• / 14
  • 下載費用:30 金幣  

维戈塞尔塔对皇家社会: 一種獸用自體血清角膜中期保存液及其制備方法.pdf

摘要
申請專利號:

维戈塞尔塔vs皇家社会 www.vmyqew.com.cn CN201811084952.0

申請日:

20180918

公開號:

CN109258622A

公開日:

20190125

當前法律狀態:

有效性:

審查中

法律詳情:
IPC分類號: A01N1/02 主分類號: A01N1/02
申請人: 揚州大學
發明人: 李建基,崔璐瑩,王亨,郭龍,張琳,李俊
地址: 225009 江蘇省揚州市大學南路88號
優先權: CN201811084952A
專利代理機構: 南京縱橫知識產權代理有限公司 代理人: 薛海霞;董建林
PDF完整版下載: PDF下載
法律狀態
申請(專利)號:

CN201811084952.0

授權公告號:

法律狀態公告日:

法律狀態類型:

摘要

本發明涉及一種獸用自體血清角膜中期保存液及其制備方法,屬于獸藥試劑制備技術領域。本發明通過使用供體血清,提供了一種經濟、保存效果好的配制方案,解決了目前尚無獸用中期角膜保存液、商品化人用角膜中期保存液價格昂貴的問題。將下列藥品分別溶于雙蒸水,制成每1000mL含MEM9.5g,HEPES?5.96g,葡聚糖20g,碳酸氫鈉2.2g,地塞米松磷酸鈉25mg,還原型谷胱甘肽0.92g,慶大霉素10mg,兩性霉素b?250μg,透明質酸鈉15?mg,供體血清300mL的溶液,過濾滅菌,4°C保存。本發明通過檢測兔角膜內皮細胞活性、角膜透明度、厚度及組織結構,比較了自體血清保存液與無血清保存液的角膜保存效果,能夠保存兔角膜7~14d,具有?;そ悄つ諂?、抑制角膜水腫的良好效果。

權利要求書

1.一種獸用自體血清角膜中期保存液,其特征在于,每1000mL角膜中期保存液組成為:MEM培養基9.5g、HEPES緩沖液5.96g、葡聚糖20g、碳酸氫鈉2.2g、地塞米松磷酸鈉25mg、還原型谷胱甘肽0.92g、慶大霉素10mg、兩性霉素B250μg、透明質酸鈉15mg、供體血清300mL,余量為雙蒸水。2.根據權利要求1所述的一種獸用自體血清角膜中期保存液的制備方法,其特征在于,制備步驟包括:1)配制基礎液;2)無菌條件下添加透明質酸、慶大霉素、兩性霉素B;3)添加供體血清。3.根據權利要求2一種獸用自體血清角膜中期保存液的制備方法,其特征在于,基礎液配制步驟包括:a)按權利要求1所述配方,將MEM培養基干粉9.5g、葡聚糖20g、碳酸氫鈉2.2g、地塞米松磷酸鈉25mg、還原型谷胱甘肽0.92g溶解于雙蒸水中,用約5.96gHEPES緩沖液調節pH至7.4,定容至700mL;b)在超凈工作臺內使用0.22μm濾器,將步驟a)得到的溶液過濾除菌,得到基礎液,備用。4.根據權利要求2所述的一種獸用自體血清角膜中期保存液的制備方法,其特征在于,步驟2)中,在無菌條件下,將透明質酸鈉15mg、慶大霉素10mg、兩性霉素B250μg加入基礎液中。5.根據權利要求2或4所述的一種獸用自體血清角膜中期保存液的制備方法,其特征在于,步驟2)中,將添加了透明質酸、慶大霉素、兩性霉素B的基礎液分裝于20mL保存瓶中,每瓶14mL。6.根據權利要求5所述的一種獸用自體血清角膜中期保存液的制備方法,其特征在于,將供體血清加入所述的保存瓶至保存瓶內液體體積為20mL,封口,4°C保存。7.根據權利要求2或6所述的一種獸用自體血清角膜中期保存液的制備方法,其特征在于,供體血清制備步驟包括:(1)采血15~20mL;(2)于37°C靜置2h,待血清完全析出;(3)在4°C條件下1400離心15分鐘,吸取上清液;(4)無菌條件下,使用0.22μm孔徑的一次性濾器,將血清過濾除菌。

說明書

技術領域

本發明涉及一種獸用自體血清角膜中期保存液及其制備方法,屬于獸藥試劑制備技術領域。

背景技術

隨著中國寵物數量的迅速發展,寵物疾病迅速增多。角膜移植已成為治療嚴重犬角膜疾病的常用手術。角膜保存液為移植術提供了供體角膜,并使角膜移植術由緊急手術轉化為擇期手術,為供體和供體角膜的檢查提供時間。然而目前獸醫臨床角膜移植缺乏有效、經濟和簡便的角膜保存液。

維持角膜內皮的生存能力和完整性是角膜保存技術的重要目標。按照對角膜內皮細胞活性的影響,角膜保存可分為活性保存和非活性保存?;钚員4嬗摯篩荼4媸奔浞治唐詒4?、中期保存和長期保存。短期保存主要指濕房保存,是將全眼取出,經滅菌處理,封閉放置在4℃濕房中。該方法保存時間在48小時內,難以滿足術前篩查,移植失敗率偏高。長期保存包括器官培養和深低溫冷凍保存,可維持角膜活性數周至數年,但所需設備復雜,價格昂貴。

中期角膜保存是將供體角膜片無菌儲存于4℃保存液中,利用低溫抑制角膜代謝,降低組織能量需求,使角膜內皮活性保持4~14天。目前常用中期保存液有Optisol、Eusol-C、Optisol-GS和Dexsol等,其中Optisol是美國眼庫最常用的角膜活性保存液,具有維持角膜厚度、保持內皮細胞形態與結構穩定的效果。這些進口商品化中期角膜保存液一方面價格偏高,另一方面是針對人角膜移植研制,在我國寵物診療行業難以推廣。因此找到有效、經濟和簡便的獸用角膜保存技術具有重要臨床意義。

中期角膜保存液的常見成分包括HEPES緩沖液、硫酸軟骨素、葡聚糖、透明質酸鈉、皮質類固醇、抗微生物藥、抗氧化劑、各種生長因子和受體血清。血清與房水成分相似,可用于角膜保存。在人角膜保存液的研制中,已有人使用受體血清保存角膜。與受體血清相比,供體血清源自供體本身,是更理想的角膜保存液成分,也為我們配制獸用角膜中期保存也提供了思路。

發明內容

為了克服上述缺陷,本發明目的在于填補當前尚無獸用角膜中期保存液的空缺,提供了一種含有自體血清的獸用角膜中期保存液并對其血清含量進行合理優化。該保存液能有效抑制角膜水腫、保持角膜透明度,維持角膜內皮細胞活性和形態結構的完整性,避免因長時間保存而出現的內皮細胞壞死和融合現象。

為了實現上述發明目的,本發明的獸用角膜中期保存液成分為:MEM9.5g/L、HEPES 5.96g/L、葡聚糖20g/L、碳酸氫鈉2.2g/L、地塞米松磷酸鈉25mg/L、還原型谷胱甘肽0.92g/L、慶大霉素10mg/L、兩性霉素B 250μg/L、透明質酸鈉15mg/L、供體血清30%,百分比為體積百分比,即,每1000mL角膜中期保存液組成為:MEM培養基9.5g、HEPES緩沖液5.96g、葡聚糖20g、碳酸氫鈉2.2g、地塞米松磷酸鈉25mg、還原型谷胱甘肽0.92g、慶大霉素10mg、兩性霉素B 250μg、透明質酸鈉15mg、供體血清300mL,余量為雙蒸水。

一種獸用自體血清角膜中期保存液的制備方法,制備步驟包括:

1)配制基礎液;

2)無菌條件下添加透明質酸、慶大霉素、兩性霉素B;

3)添加供體血清。

基礎液配制步驟包括:

a)按權利要求1所述配方,將MEM培養基干粉9.5g、葡聚糖20g、碳酸氫鈉2.2g、地塞米松磷酸鈉25mg、還原型谷胱甘肽0.92g溶解于雙蒸水中,用約5.96g HEPES緩沖液調節pH至7.4,定容至700mL;

b)在超凈工作臺內使用0.22μm濾器,將步驟a)得到的溶液過濾除菌,得到基礎液,備用。

步驟2)中,在無菌條件下,將透明質酸鈉15mg、慶大霉素10mg、兩性霉素B250μg加入基礎液中。

步驟2)中,將添加了透明質酸、慶大霉素、兩性霉素B的基礎液分裝于20mL保存瓶中,每瓶14mL。

將供體血清加入所述的保存瓶至保存瓶內液體體積為20mL,封口,4℃保存。

供體血清制備步驟包括:

(1)采血15~20mL;

(2)于37℃靜置2h,待血清完全析出;

(3)在4℃條件下1400g離心15分鐘,吸取上清液;

(4)無菌條件下,使用0.22μm孔徑的一次性濾器,將血清過濾除菌。

總之,本發明的獸用自體血清角膜中期保存液的制備方法,包括:

1)對供體動物采血并制備血清,過濾后備用;

2)溶解MEM、葡聚糖、碳酸氫鈉、地塞米松磷酸鈉、還原性谷胱甘肽,制備基礎液;

3)用HEPES調整基礎液pH至7.4,將基礎液過濾除菌;

4)無菌條件下添加透明質酸鈉、慶大霉素和兩性霉素B,并使其濃度分別為:透明質酸鈉15mg/L、慶大霉素10mg/L和兩性霉素B 250μg/L;

5)分裝溶液,添加血清,使每瓶溶液體積為20mL,血清含量為30%。

相對于現有技術,本發明的有益效果為:本發明的保存液能有效保存角膜7~14天,效果優于無血清保存液。通過比較含有不同濃度血清的中期保存液效果,優選出最佳的血清濃度。保存期間能夠保持角膜透明度、抑制角膜水腫,維持角膜內皮細胞活性及正常形態。

附圖說明

圖1兔角膜透明度觀察;

圖2兔角膜內皮細胞的形態學變化,臺盼藍-茜素紅染色,10×;

圖3兔角膜組織結構的變化(10×);

圖4兔角膜組織結構的變化(40×);

圖5兔角膜7天時的超微結構觀察(掃描電鏡,1000×;2000×)。

具體實施方式

下面通過實施例對本發明的保存液進行詳細的描述。

實施例1角膜中期保存液的制備

1.血清制備

1)將成年新西蘭兔右側臥綁定,左側胸部剃毛,碘伏消毒,使用20號針頭于第三肋間胸骨左側垂直刺入心臟,緩慢采血15~20mL;

2)采血后立即將血液轉移至生理鹽水潤洗過的10mL EP管中,在37℃水浴鍋中靜置2h;

3)待血清完全析出后,將EP管4℃離心1400g,15分鐘;

4)小心吸出血清,并使用0.22μm孔徑的濾器將血清過濾除菌,獲得備用血清4℃保存。

2.將MEM培養基干粉9.5g、葡聚糖20g、碳酸氫鈉2.2g、地塞米松磷酸鈉25mg、還原型谷胱甘肽0.92g溶解于雙蒸水中;

3.用HEPES(約5.96g)調節pH至7.4,定容至700mL配成基礎液;

4.在超凈工作臺內,使用0.22μm濾器,將基礎液過濾除菌;

5.在超凈工作臺內,于基礎液中加入透明質酸鈉15mg、慶大霉素10mg和兩性霉素B 250μg;

6.分裝基礎液,置于20mL保存瓶,每瓶14mL;

7.添加供體血清至20mL,封口,4℃冷藏備用。

實施例2角膜保存液的效果檢測與血清濃度優化

1.不同濃度血清角膜保存液的配制:基礎液的配制同實施例1,基礎液分裝時,不含血清的保存液直接分裝為每瓶20mL,含有10%、20%和30%血清的保存液每瓶分別分裝18、16和14mL,再分別添加供體血清至20mL。

2.兔角膜植片制備:新西蘭大白兔處死后取出眼球,用含抗生素的生理鹽水沖洗,并檢查角膜上皮完整性及前房情況。無菌條件下沿角膜緣外2mm處用剪取完整兔角膜,分別在含有10%、20%和30%血清的保存液和無血清保存液中4℃保存7、10、12和14天。

3.角膜片形態評價:角膜保存期間,觀察各組角膜的形態變化。結果發現,各組角膜在保存至第7天時均保持透明,未見明顯水腫和增厚,與新鮮角膜無顯著差別。第10天時對照組(保存液不含血清)角膜出現水腫,角膜呈灰白色渾濁狀,上皮面較嚴重,并有小片狀剝離區;10%血清組(保存液含有10%血清)角膜輕微水腫,含20%和30%血清組(分別指保存液含有20%和30%血清)未見明顯水腫。第14天時,無血清組角膜進一步水腫增厚,呈灰白渾濁狀,上皮面脫落范圍增大;10%血清組角膜水腫、呈淺灰白渾濁狀;20%血清組角膜水腫,呈淺灰白渾濁狀;30%角膜僅輕微水腫(圖1-5)。

4.角膜片厚度測量(表1):將角膜連同保存液復溫(30~35℃)2小時,取出角膜置于光學顯微鏡下,內皮朝上放置角膜,觀察上皮層和內皮層,并用調焦旋鈕記錄各自的刻度,計算上皮層和內皮層之間差值,每只角膜測量3次。結果表明,各組角膜片的厚度隨著角膜保存時間的延長而逐漸增厚。與第7天相比,對照組角膜厚度在第10、12和14天顯著增加。第10天時,20%和30%血清組角膜厚度薄于同期對照組和10%血清組。第12天時,20%血清組角膜厚度薄于對照組、10%血清組;30%血清組角膜厚度薄于對照組、10%和20%血清組。第14天時,10%血清組角膜薄于對照組;20%血清組角膜厚度薄于對照組和10%血清組;30%血清組角膜厚度薄于對照組、10%和20%血清組。

表1兔角膜厚度變化的檢測(μm)

“*”與同一天內的對照組相比(t檢驗),差異顯著(p<0.05)

5.角膜片透明度和后彈力層皺褶程度:在無菌平皿下墊一片由數道黑色線條組成的硬紙片,將角膜片置于載玻片上,觀察下方線條清晰度及變形情況。線條清晰度提示角膜透明度,線條變形情況提示后彈力層皺褶程度。結果表明,各組角膜保存第7天,各組角膜透明度良好,線條清晰可見,與新鮮角膜無顯著差異;對照組僅部分角膜因輕微水腫,后彈力層微小皺褶,線條略有變形。第10天時,對照組角膜透明度降低,線條仍可見,后彈力層皺褶,線條走行不整齊;10%血清組角膜透明度略降低,線條可見,后彈力層輕微皺褶,線條略有毛邊;20%和30%血清組角膜透明度良好,線條清晰可見,線條變形輕微。第14天時,對照組角膜渾濁,線條模糊不清,存在明顯變形甚至中斷;10%血清組角膜渾濁,線條模糊變形;20%組角膜輕度渾濁,線條可見輕微模糊;30%血清組角膜透明度較好,線條可見,線條變形程度較輕。

6.角膜片內皮細胞活性率及形態學檢測:在角膜內皮面進行臺盼藍-茜素紅染色,光學顯微鏡下計數內皮細胞密度和細胞死亡率;觀察內皮細胞形態。結果表明,隨著保存時間的延長,各組角膜內皮細胞依次開始出現腫脹、死亡和細胞缺失(圖1)。

第7天時,各組角膜內皮細胞密度均較高,但與新鮮角膜相比有所下降。對照組角膜內皮細胞密度在第10、12和14天逐漸下降,內皮細胞死亡率逐漸升高。第10天時,對照組內皮細胞密度低于30%血清組。第12和14天時,與各血清組相比,對照組內皮細胞密度下降,細胞死亡率升高;其中20%與30%血清組細胞密度有所升高;與30%血清組相比,10%和20%血清組的角膜內皮細胞密度較低、死亡率偏高。

表2兔角膜內皮細胞密度和死亡率的變化

“*”與同一天內的對照組相比(t檢驗),差異顯著(p<0.05)

第7天時,對照組角膜內皮細胞有少量細胞腫脹和核藍染,個別細胞邊界融合;血清組細胞形態基本保持完整六邊形結構,無明顯腫脹和核藍染,與新鮮角膜無顯著差異;第10天時,對照組角膜內皮細胞核藍染增多,少量細胞腫脹、包膜融合、邊界消失,單個細胞面積增加;10%血清組角膜內皮細胞呈六邊形結構,少量細胞腫脹、核藍染;20%和30%血清組角膜內皮細胞形態規律,排列整齊,僅個別細胞腫脹或核藍染。第12和14天時,對照組角膜內皮細胞核藍染、細胞變形增加,部分區域存在細胞缺失,胞間連接松弛,單個細胞面積增加;與對照組相比,血清組細胞核藍染、細胞腫脹數量少于對照組,其中30%血清組最少;30%血清組角膜在第14天的細胞活性率與形態上與第7天無顯著差異,基本能保持內皮細胞六邊形形態(圖2-5)。

7.以上結果提示,與無血清保存液相比,含自體血清的角膜保存液可有效減緩角膜混濁、內皮細胞死亡、細胞腫脹等情況;不同濃度的血清保存液中,30%的血清含量保存效果優于10%和20%的保存液;保存期間角膜透明度高,無明顯基質水腫,具有良好的內皮活性,可有效保存角膜7~14天。

實施例3角膜保存效果的組織學觀察與血清濃度的優化

1.不同濃度血清角膜保存液的配制同實施例2;

2.兔角膜植片的制備同實施例2;

3.角膜片組織結構觀察:各組分別取保存第7、10、12、14天的角膜片,采用OCT包埋,以5μm厚度行連續冰凍切片;進行蘇木精-伊紅染色,顯微鏡下觀察拍照。新鮮角膜四層結構銜接緊密,內皮細胞貼附于后彈力層上,后彈力層無皺褶,基質內膠原纖維多量且排列整齊,上皮細胞緊湊;保存結果表明,第7天時,各組角膜在10倍光學顯微鏡下角膜組織層次清楚,連接緊密;40倍光學顯微鏡下角膜單層內皮細胞排列整齊,無脫落,緊密貼附于后彈力層上,基質層各層纖維排列緊密,上皮細胞排列整齊,無明顯缺失。

第10天時,10倍鏡下可見對照組角膜組織水腫增粗,基質間有間隙,上皮層變??;血清組角膜組織各層均較清楚,其中10%血清組角膜組織略增粗。40倍鏡下可見對照組角膜內皮層出現毛邊,略有缺失,基質層各層纖維排列疏松,上皮層細胞有脫落缺失,上皮細胞排列紊亂,上皮層變??;10%血清組角膜組織內皮層排列整齊,緊密貼附在后彈力膜上,后彈力膜有皺褶,基質層各層纖維間有小間隙,上皮層細胞有少量脫落,排列不整齊。20%和30%血清組角膜組織各層清楚,內皮層緊密貼附在后彈力膜上,基質層各層纖維細胞緊密排列,上皮層細胞排列整齊。

第12天時,10倍鏡下可見對照組角膜組織間隙增大,連接疏松;10%和20%血清組角膜組織增厚,上皮層與基質層之間產生縫隙;30%血清組角膜組織各層均較清楚。40倍鏡下可見對照組角膜組織結構稀疏,內皮細胞脫落增多,與后彈力層產生間隙,基質層纖維減少。10%與20%血清組角膜組織增厚,內皮細胞脫落,基質纖維間隙增寬,其中10%血清組上皮層數減少,20%血清組上皮層細胞存在脫落、排列不整齊;30%血清組角膜組織各層清晰,內皮層與后彈力層緊密貼附,基質層纖維走向整齊。

第14天時,10倍鏡下可見對照組角膜間隙進一步增大,上皮與基質分離,基質間隙增大,內皮層有脫落或斷裂;10%與20%血清組角膜組織均有增厚,基質存在細小間隙,上皮層有不同程度的脫落;30%血清組略有水腫,上皮少量脫落。40倍鏡下可見對照組角膜各層組織腫脹、界限不清晰,內皮細胞脫落甚至斷裂,與后彈力層間隙明顯增寬,基質纖維減少、排列混亂、存在空泡,上皮細胞脫落較多,上皮層變薄。10%血清組角膜組織水腫,內皮細胞脫落,與后彈力層連接不緊密,基質層各纖維間隙增寬或斷裂,上皮細胞層脫落,上皮變??;20%血清組角膜水腫輕微,內皮細胞少量脫落,與后彈力層連接不緊密,少量毛邊,基質纖維存在微小間隙。30%血清組角膜組織界限清晰,內皮細胞排列整齊、內皮層與后彈力層連接不緊密,基質層輕微增厚,基質纖維排列整齊。

4.以上結果提示,與無血清保存液相比,含血清的保存液對角膜組織結構具有?;ぷ饔?,其中含30%血清的保存液可有效維持角膜各組織間隙緊密連接,減少上皮細胞、基質和內皮細胞的缺失,有效保存角膜7~14天。

實施例4角膜保存效果的超微結構觀察與血清濃度優化

1.不同濃度血清角膜保存液的配制同實施例2;

2.兔角膜植片的制備同實施例2;

3.角膜片掃描電鏡觀察:選取保存7天的角膜片,戊二醛固定、沖洗及鋨酸處理后,進行臨界點干燥、噴金鍍膜,掃描電鏡下觀察內皮細胞并拍照。結果表明,低倍鏡下對照組、10%血清組和20%血清組的角膜內皮細胞有不同程度的形狀改變,彼此連接尚緊;30%血清組角膜內皮細胞呈六邊形,排列整齊、形態規則。高倍鏡下對照組、10%血清組和20%血清組的個別細胞Y型連接消失,細胞表面微絨毛不同程度的減少;30%血清組角膜內皮細胞緊密連接,Y型結構連續緊密,細胞表面大量微絨毛存在。對照組與30%血清組差異明顯。

4.以上結果提示,含30%血清的角膜保存液可在一定程度上保持內皮細胞的結構完整、細胞微絨毛和Y型連接,?;つ諂ば翁?,其效果顯著優于無血清保存液,以及含10%和20%血清的保存液。

實施例5角膜中期保存液的應用

1.犬血清角膜保存液的配制:對供體犬進行頸靜脈采血,制備血清;基礎液配制同實施例1,將14mL基礎液分裝于20mL保存瓶中;添加供體犬血清至20mL。

2.犬角膜植片制備、保存和移植:無菌摘取供體犬眼球,沖洗后用將眼球用濕紗布包裹住,攥在手中,剪下含有一圈鞏膜環的角膜片,保存于本發明的角膜中期保存液中,4℃冷藏保存7天(A組)、14天(B組)。移植前兩天對角膜植片進行脫水處理;移植當天用角膜環鉆切割使角膜植片邊緣規則;受體植床制備好后,將角膜植片放入,眼科縫線縫合。

4.犬角膜移植效果觀察:術后3、7、14、21、35和70天采用裂隙燈觀察角膜混濁度、新生血管和水腫情況。結果表明,在術后3天和7天,兩組角膜植片中央透明,瞳孔可見,角膜緣水腫、未見新生血管。術后14天,A組角膜片中央透明,瞳孔清晰可見,角膜水腫減輕,未見新生血管;與A組相比,B組角膜緣水腫。術后21天,兩組角膜水腫均減輕,植片中央透明,瞳孔清晰可見;術后35天,A組角膜水腫消失,B組角膜水腫進一步減輕。術后70天,兩組角膜水腫消失、角膜愈合良好。

5.以上結果提示,本發明中的角膜中期保存液可應用于臨床上的犬角膜的中期保存和移植。

本發明所述的實例是對本發明的說明而不能限制本發明,在與本發明相當的含義和范圍內的任何改變和調整,都應認為是在本發明的范圍內。

關 鍵 詞:
一種 血清 角膜 中期 保存 及其 制備 方法
  專利查詢網所有資源均是用戶自行上傳分享,僅供網友學習交流,未經上傳用戶書面授權,請勿作他用。
關于本文
本文標題:一種獸用自體血清角膜中期保存液及其制備方法.pdf
鏈接地址://www.vmyqew.com.cn/p-6880969.html
關于我們 - 網站聲明 - 網站地圖 - 資源地圖 - 友情鏈接 - 網站客服客服 - 聯系我們

[email protected] 2017-2018 www.vmyqew.com.cn網站版權所有
經營許可證編號:粵ICP備17046363號-1 
 


收起
展開