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维戈塞尔塔vs皇家社会比分: 用于增強抗腫瘤抗體療法的方法.pdf

摘要
申請專利號:

维戈塞尔塔vs皇家社会 www.vmyqew.com.cn CN201080063243.X

申請日:

20101207

公開號:

CN102753195A

公開日:

20121024

當前法律狀態:

有效性:

失效

法律詳情:
IPC分類號: A61K39/395 主分類號: A61K39/395
申請人: 小利蘭·斯坦福大學托管委員會
發明人: 霍爾布魯克·科爾特,羅奇·烏奧,羅納德·萊維,阿拉什·阿什·阿里扎德,馬修·J·戈爾茨坦,詹姆斯·托爾基亞
地址: 美國加利福尼亞州
優先權: 61/267,337,61/287,067,61/358,303
專利代理機構: 北京弘權知識產權代理事務所(普通合伙) 代理人: 郭放;張文
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法律狀態
申請(專利)號:

CN201080063243.X

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法律狀態公告日:

法律狀態類型:

摘要

公開了一種增強用于針對殺傷腫瘤細胞的療法抗體導向的細胞的細胞毒性(ADCC)效率的方法。癌癥特異性細胞表面抗原被單克隆抗體結合,從而刺激細胞毒性T細胞反應,其特征在于共刺激分子在T細胞上上調的細胞表面表達。通過隨后施用第二抗體來加強ADCC反應,第二抗體是共刺激分子的激動劑。

權利要求書

1.一種治療癌癥的方法,該方法包括:向個體施用癌細胞抗原選擇性的第一抗體,經過一段足以誘導或上調可誘導的共刺激分子在NK細胞上的表達的時間后;以有效增強Nk細胞抗體依賴性細胞的細胞毒性(ADCC)的劑量向所述個體施用所述可誘導的共刺激分子的激動劑;其中所述患者的腫瘤細胞群減少。2.如權利要求1所述的方法,其中所述可誘導的共刺激分子是CD137、OX40、GITR、CD30和ICOS中的一種或多種。3.如權利要求1所述的方法,其中所述激動劑是單克隆抗體。4.如權利要求3所述的方法,其中第一抗體特異于CD20、CD19、CD22、CD52、Her2和表皮生長因子受體(ERFR)中的至少一種。5.如權利要求1所述的方法,其中方法在減少腫瘤細胞群方面提供協同作用。6.如權利要求1所述的方法,還包括在施用所述第一抗體之前以及施用所述激動劑之前,測量所述患者中所述可誘導的共刺激分子在NK細胞上的表達的步驟,其中所述激動劑在所述可誘導的共刺激分子在NK細胞上的表達增加之后施用。7.如權利要求1所述的方法,其中所述癌癥是淋巴瘤。8.如權利要求1所述的方法,其中所述癌癥是實體瘤。9.如權利要求8所述的方法,其中所述實體瘤是乳癌。10.如權利要求8所述的方法,其中所述實體瘤是結腸癌。11.如權利要求8所述的方法,其中所述實體瘤是頭頸癌。12.如權利要求1所述的方法,其中癌細胞抗原選擇性抗體特異于CD20。13.如權利要求1所述的方法,其中癌細胞抗原選擇性抗體特異于her-2。14.如權利要求1所述的方法,其中癌細胞抗原選擇性抗體特異于表皮生長因子受體(ERFR)。15.如權利要求1所述的方法,其中癌細胞抗原選擇性抗體特異于CD52。16.如權利要求1所述的方法,其中癌細胞抗原選擇性抗體特異于CD19。17.如權利要求1所述的方法,其中癌細胞抗原選擇性抗體特異于CD22。

說明書

背景技術

在過去四分之一世紀中,單克隆抗體技術是最著名的科學進步之一。這種研究的快速轉化延長了上千癌癥患者的生存。第一個被批準的單克隆抗體是利妥昔單抗,它是一種抗CD20的鼠-人嵌合性IgG1抗體,已經成為患有B細胞淋巴瘤患者的醫護標準??笻ER2(曲妥珠單抗)和抗EGF受體(西妥昔單抗)的單克隆抗體也相似地分別改變了患有乳癌、結直腸癌和頭頸癌的被選患者的自然病程。

盡管單克隆抗體的有前景的活性,患有難治的或晚期癌癥的患者中的反應率并未達到最理想,典型地在25%以下。增強單克隆抗體的活性的努力集中在細胞毒性化療的各種組合上。這在很大程度上忽略并可能部分拮抗單克隆抗體借此發揮功能的免疫機制。

獲得性免疫細胞和固有免疫細胞參與腫瘤細胞的監測和消除。在固有細胞中是自然殺傷細胞(NK細胞)構成了固有免疫系統的主要組成成分。在腫瘤和感染病毒的細胞的排除中NK細胞發揮主要作用。這種細胞通過釋放小的蛋白質細胞質顆粒(稱為穿孔素和顆粒酶),其通過凋亡引起靶細胞死亡來進行殺傷。

自然殺傷細胞的活性受到嚴格的調節,并需要激活信號。例如,通過抗體激活Fc受體允許NK細胞通過抗體依賴性細胞的細胞毒性(ADCC)去裂解細胞。經激活,NK細胞釋放包含顆粒酶和穿孔素的顆粒。穿孔素在靶細胞的細胞膜中形成孔,顆粒酶和相關分子穿過該孔可以進入,從而誘導凋亡。

ADCC是針對腫瘤的單克隆抗體療法發揮作用的一個主要機制。然而,常規的細胞毒性化療引起骨髓抑制,減少了NK細胞群,從而降低ADCC的療效。相比之下,具有加強的NK細胞功能的療法可能會提供改善單克隆抗體的活性而不增加非癌細胞毒性的能力。臨床上這是顯著的,因為由于較大的年齡、晚期的疾病或事先的療法而增加的癌癥患者群體不是常規細胞毒性化療的候選者。本發明解決了這個問題。

發明內容

本發明提供了增強針對腫瘤抗原的單克隆抗體的抗腫瘤作用的方法。在本發明的方法中,通過順序施用針對一種或多種腫瘤抗原的抗體以及抗一種或多種NK細胞上可誘導的共刺激分子的激動抗體,來尤其加強ADCC的功能,其反過來又增強靶細胞的殺傷。

對診斷患有腫瘤的個體首先施用針對腫瘤的抗體。經過一段時間后,NK細胞上調可誘導的共刺激分子(比如CD137、OX40、GITR、CD30或ICOS)的表達,所述NK細胞是對于ADCC關鍵的固有免疫效應細胞。隨后,施用靶向NK細胞上誘導的共刺激分子的第二抗體(包括但不限于抗-CD137、抗-OX40、抗-GITR、抗-CD30或抗-ICOS)。在一些實施方式中,施用針對腫瘤的抗體之后評價上述共刺激分子的表達,以確定第二劑給藥的最佳時間?;蛘?,憑經驗確定定時時間段,并且普遍適用。顯示所述劑的組合及其順序施用,來提供一種在單獨的單劑施用中觀察不到的腫瘤特異性、治療協同作用的水平。該方法特異性增強針對腫瘤抗原的單克隆抗體的抗腫瘤功能。因為第二抗體靶向通過針對腫瘤的抗體在NK細胞上可誘導表達的共刺激分子,該方法允許特異性刺激ADCC介導的腫瘤細胞殺傷中涉及的NK細胞,而省去其它NK細胞,從而限制了潛在的非特異性副作用。

在本發明的一些實施方式中,可誘導共刺激分子是CD137。在這種方法中,對診斷患有腫瘤的個體首先施用腫瘤選擇性的抗體。經過一段足以上調CD137在免疫系統細胞中的表達的時間后,施用第二劑,而所述劑是CD137的激動劑。在一些實施方式中,在各施用步驟之前,確定在血細胞上的CD137表達水平,其中表達的提高表明第二劑可以施用了。

附圖說明

圖1A-1C.與CD20-陽性腫瘤B細胞孵育之后,利妥昔單抗誘導CD137在人NK細胞上的上調。用淋巴瘤細胞系與曲妥珠單抗或利妥昔單抗培養24小時后,分析來自三個健康供體的外周血的CD137在CD3-CD56+NK細胞上的表達。(A)顯示用CD20-淋巴瘤細胞系(OCI-Ly19)或CD20-陽性淋巴瘤細胞系(Ramos,DHL-4,Raji)細胞系培養的來自三個健康供體的CD137+細胞在CD3-CD56+NK細胞中的百分比。(B)顯示在淋巴瘤細胞系(OCI-Ly19、Ramos,DHL-4和Raji)上的CD20表面表達。根據淋巴瘤細胞系的MFI相對于同種型的MFI中的log10-倍增加對直方圖進行著色。(C)顯示用CD20-陽性淋巴瘤細胞系、Ramos和利妥昔單抗培養24小時后,來自代表性的健康供體的CD137在NK細胞亞群CD3-CD56亮和CD3-CD56暗上的表達。

圖2A-2F.抗CD137激動性mAb增加腫瘤細胞上利妥昔單抗介導的NK細胞細胞毒性。用下列五種條件培養24小時之后:僅培養基;CD20-陽性淋巴瘤細胞系(Raji、Ramos或DHL-4);腫瘤和利妥昔單抗;腫瘤和抗CD137抗體;或腫瘤、利妥昔單抗和抗CD137激動抗體(A,Raji,*p=.01;B,Ramos,*p=.003,C,DHL-4,*p=.002),分析從健康供體外周血中分離并純化的NK細胞的通過CD107a動員的脫顆粒。在鉻釋放試驗中分析NK細胞對Raji、Ramos和DHL-4腫瘤細胞的細胞毒性(D-F)。與鉻標記的Raji、Ramos和DHL-4細胞孵育4小時前,純化預激活的NK細胞(如材料和方法中描述的)。(D-F)顯示通過鉻釋放在不同的效應物(激活的NK細胞):靶(Raji)細胞比率下用下列條件培養的靶細胞的裂解百分比:僅用培養基(◆)、抗CD137(▲)、利妥昔單抗(●)或利妥昔單抗和抗CD137(■)抗體(D,Raji,*p=.01;E,Ramos,*p=.01,F,DHL-4,*p=.009)。

圖3A-3D.抗CD137激動mAb增強鼠抗CD20mAb的體內抗淋巴瘤活性。用5×106BL3750淋巴瘤腫瘤細胞對C57BL/6小鼠皮下接種至腹部上。A-B)腫瘤接種后,小鼠然后或者在第3天接受大鼠IgG對照(●)、在第3天接受抗CD20抗體(■)、在第4天接受抗CD137抗體(◆),或在第3天接受抗CD20抗體和在第4天接受抗CD137抗體(▲)。然后監測小鼠(每組10只)的腫瘤生長(A,*p<.001)和總存活率(B,*p=.048)。C-D)顯示具有相同治療順序但是治療延遲至腫瘤接種后8天的腫瘤生長和存活。小鼠或者在第8天接受大鼠IgG對照(●)、在第8天接受抗CD20抗體(■)、在第9天接受抗CD137抗體(◆),或在第8天接受抗CD20抗體和在第9天接受抗CD137抗體(▲)。然后監測小鼠(每組10只)的腫瘤生長(C,*p<.001)和總存活率(D,*p<.001)。

圖4A-4B.抗CD20和抗CD137mAbs的組合活性要求適當的mAb施用順序。用5×106BL3750淋巴瘤腫瘤細胞對C57BL/6小鼠皮下接種至腹部上。腫瘤接種后,小鼠然后或者在第3天接受大鼠IgG對照(●)、在第3天接受抗CD20mAb和在第4天接受抗CD137mAb(▲),或在第3天接受抗CD20mAb和在第3天接受抗CD137mAb(■)。然后監測小鼠(每組10只)的腫瘤生長(A,*p<.001)和總存活率(B,*p=.001)。

圖5A-5D.通過抗CD137激動mAb對抗CD20mAb的抗淋巴瘤活性的增強取決于NK細胞和巨噬細胞。(A)對來自腫瘤接種后4天的生淋巴瘤的C57BL/6小鼠的外周血細胞亞群的CD137在CD3-NK1.1+NK細胞(NK)、F4/80+巨噬細胞和CD3+CD8+T細胞(CD8)和CD3+CD4+T細胞(CD4)上的表達進行分析,其中小鼠在第3天用IgG對照或抗CD20抗體進行治療(n=每組3只小鼠,*p=.001)。(B)對來自腫瘤接種后7天的生淋巴瘤的C57BL/6小鼠的腫瘤浸潤淋巴細胞的CD137在CD3-NK1.1+NK細胞(NK)、F4/80+巨噬細胞和CD3+CD8+T細胞(CD8)和CD3+CD4+T細胞(CD4)上的表達進行分析,其中小鼠在第3天用IgG對照或抗CD20抗體進行治療(n=每組3只小鼠,*p=.012,NS=不顯著)。(C-D)用5×106BL3750淋巴瘤腫瘤細胞接種C57BL/6小鼠。腫瘤接種后,小鼠然后或者在第3天接受大鼠IgG對照(●)、在第-1、0、5、10、15、20和25天接受抗-脫唾液酸基-GM1且在第3天接受抗CD20抗體以及在第4天接受抗CD137抗體(■)、在第-2、0、4、8、12、16、20和24天接受氯膦酸二鈉脂質體(L.)且在第3天接受抗CD20抗體和在第4天接受抗CD137抗體(▼),在第-1、0、5、10、15、20和25天接受抗CD8mAb且在第3天接受抗CD20抗體和在第4天接受抗CD137抗體(◆),或在第3天接受抗CD20抗體和在第4天接受抗CD137抗體(▲)。然后監測小鼠(每組10只)的腫瘤生長(C,*p=.002)和總存活率(D,*p<.001)。

圖6A-6C.在播散性人淋巴瘤異種移植模型中,抗CD137激動mAb增強利妥昔單抗的體內抗淋巴瘤活性。用3×106熒光素酶標記的Raji淋巴瘤腫瘤細胞通過眼后竇靜脈接種SCID小鼠。腫瘤接種后,小鼠然后或者在第3天接受大鼠IgG對照(●)、在第3天接受利妥昔單抗(■)、在第4天接受抗CD137抗體(◆),或在第3天接受利妥昔單抗和在第4天接受抗CD137抗體(▲)。每周連續治療,總共4周。代表治療后第10、第20和第30天的小鼠的熒光素酶成像顯示于(A)中。然后監測小鼠(每組5只)的定量生物發光(B,*p=.001)和總存活率(C,*p=.013)。

圖7A-7C.利妥昔單抗包被的、自體淋巴瘤細胞誘導來自患有B細胞惡性腫瘤的人類患者的NK細胞上的CD137上調。僅用培養基、曲妥珠單抗或利妥昔單抗培養24小時后,分析來自患有B細胞惡性腫瘤的人類患者的外周血和循環腫瘤細胞(CTC)的CD137在CD3-CD56+NK細胞上的表達(A和B)。(A)顯示對于患有邊緣區淋巴瘤(MZL)帶有70%CTC的患者,CD16和CD137在CD3-CD56+NK細胞上的表達。(B)顯示在患有濾泡性淋巴瘤(FL)、慢性淋巴細胞白血病(CLL)、MZL、套細胞淋巴瘤(MCL)、彌漫性大B細胞淋巴瘤(DLBCL)和CD20陽性急性淋巴細胞白血病(ALL)的25名患者的人群中CD137+在CD3-CD56+NK細胞中的百分比。(C)顯示用利妥昔單抗培養24小時之后,來自患有FLCLL(●)、MZLDLBCL和CD20陽性ALL的患者樣本的外周血CTC百分比和CD137在CD3-CD56+NK細胞表面的表達之間的相關性,R2=0.87,p<.001。

圖8A-8C.預激活后在NK細胞上的CD137誘導和時序表達(Temporal?expression)。用培養基、利妥昔單抗、曲妥珠單抗、淋巴瘤細胞系(Raji、Ramos、DHL-4或OCI-Ly19)和利妥昔單抗培養24小時后,分析從健康供體中純化的NK細胞的CD137表達(A)。用Raji細胞系和利妥昔單抗培養0、4、16、24、48和72小時后,分析從健康供體中純化的NK細胞的CD137表達(B)。對于顯示于圖8C中的實驗,將來自代表性健康供體的外周血單核細胞用Raji、Ramos或DHL-4和利妥昔單抗孵育24小時。然后在進行細胞毒性試驗之前分析預激活的NK細胞的CD137表達(C)。

圖9A-9B.抗CD137激動mAb增加細胞因子的釋放和利妥昔單抗介導的預激活NK細胞的細胞毒性。為了評價NK細胞干擾素-γ分泌,從健康PBMC中分離純化的NK細胞,并與利妥昔單抗(10μg/mL)和輻照的(5000拉德)淋巴瘤腫瘤細胞(Raji)以1∶1的比例共同培養24小時。24小時后,NK細胞經分離并用于純度評估(如通過CD3-CD56+流式細胞術確定的>90%純度)(A-B)。預激活的純化的NK細胞然后僅在培養基中、或單獨用抗CD137mAb(BMS-663513,10μg/mL)、單獨用利妥昔單抗(10μg/mL)或利妥昔單抗加上抗CD137mAb(均為10μg/mL)培養4小時,收獲上清并通過ELISA分析干擾素-γ(A,*p=.027)。NK細胞對Raji腫瘤細胞的細胞毒性在鉻釋放試驗中進行分析,在有或沒有在先的NK細胞預激活的情況下(B)。預激活的和未預激活的純化的NK細胞與鉻標記的Raji孵育4小時。通過鉻釋放在不同的效應物(連續的線表示預激活的NK細胞,虛線表示未預激活的NK細胞):靶(Raji)細胞比率下用下列條件培養的靶細胞的裂解百分比:僅用培養基(◆)、抗CD137(▲)、利妥昔單抗(●)或利妥昔單抗和抗CD137(■)抗體(*p=.024)。

圖10.抗CD137激動mAb增加利妥昔單抗介導的NK細胞脫顆粒。僅用培養基、CD20-陽性淋巴瘤細胞系(Raji、Ramos或DHL-4)、腫瘤和利妥昔單抗、腫瘤和抗CD137抗體、或腫瘤、利妥昔單抗、和抗CD137激動抗體培養24小時之后,分析從健康供體外周血分離并純化的NK細胞的CD107a動員的脫顆粒。用Ramos培養后NK細胞上CD107a表達的代表性流式細胞圖。

圖11A-11C.用HER2-陽性腫瘤細胞孵育之后,曲妥珠單抗誘導CD137在人類NK細胞上的上調。用乳癌細胞系和IgG對照、曲妥珠單抗或利妥昔單抗培養24小時后,分析來自三名健康供體的外周血的CD137在CD3-CD56+NK細胞上的表達。(A)顯示用HER2+乳癌細胞系(BT474M1)培養24小時后,來自代表性健康供體的CD69+和CD137+在CD3-CD56+NK細胞上的表達。(B)顯示HER2在乳癌細胞系(MCF7、BT474M1、SKBR3和HER18)上的表面表達。根據乳癌細胞系的MFI相對于同種型的MFI中的log10-倍增加對直方圖進行著色。(C)顯示用可變表達的HER2乳癌細胞系(MCF7、BT474M1、SKBR3、HER18)培養24小時后,來自三個健康供體的CD137在NK細胞CD3-CD56+上的表達。

圖12A-12C.如通過細胞活力測定的,抗CD137激動mAb增加曲妥珠單抗介導的NK細胞對腫瘤細胞的細胞毒性。預激活的NK細胞在用MCF7、BT474M1和HER18孵育18小時之前進行純化。(A-C)顯示用NK細胞、腫瘤、僅培養基、抗CD137、曲妥珠單抗、或曲妥珠單抗和抗CD137抗體培養之后,通過膜聯蛋白和7AAD活力染色的凋亡靶細胞的百分比(A,MCF7細胞系,B,BT474M1腫瘤系*p=.03;C,HER18,**p<.01)。

圖13.如通過鉻釋放測定的,抗CD137激動mAb增加曲妥珠單抗介導的NK細胞對腫瘤細胞的細胞毒性。在鉻釋放試驗中分析NK細胞對BT474M1腫瘤細胞的細胞毒性。預激活的NK細胞在用鉻標記的BT474M1孵育4小時之前進行純化。顯示的是通過鉻釋放在不同的效應物(激活的NK細胞)∶靶(BT474M1)細胞比率下用下列條件培養的靶細胞的裂解百分比:僅用培養基(●)、抗CD137(▼)、利妥昔單抗(▲)、或利妥昔單抗和抗CD137(●)抗體(p=.006)。

圖14A-14B.抗CD137激動mAb增強曲妥珠單抗的體內抗乳癌活性。皮下注射0.72mg/60天釋放的β雌二醇丸之后1天,用5×106BT474M1乳房腫瘤細胞對nu/nu裸鼠皮下接種至腹部上。(A-B)腫瘤接種后,小鼠然后或者在第3天接受大鼠IgG對照(●)、在第3天接受曲妥珠單抗抗體(■),在第4天接受抗CD137抗體(◆),或在第3天接受曲妥珠單抗和第4天接受抗CD137抗體(▲),每周重復各治療,共三周。然后監測小鼠(每組10只)的腫瘤生長(A,*p<.001)和總存活率(B,**p=.003)。

圖15A-15C.抗CD137激動mAb增強曲妥珠單抗的體內抗乳癌活性,同時保留了HER2特異性。皮下注射0.72mg/60天釋放的β雌二醇丸之后1天,用5×106MCF7乳房腫瘤細胞對nu/nu裸鼠在左側腹皮下接種,以及用5×106HER18乳房腫瘤細胞在右側腹皮下接種。A-C)腫瘤接種后,小鼠然后或者在第3天接受曲妥珠單抗,或在第3天接受曲妥珠單抗和在第4天接受抗CD137抗體,每周重復各治療,共三周。A)腫瘤模型。B)然后監測代表性的小鼠(每組10只中的3只)的腫瘤生長。C)治療組的腫瘤生長,腫瘤類型包括用曲妥珠單抗治療的小鼠左側腹的MCF7(○)和右側腹的HER18(□□),以及用曲妥珠單抗和抗CD137mAb治療的小鼠左側腹的MCF7(●)和右側腹的HER18(■)(*p<.001)。

圖16.抗CD137激動mAb增強曲妥珠單抗體內抗HER2+原發性乳房腫瘤的抗乳癌活性。200cGy全身輻射(TBI)后24小時,用1×106HER2+原發性乳房腫瘤細胞通過乳房內注射來接種SCID小鼠。在第40天,將小鼠隨機編入四組(每組5只小鼠)中的一組,包括在第40天治療的IgG對照(●)、在第40天曲妥珠單抗治療(■)、在第41天抗CD137mAb治療(◆),或在第40天曲妥珠單抗且在第41天抗CD137mAb治療(▲)。在各組中每周重復治療,共三次治療。然后監測小鼠的腫瘤生長(*p=.016)。

圖17A-17B.用EGFR-陽性腫瘤細胞孵育之后,西妥昔單抗誘導CD137在人類NK細胞上的上調。用頭頸癌細胞系和僅培養基、利妥昔單抗或西妥昔單抗培養24小時后,分析來自三名健康供體的外周血的CD137在CD3-CD56+NK細胞上的表達。(A)顯示EGFR在頭頸癌細胞系(103、SCC4、PC1、SCC6)上的表面表達。根據乳癌細胞系的MFI相對于同種型的MFI中的log10-倍增加對直方圖進行著色。(B)顯示用可變表達的EGFR頭頸癌細胞系(SCC6、PC1和SCC4)培養24小時后,來自三個健康供體的CD137在NK細胞CD3-CD56+上的表達。

圖18A-18C.如通過細胞活力測定的,抗CD137激動mAb增加西妥昔單抗介導的NK細胞對腫瘤細胞的細胞毒性。預激活的NK細胞在用SCC6、PC1和SCC4孵育24小時之前進行純化。(A-C)顯示用僅腫瘤、或腫瘤和NK細胞和培養基、西妥昔單抗、抗CD137、西妥昔單抗和抗CD137抗體培養之后,通過膜聯蛋白和7AAD活力染色的凋亡靶細胞的百分比(A,SCC6,*p=.002;B,PC1,**p=.011;C,SCC4,***p=.001)。

圖19.如通過鉻釋放測定的,抗CD137激動mAb增加西妥昔單抗介導的NK細胞對腫瘤細胞的細胞毒性。在鉻釋放試驗中分析NK細胞對SCC6腫瘤細胞的細胞毒性。新鮮的且預激活的NK細胞在用鉻標記的SCC6細胞孵育5小時之前進行純化。顯示的是通過鉻釋放在不同的效應物(新鮮的NK細胞)∶靶(SCC6)細胞比率下用下列條件培養的靶細胞的裂解百分比:僅用培養基(●)、抗CD137(▼)、西妥昔單抗(▲)、或西妥昔單抗和抗CD137(■)抗體(**p=.003),或者預激活的NK細胞作為效應物和SCC6靶,且西妥昔單抗和抗CD137(◆)抗體培養的靶細胞的裂解百分比(*p=.002)。

圖20.抗CD137激動mAb增強西妥昔單抗的體內抗頭頸癌活性。用3×106SCC6頭頸腫瘤細胞對nu/nu裸鼠皮下接種至腹部上。腫瘤接種后,小鼠然后或者在第21天接受大鼠IgG對照(●)、在第21天接受西妥昔單抗(■)、在第22天接受抗CD137抗體(◆)、或在第21天接受西妥昔單抗和在第22天接受抗CD137抗體(▲),每周重復各治療,共三次治療。然后監測小鼠(每組10只)的腫瘤生長(A,*p<.001)。

圖21A-21B—對患有頭頸癌的患者輸注西妥昔之后,循環NK細胞上調CD137。分析來自患有頭頸癌的患者的新鮮外周血的CD137在CD3-CD56+NK細胞上的表達。(A)顯示0期,生物標志物,實驗方案(NCT01114256)。(B)顯示西妥昔單抗輸注之前和之后,新鮮外周血CD3-CD56+NK細胞中CD137+細胞的百分比。

具體實施方式

提供了方法用于增強針對腫瘤抗原的單克隆抗體的抗腫瘤作用。在本發明的方法中,通過順序施用抗體的組合來加強ADCC功能并增強靶細胞殺傷。顯示相對于單一劑的施用,劑的組合和順序施用提供協同作用。針對腫瘤的抗體的施用上調可誘導的共刺激分子如CD137、OX40、GITR、CD30或ICOS在NK細胞上的表達,NK細胞是對ADCC關鍵的固有免疫效應細胞。隨后,施用靶向誘導的共刺激分子的第二激動抗體(包括但不限于抗-CD137、抗-OX40、抗-GITR、抗-CD30或抗-ICOS)。在一些實施方式中,評價施用針對腫瘤的抗體之后上述共刺激分子的表達,以確定第二劑給藥的最佳時間?;蛘?,憑經驗確定定時時間段,并且普遍適用。因為第二抗體靶向通過針對腫瘤的抗體已經在NK細胞上可誘導表達的共刺激分子,該方法允許特異性刺激ADCC介導的腫瘤細胞殺傷中涉及的NK細胞,而省去其它NK細胞,從而限制了潛在的非特異性副作用。

進一步說明本發明之前,應當理解的是本發明不限于如此描述的具體實施方式,正因為如此,當然有變化?;褂斫獗疚乃褂玫氖跤锝齔鲇諉枋鼉嚀迨凳┓絞降哪康?,并無意進行限制,因為本發明的范圍將只受到附加權利要求的限制。

當提供值的范圍時,應理解除非另有指明,否則該范圍的上限和下限之間的和任何其它規定的各居中值或所規定范圍中的居中值至下限單位的十分之一涵蓋在本發明的范圍內。受限于規定范圍內任何明確排除的限制,這些更小范圍的上限和下限可獨立地包含在更小的范圍內,并也包括在本發明范圍內。當規定的范圍包括一個或兩個限制時,排除一個或兩個包括的限制的范圍也包括在本發明內。

可按照邏輯上可行的所敘述事件的任何順序以及所敘述的事件順序來實施本文敘述的方法。

除非另有定義,本文使用的所有技術和科學術語具有本發明所屬領域的普通技術人員通常理解的相同的含義。盡管與本文所述的那些相似或等同的任何方法和材料也可以用于本發明的實踐或測試中,優選現描述的方法和材料。

本文提及的所有出版物納入本文作為參考,結合所引用的出版物來公開和描述方法和/或材料。

必須指出,如本文和附加權利要求中所用,除非另有指明,否則單數形式“一”和“該”包括復數指代。應進一步注意的是,這樣起草權利要求來排除任何可選的要素。正因如此,這種表述結合權利要求要素的敘述作為這種排除性術語如“僅”、“只”等的使用、或者作為“負”限制的使用的前提基礎。

本文討論的出版物僅因為其在本申請提交日之前公開而提供。本文任何情況不能解釋為承認本發明憑借在先的發明無權先于這種出版物。此外,提供的出版日期可能不同于實際的出版日期,這可能需要單獨證實。

定義

可誘導的共刺激分子。如本文所用,可誘導的共刺激分子是一種表達在免疫細胞(包括但不限于自然殺傷(NK)細胞)上的多肽,其表達在NK細胞激活期間被誘導或顯著上調。共刺激分子的激活增強效應細胞的功能,例如增加由激活的NK細胞介導的ADCC。這種可誘導的共刺激分子包括但不限于CD137、OX40、GITR、CD30、ICOS等,是本領域技術人員已知的。這種分子的激動劑,包括結合并激活共刺激分子的抗體,是本發明方法所關注的。許多這種共刺激分子是腫瘤壞死因子受體家族(TNFR)的成員。TNFR相關分子沒有任何已知的酶活性,并且依賴于細胞質蛋白質的募集來激活下游信號通路。

CD137。CD137,也可以稱為Ly63、ILA或4-1BB,是一種腫瘤壞死因子(TNF)受體家族的成員。該受體家族的成員及其結構上相關的配體是各種生理過程重要的調節子并在免疫應答調節中發揮重要作用。CD137由激活的NK細胞、T和B淋巴細胞和單核細胞/巨噬細胞表達?;蟣嗦?55個氨基酸的蛋白質,其具有胞外域中的3個富含半胱氨酸的基序(該受體家族的特征)、跨膜區、以及含有潛在磷酸化位點的短N-端胞質部分。原代細胞中的表達是嚴格激活依賴性的。該受體的配體是TNFSF9。報道人CD137僅結合其配體。激動劑包括天然配體(TNFSF9)、適配體(見McNamara等人(2008)J.Clin.Invest.118:376-386)和抗體。

CD134。OX40(CD134)及其結合伙伴OX40L(CD252),是腫瘤壞死因子受體/腫瘤壞死因子超家族的成員,并表達于激活的T細胞以及一些其它淋巴和非淋巴細胞上。OX40和OX40L調節來自T細胞、抗原呈遞細胞、自然殺傷細胞和自然殺傷T細胞的細胞因子產生,并調節細胞因子受體信號傳導。

GITR。糖皮質激素誘導的TNFR相關的(GITR)蛋白質屬于腫瘤壞死因子受體/腫瘤壞死因子超家族,并刺激獲得性和固有免疫。它表達于幾種細胞和組織(包括T和自然殺傷(NK)細胞)中,并由其配體GITRL(主要表達于抗原呈遞細胞和內皮細胞上)激活。GITR/GITRL系統參與自身免疫/炎癥反應的進展,并通過包括NK-細胞-共激活的機制加強對感染和腫瘤的反應。

CD30??縋な芴錍D30(TNFRSF8)及其配體CD30L(CD153,TNFSF8)是腫瘤壞死因子(TNF)超家族的成員,并顯示在激活的免疫細胞亞群中的限制表達。CD30是一種TNF受體超家族的I型跨膜糖蛋白。CD30的配體是CD30L(CD153)。CD30對CD30L的結合介導多效性作用,包括細胞增殖、激活、分化和凋亡的細胞死亡。

可誘導的共刺激分子(ICOS)。ICOS是CD28家族的成員。ICOS表達可能是可容易檢測到是靜止的,但激活后上調。ICOS和ICOS-L似乎是單配的一對。ICOS共刺激增強效應物功能。

“可誘導的共刺激分子激動劑”包括如上所述的天然配體、適配體、特異于激活受體的可誘導的共刺激分子的抗體、以及選擇性結合可誘導的共刺激分子的抗體的衍生物、變體和生物活性片段?!氨涮濉倍嚯氖侵溉縵露ㄒ宓木哂杏胩烊恍蛄卸嚯?00%以下序列一致性的一種生物活性多肽。該變體包括其中在天然序列的N-或C-端或在天然序列中添加有一個或多個氨基酸殘基的多肽;刪除約1至40個氨基酸殘基、以及任選被一個或多個氨基酸殘基取代的多肽;以及上述多肽的衍生物,其中氨基酸殘基被共價修飾從而獲得的產物具有非天然存在的氨基酸。通常,生物活性變體將具有與天然序列多肽至少約90%,優選至少約95%,更優選至少約99%氨基酸序列一致性的氨基酸序列。變體多肽可被天然地或非天然地糖基化,即多肽具有不同于在相應天然存在的蛋白質中發現的糖基化模式的糖基化模式。

受關注的是特異于可誘導的共刺激分子的配體或抗體的片段,尤其是生物活性片段和/或對應著功能域的片段。受關注片段通常長度上至少約10aa至至少約15aa,通常在長度至少約50aa,但通常長度將不會超過200aa,其中片段將具有與其所源自的多肽一致的連續氨基酸延伸?!俺ざ壬現遼?0aa”的片段例如意圖包括來自例如CD137特異性抗體或來自TNFSF9的20個或更多連續的氨基酸。在本文中,“約”包括特定引用的值、或者多或少幾個(5、4、3、2或1)氨基酸的值。本文所述的蛋白質變體由本發明范圍內的多核苷酸編碼。遺傳密碼可用于選擇適當的密碼子來構建相應的變體。通過已知的方法,多核苷酸可用于生產多肽,且這些多肽可用于生產抗體?!叭諍稀倍嚯氖且恢職ㄈ諍現粱蚪岷現烈煸炊嚯牡畝嚯幕蚱洳糠?例如,一個或多個域)的多肽。

在一些實施方式中,可誘導的共刺激分子激動劑是一種抗體。術語“抗體”或“抗體部分(moiety)”意圖包括含有具有適合和識別表位的特定形狀的含任何多肽鏈的分子結構,其中一個或多個非共價結合相互作用穩定分子結構和表位間的復合物。本發明利用的抗體可能是多克隆抗體,但優選單克隆抗體,因為它們可通過細胞培養或重組地進行復制,并可經過修飾來降低它們的抗原性。

通過標準操作,通過用抗原組合物注射生產動物可產生多克隆抗體。見例如Harlow和Lane,Antibodies:A?Laboratory?Manual,Cold?Spring?Harbor?Laboratory,1988。當利用整個蛋白質、或蛋白質的較大段時,通過用蛋白質和合適的佐劑(如,弗氏、弗氏完全的、水包油乳液等)免疫生產動物可產生抗體。當利用較小的肽時,用較大的分子綴合肽來制備免疫刺激綴合物是有利的。用于這種目的的商業上可獲得的常用綴合蛋白質包括牛血清白蛋白(BSA)和鎖孔戚血藍蛋白(KLH)。為了產生針對特定表位的抗體,可利用源自全序列的肽?;蛘?,為了產生針對蛋白質靶的相對短的肽部分的抗體,如果多肽結合到載體蛋白質(比如卵清蛋白、BSA或者KLH)上可引起優異的免疫應答?;蛘?,對于單克隆抗體,通過分離刺激的免疫細胞(比如來自接種動物脾的那些)可形成雜交瘤。這些細胞然后融合至永生細胞,如在細胞培養中能夠無限復制的骨髓瘤細胞或轉化細胞,從而產生永生的、分泌免疫球蛋白的細胞系。此外,通過遺傳工程可產生抗體或抗原結合片段。當向人類施用時產生較少免疫應答的人源化、嵌合或異種人類抗體優選用于本發明。

除了整個免疫球蛋白(或它們的重組對應物)以外,包括表位結合位點的免疫球蛋白片段(如,Fab′、F(ab′)2、或其它片段)可用作本發明的抗體部分。該抗體片段可通過蓖麻毒蛋白、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、或其它蛋白酶切割產生自整個的免疫球蛋白??衫彌刈槊庖咔虻鞍準際跎杓啤捌巍被蜃钚〉拿庖咔虻鞍?。例如,可通過將可變輕鏈區經過肽接頭(如,不形成α螺旋或β片層基序的聚甘氨酸或其它序列)連接至可變重鏈區產生用于本發明的“Fv”免疫球蛋白。

“增強效率”是指,與用單一劑(如特異于腫瘤細胞的單克隆抗體)所觀察到的凋亡水平相比,ADCC介導的腫瘤細胞凋亡的增加。協同的,是指劑的組合提供比單一劑高的效果,這種效果可以高于所組合的各劑的添加的效果。

針對腫瘤的抗體。一些抗體目前正在臨床中用于癌癥治療,而其它的正處于臨床開發的不同階段。本發明方法的受關注抗體通過ADCC發揮作用,并典型地對腫瘤細胞有選擇性,盡管如此本領域技術人員將認識到一些臨床上有用的抗體實際上作用于非腫瘤細胞如CD20。

有許多抗原和相應的單克隆抗體用于治療B細胞惡性腫瘤。一種流行的靶抗原是CD20,其發現在B細胞惡性腫瘤上。利妥昔單抗是一種針對CD20抗原的嵌合的未綴合的單克隆抗體。CD20在B細胞激活、增殖和分化中有重要功能作用。單克隆抗體阿侖單抗靶向CD52抗原,阿侖單抗表明對慢性淋巴細胞白血病的治療。CD22為一些抗體所靶向并且最近已證實與毒素組合在化療耐受性毛細胞白血病中的療效。兩個新的靶向CD20的單克隆抗體,托西莫單抗和替伊莫單抗,已提交給食品和藥品監督管理局(FDA)。這些抗體與放射性同位素綴合。

本發明方法中有用的單克隆抗體包括但不限于依決洛單抗和曲妥珠單抗(赫賽汀),已用于實體瘤。依決洛單抗靶向見于結腸癌和直腸癌的17-1A抗原,并已在歐洲批準用于這些適應癥。其抗腫瘤作用是通過ADCC、CDC和抗獨特型網絡的誘導所介導的。曲妥珠單抗靶向HER-2/neu抗原。該抗原見于25%至35%的乳癌。曲妥珠單抗被認為以各種方式發揮作用:下調HER-2受體表達、抑制過度表達HER-2蛋白質的人腫瘤細胞的增殖、增強免疫更新(immune?recruitment)和抗過度表達HER-2蛋白質的腫瘤細胞的ADCC、以及下調血管生成因子。

阿侖單抗(Campath)用于治療慢性淋巴細胞白血??;結腸癌和肺癌;發現吉妥單抗(Mylotarg)用于治療急性骨髓性白血??;發現替伊莫單抗(Zevalin)用于治療非霍奇金氏淋巴瘤;發現帕尼單抗(Vectibix)用于治療結腸癌。

在本發明方法中使用西妥昔單抗(Erbitux)也是受關注的??固褰岷現罞GF受體(EGFR),并已用于治療實體瘤,包括結腸癌和頭頸部鱗狀細胞癌(SCCHN)。

術語“生物樣本”包括多種獲自生物體的樣本類型,并且可用于診斷或監測試驗。該術語包括生物來源的血液和其它液體樣本、固體組織樣本,如活檢標本或組織培養物或由此衍生的細胞及其后代。該術語包括獲取之后以任何方式操作過的樣本,比如用試劑處理、溶解或某些成分的富集。該術語包括臨床樣本,還包括細胞培養中的細胞、細胞上清、細胞裂解物、血清、血漿、生物體液和組織樣本。

術語“癌癥”、“贅生物”、“腫瘤”和“癌”本文互換使用是指這樣的細胞,其表現相對自主的生長細胞,從而它們表現出一種異常的生長表型,特征在于細胞增殖控制的顯著喪失。在一般情況下,本申請中檢測或治療的受關注的細胞包括癌前的(例如,良性)、惡性的、轉移前的、轉移的和非轉移的細胞。特別受關注的是癌細胞的檢測。如“正常細胞”的情況中所用的術語“正?!筆侵肝醋硇偷南赴蟣硐殖霰患觳樽櫓嘈偷姆親赴翁南赴??!鞍┲⒈硇汀幣話閌侵赴┫赴賾械娜魏胃髦稚鏘窒?,這些現象可以隨著癌癥類型而不同。癌癥表型通常通過例如在細胞生長或增殖(如,不受控制的生長或增殖)、細胞周期的調節、細胞運動、細胞-細胞相互作用、或轉移等方面的異常來確定。受關注癌癥包括但不限于包括白血病的造血性癌癥、淋巴瘤(霍奇金和非霍奇金)、骨髓瘤和骨髓增生性疾??;肉瘤;黑色素瘤、腺瘤、實體組織癌、口腔、咽喉、喉和肺的鱗狀細胞癌、肝癌、泌尿生殖系統癌癥如子宮頸癌、膀胱癌和腎細胞癌、頭頸癌、胃腸道癌和神經系統癌癥、良性病變如乳頭狀瘤等。

短語“實體瘤”如本文所用是指通常不包含囊腫或液體區域的組織的異常團塊。實體瘤可能是良性或惡性的。不同類型的實體瘤根據形成它們的細胞類型而命名。實體瘤的實例是肉瘤、癌、淋巴瘤等。

針對特定的癌癥表位或表位組合的單克隆抗體允許靶向和/或耗盡表達標志物的癌細胞群。使用單克隆抗體的各種技術可用于篩選表達標志物的細胞群,并包括使用抗體包被的磁珠的磁分離、用附著到固體基質(即板)上的抗體“篩選”和流式細胞術(見,例如,美國專利5,985,660;Morrison等人,Cell,96:737-49(1999))。這些技術允許在活檢樣本的免疫組織化學中;在檢測從癌細胞脫落入血液和其它生物體液中的標志物的存在中等用于篩選特定的細胞群。

本文所用術語“治療”、“治”、“處理”等通常是指獲得希望的藥物和/或生理作用。該作用在完全或部分防止疾病或其癥狀方面可以是預防性的,和/或在部分或完全穩定或治愈疾病和/或可由疾病引起的不利作用方面可以是治療性的。如本文所用“治療”覆蓋哺乳動物中(尤其是人)任何疾病的治療,并包括:(a)在對疾病或癥狀易感的但是尚未診斷患有疾病或癥狀的對象中,防上上疾病或癥狀的發生;(b)抑制疾病的癥狀,即停滯其發展;或(c)減輕疾病的癥狀,即引起疾病或癥狀的消退。

術語“受體”、“個體”、“對象”、“宿主”和“患者”本文互換使用,并且是指需要診斷、治療或療法的任何哺乳動物對象,特別是人類。

“治療靶”是指由腫瘤細胞和/或非腫瘤(免疫)細胞表達的分子,其可以被靶向來誘導或增強抗腫瘤活性。

方法

提供增強由針對腫瘤細胞的抗體的施用所誘導的細胞殺傷效率的方法。向患者施用有效劑量的針對腫瘤的第一抗體,其誘導可誘導的共刺激分子如CD137、OX40、GITR、CD30或ICOS在NK細胞上的上調,NK細胞是對于ADCC關鍵的固有免疫效應細胞。隨后,向所述個體施用有效劑量的抗這些分子之一的第二激動抗體,這些分子包括但不限于CD137、OX40、GITR、CD30或ICOS,其中第二抗體足以增強第一抗體所靶向的腫瘤細胞的ADCC殺傷。因為第二抗體靶向已通過針對腫瘤的抗體在NK細胞上可誘導表達的共刺激分子,該方法允許特異性刺激ADCC介導的腫瘤細胞殺傷中涉及的NK細胞,而省去其它NK細胞,從而限制了潛在的非特異性副作用。

在一些實施方式中,在患者樣本(通?;頰叩難貉凈蚱湎赴糠?中確定由針對腫瘤的抗體誘導的共刺激分子(包括但不限于CD137、OX40、GITR、CD30、或ICO)的水平。作為基線,可以在施用針對腫瘤的抗體之前,確定樣本中共刺激分子的水平,和可以在施用針對腫瘤的抗體之后確定表達的提高。

在本發明的一些實施方式中,向患者施用有效劑量的腫瘤選擇性抗體,隨后經過足夠的時間使得CD137在免疫系統細胞(尤其是NK細胞)上的表達上調。該足夠的時間通常是至少約12小時,更通常至少約18小時,通常至少約24小時,并可能至少約2天,至少約3天,并且不超過約5天,通常不超過約4天。CD137上調之后,向所述個體施用有效劑量的CD137激動劑,其中激動劑足以增強由第一抗體所靶向的腫瘤細胞的ADCC殺傷。在一些實施方案中,在患者樣本(通?;頰叩難貉凈蚱湎赴糠?中確定CD137的水平。作為基線,可以在施用腫瘤選擇性抗體之前,確定樣本品中CD137的水平,和可以在施用腫瘤選擇性抗體之后確定表達的提高。CD137在NK細胞上的表達希望的增加是至少約1.5倍,至少約2倍或更高。當在整體血細胞中測量時,由于污染的非反應細胞的數量,表達增加可能較低。

“降低癌細胞的生長”包括但不僅限于,減少癌細胞的增殖和提高腫瘤細胞的凋亡。利用任何已知的試驗,包括但不限于摻加[3H]-胸苷;計數一段時間的細胞數目;檢測和/或測量與相關癌癥有關的標志物等,可以容易地確定是否已實現癌細胞生長的減少。

利用任何已知的癌癥診斷試驗,包括但不限于活體檢查、對比射線照相研究、CAT掃描和在個體血液中檢測與癌癥相關的腫瘤標志物,可以評價一種物質或特定量的該物質在治療癌癥中是否有效??梢勻砘蚓植?,通常是全身施用物質。

制劑

通過將具有所需純度程度的抗體與任選的生理可接受載體、賦形劑或穩定劑混合,為了保存可作為凍干制劑或水溶液的形式來制備包括用于本發明方法中的一種或多種抗體的治療制劑(Remington′s?Pharmaceutical?Sciences第16版,Osol,A.Ed.(1980))。以與良好醫療操作一致的方式配制、制劑和施用抗體組合物。在這方面考慮的因素包括正在接受治療的特定癌癥、個體患者的臨床狀況、劑的遞送位點、施用方法、施用計劃和醫療操作者已知的其他因素。待施用的抗體“治療有效量”將受到這種考慮的控制。

治療劑量可能是至少約0.01μg/kg體重,至少約0.05μg/kg體重;至少約0.1μg/kg體重,至少約0.5μg/kg體重,至少約1μg/kg體重,至少約2.5μg/kg體重,至少約5μg/kg體重,并且不超過約100μg/kg體重。本領域技術人員將理解,這些準則將根據如在使用抗體片段中,或在使用抗體綴合物中活性劑的分子量進行調整。劑量還可能根據施用途徑變化。

可接受的載體、賦形劑或穩定劑在所用的劑量和濃度時對于受體是無毒的,并包括緩沖劑比如磷酸鹽、檸檬酸鹽和其他有機酸等;抗氧化劑包括抗壞血酸和蛋氨酸;防腐劑(比如氯化十八烷基二甲基芐基銨;氯化六甲雙銨;苯扎氯銨、芐索氯銨;苯酚、丁醇或芐醇;烷基苯甲酸酯類比如甲基或丙基苯甲酸酯;鄰苯二酚;間苯二酚;環己醇;3-戊醇;間甲酚);低分子量(小于約10個殘基)多肽;蛋白質如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白;親水聚合物比如聚乙烯吡咯烷酮;氨基酸如甘氨酸、谷氨酸、天門冬酰胺、組氨酸、精氨酸或賴氨酸;單糖、二糖和其它碳水化合物包括葡萄糖、甘露糖或糊精;螯合劑比如EDTA;糖比如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇;形成鹽的反離子比如鈉;金屬復合物(如,鋅蛋白復合物);和/或非離子表面活性劑如TWEEN.TM.、PLURONICS.TM.或聚乙二醇(PEG)。待用于體內施用的制劑必須是無菌的。這很容易通過穿過無菌過濾膜的過濾實現。

在本發明的另一個實施方式中,提供了含有用于治療上述疾病的材料的制造的物品。制造的物品包括容器和標簽。合適的容器包括,例如瓶、小瓶、注射器和試管。容器可由各種材料如玻璃或塑料制成。容器盛放對治療病癥有用的組合物,并且可具有無菌入口(例如,容器可能是靜脈溶液袋或具有皮下注射針可穿刺的塞的小瓶)。組合物中的活性劑是一種或多種上述抗體。容器上的或結合的標簽表明組合物用于治療所選擇的條件。制造的物品可還包括第二容器,其包含藥學上可接受的緩沖液比如磷酸鹽緩沖鹽水、林格氏液和右旋糖溶液。它可還包括其它材料,從商業和用戶的角度來看所需的其它緩沖劑、稀釋劑、過濾器、針、注射器和帶有使用說明的包裝內冊。

適用于本發明方法的抗體和激動劑可作為試劑盒的形式提供,例如存在于含有一個或多個含有活性成分的單位劑型的包裝或分裝裝置中。該包裝或裝置可例如包括金屬或塑料箔,比如吸塑包裝。包裝或分裝裝置可附有施用說明。也可制備包括可以配制于兼容的藥物載體中的用于本發明方法的劑的組合物,將其置于適當的容器中以及貼上用于治療指示的病癥的標簽。標簽上指示的適用條件可包括癌癥的治療。試劑盒還包括適于測量NK細胞上可誘導的共刺激分子的表達的單元,如包括特異性結合可誘導的共刺激分子的可檢測的帶標記的試劑,和表達參照物以及本領域已知的等。

實驗

十年前治療癌癥的范例限于常規細胞毒性的化療,假設迅速增殖的腫瘤細胞對劑(比如細胞周期抑制劑或DNA損傷劑)的敏感性增加。隨著食品和藥物管理局對利妥昔單抗的批準,這種范例在1997年改變了,利妥昔單抗是首個治療性單克隆抗體并靶向表面標志物CD20用于非霍奇金淋巴瘤的治療。單克隆抗體比常規細胞毒性的化療具有獨特的優勢,即良好的耐受性,且較小的系統性毒性,對腫瘤的選擇性和最小的脫靶效應,以及靶向未經歷頻繁有絲分裂的緩慢增殖的細胞的能力。

利妥昔單抗的批準之后,在1998年批準了曲妥珠單抗用于HER2+乳癌,它是一種抗HER2(人類表皮生長因子受體2)的人源化IgG1抗體。在2004年批準了西妥昔單抗用于結直腸癌,它是一種靶向EGFR(表皮生長因子受體)的嵌合的IgG1抗體。在2006年,西妥昔單抗還被批準用于治療頭頸癌。正如最近HER2+胃癌和食管癌的鑒定所證明的,癌癥療法現在的重點是發現新的或當前的抗體可以靶向的新型的和已知的靶。

與常規化療相比,單克隆抗體證明最小的直接的細胞毒性。盡管證據支持多種抗體功能的機制,抗腫瘤活性的主要機制是通過抗體依賴性細胞細介導的細胞毒性(ADCC)。通過ADCC發生的細胞毒性是由帶有Fc受體的自然殺傷(NK)細胞或巨噬細胞/單核細胞介導的,Fc受體結合抗體靶向的腫瘤細胞。結合至抗體的NK細胞Fc受體激活NK細胞,導致釋放觸發抗體靶向的腫瘤細胞凋亡的細胞因子和細胞毒性顆粒。提高的NK細胞的功能加強了ADCC并產生改進的抗腫瘤活性。

識別抗體包被的腫瘤細胞后,本發明鑒定在NK細胞上可誘導表達的共刺激分子,NK細胞是對于ADCC關鍵的固有效應細胞。被針對腫瘤的抗體上調之后,這些共刺激分子(包括但不限于CD137、OX40、GITR、CD30、或ICOS)可以隨后用激動抗體靶向來增強這些效應細胞介導的ADCC。鑒于越來越多的針對腫瘤的靶特異性抗體,這對于單克隆抗體所直接靶向的任何癌癥類型都具有治療意義。

增強NK細胞功能的激動抗體的臨床益處僅受到腫瘤細胞所表達的靶和靶特異性抗體的數目的限制。鑒于利妥昔單抗、曲妥珠單抗和西妥昔單抗在過去十年的影響,發現靶和抗體的努力似乎仍然是活躍的研究領域。盡管激動性NK細胞抗體的應用將擴展到非霍奇金淋巴瘤、乳癌、結直腸癌和頭頸癌以外,這四種仍然證明了臨床益處的大小。

抗體包被的腫瘤細胞觸發NK細胞的激活,NK細胞的殺傷活性然后可以通過抗CD137的第二激活抗體被刺激。激動性抗CD137抗體的加入是增強任何抗腫瘤抗體的治療作用的通用方法。

實施例1

NK細胞暴露于利妥昔單抗包被的CD20+淋巴瘤后,發生增強的CD137的NK細胞表達。用激動抗體靶向CD137來增強抗腫瘤的ADCC依賴于其在暴露于抗體包被的腫瘤細胞之后在NK細胞上增加的表面表達。因為第二抗體靶向通過針對腫瘤的抗體(利妥昔單抗、曲妥珠單抗)在NK細胞上可誘導表達的共刺激分子(CD137),該方法允許特異性刺激ADCC介導的腫瘤細胞(淋巴瘤、乳癌)殺傷中涉及的NK細胞,而省去其它NK細胞,從而限制了潛在的非特異性副作用。

我們從由于慢性淋巴細胞白血病(CLL)、邊緣區淋巴瘤(MZL)和CD20+急性淋巴細胞白血病(ALL)而具有循環CD20+腫瘤細胞的患者中分離了外周血單核細胞(PBMC)。用曲妥珠單抗或利妥昔單抗培養之后,通過流式細胞術分析PBMC。用利妥昔單抗培養之后,CD137+NK細胞百分比從基線處的1-2%增加至22-43%,同時CD16(Fc受體)下調。這似乎是抗體依賴性的,因為用曲妥珠單抗培養后沒有發生激活。如圖1A-1C所示,用CD20陽性腫瘤B細胞孵育之后,利妥昔單抗誘導CD137在人NK細胞上的上調。用淋巴瘤細胞系和曲妥珠單抗或利妥昔單抗培養24小時后,分析來自三個健康供體的外周血的CD137在CD3-CD56+NK細胞上的表達。

抗CD137激動mAb增加利妥昔單抗介導的NK細胞對腫瘤細胞的細胞毒性,如圖2A-2F所示。用下列五種條件培養24小時之后:僅培養基;CD20-陽性淋巴瘤細胞系(Raji、Ramos或DHL-4);腫瘤和利妥昔單抗;腫瘤和抗CD137抗體;或腫瘤、利妥昔單抗和抗CD137激動抗體,分析從健康供體外周血中分離并純化的NK細胞的通過CD107a動員的脫顆粒。如圖3A-3D中所示,也有抗CD137激動mAb的抗淋巴瘤活性的增強。

如圖4A-4B所示,抗CD20和抗CD137mAb組合活性需要適當的mAb施用順序,并依賴于NK細胞和巨噬細胞。圖5A-5D中顯示,對來自腫瘤接種后4天的生淋巴瘤的C57BL/6小鼠的外周血細胞亞群的CD137在CD3-NK1.1+NK細胞(NK)、F4/80+巨噬細胞CD3+CD8+T細胞(CD8)和CD3+CD4+T細胞(CD4)上的表達進行分析,其中小鼠在第3天用IgG對照或抗CD20抗體進行治療;對來自腫瘤接種后7天的生淋巴瘤的C57BL/6小鼠的腫瘤浸潤淋巴細胞的CD137在CD3-NK1.1+NK細胞(NK)、F4/80+巨噬細胞CD3+CD8+T細胞(CD8)和CD3+CD4+T細胞(CD4)上的表達進行分析,其中小鼠在第3天用IgG對照或抗CD20抗體進行治療。

通過用利妥昔單抗、曲妥珠單抗和西妥昔單抗在異種移植無胸腺的裸鼠模型中測試CD137Ab的活性,驗證了在同系小鼠模型中觀察到的抗CD20Ab和抗CD137Ab療法的協同作用是有效的。這種模型之前用于利妥昔單抗、曲妥珠單抗和西妥昔單抗的臨床前測試。在淋巴瘤模型中,Balb/c裸nu/nu小鼠在第0天接種3×106轉染有螢火蟲熒光素酶的Raji細胞,并在第3天用利妥昔單抗治療(10μg/g體重,IP),隨后在第4天用150μg大鼠抗小鼠抗CD137Ab?IP治療。在第3天利妥昔單抗治療前收集血液、在第4天抗CD137Ab?IP治療前收集血液、以及在第5天收集血液,分析CD137、CD69和CD16的NK細胞的表達。在第3天Ab療法之前,IP熒光素注射(200μL)后進行生物發光成像,每周重復。用利妥昔單抗的CD137的效果顯示于播散性人類淋巴瘤異種移植模型中,如圖6A-6C所示。

利妥昔單抗包被的自體淋巴瘤細胞誘導CD137在來自患有B細胞惡性腫瘤的人類患者的NK細胞上的上調,如圖7A-7C中所示。僅用培養基、曲妥珠單抗或利妥昔單抗培養24小時后,分析來自患有B細胞惡性腫瘤的人類患者的外周血和循環腫瘤細胞(CTC)的CD137在CD3-CD56+NK細胞上的表達。圖8A-8C中預激活后分析NK細胞上CD137的誘導和時序表達的動力學。

用抗CD20Ab或抗CD137Ab單一療法降低約50%的腫瘤生長。然而,所有用抗CD20Ab治療的小鼠在60天之前死亡,而僅50%用抗CD137Ab治療的小鼠腫瘤接種后生存100天。在第3天用抗CD20Ab治療隨后在第4天用抗CD137Ab治療導致腫瘤完全消退并且90%的小鼠存活100天。為了確定所觀察到的協同作用是否依賴于NK細胞功能,在第-1、0天和此后每5天直至第20天用抗-脫唾液酸基-GM1耗盡NK細胞,在這一點上觀察到清晰的治療組的分離。用抗-脫唾液酸基-GM1耗盡NK細胞取消了組合療法的好處。

抗CD137激動mAb增加細胞因子的釋放和利妥昔單抗介導的預激活NK細胞的細胞毒性,如圖9A-9B所示。為了評價NK細胞干擾素γ分泌,從健康PBMC中分離純化的NK細胞,并與利妥昔單抗(10μg/mL)和輻照的(5000拉德)淋巴瘤腫瘤細胞(Raji)以1∶1的比例共同培養24小時。24小時后,NK細胞經分離并用于純度評估。預激活的純化的NK細胞然后僅在培養基中、或單獨用抗CD137mAb、單獨用利妥昔單抗或利妥昔單抗加上抗CD137mAb培養4小時,收獲上清并通過ELISA分析干擾素-γ。NK細胞對Raji腫瘤細胞的細胞毒性在鉻釋放試驗中進行分析,在有或沒有在先的NK細胞預激活的情況下??笴D137激動mAb還增加利妥昔單抗介導的NK細胞脫顆粒,顯示于圖10中。

實施例2

NK細胞暴露于曲妥珠單抗包被的HER2+乳癌后,發生增加的CD137的NK細胞表達。然后,我們確定它們在暴露于曲妥珠單抗包被的乳癌之后,是否CD137在NK細胞上的表達同樣地增加。我們從健康供體的血液中分離NK細胞并將它們連同曲妥珠單抗或利妥昔單抗一起加入到乳癌細胞系中保持24小時,所述乳癌細胞系包括MCF7(非表達HER2的乳癌細胞系)和SKBR3(過度表達HER2的乳癌細胞系)。然后通過流式細胞術分析NK細胞的CD137表達,如圖11所示。

用如上所述針對乳癌細胞系的西妥昔單抗(10μg/mL)、利妥昔單抗(10μg/mL)或曲妥珠單抗(10μg/mL)包被的適當腫瘤細胞系共培養之后確定CD137的NK細胞表達。進行CD3和CD56的流式細胞術來評價NK細胞分離物的純度。包括CD69、CD107和CD16的其它激活標志物包括在流式細胞術的面板中。結腸癌細胞系包括HCT-8(EGFR+)和SW620(EGFR),以及鱗狀的頭頸癌細胞系包括TE3(EGFR+HER2-)和TE4(EGFR-HER2+)。

如圖12A-12C所示,如通過細胞活力測定的,抗CD137激動mAb增加曲妥珠單抗介導的NK細胞對腫瘤細胞的細胞毒性。預激活的NK細胞在用MCF7、BT474M1和HER18孵育18小時之前進行純化,并評價凋亡。

還通過鉻釋放試驗確定激活的NK細胞經抗體和腫瘤細胞刺激之后的功能能力。為了研究抗HER2+乳癌的活性,從正常血液中分離的NK細胞通過與SKBR3(HER2+)和曲妥珠單抗共培養而激活。通過流式細胞術測試這些暴露的NK細胞的CD137和CD69的表達以評價其激活。激活的NK細胞按照12.5∶1、25∶1、50∶1和100∶1的比例連同曲妥珠單抗(10μg/mL)、抗CD137Ab(10μg/mL)、或曲妥珠單抗+抗CD137Ab(均為10μg/mL)一起加入到鉻標記的SKBR3靶細胞中。用HCT-8(EGFR+)細胞系和西妥昔單抗進行相似的激活和殺傷試驗來研究抗EGFR+結腸癌的體外功能活性、用TE3(EGFR+HER2-)細胞系和西妥昔單抗進來研究EGFR+頭頸癌的體外功能活性。如圖13中所示,如通過鉻釋放測定的,抗CD137激動mAb增加曲妥珠單抗介導的NK細胞對腫瘤細胞的細胞毒性。

在同系小鼠淋巴瘤模型中已經提供了支持性的證據,抗CD137激動mAb增強曲妥珠單抗的體內抗乳癌活性。如圖14A-14B所示,皮下注射0.72mg/60天釋放的β雌二醇丸之后1天,用5×106BT474M1乳房腫瘤細胞對nu/nu裸鼠皮下接種至腹部上。腫瘤接種后,小鼠然后或者在第3天接受大鼠IgG對照、在第3天接受曲妥珠單抗抗體,在第4天接受抗CD137抗體、或在第3天接受曲妥珠單抗且在第4天接受抗CD137抗體,每周重復各治療,共三周。然后監測小鼠的腫瘤生長和總存活率。

如圖15A-15C所示,抗CD137激動mAb增強曲妥珠單抗的體內抗乳癌活性,同時保留了HER2特異性。皮下注射0.72mg/60天釋放的β雌二醇丸之后1天,用5×106MCF7乳房腫瘤細胞對nu/nu裸鼠在左側腹皮下接種,以及用5×106HER18乳房腫瘤細胞在右側腹皮下接種。腫瘤接種后,小鼠然后或者在第3天接受曲妥珠單抗,或在第3天接受曲妥珠單抗和在第4天接受抗CD137抗體,每周重復各治療,共三周。然后監測代表性的小鼠的腫瘤生長。

如圖16所示,抗CD137激動mAb增強曲妥珠單抗體內抗HER2+原發性乳房腫瘤的抗乳癌活性。200cGy全身輻射(TBI)后24小時,用1×106HER2+原發性乳房腫瘤細胞通過乳房內注射來接種SCID小鼠。在第40天,將小鼠隨機編入四組中的一組,包括在第40天治療的IgG對照、在第40天曲妥珠單抗治療、在第41天抗CD137mAb治療、或在第40天曲妥珠單抗且在第41天抗CD137mAb治療。在各組中每周重復治療,共三次治療。然后監測小鼠的腫瘤生長。

實施例3

如圖17A-17B所示,用EGFR-陽性腫瘤細胞孵育之后,西妥昔單抗誘導CD137在人類NK細胞上的上調。用頭頸癌細胞系和僅培養基、利妥昔單抗或西妥昔單抗培養24小時后,分析來自三名健康供體的外周血的CD137在CD3-CD56+NK細胞上的表達,和顯示已增加的表達。

如圖18A-18C所示,如通過細胞活力測定的,抗CD137激動mAb增加西妥昔單抗介導的NK細胞對腫瘤細胞的細胞毒性。預激活的NK細胞在用SCC6、PC1和SCC4孵育24小時之前進行純化。用僅腫瘤、或腫瘤和NK細胞和培養基、西妥昔單抗、抗CD137、西妥昔單抗和抗CD137抗體培養之后,通過膜聯蛋白和7AAD活力染色確定凋亡靶細胞的百分比。

如通過鉻釋放測定的,抗CD137激動mAb增加西妥昔單抗介導的NK細胞對腫瘤細胞的細胞毒性。NK細胞對SCC6腫瘤細胞的細胞毒性在鉻釋放試驗中進行測定。新鮮的且預激活的NK細胞在用鉻標記的SCC6細胞孵育5小時之前進行純化。圖19中顯示的是通過鉻釋放在不同的效應物(新鮮的NK細胞):靶(SCC6)細胞比率下靶細胞的裂解百分比。

抗CD137激動mAb增強西妥昔單抗的體內抗頭頸癌活性。如圖20所示,用3×106SCC6頭頸腫瘤細胞對nu/nu裸鼠皮下接種至腹部上。腫瘤接種后,小鼠或者在第21天接受大鼠IgG對照、在第21天接受西妥昔單抗、在第22天接受抗CD137抗體、或在第21天接受西妥昔單抗且在第22天接受抗CD137抗體,每周重復各治療,共三次治療。然后監測小鼠的腫瘤生長。

此外還顯示,對患有頭頸癌的患者輸注西妥昔之后,循環NK細胞上調CD137(圖21A-21B)。分析來自患有頭頸癌的患者的新鮮外周血的CD137在CD3-CD56+NK細胞上的表達,和顯示所述表達被上調。

當NK細胞暴露于抗體包被的腫瘤細胞之后激活出現在NK細胞上的特異性靶(CD137)、以及針對這些宿主細胞上的CD137靶的第二抗體在多種腫瘤模型中具有協同抗腫瘤活性,這種表現是創新的且對于患者護理有高度的影響。激動性抗CD137抗體(例如BMS-663513)目前在多個大型制藥公司正處于早期階段的臨床試驗中以及臨床前開發中。在I期和II期臨床試驗中,約300名患者已經用BMS抗體進行了治療。已觀察到可忽略的單劑活性,反應率低于10%。

基于我們的體外數據,沒有共存的針對腫瘤的抗體(比如利妥昔單抗)時,沒有觀察到顯著的NK細胞功能的增加。然而,當兩種抗體組合時NK細胞的功能顯著增加。盡管在實體瘤中最小的單劑活性,因為有機會證明抗CD137組合抗體療法的臨床價值,所以本發明具有高度的重要性。以通過免疫調節的協同作用為基礎的療法是創新的,且成為轉變改善患有很多類型癌癥的患者生存的方法的范例。

更廣泛地,除了CD137以外,我們已經觀察到一些當暴露于抗體包被的腫瘤細胞后在NK細胞上被上調的其它共刺激分子,如OX40和GITR。和CD137相似,預期用激動抗體靶向這些可誘導的共刺激分子來刺激并增強NK細胞功能,從而導致增加的ADCC。

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