• / 6
  • 下載費用:30 金幣  

维戈塞尔塔vs皇家社会ds比分预测: 植物內生菌殺蟲劑及其制備方法.pdf

摘要
申請專利號:

维戈塞尔塔vs皇家社会 www.vmyqew.com.cn CN201810620553.5

申請日:

20180615

公開號:

CN108739864A

公開日:

20181106

當前法律狀態:

有效性:

審查中

法律詳情:
IPC分類號: A01N63/04,A01P7/04,C12N1/14 主分類號: A01N63/04,A01P7/04,C12N1/14
申請人: 江蘇師范大學
發明人: 張廣喜,彭夢甜,馬嘉欣,袁茜,王慶慶,陳可欣,朱雅文,馮昭中
地址: 221009 江蘇省徐州市云龍區和平路57號
優先權: CN201810620553A
專利代理機構: 代理人:
PDF完整版下載: PDF下載
法律狀態
申請(專利)號:

CN201810620553.5

授權公告號:

法律狀態公告日:

法律狀態類型:

摘要

植物內生菌殺蟲劑制備方法,包括步驟:從衛矛科植株上提取植物內生菌;純化培養提取的植物內生菌以備測試;將培養的植物內生菌的代謝產物稀釋后分別噴灑在果蠅和蚊子上,選出高致死率植物內生菌菌株;將選出的菌株進行發酵培養;過濾并濃縮發酵培養的發酵液得植物內生菌殺蟲劑。本發明的植物內生菌殺蟲劑制備方法所制備的殺蟲劑,所篩選的植物內生菌本身即從具有驅蟲效果的植物中提取,對害蟲防治效果好,對人、畜、植物安全無毒,不污染環境,無殘留;植物內生菌對病蟲殺傷特異性強,同時不傷害天敵和有益生物,能保持生態自然平衡;生產原料和有效成分屬于天然產物,可回歸自然而減少對于自然的破壞,保證可持續發展。

權利要求書

1.植物內生菌殺蟲劑制備方法,其特征在于,包括步驟:S1:從衛矛科植株上提取植物內生菌;S2:純化培養提取的植物內生菌以備測試;S3:將培養的植物內生菌的代謝產物稀釋后分別噴灑在果蠅和蚊子上,選出高致死率植物內生菌菌株;S4:將選出的菌株進行發酵培養;S5:過濾并濃縮發酵培養的發酵液得植物內生菌殺蟲劑。2.根據權利要求1所述的植物內生菌殺蟲劑制備方法,其特征在于,所述步驟S1具體包括:S11:植物材料的表面消毒:采集植物時保留根部土壤,用塑料布包裹根部,保持其鮮活狀態;S12:取所采集植株的根、莖、葉的健康組織用流水沖洗干凈,用70%的酒精浸泡3min,再用2%次氯酸鈉浸泡3min,最后用無菌水沖洗3次用以去除附著在材料表面的消毒劑;S13:將最后一遍浸洗的無菌水取100gl涂布在LB培養基平板上,28℃培養72h小時后無微生物長出,表明表面消毒徹底;S14:內生菌的分離:面消毒后的植株根、莖、葉分別用無菌剪刀縱切,然后放入滅菌研缽中研磨充分;S15:將研磨后的植物組織液加入緩沖液在28℃、l50rpm條件下振蕩1h,取不同稀釋梯度的溶液分別涂布在LB培養基平板上,28℃恒溫培養2-14天,待菌落生長完全后挑選接入LB瓊脂斜面置于4℃條件下保存;S16:菌落形態觀察:有氮培養基上劃線得到單菌落,觀察單菌落形態與菌體形態并記錄。3.根據權利要求2所述的植物內生菌殺蟲劑制備方法,其特征在于,所述緩沖液為10mlPBS緩沖液。4.根據權利要求1所述的植物內生菌殺蟲劑制備方法,其特征在于,所述步驟S3具體包括:將培養的植物內生菌的代謝產物稀釋后分別噴灑在果蠅和蚊子上,選出高致死率植物內生菌菌株作為待測菌株;將待測菌株進行多代培養,將多代培養后的植物內生菌代謝物稀釋后分別噴灑在果蠅和蚊子上,選出遺傳穩定性良好的菌株;將選出的遺傳穩定性良好的菌株繼續培養,并將其代謝產物稀釋后噴灑小鼠,將對小鼠無毒的菌株作為目標菌株。5.根據權利要求1所述的植物內生菌殺蟲劑制備方法,其特征在于,所述步驟S5具體包括:過濾并濃縮發酵培養的發酵液,將濃縮后的發酵液配制成粉劑、可濕性粉劑、膠懸劑、噴射劑或氣霧劑。6.由以上任一權利要求所述的制備方法所制得的植物內生菌殺蟲劑。

說明書

技術領域

本發明涉及微生物農藥的制備,尤其涉及植物內生菌殺蟲劑及其制備方法。

背景技術

目前我國殺蟲劑產品結構不合理,在殺蟲劑總產量中有機磷殺蟲劑占70%,而高毒品種占有機磷殺蟲劑的70%。我國殺蟲劑中高毒品種多、產量大,已成為農藥生產、使用的突出矛盾?;┮┎辛粼謁?、土、動物以及人類的身體內,扼殺自然界的活力,破壞生態環境,隨著化學制劑的增多,對人類的危害愈益嚴重。生物體農藥指用來防除病、蟲、草等有害生物的活體生物,生物化學農藥是指的從生物體中分離出的,具有一定化學結構的,對有害生物有控制作用的生物活性物質,該物質可能是生物體的代謝產物。

生物農藥中的微生物農藥是利用生物活體或者其代謝產物對有害生物進行防治的一類制劑,是生物防治的物質基礎和重要手段。植物內生菌(Endophyte)是一定階段或全部階段生活于健康植物的組織和器官內部的真菌或細菌。植物內生菌本身即從某種具有驅蟲效果的植物中提取,對害蟲防治效果好,從根源處解決蟲害,在植物中不會影響植物生長,對人、畜、植物安全無毒,不污染環境,無殘留。植物內生菌對病蟲殺傷特異性強,同時不傷害天敵和有益生物,能保持生態自然平衡。生產原料和有效成分屬于天然產物,可回歸自然而減少對于自然的破壞,保證可持續發展。目前已成為生物防治中有潛力的微生物農藥、增產菌或作為潛在的生防載體菌而加以利用。內生菌在植物體內普遍存在,數量非常巨大,至今已研究幾百種,其潛在數量更是難以估算。植物內生菌作為微生物中非常重要的群類,可產生豐富多樣的具有生物活性的天然產物,而將其產物用于病蟲草害的控制是目前微生物農藥的重要途徑,殺菌劑井岡霉素和多氧霉素,殺蟲劑阿維菌素和多殺菌素等目前已廣泛投入使用。但目前植物內生菌的利用主要在農業除菌去病方面,而在殺蟲尤其是夏季殺蚊殺蟲方面則少有報道。

發明內容

本發明的目的在于提供一種植物內生菌殺蟲劑及其制備方法。

為實現上述發明目的,本發明的技術方案如下:

植物內生菌殺蟲劑制備方法,包括步驟:

S1:從衛矛科植株上提取植物內生菌;

S2:純化培養提取的植物內生菌以備測試;

S3:將培養的植物內生菌的代謝產物稀釋后分別噴灑在果蠅和蚊子上,選出高致死率植物內生菌菌株;

S4:將選出的菌株進行發酵培養;

S5:過濾并濃縮發酵培養的發酵液得植物內生菌殺蟲劑。

進一步的,所述步驟S1具體包括:

S11:植物材料的表面消毒:采集植物時保留根部土壤,用塑料布包裹根部,保持其鮮活狀態;

S12:取所采集植株的根、莖、葉的健康組織用流水沖洗干凈,用70%的酒精浸泡3min,再用2%次氯酸鈉浸泡3min,最后用無菌水沖洗3次用以去除附著在材料表面的消毒劑;

S13:將最后一遍浸洗的無菌水取100gl涂布在LB培養基平板上,28℃培養72h小時后無微生物長出,表明表面消毒徹底;

S14:內生菌的分離:面消毒后的植株根、莖、葉分別用無菌剪刀縱切,然后放入滅菌研缽中研磨充分;

S15:將研磨后的植物組織液加入緩沖液在28℃、l50rpm條件下振蕩1h,取不同稀釋梯度的溶液分別涂布在LB培養基平板上,28℃恒溫培養2-14天,待菌落生長完全后挑選接入LB瓊脂斜面置于4℃條件下保存;

S16:菌落形態觀察:有氮培養基上劃線得到單菌落,觀察單菌落形態與菌體形態并記錄。

進一步的,所述緩沖液為10mlPBS緩沖液。

進一步的,所述步驟S3具體包括:將培養的植物內生菌的代謝產物稀釋后分別噴灑在果蠅和蚊子上,選出高致死率植物內生菌菌株作為待測菌株;將待測菌株進行多代培養,將多代培養后的植物內生菌代謝物稀釋后分別噴灑在果蠅和蚊子上,選出遺傳穩定性良好的菌株;將選出的遺傳穩定性良好的菌株繼續培養,并將其代謝產物稀釋后噴灑小鼠,將對小鼠無毒的菌株作為目標菌株。

進一步的,所述步驟S5具體包括:過濾并濃縮發酵培養的發酵液,將濃縮后的發酵液配制成粉劑、可濕性粉劑、膠懸劑、噴射劑或氣霧劑。

由上述制備方法所制得的植物內生菌殺蟲劑。

與現有技術相比,本發明的有益效果:

本發明的植物內生菌殺蟲劑制備方法,所篩選的植物內生菌本身即從某種具有驅蟲效果的植物中提取,對害蟲防治效果好,從根源處解決蟲害,在植物中不會影響植物生長,對人、畜、植物安全無毒,不污染環境,無殘留;植物內生菌對病蟲殺傷特異性強,同時不傷害天敵和有益生物,能保持生態自然平衡;生產原料和有效成分屬于天然產物,可回歸自然而減少對于自然的破壞,保證可持續發展;由于多種因素和成分發揮作用,微生物本身擁有的基因變異,害蟲難以產生抗藥性。

具體實施方式:

實施例1物內生菌的提取

植物材料的表面消毒:采集植物時保留根部土壤,用塑料布包裹根部,保持其鮮活狀態。取所采集植株的根、莖、葉的健康組織用流水沖洗干凈,用70%的酒精浸泡3min,再用2%次氯酸鈉浸泡3min,最后用無菌水沖洗3次用以去除附著在材料表面的消毒劑。將最后一遍浸洗的無菌水取100gl涂布在LB培養基平板上,28℃培養72h小時后無微生物長出,表明表面消毒徹底。

實施例2內生菌的分離

面消毒后的植株根、莖、葉分別用無菌剪刀縱切,然后放入滅菌研缽中研磨充分。為了保證內生細菌充分分離,植物組織研磨后倒入裝有10mlPBS緩沖液的錐形瓶中,在28℃、l50rpm條件下振蕩1h,取100g不同稀釋梯度依次為103、104、105和106的汁液涂布在LB培養基平板上,28℃恒溫培養2-14天。待菌落生長完全后挑選接入LB瓊脂斜面置于4℃條件下保存。有氮培養基上劃線得到單菌落,觀察單菌落邊緣形狀、大小、隆起情況、表面形態、菌落顏色、透明度和色素產生情況等。菌株培養15h后,進行革蘭氏染色,過程為:①取菌種培養物常規涂片、干燥、固定;②滴加結晶紫染色1-2rain,水洗:③用碘液沖去殘水,并用碘液覆蓋約lmin,水洗;④用濾紙吸去殘水,用滴管加95%乙醇脫色,直至流出的乙醇無紫色時,立即水洗:⑤用番紅復染約2min,水洗;⑥干燥后,用油鏡觀察革蘭氏染色的陰陽性和菌體的形態,用鏡臺微尺測菌體的長和寬。

從衛矛科植物中共分離到155株內生真菌。從苦皮藤植物中分離得到的內生真菌數量最多,為95株,而從其它3種植物中分離到的內生真菌較少,分別為25株、18株和12株。另外,植物內生真菌在植物不同部位中數量也存在差異??嗥ぬ?、冬青衛矛和扶芳藤3種衛矛科植物的內生菌在根中分布較多,其次是莖,最后是果實及其它部位。

實施例3測試與篩選

測定從4種衛矛科植物中分離得到155的株內生菌發酵濾液的殺蟲活性,以和蚊子同為雙翅目的果蠅為試蟲對155株內生菌的殺蟲活性進行初步篩選,結果表明,通過其中的8種內生菌代謝產物稀釋液,果蠅24h后死亡率在90%以上,結果如表1所示。通過5株內生菌代謝產物稀釋液,果蠅24h死亡率在70%以上。將內生菌的代謝產物稀釋后噴灑小鼠,小鼠未產生明顯影響。用4種不同的顯色劑對初篩得到的內生菌發酵液及菌絲體提取液進行顯色反應,以明確內生菌是否產生生物堿類化合物。結果表明,有殺蟲活性的內生菌的胞內代謝物粗提物成陽性反應,初步斷定其中含有生物堿類化合物。

表1內生菌發酵濾液殺蟲活性測定結果

供試樣品 死亡率(%) 供試樣品 死亡率(%) 1 30 8 10 2 60 9 47 3 20 10 65 4 55 11 5 5 10 12 16 6 30 13 13 7 69 14 24

對致死率最高的4株內生菌進行遺傳穩定性測定,結果表明:產殺蟲活性物質的4株內生真菌在傳代到第5代時,其中兩個菌種的發酵產物均對淡色庫蚊幼蟲不表現殺蟲活性,表明這兩株菌可能在離體培養中失去了產生活性產物的能力,而其他內生菌遺傳穩定性測定結果表明,菌株在傳代5代后其產生抑菌活性物質的能力沒有明顯降低,表明此種方法可篩選出低毒高效且遺傳穩定性好的植物內生菌。

實施例4植物內生菌殺蟲劑的制備

將篩選出的目標菌株進行發酵培養,過濾并濃縮發酵培養的發酵液,將濃縮后的發酵液配制成粉劑、可濕性粉劑、膠懸劑、噴射劑或氣霧劑,實際使用時可根據情況選擇合適的劑型。

應當理解的是,本發明的應用不限于上述的舉例,對本領域正常技術人員來說,可以根據上述說明加以改進或變換,所有這些改進和變換都應屬于本發明所附權利要求的?;し段?。

關 鍵 詞:
植物 內生菌 殺蟲劑 及其 制備 方法
  專利查詢網所有資源均是用戶自行上傳分享,僅供網友學習交流,未經上傳用戶書面授權,請勿作他用。
關于本文
本文標題:植物內生菌殺蟲劑及其制備方法.pdf
鏈接地址://www.vmyqew.com.cn/p-6882020.html
關于我們 - 網站聲明 - 網站地圖 - 資源地圖 - 友情鏈接 - 網站客服客服 - 聯系我們

[email protected] 2017-2018 www.vmyqew.com.cn網站版權所有
經營許可證編號:粵ICP備17046363號-1 
 


收起
展開