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维戈塞尔塔vs皇家马德里优酷直播: 一種角膜組織長期保存液及其制備方法.pdf

摘要
申請專利號:

维戈塞尔塔vs皇家社会 www.vmyqew.com.cn CN201811440809.0

申請日:

20181129

公開號:

CN109221093A

公開日:

20190118

當前法律狀態:

有效性:

審查中

法律詳情:
IPC分類號: A01N1/02 主分類號: A01N1/02
申請人: 鎮江雷音再生醫學科技有限公司
發明人: 蘇萍,童劍萍,許偉,吳佳宇,肖丹
地址: 212009 江蘇省鎮江市新區丁卯楚橋路99號中心研發區C30號樓219室
優先權: CN201811440809A
專利代理機構: 南京蘇高專利商標事務所(普通合伙) 代理人: 湯磊
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法律狀態
申請(專利)號:

CN201811440809.0

授權公告號:

法律狀態公告日:

法律狀態類型:

摘要

本發明公開了一種角膜組織長期保存液及其制備方法,包括以下組分及含量:硫酸軟骨素鈉15~25g/L、透明質酸鈉0.5~4g/L、右旋糖酐40?0.5~3g/L、甘油15~30g/L、丙酮酸鈉0.001~0.3g/L、維生素C?0.002~2g/L、硫酸慶大霉素0.05~0.7g/L、碳酸氫鈉1.4~2.2g/L、4?羥乙基哌嗪乙磺酸5.0~6.5g/L、注射用水1L。本發明采用硫酸軟骨素鈉協同透明質酸鈉和右旋糖酐的復配體系,得到可用于角膜組織長期保存的保存液,特別有利于長期維持角膜透鏡原有的膠原纖維結構和透明性;該長期保存液保存角膜組織后,復溫即可直接使用,操作簡單,不需復水。

權利要求書

1.一種角膜組織長期保存液,其特征在于包括以下組分及含量:2.根據權利要求1所述的角膜組織長期保存液,其特征在于:所述長期保存液的pH值為7.2~7.6,外觀為無色至微黃色澄明液體,且無懸浮物、無沉淀。3.根據權利要求1所述的角膜組織長期保存液,其特征在于:所述注射用水的細菌內毒素<0.25EU/ml。4.一種權利要求1~3任一所述的角膜組織長期保存液的制備方法,其特征在于包括以下步驟:步驟S10:稱量:按照配方量分別稱取各組分;步驟S20:配制:包括:步驟S201:容器內加入部分注射用水,控制水溫25~60℃,然后分別加入硫酸軟骨素鈉、透明質酸鈉、右旋糖酐40、丙酮酸鈉、碳酸氫鈉、4-羥乙基哌嗪乙磺酸,再補入注射用水并攪拌30~120min;步驟S202:將步驟S201的混合液控制溫度16~40℃,加入維生素C,再加入部分注射用水并攪拌5~30min;步驟S203:將步驟S202的混合液控制溫度16~40℃,加入硫酸慶大霉素,再加入部分注射用水并攪拌5~30min;步驟S204:將步驟S203的混合液控制溫度16~40℃,加入甘油,再加入余量的注射用水定容并攪拌10~30min,得到中間品;步驟S30:中間品檢測:對中間品取樣,進行pH檢測和外觀檢測,檢測如不符合則需對中間品進行pH調節,調節后仍不符合則報廢;步驟S40:除菌過濾:將步驟S30檢測合格的中間品或經調節后合格的中間品,先進行預過濾,再通過0.2μmPES過濾器進行過濾,即得所述角膜組織長期保存液。5.根據權利要求4所述的制備方法,其特征在于:步驟S30中,pH檢測合格指標為7.2~7.6,外觀檢測合格指標為無色至微黃色澄明液體,且無懸浮物、無沉淀。6.根據權利要求4所述的制備方法,其特征在于:步驟S40中,對中間品進行pH調節采用鹽酸或氫氧化鈉溶液。7.根據權利要求4所述的制備方法,其特征在于:所述長期保存液采用低硼硅安瓿瓶或中硼硅安瓿瓶灌裝,并經加塞和軋蓋密閉。

說明書

技術領域

本發明涉及一種角膜組織長期保存液及其制備方法。

背景技術

角膜病是我國第二位致盲眼病,我國現有約400萬角膜盲患者,每年角膜盲病人新增15多萬人,角膜移植仍然是恢復視力、保存眼球的主要手段,然而我國角膜材料嚴重匱乏,與龐大的需求相比,杯水車薪。

飛秒激光小切口角膜基質透鏡取出術(Small Incision Lenticule Extraction,SMILE)是近年來角膜屈光手術領域最大的發展之一,用于近視及散光的矯正,具有極高的安全性、有效性、穩定性及可預測性。這部分在角膜基質層內取出的組織我們稱為“角膜透鏡”。SMILE角膜組織透鏡來源非常豐富,國內每年開展SMILE手術約一百萬臺,然而SMILE手術中取出的角膜透鏡這一“副產品”往往被拋棄,并未得到有效的利用。角膜透鏡預期可用于矯正遠視和治療圓錐角膜、角膜營養不良、邊緣角膜變性(周邊角膜的免疫性、非感染性疾病)、角膜基質變薄、角膜潰瘍、角膜穿孔等角膜疾病,以及利用其構建組織工程化生物角膜的載體等。

目前市場上的角膜保存液僅適合于穿透角膜移植或內皮移植,適用于角膜的低溫中期保存,其主要保存內皮細胞的活性,組成復雜,價格昂貴,但限制了在角膜透鏡保存中的廣泛應用。然而角膜透鏡更多應關注的是膠原纖維結構和透明性?;?。

發明內容

發明目的:針對上述問題,本發明的目的之一是提供一種角膜組織長期保存液,由其適用于長期保存角膜透鏡,本發明的目的之二是提供一種這種保存液的制備方法。

技術方案:一種角膜組織長期保存液,包括以下組分及含量:

進一步的,所述長期保存液的pH值為7.2~7.6,外觀為無色至微黃色澄明液體,且無懸浮物、無沉淀。

進一步的,所述注射用水的細菌內毒素<0.25EU/ml。

一種上述的角膜組織長期保存液的制備方法,包括以下步驟:

步驟S10:稱量:按照配方量分別稱取各組分;

步驟S20:配制:包括:

步驟S201:容器內加入部分注射用水,控制水溫25~60℃,然后分別加入硫酸軟骨素鈉、透明質酸鈉、右旋糖酐40、丙酮酸鈉、碳酸氫鈉、4-羥乙基哌嗪乙磺酸,再補入注射用水并攪拌30~120min;

步驟S202:將步驟S201的混合液控制溫度16~40℃,加入維生素C,再加入部分注射用水并攪拌5~30min;

步驟S203:將步驟S202的混合液控制溫度16~40℃,加入硫酸慶大霉素,再加入部分注射用水并攪拌5~30min;

步驟S204:將步驟S203的混合液控制溫度16~40℃,加入甘油,再加入余量的注射用水定容并攪拌10~30min,得到中間品;

步驟S30:中間品檢測:對中間品取樣,進行pH檢測和外觀檢測,檢測如不符合則需對中間品進行pH調節,調節后仍不符合則報廢;

步驟S40:除菌過濾:將步驟S30檢測合格的中間品或經調節后合格的中間品,先進行預過濾,再通過0.2μm PES過濾器進行過濾,即得所述角膜組織長期保存液。

進一步的,步驟S30中,pH檢測合格指標為7.2~7.6,外觀檢測合格指標為無色至微黃色澄明液體,且無懸浮物、無沉淀。

進一步的,步驟S40中,對中間品進行pH調節采用鹽酸或氫氧化鈉溶液。

進一步的,所述長期保存液采用低硼硅安瓿瓶或中硼硅安瓿瓶灌裝,并經加塞和軋蓋密閉。

本發明的原理是:采用硫酸軟骨素鈉協同透明質酸鈉和右旋糖酐的復配體系,最大限度的保存角膜組織,特別是能夠長期維持角膜透鏡原有的膠原纖維結構和透明性。

硫酸軟骨素是中期保存液發展的關鍵技術,被認為是一種在4℃條件下能對延長角膜保存時間起關鍵作用的成分,而這類保存液存在的問題之一是角膜各層均可吸收小分子量硫酸軟骨素,從而使水流入基質導致角膜水腫。但右旋糖酐的加入則克服了上述缺點,有助于減少基質層中蛋白多糖的丟失,從而維持角膜組織的透明性。

硫酸軟骨素鈉、透明質酸鈉和右旋糖酐40分子結構含有大量的親水性極性基團,可與水分子、聚合物分子形成氫鍵締合,從而使角膜組織、高分子聚合物和水分子有機結合在一起。另外,硫酸軟骨素鈉和透明質酸鈉分子與角膜具有特殊的親和力,稱之為生物黏附(Bioadhesion),經其處理的角膜可以呈現良好的生物舒展性。因此,硫酸軟骨素鈉、透明質酸鈉、右旋糖酐的復配結合,所產生的協同增效作用,特別有利于長期維持角膜透鏡原有的膠原纖維結構和透明性。

有益效果:本發明的優點是:采用硫酸軟骨素鈉協同透明質酸鈉和右旋糖酐的復配體系,得到可用于角膜組織長期保存的保存液,特別有利于長期維持角膜透鏡原有的膠原纖維結構和透明性;該長期保存液保存角膜組織后,復溫即可直接使用,操作簡單,不需復水。

附圖說明

圖1為具體實施方式中,用于驗證保存效果的豬角膜,第0天的外觀圖;

圖2(a)-(c)為具體實施方式中,用于驗證保存效果的豬角膜,使用本發明長期保存液分別保存1個月、6個月、12個月的外觀圖;

圖3(a)-(c)為具體實施方式中,用于驗證保存效果的豬角膜,使用對照保存液分別保存1個月、6個月、12個月的外觀圖;

圖4為具體實施方式中,用于驗證保存效果的豬角膜,第0天的組織切片顯微鏡圖;

圖5(a)-(c)為具體實施方式中,用于驗證保存效果的豬角膜,使用本發明長期保存液分別保存1個月、6個月、12個月的組織切片顯微鏡圖;

圖6(a)-(c)為具體實施方式中,用于驗證保存效果的豬角膜,使用對照保存液分別保存1個月、6個月、12個月的組織切片顯微鏡圖;

圖4-圖6的顯微鏡放大倍率為200×。

具體實施方式

下面結合附圖和具體實施例,進一步闡明本發明,這些實施例僅用于說明本發明而不用于限制本發明的范圍。

實施例1

一種角膜組織長期保存液,包括以下組分及含量:

上述的角膜組織長期保存液的制備方法,具體包括以下步驟:

步驟S10:稱量:按照配方量分別稱取各組分。

步驟S20:配制:包括:

步驟S201:容器內加入部分注射用水,控制水溫59±1℃,然后分別加入硫酸軟骨素鈉、透明質酸鈉、右旋糖酐40、丙酮酸鈉、碳酸氫鈉、4-羥乙基哌嗪乙磺酸,再補入注射用水并攪拌40min,使以上組分溶解;

步驟S202:將步驟S201的混合液控制溫度39±1℃,加入維生素C,再加入部分注射用水并攪拌10min;

步驟S203:將步驟S202的混合液控制溫度39±1℃,加入硫酸慶大霉素,再加入部分注射用水并攪拌10min;

步驟S204:將步驟S203的混合液控制溫度39±1℃,加入甘油,再加入余量的注射用水定容并攪拌20min,得到中間品。

步驟S30:中間品檢測:對中間品取樣,進行pH檢測和外觀檢測,pH檢測合格指標為7.2~7.6,外觀檢測合格指標為無色至微黃色澄明液體,且無懸浮物、無沉淀,如pH檢測不符合,則采用鹽酸或氫氧化鈉溶液調節,調節后仍不符合則報廢。

步驟S40:除菌過濾:將步驟S30檢測合格的中間品或經調節后合格的中間品,先進行預過濾,再通過0.2μm PES過濾器進行過濾,即得所述角膜組織長期保存液。

可將制得的長期保存液采用低硼硅安瓿瓶或中硼硅安瓿瓶灌裝,并經加塞和軋蓋密閉。

實施例2

一種角膜組織長期保存液,包括以下組分及含量:

上述的角膜組織長期保存液的制備方法,與實施例1基本相同,區別在于:步驟S201中,控制水溫50±1℃,攪拌80min;步驟S202中,控制溫度35±1℃,攪拌20min;步驟S203中,控制溫度35±1℃,攪拌15min;步驟S204中,控制溫度35±1℃,攪拌20min。

實施例3

一種角膜組織長期保存液,包括以下組分及含量:

上述的角膜組織長期保存液的制備方法,與實施例1基本相同,區別在于:步驟S201中,控制水溫40±1℃,攪拌100min;步驟S202中,控制溫度35±1℃,攪拌30min;步驟S203中,控制溫度35±1℃,攪拌25min;步驟S204中,控制溫度35±1℃,攪拌25min。

實施例4

一種角膜組織長期保存液,包括以下組分及含量:

上述的角膜組織長期保存液的制備方法,與實施例1相同。

實施例5

一種角膜組織長期保存液,包括以下組分及含量:

上述的角膜組織長期保存液的制備方法,與實施例1相同。

下面,以實施例3制得的本發明長期保存液和傳統無菌甘油作為對照保存液,通過豬角膜來驗證本發明角膜組織長期保存液的保存效果。

豬角膜片的處理和保存步驟如下:

步驟1:在屠宰場現場摘取豬眼球,用含抗生素的無菌磷酸鹽緩沖液沖洗;

步驟2:用含抗生素溶液的濕紗塊包裹眼球鞏膜部分,以維持眼球瓶內的飽和濕氣環境(紗布塊不得接觸角膜),將眼球角膜面向上放入眼球瓶內,向角膜面滴抗生素溶液,蓋緊;

步驟3:將眼球瓶放入有冰塊的運輸箱,眼球瓶與冰塊之間需隔以材料避免冰塊溫度過低使角膜凍傷,溫度維持在2~8℃;

步驟4:運回實驗室后,在超凈工作臺上取出眼球,由齒鑷固定,用10mm環鉆在角膜表面左右旋轉,做垂直鉆切;確認角膜鞏膜緣與其下方的脈絡膜完全分離后,夾持角膜片的鞏膜緣,輕輕取出,用含抗生素的無菌磷酸鹽緩沖液進行沖洗;

步驟5:將沖洗后的角膜片分別放入含有本發明長期保存液的凍存管中和含有對照保存液的凍存管中,完全浸沒于本發明長期保存液和對照保存液,立即蓋緊瓶蓋,貼好標簽后,放入程序降溫盒進行降溫,最終放入液氮中保存;

步驟6:分別在第0天、1個月、6個月和12個月保存后,

從液氮中取出保存在本發明長期保存液中的角膜片,放入溫度為37±2℃的恒溫震蕩水浴鍋中復溫30min,然后取出進行外觀和組織切片指標檢測;

從液氮中取出保存在對照保存液中的角膜片,放入溫度為37±2℃的恒溫震蕩水浴鍋中復溫30min,然后使用無菌磷酸鹽緩沖液沖洗角膜片,之后放入磷酸鹽等滲緩沖介質(含硫酸軟骨素和右旋糖酐)復水8~25min,然后取出進行外觀和組織切片指標檢測。

1、外觀檢測:將角膜片置于自然光或日光燈下,目力觀察其外觀:

由附圖1與附圖2(a)-(c)可見,在液氮條件下,使用本發明長期保存液分別保存角膜片1個月、6個月、12個月,角膜片外觀均為中央平整、光滑、透明、無水腫和渾濁現象,與第0天的新鮮角膜外觀無差異;

由附圖1與附圖3(a)-(c)可見,而使用對照保存液保存角膜片1個月,外觀中度發黃,輕微水腫、增厚和渾濁,6個月、12個月后,角膜片明顯水腫、增厚和渾濁。

2、組織切片檢測:

由附圖4與附圖5(a)-(c)可見,顯微鏡下觀察,在液氮條件下,使用本發明長期保存液分別保存角膜片1個月、6個月、12個月,基質層無增厚及水腫,基質層基質膠原纖維排列整齊緊密,直徑均一、無分支,上皮層及內皮細胞層基本無缺失,角膜組織各層次間連接緊密;

由附圖4與附圖6(a)-(c)可見,而使用對照保存液保存角膜片后,基質層不同程度增厚、斷裂,上皮層及內皮細胞層與其粘附的組織層之間,也出現不同程度脫離、缺失。

在液氮條件下,本發明的長期保存液保存角膜組織后,復溫即可直接使用,操作簡單,不需復水。而采用傳統無菌甘油保存角膜組織后,角膜在使用時,需對角膜組織進行復溫和復水。本發明的長期保存液可用于角膜組織長期保存,包含全角膜、角膜透鏡和板層角膜。

關 鍵 詞:
一種 角膜 組織 長期 保存 及其 制備 方法
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