熒光、TUNEL檢測RGC凋亡;分析Fra-1、XPA的表達變化、相互作用以及cyclin D1表達變化與RGC凋亡之間的關系。

優選的,步驟二在體外,利用GSTpull-down分析Fra-1和XPA的相互作用,在工具細胞中利用截短突變質粒外轉分析Fra-1和XPA相互作用的結構域及機制以及對cyclin D1表達的影響。

優選的,步驟三建立大鼠原代RGC光損傷模型,western blot方法檢測Fra-1、XPA、cyclin D1、activecaspase-3的蛋白表達情況;核漿分離的方法檢測XPA的核轉位情況;免疫共沉淀方法檢測Fra-1與XPA之間的相互作用,流式細胞儀檢測損傷后RGC的細胞周期;TUNEL方法檢測RGC的凋亡情況;分析Fra-1、XPA的表達變化、相互作用以及cyclin D1表達變化對RGC凋亡的影響。

優選的,步驟四構建Fra-1、XPA慢病毒干預載體,視網膜下注射,western blot及免疫熒光檢測干預效果;建立大鼠RLD模型,檢測cyclin D1的表達;用TUNEL方法檢測大鼠視網膜RGC的凋亡情況;分析干預XPA-Fra-1復合物的形成對cyclin D1的表達變化以及對RGC凋亡的影響。

與現有技術相比,本發明的有益效果是:

證明了RGC中Fra-1與XPA形成復合物,通過調節cyclin D1的轉錄,促進RGC再進入細胞周期,誘導RGC凋亡,從而分析干預XPA-Fra-1復合物的形成對cyclin D1的表達變化以及對RGC凋亡的影響。

具體實施方式

下面對本發明實施例中的技術方案進行清楚、完整地描述,顯然,所描述的實施例僅僅是本發明一部分實施例,而不是全部的實施例?;詒痙⒚髦械氖凳├?,本領域普通技術人員在沒有做出創造性勞動前提下所獲得的所有其他實施例,都屬于本發明?;さ姆段?。

本發明提供一種技術方案:一種Fra-1與XPA復合物在細胞周期調控中的應用。

實施例一:

1、用western blot方法檢測Fra-1、XPA、cyclin D1、activecaspase-3的表達情況

取用過量光照射后的SD大鼠,迅速處死,制備蛋白質樣品,在收集的蛋白樣品中加入適量濃縮的SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液,100℃或沸水浴加熱3-5分鐘,以充分變性蛋白;冷卻到室溫后,進行SDS-PAGE電泳,隨后用電轉儀轉膜,將轉膜電流設置為300mA,轉膜時間為45分鐘;轉膜完畢后,將膜放置到預先準備好的western洗滌液中,漂洗1分鐘,將膜上的轉膜液洗去,用滴管吸凈洗滌液;加入western封閉液,在搖床上緩慢搖動,室溫封閉60分鐘;用滴管吸凈封閉液,立即加入稀釋好的一抗,在側擺搖床上搖動,室溫放置60分鐘;回收一抗,加入western洗滌液,在側擺搖床上緩慢搖動洗滌5分鐘,吸盡洗滌液后,再加入洗滌液洗滌5分鐘,一共洗滌3次;加入熒光素偶聯的二抗,在側擺搖床上搖動,室溫放置60分鐘;回收二抗,在側擺搖床上緩慢搖動洗滌5分鐘,吸盡洗滌液后,再加入洗滌液洗滌5分鐘,一共洗滌3次;將膜放置在濾紙上吸干后,通過BeyoECL Plus試劑檢測,用X光片掃膜顯影。

2、免疫共沉淀Fra-1與XPA之間的相互作用變化及定位變化

細胞轉染后24~48h收蛋白,將細胞培養皿放于冰上,用預冷PBS洗三次,加入適量細胞裂解緩沖液,冰上裂解30min,用細胞刮輕輕刮下細胞,用移液槍將細胞裂解液轉移至干凈EP管中,冰上輕輕吹打,避免氣泡產生,然后于4℃離心機,最大轉速離心13000rpm,離心10min后取上清,取少量裂解液轉移至干凈EP管中,以備Western blot分析,剩余裂解液加100ul相應的帶有X抗體瓊脂糖珠加入到細胞裂解液,4℃緩慢搖晃孵育過夜,免疫沉淀反應后,在4℃以3000rpm速度離心5min,將瓊脂糖珠離心至管底;將上清小心吸去,管底的瓊脂糖珠用預冷PBS洗三次。然后加入500ul裂解緩沖液,最后加入125μl的5×SDS上樣緩沖液,沸水煮5分鐘,以游離抗原、抗體、珠子,4℃離心機,最大轉速離心10min,取上清,樣品經緩沖液處理,經過western blot檢測,ECL法顯色。

3、免疫熒光檢測Fra-1與XPA之間的相互作用變化及定位變化

將標記的特異性熒光抗體直接加在樣品上,經染色,用水洗去未參加反應的多余熒光抗體,室溫下干燥后封片、鏡檢;滴加0.01mol/L,pH7.4的PBS于待檢標本片上,持續10分鐘,使標本保持一定濕度;滴加適當稀釋的熒光標記的抗體溶液,使其完全覆蓋標本,置于有蓋搪瓷盒內,保溫30分鐘;取出玻片,置玻片架上,先用0.01mol/L,pH7.4的PBS沖洗后,再按順序經過0.01mol/L,pH7.4的PBS三缸浸泡,每缸3~5分鐘,不時振蕩;取出玻片,用濾紙吸去多余水分,但不使標本干燥,加一滴緩沖甘油,以蓋玻片覆蓋;立即用熒光顯微鏡觀察,觀察標本的特異性熒光強度來判斷免疫復合物的多少。

4、免疫熒光檢測RGC凋亡

取得凋亡細胞,加入洗滌液,在側擺搖床上緩慢搖動洗滌5分鐘,吸盡洗滌液后,再加入洗滌液洗滌5分鐘,一共洗滌3次;制備細胞裂解液,按1ml DAB稀釋液+1滴DAB色原進行配制;隨后加如Ac-DEVD-AMC,37℃情況下反應60分鐘;熒光分光光度計分析熒光強度。

5、TUNEL檢測RGC凋亡

取得凋亡細胞,用二甲苯浸洗2次,每次5分鐘;用梯度乙醇(100、95、90、80、70%)各浸洗1次,每次3分鐘;加入洗滌液,在側擺搖床上緩慢搖動洗滌5分鐘,吸盡洗滌液后,再加入洗滌液洗滌5分鐘,一共洗滌2次;用工作液處理組織20分鐘;加入洗滌液,在側擺搖床上緩慢搖動洗滌5分鐘,吸盡洗滌液后,再加入洗滌液洗滌5分鐘,一共洗滌2次;玻片干后,加100μl的TUNEL反應混合液,封口膜在37℃情況下反應60分鐘;加入洗滌液,在側擺搖床上緩慢搖動洗滌5分鐘,吸盡洗滌液后,再加入洗滌液洗滌5分鐘,一共洗滌3次;加1滴PBS在熒光顯微鏡下計數凋亡細胞;玻片干后加100μlconverter-POD于標本上,封口膜在37℃情況下反應60分鐘;加入洗滌液,在側擺搖床上緩慢搖動洗滌5分鐘,吸盡洗滌液后,再加入洗滌液洗滌5分鐘,一共洗滌3次;在組織處加100μlDAB底物,在20℃情況下反應10分鐘;加入洗滌液,在側擺搖床上緩慢搖動洗滌5分鐘,吸盡洗滌液后,再加入洗滌液洗滌5分鐘,一共洗滌3次;拍照后再用蘇木素或甲基綠復染,幾秒后立即用自來水沖洗;加一滴PBS在視野下,用光學顯微鏡進行計數并拍照。

實施例二:

利用GSTpull-down分析Fra-1和XPA的相互作用

挑取融合蛋白Fra-1樣品,將其放置到10mlLB的10ml試管里,37℃的環境下過夜;將培養菌液轉移到含有500mlLB的1L瓶中,37℃的環境下,轉速為200轉培養至OD600=1.5左右,加入適當濃度的IPTG,在25℃下培養,10分鐘,4℃離心收集,去凈上清,放置與-20℃;室溫凍融菌體,馬上放置與冰上,每500ml培養液加入10ml細菌裂解液,混合均勻;傷病超聲破碎,開2秒,停7秒,一共60分鐘,至裂解液充分清涼;10000轉,15分鐘,4℃分離上清,-80℃保存備用;挑取融合蛋白XPA樣品,放置真核表達載體上,進行細胞轉染,48小時后,取適量融合蛋白GST-Fra-1冰上凍融,取50μlGST-XPA到EP觀眾,PBS洗一次,將凍融融合蛋白GST-Fra-1與其混合,4℃層析柜結合60分鐘;PBS洗3次,同時,裂解融合蛋白XPA,去盡培養基,PBS洗一次,加入300μl裂解液,4℃放置30分鐘;混合收集至1.5mlEP管,超聲破碎,13000轉,15分鐘,4℃離心取上清,BCA蛋白定量留取20ul,其余樣品加入到已純化蛋白的EP管中,用PBS補足液體到500ul左右,以便蛋白之間能充分結合,4℃旋轉結合PBS+1%Triton-100洗3次,PBS洗3次;40ul 5×loading buffer溶解beads上的蛋白,煮沸3分鐘,高速離心,SDS PAGE做Western Blot檢測。

實施例三:

1、用western blot方法檢測Fra-1、XPA、cyclin D1、activecaspase-3的蛋白表達情況。

實驗方法同實施例一1、用western blot方法檢測Fra-1、XPA、cyclin D1、activecaspase-3的表達情況,樣品采用大鼠原代RGC光損傷模型。

2、核漿分離的方法檢測XPA的核轉位情況

正常收取大鼠細胞,一個小圓盤的量即可;Buffer A 300uL吹吸,冰上靜止15min過程中,間斷振蕩混勻;4℃,13000rpm,30s,轉移上清保存即為漿成分;700uL BufferA洗3遍,吹散,靜查3min后,4C,13000rpm 30s,最后次吸干;Buffer B 100uL或lysis buffer裂解(推薦CHZ的lysis buffer),超聲25%10次,4℃,13000rpm,10min;轉移上清即為核的成分;測蛋白濃度(如用Buffer B,ctrl較高)。收集細胞,用100μL Buffer A重懸,冰上孵育10分鐘后,12000轉4℃情況下離心1分鐘,取上清儲存于一80℃.用1mLBufferA洗沉淀3次,重懸于150μLBufferB(20mMHEPES,PH 7.9,0.4mM NaCl,1mM EDTA,1mM EGTA,0.5%NP-40),12000轉4℃情況下離心30分鐘后,取上清即核)儲存于-80℃。

實施例四:

western blot及免疫熒光檢測干預效果,用TUNEL方法檢測大鼠視網膜RGC的凋亡情況,實驗方法同實施例一,樣品采用大鼠視網膜。

根據實施例一-四中的檢測結果,分析干預XPA-Fra-1復合物的形成對cyclin D1的表達變化以及對RGC凋亡的影響。

盡管已經示出和描述了本發明的實施例,對于本領域的普通技術人員而言,可以理解在不脫離本發明的原理和精神的情況下可以對這些實施例進行多種變化、修改、替換和變型,本發明的范圍由所附權利要求及其等同物限定。

關 鍵 詞:
FRA1 XPA 復合物 細胞周期 調控 中的 應用
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