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西甲维戈塞尔塔vs毕尔巴鄂竞技: 一種抗腫瘤聯合用藥物.pdf

摘要
申請專利號:

维戈塞尔塔vs皇家社会 www.vmyqew.com.cn CN201210210375.1

申請日:

20120626

公開號:

CN102697795A

公開日:

20121003

當前法律狀態:

有效性:

有效

法律詳情:
IPC分類號: A61K31/704,A61K31/352,A61P35/00,A61P35/02,A61K9/19 主分類號: A61K31/704,A61K31/352,A61P35/00,A61P35/02,A61K9/19
申請人: 成都醫學院
發明人: 孫毅毅,鐘玲,林東,尹佳
地址: 610083 四川省成都市金牛區蓉都大道天回路601號
優先權: 201110184237.6
專利代理機構: 成都高遠知識產權代理事務所(普通合伙) 代理人: 李高峽;全學榮
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法律狀態
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CN201210210375.1

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法律狀態公告日:

法律狀態類型:

摘要

本發明公開了表阿霉素與槲皮素制備抗腫瘤的聯合用藥物中的用途。本發明還公開了一種聯合用藥物。本發明選擇表阿霉素為抗癌藥物,槲皮素作為表阿霉素的MDR逆轉劑,PLGA為納米粒共聚物材料,制備同時包載表阿霉素和槲皮素的復方納米粒,達到一定的包封率和載藥量,以納米粒各種指標評價其性質,以體外細胞試驗評價其逆轉多藥耐藥效果。采用乳化溶劑蒸發法制備EPI-QC復方納米粒,通過比較系統的研究發現EPI-QC復方納米??梢砸歡ǔ潭饒孀琢魷赴哪鴕┬?,并且降低其對正常細胞的毒性。

權利要求書

1.表阿霉素與槲皮素制備抗腫瘤的聯合用藥物中的用途。2.根據權利要求1所述的用途,其特征在于:所述的表阿霉素與槲皮素的重量配比為:0.1-10:1-100。3.根據權利要求2所述的用途,其特征在于:所述的表阿霉素與槲皮素的重量配比為:1︰10。4.一種抗腫瘤聯合用藥物,其特征在于:它包含不同規格的單位制劑,用于同時、分別或依次給藥的表阿霉素與槲皮素,及藥學上可接受的載體制備成的制劑。5.根據權利要求4所述的抗腫瘤聯合用藥物,其特征在于:所述的表阿霉素與槲皮素的重量配比為:0.1-10:1-100。6.根據權利要求5所述的抗腫瘤聯合用藥物,其特征在于:所述的表阿霉素與槲皮素的重量配比為:1︰10。7.根據權利要求4-6任意一項所述的抗腫瘤聯合用藥物,其特征在于:它是由表阿霉素、槲皮素為活性成分,制備成納米粒,再加入凍干輔料支架劑,冷凍干燥,制備成凍干粉針;所述的納米粒是含有下述重量配比的原料及輔料制備而成:表阿霉素0.1-10份、槲皮素1-90份、PLGA?10-100份、穩定劑2-20份;其中,所述的穩定劑為F-68、PVA205、PVA403。8.根據權利要求7所述的抗腫瘤聯合用藥物,其特征在于:所述的納米粒是含有下述重量配比的原料及輔料制備而成:表阿霉素0.2份、槲皮素2份、PLGA?100份、PVA2055份。9.根據權利要求7或8所述的抗腫瘤聯合用藥物,其特征在于:所述的納米粒的粒徑小于220nm;平均電位為-0.33±0.38mV。10.根據權利要求9所述的抗腫瘤聯合用藥物,其特征在于:所述的納米粒的平均粒徑為141.1±2.89nm。11.根據權利要求7-10任意一項所述的抗腫瘤聯合用藥物,其特征在于:所述的納米粒的制備方法為:a、稱取原料及輔料:b、將表阿霉素溶解于95%乙醇溶液中,槲皮素溶解于丙酮溶液中;c、將PLGA與b步驟的乙醇溶液、丙酮溶液混合,加入二氯甲烷;混合后與含0.5-5%w/vPVA205的水相混合,其中,有機相和水相的體積比為:1︰2-5,探頭超聲3-10min,制備成初乳;d、將c步驟的初乳經減壓旋轉蒸干溶劑,得本發明納米粒。12.根據權利要求11所述的抗腫瘤聯合用藥物,其特征在于:b步驟中表阿霉素溶解于95%乙醇溶液的濃度為0.5-1.5mg/ml;槲皮素溶解于丙酮溶液的濃度為5-15mg/ml;c步驟中二氯甲烷︰丙酮︰乙醇的體積比為:1︰0.4︰0.1;c步驟所述的探頭超聲條件為:200W功率探頭超聲3min;c步驟所述的水相中含2%w/w?PVA205;有機相和水相的體積比為:1︰2;d步驟所述的減壓旋轉條件為:25℃、50r/min條件下,旋轉蒸發儀減壓旋轉40min。13.根據權利要求7所述的抗腫瘤聯合用藥物,其特征在于:所述的凍干輔料支架劑為甘露醇、注射用乳糖、注射用葡萄糖、右旋糖酐、蔗糖、山梨醇、氯化鈉、甘氨酸鈉、磷酸二氫鈉、氨基乙酸中的一種。14.根據權利要求13所述的抗腫瘤聯合用藥物,其特征在于:所述的凍干輔料支架劑為甘露醇。15.一種制備權利要求7-14任意一項所述的抗腫瘤聯合用藥物的方法,它包括如下步驟:①稱取原料及輔料:②將表阿霉素溶解于濃度為95%乙醇溶液中,槲皮素溶解于丙酮溶液中;③將PLGA與b步驟的乙醇溶液、丙酮溶液混合,加入二氯甲烷;混合后與含PVA205的水相混合,探頭超聲,制備成初乳;④將步驟③中的初乳經減壓旋轉蒸干溶劑,得本發明納米粒;⑤將步驟④中的納米粒,加入蒸餾水溶解,再加入溶劑重量2%-10%的凍干輔料支架劑,-50℃冷凍干燥,得凍干粉針。

說明書

技術領域

本發明涉及一種抗腫瘤聯合用藥物。屬藥物領域。

背景技術

惡性腫瘤已成為人類死亡的一個重要原因。近年來,化學治療同手術治療、放射治療一樣,已經成為惡性腫瘤不可或缺的重要治療手段。盡管人們在化療方面做出很多努力,研究新的化療藥物,改進化療方案,但是治療效果仍不理想。一方面,大部分抗腫瘤藥物缺乏對腫瘤細胞的選擇性,在殺傷細胞的同時,對正常細胞也有毒副作用,從而導致嚴重的全身不良反應,所以很多患者無法堅持,甚至放棄化療,臨床上難以期望通過增加藥物劑量來獲得理想的效果;另一方面,腫瘤細胞對于化療藥物的耐藥性,更多可能是繼發性耐藥引起的多藥耐藥(MDR),這些因素嚴重影響了化療療效。

多藥耐藥(MDR)是指在化療過程中,腫瘤細胞對一種抗腫瘤藥物耐藥的同時,對其他結構不同作用靶位不同的抗腫瘤藥物也產生耐藥的現象,它是導致腫瘤治療失敗的重要原因。MDR以原發性和繼發性兩種形式出現,前者是細胞固有的對藥物不敏感,首次使用藥物就產生耐藥性,后者是初始對藥物敏感,但經過幾個療程后,對藥物產生耐藥性。隨著對MDR機制了解的深入,國內外學者開始尋找逆轉腫瘤多藥耐藥的策略,很重要的一方面就是針對細胞膜P-糖蛋白(P-gp)或其它ABC家族成員等的小分子逆轉劑。目前已發現數百種MDR逆轉劑,這些逆轉劑主要包括:鈣通道阻滯劑,如維拉帕米,蛋白激酶抑制劑,鈣調素拮抗劑,生物堿等。盡管大量的體外細胞試驗已經證實許多逆轉劑可以成功逆轉P-gp介導的MDR,但是臨床應用上,發現很多都不能達到理想的治療效果,因為它們是通過與抗腫瘤藥物競爭的方式來抑制P-gp對抗腫瘤藥物的外排,但是,它們對P-gp的親合力又較弱,因此,為了使腫瘤細胞內的藥物濃度達到足夠高就不得不保證要有高的逆轉劑的血漿濃度,結果導致在體內產生了嚴重的毒副作用。

腫瘤細胞MDR機制十分復雜,牽涉到與MDR相關的基因較多,僅從單個基因表達的研究入手還不能反映MDR的全貌。一般的化學制劑只有單一的逆轉作用靶點,而中藥是一個復雜化學分子復合體,往往同時兼備數種逆轉機制,因此從中藥中篩選有效的MDR逆轉劑已經成為研究的熱點。

目前,將化療藥物和小分子逆轉劑同時包載于同一個納米粒中,可以保證將其靶向到靶點位置的同時,達到更高的逆轉倍數和治療效果,降低藥物劑量,從而減小對正常細胞的毒副作用。納米粒,一種超微型藥物載體,比細胞還小,可被組織和細胞吸收,改善藥代動力學性質,能實現緩釋、控釋和靶向釋藥的目的,從而顯著地提高療效,降低毒副反應。納米粒作為藥物傳遞系統之一,與脂質體同樣具有良好的靶向、緩釋控釋的作用,載藥納米粒的形成,可以是藥物溶解、包裹于納米粒內部,也可以是吸附粘著于納米粒表面,具有尺寸效應、表面效應、易吸收等生物優勢,能夠提高藥物的生物利用度,避免其降解或泄漏,提高其穩定性。

表阿霉素(Epirubicin,EPI)的同分異構體阿霉素,目前為治療肝癌單藥中效率最高的藥物,也是最早開發的具有抗腫瘤活性的蒽環類藥物,抗瘤譜廣﹑療效好,但是,阿霉素具有嚴重的全身不良反應,如心臟損害﹑骨髓抑制等,從而嚴重地限制其在臨床上的應用。表阿霉素為桔紅色粉末狀結晶,溶于水,微溶于乙醇,不溶于氯仿、丙酮等溶劑,在溶液中pH為7時,呈桔紅色,pH超過9時呈藍紫色。Delozier等研究認為表阿霉素的抗腫瘤活性與阿霉素相當或略好,目前的臨床結果也得出了此結果,而且在動物體內表阿霉素的毒性更低,尤其心臟毒性更是如此。表阿霉素主要作用機理是它能夠直接嵌入DNA堿基對之間,干擾轉錄過程,阻止mRNA的形成,從而能抑制DNA和RNA的合成,所以對細胞周期各階段均有作用,最主要是作用于細胞核。另外,表阿霉素對拓撲異構酶II亦有抑制作用。目前,表阿霉素臨床主要用于急性白血病和惡性淋巴瘤、乳腺癌、卵巢癌、膀胱癌、睪丸癌、胃癌、肝癌等多種實體瘤。

槲皮素(quercetin,QC)是一種天然的黃酮類化合物,化學名為3,3’,4’,5,7-五羥基黃酮,具有抗癌防癌、抗自由基、抗貧血、抗炎和抗過敏等多種生物活性及藥理作用。特別是近年來研究發現槲皮素有促進凋亡及增加某些化療藥物抗腫瘤敏感性作用,能顯著抑制人卵巢癌細胞、乳腺癌細胞、肝癌細胞、結腸癌細胞和前列腺癌細胞等生長。

目前,尚沒有文獻報道將表阿霉素和槲皮素聯合使用的相關報道。

發明內容

本發明的技術方案是提供了表阿霉素與槲皮素制備抗腫瘤的聯合用藥物中的用途。本發明的另一技術方案是提供了一種抗腫瘤聯合用藥物及其制備方法。

本發明提供了表阿霉素與槲皮素制備抗腫瘤的聯合用藥物中的用途。

其中,所述的藥物是治療腫瘤多藥耐藥的藥物。

進一步優選地,所述的表阿霉素與槲皮素的重量配比為:0.1-10:1-100。

更進一步優選地,所述的表阿霉素與槲皮素的重量配比為:1︰10。

本發明還提供了一種抗腫瘤聯合用藥物,它包含不同規格的單位制劑,用于同時、分別或依次給藥的表阿霉素與槲皮素,及藥學上可接受的載體制備成的制劑。

其中,所述的表阿霉素與槲皮素的重量配比為:0.1-10:1-100。

進一步優選地,所述的表阿霉素與槲皮素的重量配比為:1︰10。

本發明藥物是由表阿霉素、槲皮素為活性成分,制備成納米粒,再加入凍干輔料支架劑,冷凍干燥,制備成凍干粉針;所述的納米粒是含有下述重量配比的原料及輔料制備而成:

表阿霉素0.1-10份、槲皮素1-90份、PLGA?10-90份、穩定劑2-20份;其中,所述的穩定劑為F-68、PVA205、PVA403。

進一步優選地,所述的納米粒是含有下述重量配比的原料及輔料制備而成:

表阿霉素0.2份、槲皮素2份、PLGA?100份、PVA2055份。

其中,所述的納米粒的粒徑小于220nm。平均電位為-0.33±0.38mV。

進一步優選地,所述的納米粒的平均粒徑為141.1±2.89nm。

其中,所述的納米粒的制備方法為:

a、稱取原料及輔料:

b、將表阿霉素溶解于95%乙醇溶液中,槲皮素溶解于丙酮溶液中;

c、將PLGA與b步驟的乙醇溶液、丙酮溶液混合,加入二氯甲烷;混合后與含0.5-5%w/vPVA205的水相混合,其中,有機相和水相的體積比為:1︰2-5,探頭超聲3-10min,制備成初乳;

d、將c步驟的初乳經減壓旋轉蒸干溶劑,得本發明納米粒。

其中,b步驟中表阿霉素溶解于95%乙醇溶液的濃度為0.5-1.5mg/ml;槲皮素溶解于丙酮溶液的濃度為5-15mg/ml;c步驟中二氯甲烷︰丙酮︰乙醇的體積比為:1︰0.4︰0.1;c步驟所述的探頭超聲條件為:200W功率探頭超聲3min;c步驟所述的水相中含2%w/w?PVA205;有機相和水相的體積比為:1︰2;d步驟所述的減壓旋轉條件為:25℃、50r/min條件下,旋轉蒸發儀減壓旋轉40min。

其中,所述的凍干輔料支架劑為甘露醇、注射用乳糖、注射用葡萄糖、右旋糖酐、氯化鈉、甘氨酸鈉、磷酸二氫鈉、氨基乙酸中的一種。

進一步優選地,所述的凍干輔料支架劑為甘露醇。

本發明還提供了一種制備所述的抗腫瘤聯合用藥物的方法,它包括如下步驟:

①稱取原料及輔料:

②將表阿霉素溶解于濃度為95%乙醇溶液中,槲皮素溶解于丙酮溶液中;

③將PLGA與b步驟的乙醇溶液、丙酮溶液混合,加入二氯甲烷;混合后與含PVA205的水相混合,探頭超聲,制備成初乳;

④將步驟③中的初乳經減壓旋轉蒸干溶劑,得本發明納米粒;

⑤將步驟④中的納米粒,加入蒸餾水溶解,再加入溶劑重量2%-10%的凍干輔料支架劑,-50℃冷凍干燥,得凍干粉針。

本發明選擇表阿霉素為抗癌藥物,槲皮素作為表阿霉素的MDR逆轉劑,PLGA為納米粒共聚物材料,制備同時包載表阿霉素和槲皮素的復方納米粒,達到一定的包封率和載藥量,以納米粒各種指標評價其性質,以體外細胞試驗評價其逆轉多藥耐藥效果。采用乳化溶劑蒸發法制備EPI-QC復方納米粒,通過比較系統的研究發現EPI-QC復方納米??梢砸歡ǔ潭饒孀琢魷赴哪鴕┬?,并且降低其對正常細胞的毒性,為臨床提供了一種新的用藥選擇。

附圖說明

圖1本發明藥物制備工藝圖

圖2不同穩定劑的篩選結果

圖3PVA205不同濃度篩選結果

圖4PLGA用量篩選結果

圖5有機相和水相體積比的篩選

圖6EPI-QC復方納米粒的Zeta電位

圖7K562cells(×400)

圖8K562/A02cells(×400)

圖9L02cells(×400)

具體實施方式

實施例1本發明藥物凍干制劑的制備

處方:表阿霉素0.2g、槲皮素2g、PLGA100g、PVA2055g、甘露醇50g;共制1000支;

具體步驟為:

a、用乙醇配制成濃度為的1mg/ml的EPI溶液,丙酮配制濃度為10mg/ml的QC溶液,備用;

b、稱取PLGA,加入二氯甲烷和丙酮溶液溶解PLGA,再加入乙醇溶液組成有機相,二氯甲烷︰丙酮︰乙醇的體積比為:1︰0.4︰0.1,混勻,與2%PVA的水相混合,200W功率探頭超聲3min后置圓底燒瓶中,25℃、50r/min條件下,于旋轉蒸發儀上減壓除去有機溶劑,40min后即得納米粒(EPI-QC復方納米粒);加入蒸餾水,完全溶解,再加入溶劑重量2%-10%的甘露醇,冷凍干燥,經預凍(-50℃,7小時)、升華干燥、解析干燥,得凍干粉針。

具體制備工藝見制備工藝見圖1。

實施例2納米粒同時包載鹽酸表阿霉素和槲皮素制備工藝的研究

納米粒包裹材料方面,本發明選擇了在國外已經批準的具有良好生物相容性和降解性的聚乳酸共聚物(PLGA),此材料在體內能完全降解為乳酸和乙酸,再經過三羧酸循環轉化為水和二氧化碳排出體外,無刺激、無毒。

本發明選擇的模型藥物表阿霉素和槲皮素在理化性質上差別較大,前者是水溶性藥物,后者為水不溶、脂難溶藥物,在制備工藝上有很大的困難。

1儀器與試藥

1.1儀器

1.2試劑

PLGA????山東省醫療器械研究所

PVA?????可樂麗國際貿易(上海)有限公司

F68?????BASF

甲醇和乙腈為色譜純;水為超純水;其余試劑均為分析純

2實驗方法

2.1破膜溶劑的選擇

文獻報道中,能夠溶解PLGA的溶劑有DMSO、乙腈、丙酮和二氯甲烷,本實驗中對以上有機溶劑進行了篩選,以獲得合適的破膜劑。

2.2包封率和載藥量

納米?;煨褐瀉坎舛òǎ夯煨褐幸┪鎰芎康牟舛ê桶諛擅琢D誆炕蛭皆諛擅琢1礱嫻囊┪?。選擇合適的方法分離未包封游離藥物和納米粒,按下面公式計算藥物包封率和載藥量(公式2-1,2-2)。

公式2-1

公式2-2

分離游離藥物與含藥納米粒的方法中,常見的有三種:透析法,凝膠過濾法和離心法,實驗中篩選了透析和離心兩種方法。

2.2.1透析法

2.2.1.1透析袋的預處理

①EDTA溶液的配制:稱取EDTA?93.05mg,加蒸餾水180mL溶解,用0.5mol/L?NaOH溶液調節pH=8.0,加蒸餾水定容至250mL備用;

②EDTA-NaHCO3混合溶液的配制:分別稱取EDTA?93.05mg,NaHCO35g,加蒸餾水180mL溶解,用0.5mol/L?NaOH溶液調節pH=8.0,加蒸餾水定容至250mL備用;

③將透析袋剪成適當長度小段,用EDTA-NaHCO3混合溶液煮沸10min,放冷,用蒸餾水徹底洗凈,然后用EDTA溶液煮沸10min,放冷,用蒸餾水徹底洗凈,最后用20%-50%乙醇溶液浸泡,4℃保存。

2.2.1.2包封率的測定

取制備好的EPI-QC復方納米粒1mL置于處理過的透析袋中,排出氣泡,將透析袋兩端扎緊,置盛有25mL介質的錐形瓶中,室溫下,60r/min水浴振蕩透析,考察透析平衡的時間,HPLC測定介質中的藥物濃度,同時取1mLEPI-QC復方納米粒,DMSO破乳后,甲醇定容至10mL,同法測定兩種藥物總量,按公式2-1計算包封率。

2.2.2離心法

取制備好的EPI-QC復方納米粒1mL,篩選離心時間和轉速,棄上清液,加入DMSO超聲溶解底部沉淀,甲醇定容至10mL,HPLC測定含量,同法測定藥物總量,按公式2-1計算包封率。

2.3制備方法的篩選

納米粒常見的制備方法有乳化溶劑蒸發法、納米沉淀法、鹽析法和復乳法等,其中前兩者的使用較多,因此本發明對乳化溶劑蒸發法、納米沉淀法這兩種方法進行考察。

2.3.1乳化溶劑蒸發法

用乙醇配制一定濃度的EPI溶液,丙酮配制一定濃度的QC溶液(其中,EPI0.2g,,濃度為1mg/ml、QC2mg,濃度為10mg/ml),備用,稱取PLGA?60mg,加入1mL二氯甲烷和0.4mL丙酮溶液溶解PLGA,再加入0.1mL乙醇溶液組成有機相,混勻,與2%PVA的水相混合,200W功率探頭超聲3min后置圓底燒瓶中,25℃、50r/min條件下,于旋轉蒸發儀上減壓除去有機溶劑,40min后即得EPI-QC復方納米粒。

2.3.2納米沉淀法

用乙醇配制一定濃度的EPI溶液,丙酮配制一定濃度的QC溶液(其中,EPI0.2g,,濃度為1mg/ml、QC2mg,濃度為10mg/ml),備用,稱取PLGA?60mg,加入1mL丙酮溶解PLGA,再加入0.1mL乙醇溶液組成有機相,在一定強度磁力攪拌條件下緩緩注入到2%PVA的水相中,繼續攪拌一定時間轉入圓底燒瓶中,25℃、50r/min條件下,于旋轉蒸發儀上減壓除去殘余有機溶劑后即得EPI-QC復方納米粒。

2.4單因素實驗考察

2.4.1穩定劑種類的篩選

乳化溶劑蒸發法第一步要制得穩定的乳劑,需在外水相中加入一定量的表面活性劑。選用不同的表面活性劑,按照前述的制備方法,通過考察外觀和穩定性,測定粒徑和包封率等指標來篩選適宜者。實驗中考察的穩定劑為比較常用的F-68,PVA205和PVA403。

2.4.2穩定劑濃度的篩選

固定其它條件不變,考察穩定劑濃度分別為0.5%、1%、2%和5%。

2.4.3PLGA用量的篩選

固定其它條件不變,考察PLGA用量分別為40mg、60mg、80mg和100mg。

2.4.4有機相和水相體積比的篩選

有機相和水相的比例需要在一定的范圍內,才能保證在制備納米粒的第一步得到穩定的乳劑,考察有機相和水相的體積比為1:2、1:3、1:4和1:5。

2.4.5超聲時間的篩選

乳化溶劑蒸發法中初乳的形成對于最終納米粒的質量影響至關重要,超聲時間過短,達不到細胞粉碎的目的,難以形成小粒徑的粒子;超聲時間過長,可能會破壞乳劑,也不利于乳劑的形成??疾斐奔浞直鷂?min,5min,10min對形成乳劑的影響,以能靜置30min不分層為評價指標。

3實驗結果

3.1破膜溶劑的選擇

實驗篩選了DMSO、乙腈、丙酮和二氯甲烷四種破膜劑,結果表明,每200μL納米粒加入500μLDMSO超聲后能夠得到完全澄清透明的溶液,乙腈和丙酮在此濃度下不能完全破乳,而二氯甲烷不能夠溶解槲皮素,所以選擇DMSO為破膜溶劑。

3.2包封率和載藥量測定方法

3.2.1透析法

模型藥物EPI和QC均有顏色,透析過程中,可以觀察到部分藥物吸附在捆綁透析袋的細線上,透析完的透析袋上也有少量的吸附,HPLC測定該法對兩種藥物的回收率分別為60.00%和55.79%,不符合要求,故此法不適合用于EPI-QC復方納米粒包封率的測定。

3.2.2離心法

離心條件:4℃,45000r/min,離心30min,棄上清液,加入DMSO超聲溶解底部沉淀,甲醇定容至10mL,HPLC測定含量。

3.3制備方法的篩選

3.3.1乳化溶劑蒸發法

此法制得的EPI-QC復方納米粒外觀為粉紅色混懸液,室溫放置一周能保持穩定。

3.3.2納米沉淀法

此法制得的EPI-QC復方納米粒外觀為粉紅色混懸液,室溫放置幾個小時后就有沉淀產生,制備過程中考察了水相穩定劑的種類和濃度,并沒對沉淀產生的問題有所改善,也考察了注射器在液面下注入還是液面上注入的問題,發現液面下注入得到的納米粒外觀較好,但是由于液面下注入操作不便,方法重新性差。

乳化溶劑蒸發法制備的納米粒在外觀、穩定性和重復性三個方面都優于納米沉淀法,本發明選擇乳化溶劑蒸發法制備EPI-QC復方納米粒。

3.4單因素實驗考察

3.4.1穩定劑種類的篩選

實驗結果見表1,圖2。F-68作穩定劑制備出的納米粒很不穩定,過夜就有沉淀產生,所以并沒有進一步測定其粒徑和包封率。PVA205和PVA403作穩定劑都能得到外觀、穩定性、粒徑和PDI都較好的納米粒。但是PVA205作穩定劑制備的納米粒包封率更高,本發明選擇PVA205作穩定劑。

PVA(聚乙烯醇)外觀為白色粉末,是一種用途相當廣泛的水溶性高分子聚合物,具有合成方便、安全低毒、產品質量易于控制、價格便宜、使用方便等特點,是極有潛力的優良藥用輔料。PVA系列均可以在95℃以下的熱水中溶解,但由于聚合度、醇解度高低的不同,醇解方式等不同在溶解時間、溫度上有一定的差異,溶解PVA205和PVA403時,可邊攪拌邊將本品緩緩加入水中,室溫溶脹2h,而后升溫到95℃左右加速溶解,并保溫1.5h小時,直到溶液不再含有微小顆粒,備用。

表1不同穩定劑的篩選結果

3.4.2穩定劑濃度的篩選

表2PVA205不同濃度篩選結果

實驗結果見表2,圖3,PVA205需要達到一定濃度,納米粒才可以穩定放置,濃度太小很快就有沉淀產生,采用2%或更大濃度時,很容易得到外觀、穩定性、粒徑和PDI都較好的納米粒,但是當用量過大時,超聲時形成的乳劑比較粘,在探頭上粘附比較多,損失比較大,另外,旋轉蒸發除去有機溶劑這一步很難控制真空度,非常容易起泡,制備工藝的重現性很差,而且EPI和QC的包封率很低,都沒有到20%,本發明選擇穩定劑PVA205的濃度為2%w/w。

3.4.3PLGA用量的篩選

表3PLGA用量篩選結果

實驗結果見表3,圖4,PLGA的用量對納米粒外觀影響并不大,都可以得到性狀較好的納米粒,隨著PLGA用量的增加,兩種藥物的包封率都呈增加的趨勢,其中EPI的趨勢大于QC,可能是因為處方中EPI的投藥量小于QC,投入更多的材料,藥物更容易包裹于材料中或者吸附在材料表面。除40mg外,粒徑和PDI呈上升趨勢,但都小于220nm,考慮到包封率的影響,EPI用量為0.2mg、QC2mg的情況下,本發明選擇PLGA的用量為100mg。

3.4.4有機相和水相體積比的篩選

表4有機相和水相體積比的篩選

實驗結果如表4,圖5,有機相與水的體積比在1:2-1:5都能夠得到性狀比較穩定的納米粒,EPI的包封率相差不大,QC的包封率隨著水相體積的增加而減小,考慮到水相體積太大,單位體積中藥物含量太少,本發明選擇有機相和水相的體積比為1:2。

3.4.5超聲時間的篩選

探頭超聲時間為3min,5min和10min時,都可以得到30min內不分層的乳劑,考慮到超聲時間過長可能會破壞原本已經形成的乳劑,本發明選擇3min為超聲時間。

4結論與討論

4.1破膜溶劑的選擇

本實驗室HPLC是紫外檢測器,關于納米粒藥物含量的測定,不能夠直接用制劑進樣,因為納米粒帶有乳光,直接進樣測定會影響結果的準確性,需要選擇一種破膜劑,既可以破壞溶解包載材料,還能夠溶解藥物,本實驗中選擇滿足以上條件的DMSO作為破膜劑。

4.2EPI-QC復方納米粒制備工藝研究

從可重復性、操作的簡便性和制劑穩定性三個方面考慮,本發明選擇乳化溶劑蒸發法作為制備納米粒的方法,采用高速冷凍離心法測定其包封率和載藥量,綜合考察外觀、穩定性、粒徑、PDI以及包封率,結合細胞部分預實驗確定其最適處方。

4.3處方和工藝確定

確定最佳處方為:PLGA?100mg,EPI和QC質量比為1:10,二氯甲烷:丙酮:乙醇=1:0.4:0.1,穩定劑為2%PVA205,有機相與水相體積比為1:2。

文獻報道,乳化溶劑蒸發法中,單純用一種有機溶劑無法得到最佳的工藝,因此實驗中除了二氯甲烷外,往往加入一些與水互溶的有機溶劑。丙酮和乙醇具有極好的水溶性,能與水以任意比例互溶,與二氯甲烷混合使用制備W/O型乳液可以降低CH2Cl2/水的界面張力,增強乳液的穩定性,得到外觀性狀更好的納米粒。本發明中,選擇丙酮與乙醇的混合溶劑,也有助于兩種模型藥物溶解在有機相中。

在最初預實驗的時候,也考察過二氯甲烷和丙酮的比例,發現兩者比例為4:1的時候,過夜有沉淀產生,可能是丙酮量太少,影響了納米粒的成型過程。

按上述處方制備三批EPI-QC復方納米粒,外觀均為粉紅色懸濁液,穩定性好,測定其包封率和載藥量如表5。

表5本發明復方納米粒包封率和載藥量

從表5可知,EPI-QC復方納米粒中EPI的包封率和載藥量分別為64.48±2.50%,RSD為3.88%,0.129±0.005%,RSD為3.67%;QC的包封率和載藥量分別為44.83±2.15%,RSD為4.79%,0.897±0.043%,RSD為4.79%。此處方工藝重現性良好。

實施例3本發明EPI-QC復方納米粒質量研究及其凍干工藝研究

對最終處方的EPI-QC復方納米粒的形態、粒徑分布和Zeta電位進行了考察,并且研究其凍干工藝。

1儀器和試藥

1.1儀器

Malvern?Zetasizer?Nano?ZS90激光粒度測定儀英國Malvern公司

pHS–4C型酸度計??????成都方舟科技開發公司

ModulyoD冷凍干燥機???美國熱電公司

1.2試劑

鹽酸表阿霉素?????????濟南偉都化工有限公司

槲皮素???????????????成都超人植化有限公司惠贈

EPI-QC復方納米粒?????按實施例1的方法制備

乙腈為色譜純;其余試劑均為分析純。

2實驗方法

2.1納米粒外觀性狀

對EPI-QC復方納米粒進行拍照,觀察其外觀性狀。

2.2透射電鏡下觀察形態

取EPI-QC復方納米粒適當稀釋后,用2%的磷鎢酸負染,自然風干后,用透射電子顯微鏡觀察并拍照。

2.3粒徑分布

粒徑是評價納米粒質量的重要指標,它影響其在人體內的循環和代謝,被動靶向中,粒徑對于納米粒在體內分布起到決定性作用,后續細胞實驗中,要求過濾滅菌,因此我們需要嚴格控制粒徑在220nm以下,并且分布比較均勻。取EPI-QC復方納米粒稀釋適當倍數后,激光粒度分析儀測定粒徑分布。

2.4多分散系數(PDI)

PDI是評價粒徑分布的一個重要指標。PDI數值越小,則粒子的粒徑越趨向均一,數值越大,則粒徑分布范圍越寬,一般要求微粒系統的PDI<0.3。

2.5Zeta電位

取EPI-QC復方納米粒,測定其Zeta電位。

2.6含量測定

2.6.1色譜條件

2.6.2線性范圍考察

精密稱取鹽酸表阿霉素10.00mg,用甲醇溶解并定容至100mL容量瓶中,得到100.0μg/mL的儲備液,放置于4℃冰箱中保存。分別精密量取儲備液2.0、1.0、0.2、0.1、0.05mL置10mL容量瓶中定容。分別進樣測定,記錄峰面積,用峰面積(A)對濃度(C)作線性回歸,得到標準曲線回歸方程,并繪制標準曲線。

精密稱取槲皮素10.00mg,用甲醇溶解并定容至100mL容量瓶中,得到100.0μg/mL的儲備液,放置于4℃冰箱中避光保存。分別精密量取儲備液10.0、2.0、1.0、0.5、0.2mL置10mL容量瓶中定容。分別進樣測定,記錄峰面積,用峰面積(A)對濃度(C)作線性回歸,得到標準曲線回歸方程,并繪制標準曲線。

2.6.3專屬性考察

取空白納米粒和載藥納米粒各1mL,適當稀釋后,進樣10μL,記錄色譜圖。

2.6.4回收率考察

取空白納米粒1mL,加入EPI和QC的標準液,分別制成高、中、低濃度的溶液,進樣10μL,記錄峰面積,計算回收率。

2.6.5包封率測定

按照下面公式計算包封率。

2.7凍干粉針處方(EPI0.2mg,QC2mg,PLGA100mg,甘露醇50mg,納米粒按實施例1的方法制備)

2.7.1支架劑的選擇

納米粒呈混懸液,長期貯存可能會出現藥物滲漏、相分離等物理和化學變化,對長期貯存不利,所以往往采用冷凍干燥的方法保存,保持它的物理化學穩定性,防止藥物滲漏,增加其在貯存過程中的穩定性。

表6標準計分

冷凍干燥過程中,為了?;つ擅琢2槐黃蘋?,往往加入一些低分子糖類作為凍干?;ぜ?,有利于制劑的分散和穩定。本發明中,考察了不加支架劑,加入乳糖、葡萄糖、山梨醇、蔗糖和甘露醇作為支架劑,以凍干粉針的外觀、色澤、再分散性以及分散之后的粒徑和PDI為指標,平行實驗三份,進行打分,確定支架劑的種類和比例。

以凍干之后納米粒的外觀、色澤和再分散性作為評價指標,評分標準如表6,同一得分以輔料用量少者為佳。

2.7.2凍干粉針質量評價

觀察凍干后的EPI-QC復方納米粒的外觀、顏色和再分散性,重新分散后,比較凍干前后的包封率有無明顯變化。

3實驗結果

3.1納米粒外觀性狀

EPI-QC復方納米粒呈粉紅色,有明顯乳光。

3.2透射電鏡下觀察形態

透射電鏡可以看出,EPI-QC復方納米粒呈比較規則的球形,粒徑較小,無明顯團聚。

3.3粒徑分布

測定三批EPI-QC復方納米粒,平均粒徑為141.1±2.89nm,PDI為0.05±0.02,粒徑分布比較均勻。

3.4Zeta電位,見圖6

Zeta電位如圖6,測定三批EPI-QC復方納米粒,平均電位為-0.33±0.38mV。

3.5含量測定

3.5.1色譜條件

EPI的色譜條件

色譜柱為:Aichrom?Reliasil?C18柱(150mm×4.6mm,5μm);

流動相為:乙腈-水=32:68,用85%磷酸調節pH=2.4;

檢測波長為:254nm;

流速為:1.0mL/min;

柱溫為:40℃;

進樣量為:10μL。

QC的色譜條件

色譜柱為:Aichrom?Reliasil?C18柱(150mm×4.6mm,5μm);

流動相為:甲醇-0.04%磷酸=55:45;

檢測波長為:372nm;

流速為:1.0mL/min;

柱溫為:40℃;

進樣量為:10μL。

數據處理后回歸方程為A=24495C-2732.7,r=0.9999(n=5),表明鹽酸表阿霉素在0.5-20μg/mL范圍內線性關系良好,標準曲線數據見表7標準曲線,符合測定要求。

表7不同的表阿霉素鹽酸濃度的峰面積

表8不同槲皮素濃度的峰面積

數據處理后回歸方程為A=35088C-57004,r=0.9998(n=5),表明槲皮素在2-100μg/mL范圍內線性關系良好,標準曲線數據見表8,標準曲線符合測定要求。

3.5.3專屬性

空白輔料對EPI-QC復方納米粒中兩種藥物含量測定無干擾。

3.5.4回收率

表9不同濃度EPI-回收率(n=3)

表10不同濃度QC回收率(n=3)

EPI和QC的回收率見表10,結果表明,回收率都在95%-105%以上,符合測定要求。

3.5.5包封率

實驗三批納米粒,EPI和QC平均包封率分別為60.28,43.19。

3.6凍干粉針處方

3.6.1支架劑的選擇

結果見表11

表11EPI-QC復方納米粒支架劑的選擇

測定復溶之后納米粒的平均粒徑和PDI,見表12。

表12復溶之后納米粒的平均粒徑和PDI

綜合外觀、色澤、再分散性、平均粒徑和PDI得出結論:從外觀上看,不加支架劑的凍干粉針外觀很差,加入支架劑之后對外觀有不同程度的改善,但是種類不同影響效果差別較大,其中以甘露醇最好,而且其用量沒有太大影響;從復溶情況看,只有甘露醇能夠在30秒內完全溶解,其它都有不同程度的小結塊存在;從粒徑和PDI看,凍干之后粒徑都比凍干之前稍微有些偏大,但是PDI仍然較好,而且加不加支架劑并沒有太大影響。結果表明,選用5%或者10%甘露醇作為支架劑都比較理想,本著節約成本方面的考慮,本發明選擇5%甘露醇作為凍干支架劑。

3.6.2凍干粉針質量評價

3.6.2.1外觀

肉眼觀察凍干粉針,外觀為粉紅色、顏色均勻的細膩疏松塊狀物,無花斑和明顯缺陷。

3.6.2.2再分散性

取上述凍干粉針,加入同體積的蒸餾水,輕輕振搖30s后,得到分散均勻的混懸液。

3.6.2.3包封率

表13本發明凍干粉針的包封率測定

包封率見表13.,凍干之后,包封率有所下降,但是變化范圍不大4結論與討論

4.1透射電鏡下,EPI-QC復方納米粒呈比較規則的球形,粒徑大多小于150nm,這與激光粒度測定儀測出結果基本一致,PDI值很小,說明粒徑比較均勻。

4.2實驗中選擇PLGA(聚乳酸乙醇酸)作為納米粒載體材料,它是由乳酸和乙醇酸以不同比例嵌段共聚而成的高分子納米材料,在國外已經獲得批準,具有良好的生物相容性和降解性。PLGA包裹藥物制備成納米粒后,穩定性有可能會因各種因素而下降,從而造成藥物的泄露,實驗中采取冷凍干燥的辦法來提高納米制劑的穩定性,冷凍干燥是利用冷凍的溶液在低溫低壓條件下,從凍結狀態不經過液態直接升華除去水分完成干燥,使藥物保持原有的理化性質和生理活性,且提高藥物包封率和減少有效成分的損失。本發明中選用5%甘露醇作為支架劑效果較理想,凍干后的粒徑和PDI與凍干前相比無明顯變化,包封率有所下降,但是變化范圍不大,采用的凍干工藝制得的納米粒符合要求。

以下通過藥效學試驗證明本發明的有益效果。

試驗例1本發明EPI-QC復方納米粒逆轉腫瘤細胞多藥耐藥的研究

本發明選擇K562/A02為模型細胞,對EPI-QC復方納米粒的體外細胞實驗進行研究。

1儀器與試劑

1.1儀器

1.1.1細胞系

白血病細胞株K562及K562/A02細胞(耐藥細胞株):四川大學華西醫院血液科實驗室

正常肝細胞L02:四川大學國家重點實驗室

1.1.2儀器和耗材

1.2試劑

1.3試劑的配制

1.3.1RPMI?1640完全培養基的配制

胎牛血清保存于-40℃低溫冰箱中,使用前一天放置4℃冰箱使其完全溶解,搖勻之后56℃水浴30min滅活補體,按10%的濃度加入到RPMI1640培養基中,并加入100單位/mL的青霉素和鏈霉素,4℃冰箱保存。

1.3.2DMEM完全培養基的配制

配制方法同上。

1.3.3消化液的配制

分別稱取250mg胰蛋白酶、20mgEDTA溶于一定量的PBS中,反復攪拌直至完全溶解,將上述溶液混合后定容到100mL,配制成胰蛋白酶濃度為0.25%,EDTA濃度為0.02%的細胞消化液,過濾滅菌后4℃冰箱保存。

1.3.4MTT的配制

稱取100mg?MTT溶于20mL?PBS中,渦旋使其完全溶解,得到濃度為5mg/mL的MTT試劑,過濾滅菌后4℃冰箱保存。

1.3.5PBS的配制

稱取氯化鈉4g,氯化鉀0.1g,磷酸氫二鈉0.78g,磷酸二氫鉀0.1g,加蒸餾水至500ml調pH值為7.2,高壓滅菌,4℃密封保存。

2實驗方法

2.1細胞培養

2.1.1細胞復蘇

從液氮容器中取出K562、K562/A02和L02細胞凍存管,迅速放入盛有37℃水浴裝置中,反復振搖使其快速融化,用酒精棉球擦拭凍存管表面,吸出細胞懸液,轉移到離心管中,1000rpm離心5min棄上清液,補加一定量的完全培養基,吹打重新懸浮細胞,移入培養瓶中,置37℃,5%CO2飽和濕度培養箱中培養。

2.1.2細胞凍存

選擇處于對數生長期的細胞,凍存前一天換液一次,L02用細胞消化液消化后得到細胞懸液,K562和K562/A02吹打幾次得到細胞懸液,加入一定量含10%DMSO的完全培養基,分裝在事先滅菌的凍存管中,每管1.5mL細胞懸液,-40℃放置兩個小時,用紗布裹好,做好標記,然后移入液氮罐表面30min后整個浸沒在液氮罐中。

2.1.3K562和K562/A02細胞的培養

K562細胞接種于含10%胎牛血清的1640培養基的細胞培養瓶,培養基中加入青、鏈霉素濃度為100單位/mL的雙抗,置37℃,5%CO2飽和濕度培養箱中培養,K562為半貼壁細胞,傳代之前需要搖晃培養瓶,輕輕吹打細胞團使之分散,每2天換液一次并傳代。K562/A02細胞接種于含10%胎牛血清的1640培養基的細胞培養瓶,培養基中加入青、鏈霉素終濃度為100μg/mL的雙抗,另外加入終濃度為0.8μg/mL的鹽酸阿霉素以維持其耐藥性,實驗前兩周用無藥培養基培養,取對數生長期的細胞用于實驗。

2.1.4L02細胞的培養

L02細胞接種于含10%胎牛血清的DMEM培養基的細胞培養瓶,培養基中加入青、鏈霉素終濃度為100單位/mL的雙抗,置37℃,5%CO2飽和濕度培養箱中培養,3-4天傳代。傳代方法為:倒掉舊的培養基,用PBS從細胞對面的瓶壁上潤洗兩次,棄之,加入消化液大約1mL,使之鋪滿瓶壁,放入37℃度培養箱中,1min后拿出在顯微鏡下觀察,消化成單個細胞就可以了,注意消化時間不要太長,然后倒掉消化液,加入培養基,吹打即可。

2.2細胞形態觀察

細胞培養瓶置于倒置顯微鏡下,觀察三種細胞的形態。

2.3K562/A02細胞耐藥倍數的測定

2.3.1細胞計數

觀察細胞,對數期生長的K562/A02那個培養瓶,吹打過后進行細胞計數,將少許細胞懸液吸出沿蓋玻片邊緣自然滲入,使懸液充滿蓋玻片和計數板之間,不要留有氣泡,亦不要外泄;靜置,顯微鏡下觀察計數板四角大方格和中央大方格中細胞數,細胞壓中線時,一般遵循:記左不記右,記上不記下的原則。

將計數結果代入下式計算:

4大格細胞總數/4×104×稀釋倍數=細胞數/mL

2.3.2K562/A02細胞耐藥倍數的測定

查閱文獻和預實驗的基礎上,確定K562和K562/A02兩種細胞接種到96孔板的細胞數均為1×105個/mL比較合適。取對數生長期的細胞,1000r/min離心5分鐘后,棄上清液,加入新鮮培養基后吹打混勻,進行細胞計數,適當稀釋使其細胞濃度為1×105個/mL。取96孔板,每孔加入20μLEPI溶液,K562細胞中EPI濃度按照0.04、0.2、0.4、2、4、20和40μg/mL設置7個濃度,K562/A02細胞中EPI按照0.4、2、4、20、40、80和160μg/mL設置7個濃度,再加入細胞懸液100μl,設置空白凋零孔(只加入培養基)和正常對照孔(只加入細胞懸液),每個濃度設置6個復孔,96孔板中36個四周邊孔不用,加入滅菌PBS飽和水分。將其置于37℃,5%CO2飽和濕度培養箱中培養,48小時后,1000rpm離心5min棄上清液,小心用PBS沖2-3遍后,再加入含MTT的培養液,4小時后,1000rpm離心5min棄上清液,最后加入DMSO使甲臜顆粒充分溶解后,10min后在570nm酶標儀測量其吸收值,并根據光吸收值計算不同濃度EPI對細胞的抑制率。

細胞抑制率(%)=[1-(實驗組OD-空白凋零組OD)/(正常對照組OD-空白凋零組OD)]×100%

每種濃度可以得到六個數值,取其平均值作為最終數值。用SPSS17.0軟件統計得到K562和K562/A02的IC50值,IC50為抑制細胞生長達到50%時的藥物濃度,根據下面公式計算細胞耐藥倍數。實驗重復三次,取平均值為最終結果。

耐藥倍數=耐藥細胞IC50/敏感細胞IC50

2.4逆轉劑濃度的確定

稱取QC0.3778g,溶于5mL?DMSO中,渦旋混勻,得到250mmol/L的槲皮素儲備液,用培養基適當稀釋配制成75μmol/L、40μmol/L、20μmol/L和10μmol/L。取對數生長期的K562/A02細胞,1000r/min離心5分鐘后,棄上清液,加入新鮮培養基后吹打混勻,進行細胞計數,適當稀釋使其細胞濃度為1×105個。取96孔板,每孔加入20μLQC溶液,按照10、20、40和75μmol/L設置4個濃度,其余操作同上,并根據光吸收值計算不同濃度QC對細胞的抑制率。

2.5測定逆轉倍數

取96孔板,每孔加入20μLEPI溶液,EPI按照0.4、2、4、20、40、80和160μg/mL設置7個濃度,每孔再加入40μmol/LQC溶液和100μL?K562/A02細胞懸液,其余操作同上,SPSS17.0統計逆轉后的IC50,按下面公式計算逆轉倍數。

逆轉倍數(RI)=不加逆轉劑IC50/加逆轉劑IC50

2.6游離藥物及其納米粒對L02的毒性研究

取對數生長期的L02細胞,消化后進行細胞計數,在預實驗的基礎上,確定96孔板中接種數為5×104。取96孔板,每孔加入20μL不同試劑,分別為EPI,QC、EPI和QC混合物、空白納米粒和EPI-QC復方納米粒,再加入細胞懸液100μL,設置空白凋零孔(只加入培養基)和正常對照孔(只加入細胞懸液),每個濃度設置6個復孔,在570nm酶標儀測量其吸收值,并根據光吸收值計算對L02細胞的抑制率。

2.7游離藥物及其納米粒對K562/A02的抑制作用研究

取對數生長期的K562/A02細胞,每孔加入20μL不同試劑,分別為EPI,QC、EPI和QC混合物、空白納米粒和EPI-QC復方納米粒再加入細胞懸液100μL,設置空白凋零孔(只加入培養基)和正常對照孔(只加入細胞懸液),每個濃度設置6個復孔,在570nm酶標儀測量其吸收值,并根據光吸收值計算對K562/A02細胞的抑制率。

3結果

3.1K562和K562/A02細胞形態學的觀察。

倒置顯微鏡下,K562和K562/A02兩種細胞呈現比較規則的圓形,輪廓清晰,清亮。

(圖7、8)。

3.2L02細胞形態學的觀察。

倒置顯微鏡下,未貼壁的細胞保持比較規則的圓形,輪廓清楚,幾個小時后開始向四周伸展,慢慢鋪滿瓶壁,呈多角形,大小比較均勻。

(圖9)。

倒置顯微鏡下,未貼壁的細胞保持比較規則的圓形,輪廓清楚,幾個小時后開始向四周伸展,慢慢鋪滿瓶壁,呈多角形,大小比較均勻。

3.3K562/A02細胞耐藥倍數的測定結果

3.3.1EPI對K562細胞增殖的影響

不同濃度EPI對處理K562細胞48h后,隨著EPI濃度的增加,細胞抑制率也呈上升趨勢,SPSS17.0統計IC50值為1.898。

表14EPI對K562細胞增殖的影響(n=3)

3.3.2EPI對K562/A02細胞增殖的影響

不同濃度EPI對處理K562/A02細胞48h后,隨著EPI濃度的增加,細胞抑制率也呈上升趨勢,SPSS17.0統計IC50值為56.585。

表15EPI對K562/A02細胞增殖的影響(n=3)

3.3.3K562/A02細胞耐藥倍數的測定

表16K562/A02細胞耐藥倍數的測定

3.4逆轉劑濃度的確定

槲皮素濃度為10μmol/L和20μmol/L時,抑制率為負數,表明槲皮素在低濃度時促進了細胞的生長,槲皮素濃度為40μmol/L和75μmol/L時,抑制率分別為3.75%和23.3%,確定對細胞基本無毒的40μmol/L為逆轉劑濃度。

3.5測定逆轉倍數

表17EPI?and?EPI-QC對K562/A02的影響(n=3)

表18EPI?and?EPI-QC對K562/A02細胞毒性的影響

K562/A02的IC50為56.585,與40μmol/LQC聯用后,IC50有所下降,為7.237,逆轉倍數為7.81倍。結果表明,QC對K562/A02的多藥耐藥有一定的逆轉作用。

3.6游離藥物及其納米粒對L02的毒性研究

表19游離藥物及其納米粒對L02的毒性研究(n=3)

結果見表19,空白納米粒對正常肝細胞L02的生長沒有抑制作用,說明載藥納米粒給藥時,其載體材料本身對正常肝細胞并沒有毒性。兩種藥物聯用后,對細胞的毒性顯著增加,而制備成復方納米粒后,毒性有所下降,由此可見,制備復方納米粒以降低其對正常肝細胞的毒性是有必要的。

3.7游離藥物及其納米粒對K562/A02的抑制作用研究

結果見表20,單獨使用EPI和QC時對耐藥細胞幾乎沒有抑制作用,EPI和QC聯合使用時,有明顯抑制作用產生,說明QC確實可以一定程度逆轉K562/A02對EPI的耐藥作用,聯用后,減少抗腫瘤藥物劑量可以達到抑制腫瘤細胞的作用。將之制備成復方納米粒后,抑制作用與游離藥物聯用相比,并沒有顯著差異,結合上面實驗結果,制備成納米制劑之后可以降低藥物對正常肝細胞的毒性,說明將抗腫瘤藥物和逆轉劑同時包裹在納米粒中是有現實意義的。

表20游離藥物及其納米粒對K562/A02的抑制作用(n=3)

4結論與討論

4.1血清從-40℃取出的時候最好先放到4℃冰箱過夜解凍,不要放到37℃解凍或者56℃直接滅活,這樣血清中會出現沉淀,影響其活性,滅活時間不要過長,否則會嚴重影響血清活性。

4.2細胞復蘇這一步一定要迅速,因為凍存液多用含DMSO的培養基,常溫時對細胞有害,取出液氮罐之后應立即置于37℃水浴中使其溶解,時間最好控制在1-2min內,通?;岬髡露鵲?0℃來加快它的溶解。

4.3K562/A02是對K562長期誘導和篩選得到的良好細胞系,為人原性的,不僅對其誘導藥物阿霉素有很強的耐藥性,對具有其它化學結構和臨床藥理作用的抗腫瘤藥物也有不同程度的交叉耐藥性。

K562/02細胞系在有藥條件下培養傳六十代生長良好,在無藥條件下傳20代之后,耐藥性也可以基本維持。

本發明所選模型藥物表阿霉素為阿霉素的光學異構體,在臨床應用上,用于治療白血病效果比較顯著,所以本發明選擇K562/A02細胞系來研究腫瘤細胞多藥耐藥。

4.4MTT是一種黃顏色的染料,全稱為3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽,其檢測細胞存活的原理為活細胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性MTT還原為水不溶性的藍紫色結晶甲臜并沉積于細胞內或細胞周圍,而死細胞無此功能,形成甲臜的量與細胞活化的程度成正比,通過適當溶劑溶解甲臜后,用酶標儀測溶液的光密度就可以判斷活細胞數。最早用于溶解甲臜的溶劑為鹽酸異丙醇,振蕩溶解結晶后有時會發現溶液中有白色的絮狀懸浮物出現,可能是由于細胞密度過大,裂解不完全造成的,后來用于溶解甲臜的溶劑多為DMSO和三聯液,三聯液的成分為10%SDS-5%異丁醇-0.012mol/L?HCL(w/v/v),它的優點是可以避免因為吸出前面加入的培養基和MTT等繁瑣步驟帶來的誤差,同時也為懸浮細胞的測定提供一種思路。

本發明選擇的逆轉劑槲皮素由于其可與MTT反應,直接把MTT還原而嚴重干擾測定結果,K562和K562/A02均為懸浮細胞,所以在加入MTT之前必須離心去除前面加入的培養基,又考慮到三聯液中SDS要與槲皮素反應,故不選擇三聯液溶解甲臜,最后實驗方案定為離心去除上清液之后加入DMSO溶解甲臜,然后測定光密度。

4.5MDR的產生是多種基因產物共同作用的結果,參與多藥耐藥發生的因素很多,其中P-gp是最典型的泵。細胞過度表達P-gp會引起廣泛的耐藥,臨床發現,血液系統腫瘤、淋巴瘤以及骨髓瘤在診斷的初期因為P-gp低表達而且對化療敏感,初次化療可達到治療效果,但是在復發后P-gp表達出現上調,產生多藥耐藥。

本發明將EPI和QC同時包裹于納米材料中考察其對正常肝細胞L02和白血病耐藥細胞K562/A02的抑制作用,結果表明,40μmol/L的QC可以一定程度逆轉白血病耐藥細胞K562/A02對EPI的耐藥性,降低其IC50,制備成EPI-QC復方納米粒之后的逆轉作用與游離藥物聯用相比沒有顯著性差異,但是對正常肝細胞L02的毒性降低,說明將抗腫瘤藥物和逆轉劑制成復方納米制劑具有重要的現實意義。

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一種 腫瘤 聯合 用藥
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