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维戈塞尔塔对毕尔: 一種用大孔樹脂分離純化核桃青皮中多酚類物質的方法.pdf

摘要
申請專利號:

维戈塞尔塔vs皇家社会 www.vmyqew.com.cn CN201510771231.7

申請日:

20151112

公開號:

CN105361185A

公開日:

20160302

當前法律狀態:

有效性:

失效

法律詳情:
IPC分類號: A23L33/105 主分類號: A23L33/105
申請人: 橫山縣紅夢園科技實業有限公司
發明人: 張有林,韓軍岐,張潤光,馬樂
地址: 719200 陜西省榆林市北大街
優先權: CN201510771231A
專利代理機構: 西安通大專利代理有限責任公司 代理人: 陸萬壽
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法律狀態
申請(專利)號:

CN201510771231.7

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法律狀態公告日:

法律狀態類型:

摘要

一種用大孔樹脂分離純化核桃青皮中多酚類物質的方法,第一步、將核桃青皮干粉用50%乙醇在溫度35℃~40℃條件下超聲提取多次,提取液真空抽濾,濾液蒸發得核桃青皮多酚粗提液,稀釋至所需濃度,冷藏備用;第二步、采用Folin-Ciocaileu法測定核桃青皮中多酚總含量;第三步、大孔樹脂的預處理;第四步、大孔樹脂靜態吸附與解吸;第五步、大孔樹脂動態吸附與解吸;第六步、采用HPLC法測定大孔樹脂分離純化后的核桃青皮多酚提取物單體酚的組成及含量,完成所有分離純化過程。本發明提供了核桃青皮中多酚類物質分離純化的新途徑,操作簡便,分離純化的品質和效率高。

權利要求書

1.一種用大孔樹脂分離純化核桃青皮中多酚類物質的方法,其特征在于:第一步、將核桃青皮干粉用50%乙醇在溫度35℃~40℃條件下超聲提取多次,提取液真空抽濾,濾液蒸發得核桃青皮多酚粗提液,稀釋至所需濃度,冷藏備用;第二步、采用Folin-Ciocaileu法測定核桃青皮中多酚總含量;第三步、將大孔樹脂用4%NaOH溶液浸泡處理2~4h,再使用蒸餾水沖洗至中性;然后用4%HCl溶液浸泡2~4h,使用蒸餾水沖洗至中性;最后再用95%乙醇浸泡處理2~4h,蒸餾水洗至無醇味為止;備用;第四步、大孔樹脂對核桃青皮多酚稀釋液的靜態吸附與解吸;第五步、大孔樹脂對核桃青皮多酚稀釋液的動態吸附與解吸;第六步、采用HPLC法測定大孔樹脂分離純化后的核桃青皮多酚提取物單體酚的組成及含量,完成所有分離純化過程。2.根據權利要求1所述的用大孔樹脂分離純化核桃青皮中多酚類物質的方法,其特征在于:大孔樹脂采用NKA-9。3.根據權利要求1所述的用大孔樹脂分離純化核桃青皮中多酚類物質的方法,其特征在于:所述的第一步中核桃青皮干粉與乙醇的料液比為1g:17mL,超聲提取兩次,濾液通過旋轉蒸發,得核桃青皮多酚粗提液。4.根據權利要求1所述的用大孔樹脂分離純化核桃青皮中多酚類物質的方法,其特征在于,所述的Folin-Ciocaileu法測定核桃青皮中多酚總含量的具體過程為:取0.2mL核桃青皮多酚粗提液,加入到10mL容量瓶中,加入0.5mLFC試劑,混合均勻,在1min內加入1.5mL20%碳酸鈉溶液,混合,用去離子水定容;將上述溶液在35~40℃下暗放置1.5~2h后,以不加粗提液的溶液作為空白對照,在760nm波長下測定吸光度值。5.根據權利要求1所述的用大孔樹脂分離純化核桃青皮中多酚類物質的方法,其特征在于,所述的大孔樹脂靜態吸附的具體過程為:稱取1.0g樹脂于50mL三角瓶中,加入第三步所得備用樹脂樣品液30mL,密封置于160~175r/min搖床上,室溫下振蕩4~5h,從上清液中取樣,測定多酚含量;據以下公式計算吸附量和吸附率,考察樣品液的濃度和pH對樹脂吸附性能的影響;qe=(C0-C1)×V1/W(1)E(%)=[(C0-C1)/C0]×100(2)式中:qe—吸附量,mg/g;E—吸附率,%;C0—起始濃度,mg/mL;C1—平衡濃度,mg/mL;V1—吸附溶液體積,mL;W—樹脂的重量,g。6.根據權利要求1所述的用大孔樹脂分離純化核桃青皮中多酚類物質的方法,其特征在于,所述的大孔樹脂靜態解吸的具體過程為:將已充分吸附后的樹脂用蒸餾水清洗,直至表面無樣品液殘留,再用濾紙吸干水分,置于三角瓶中,加入30mL不同濃度乙醇溶液,密封放置于160~175r/min振蕩器中,室溫下解吸2~3h,從上清液中取樣,測多酚含量;據以下公式計算解吸率和解吸量,考察洗脫液的濃度和pH對樹脂洗脫性能的影響;D(%)=C2×V2×100/(C0-C1)×V1(3)qd=C2×V2/W(4)式中:D—解吸率,%;qd—解吸量,mg/g;C0—起始濃度,mg/mL;C1—平衡濃度,mg/mL;C2—解吸液中多酚濃度,mg/mL;V1—吸附溶液體積,mL;V2—解吸溶液體積,mL;W—樹脂取量,g。7.根據權利要求1所述的用大孔樹脂分離純化核桃青皮中多酚類物質的方法,其特征在于,所述的大孔樹脂動態吸附的具體過程為:將第三步預處理好的樹脂濕法裝入16mm×500mm的層析柱中,用蒸餾水平衡后,將樣品液按1.3mL/min勻速上樣并收集流出液,每10mL為一管,檢測并計算流出液濃度,確定流速、體積條件,得到最佳吸附條件,繪制動態吸附曲線。8.根據權利要求1所述的用大孔樹脂分離純化核桃青皮中多酚類物質的方法,其特征在于,所述的大孔樹脂動態解吸的具體過程為:將已吸附飽和的樹脂進行解吸實驗,用蒸餾水洗至無樣品液殘留,按0.43mL/min勻速用乙醇溶液進行洗脫,收集洗脫液,計算流出液濃度,確定洗脫流速、體積條件,得到最佳洗脫條件,繪制動態洗脫曲線。9.根據權利要求1所述的用大孔樹脂分離純化核桃青皮中多酚類物質的方法,其特征在于,采用HPLC法測定大孔樹脂分離純化后核桃青皮多酚提取物中單體酚組成及含量的具體方法為:采用5μm,250mm×4.6mm的DiamonsilC18柱;檢測波長280nm;流速1.0ml/min;柱溫30℃;進樣量20uL;流動相A為0.1%甲酸高純水;流動相B為0.1%甲酸乙腈;梯度洗脫程序依次為93%A,7%B,0min;82%A,18%B,30min;78%A,22%B,40min;50%A,50%B,45min;50%A,50%B,50min;將樣品峰保留時間與標準品保留時間進行對比,判斷單體酚種類,按照峰面積計算單體酚含量。

說明書

技術領域

本發明屬于食品科學領域,具體涉及一種用大孔樹脂分離純化核桃青皮中多酚類物質的方法。

背景技術

近年來,隨著生活水平的提高,人們對保健食品的需求與日俱增。植物中含有大量的多酚類物質,這些物質具有抗腫瘤、抗氧化、抗輻射、抗高血糖、降血脂等多種生理功能,是保健食品的重要原料,通過分離純化能夠從植物中獲取多酚類物質。然而傳統的分離純化方法如沉淀分離法、溶劑萃取法等,存在純度低或成本高等缺點,大孔樹脂法能夠彌補這些缺點,它工藝簡單、操作方便、成本低廉,在食品、藥品、化妝品行業的應用帶來了可觀的經濟效益,但是目前尚未出現大孔樹脂法在分離純化核桃青皮多酚類物質中的應用。

發明內容

本發明的目的在于針對上述現有技術中的問題,提供一種用大孔樹脂分離純化核桃青皮中多酚類物質的方法,提高分離純化的品質和效率。

為了實現上述目的,本發明采用的技術方案為:

第一步、將核桃青皮干粉用50%乙醇在溫度35℃~40℃條件下超聲提取多次,提取液真空抽濾,濾液蒸發得核桃青皮多酚粗提液,稀釋至所需濃度,冷藏備用;

第二步、采用Folin-Ciocaileu法測定核桃青皮中多酚總含量;

第三步、將大孔樹脂用4%NaOH溶液浸泡處理2~4h,再使用蒸餾水沖洗至中性;然后用4%HCl溶液浸泡2~4h,使用蒸餾水沖洗至中性;最后再用95%乙醇浸泡處理2~4h,蒸餾水洗至無醇味為止;備用;

第四步、大孔樹脂對核桃青皮多酚稀釋液的靜態吸附與解吸;

第五步、大孔樹脂對核桃青皮多酚稀釋液的動態吸附與解吸;

第六步、采用HPLC法測定大孔樹脂分離純化后的核桃青皮多酚提取物單體酚的組成及含量,完成所有分離純化過程。

所述的大孔樹脂采用NKA-9。

所述的第一步中核桃青皮干粉與乙醇的料液比為1g:17mL,超聲提取兩次,濾液通過旋轉蒸發,得核桃青皮多酚粗提液。

所述的Folin-Ciocaileu法測定核桃青皮中多酚總含量的具體過程為:取0.2mL核桃青皮多酚粗提液,加入到10mL容量瓶中,加入0.5mLFC試劑,混合均勻,在1min內加入1.5mL20%碳酸鈉溶液,混合,用去離子水定容;將上述溶液在35~40℃下暗放置1.5~2h后,以不加粗提液的溶液作為空白對照,在760nm波長下測定吸光度值。

所述的大孔樹脂靜態吸附的具體過程為:稱取1.0g樹脂于50mL三角瓶中,加入第三步所得備用樹脂樣品液30mL,密封置于160~175r/min搖床上,室溫下振蕩4~5h,從上清液中取樣,測定多酚含量;據以下公式計算吸附量和吸附率,考察樣品液的濃度和pH對樹脂吸附性能的影響;

qe=(C0-C1)×V1/W(1)

E(%)=[(C0-C1)/C0]×100(2)

式中:qe—吸附量,mg/g;E—吸附率,%;C0—起始濃度,mg/mL;

C1—平衡濃度,mg/mL;V1—吸附溶液體積,mL;W—樹脂的重量,g。

所述的大孔樹脂靜態解吸的具體過程為:將已充分吸附后的樹脂用蒸餾水清洗,直至表面無樣品液殘留,再用濾紙吸干水分,置于三角瓶中,加入30mL不同濃度乙醇溶液,密封放置于160~175r/min振蕩器中,室溫下解吸2~3h,從上清液中取樣,測多酚含量;據以下公式計算解吸率和解吸量,考察洗脫液的濃度和pH對樹脂洗脫性能的影響;

D(%)=C2×V2×100/(C0-C1)×V1(3)

qd=C2×V2/W(4)

式中:D—解吸率,%;qd—解吸量,mg/g;C0—起始濃度,mg/mL;

C1—平衡濃度,mg/mL;C2—解吸液中多酚濃度,mg/mL;V1—吸附溶液體積,mL;V2—解吸溶液體積,mL;W—樹脂取量,g。

所述的大孔樹脂動態吸附的具體過程為:將第三步預處理好的樹脂濕法裝入16mm×500mm的層析柱中,用蒸餾水平衡后,將樣品液按1.3mL/min勻速上樣并收集流出液,每10mL為一管,檢測并計算流出液濃度,確定流速、體積條件,得到最佳吸附條件,繪制動態吸附曲線。

所述的大孔樹脂動態解吸的具體過程為:將已吸附飽和的樹脂進行解吸實驗,用蒸餾水洗至無樣品液殘留,按0.43mL/min勻速用乙醇溶液進行洗脫,收集洗脫液,計算流出液濃度,確定洗脫流速、體積條件,得到最佳洗脫條件,繪制動態洗脫曲線。

采用HPLC法測定大孔樹脂分離純化后核桃青皮多酚提取物中單體酚組成及含量的具體方法為:采用5μm,250mm×4.6mm的DiamonsilC18柱;檢測波長280nm;流速1.0ml/min;柱溫30℃;進樣量20uL;流動相A為0.1%甲酸高純水;流動相B為0.1%甲酸乙腈;梯度洗脫程序依次為93%A,7%B,0min;82%A,18%B,30min;78%A,22%B,40min;50%A,50%B,45min;50%A,50%B,50min;將樣品峰保留時間與標準品保留時間進行對比,判斷單體酚種類,按照峰面積計算單體酚含量。

與現有技術相比,本發明用大孔樹脂分離純化核桃青皮中多酚類物質的方法具有如下的有益效果:大孔樹脂提供了核桃青皮中多酚類物質分離純化的新途徑,通過實驗檢測,當吸附條件為上樣多酚液濃度為0.574mg/mL,pH為1.0,上樣速率為1.3mL/min,吸附率能夠達到90.1%;當洗脫條件為50%的乙醇洗脫劑,pH為3.0,洗脫速率0.43mL/min,解吸率達87.9%。經HPLC鑒定和分析,核桃青皮酚類物質主要由原兒茶素、綠原酸、咖啡酸、表兒茶素、阿魏酸、蘆丁等單體組成。核桃青皮多酚純化前保留時間2-5min和48-50min之間的雜峰經過純化后被降低,且純化前后剩余峰基本被保留,由此說明此種樹脂適用于分離純化核桃青皮多酚。本發明方法的操作簡便,分離純化的品質和效率高。

進一步的,本發明NKA-9大孔樹脂動態吸附過程中,如果流速過快,樹脂和粗提液不能夠充分接觸,降低其吸附量;如果流速過慢,雖有利于酚類物質的吸附,但卻會降低生產效率,影響生產周期,1.3mL/min為最佳上樣流速。

進一步的,本發明洗脫速度對解吸效果有顯著地影響,雖然洗脫流速要求慢,但如果流速過慢,則會引起解吸時間延長,且在流動過程中被洗脫的多酚可能會被重新吸附,兩相間會重新建立動態平衡,降低解吸量;而如果流速過快,則會導致洗脫劑不能和吸附飽和的樹脂充分接觸而快速流出,使得解吸量降低,生產效率下降,實驗驗證0.43mL/min為最佳洗脫流速。

附圖說明

圖1是pH對多酚吸附率的影響圖;

圖2是不同濃度多酚靜態吸附曲線圖;

圖3是乙醇濃度對多酚解吸效果的影響圖;

圖4是pH對多酚解吸率的影響圖;

圖5是流速對樹脂吸附效果的影響圖;

圖6是洗脫劑流速對樹脂解吸效果的影響圖;

圖7是核桃青皮多酚純化前保留時間與峰值變化圖;

圖8是核桃青皮多酚純化后保留時間與峰值變化圖;

具體實施方式

下面結合附圖對本發明做進一步的詳細說明。

一、材料與試劑;

青皮核桃:于8月中旬采摘于陜西省藍田縣將青皮核桃取青皮,切碎,經冷凍干燥后研磨粉碎,過60目篩,密封盛裝于棕色玻璃瓶內,冷藏備用;

大孔樹脂:NKA-9;

鎢酸鈉、硫酸鋰、鉬酸鈉、濃磷酸、濃鹽酸、氫氧化鈉、無水乙醇、無水碳酸鈉固體、溴水、甲醇、乙腈;

二、主要儀器設備;

數控超聲波清洗器:KQ3200DE型,昆山市超聲儀器有限公司;旋轉蒸發儀:RE-52型,上海安亭實驗儀器有限公司;數顯恒溫水浴鍋:HH-S型,江蘇省金壇市醫療儀器廠;紫外可見分光光度計:UV-1100型,上海美譜達儀器有限公司;恒溫振蕩器:SHZ-82型,金壇市富華儀器有限公司;恒流泵:HL-2S型,上?;ξ鞣治鲆瞧鞒в邢薰?;精密pH計:PHS-3C型,上海精密科學儀器有限公司;電子天平:JA1203型,上海精密科學儀器有限公司;冷凍干燥機:LGJ-18C型,北京四環科學儀器廠。

三、分離純化方法;

實施例一:

3.1樣品溶液的制備:稱量一定量的核桃青皮干粉,用50%乙醇,在溫度35℃,料液比1g:17mL條件下超聲提取30min,提取2次。提取液真空抽濾,取濾液旋轉蒸發,得核桃青皮多酚粗提液,稀釋至相應濃度,冷藏備用。

3.2多酚含量的測定:核桃青皮中多酚總含量測定采用Folin-Ciocaileu法,移取0.2mL粗提液,加入到10mL容量瓶中,加入0.5mL的FC試劑,混合均勻,在1min內加入1.5mL20%的碳酸鈉溶液,混合,用去離子水定容;

將上述溶液在35℃下暗放置1.5h后,以不加粗提液的溶液作為空白對照,在760nm波長下測定吸光度值。

3.3大孔樹脂的預處理:大孔樹脂用4%NaOH溶液浸泡處理2h,蒸餾水不斷沖洗至中性;然后用4%HCl溶液浸泡2h,蒸餾水洗樹脂至中性;最后再用95%乙醇浸泡處理2h,蒸餾水洗至無醇味為止,備用。

3.4大孔樹脂靜態吸附與解吸:

(1)靜態吸附實驗:稱取1.0g樹脂于50mL三角瓶中,加入樣品液30mL,密封置于160r/min搖床上,室溫下振蕩4h,從上清液中取樣,測定多酚含量。據以下公式計算吸附量和吸附率,考察樣品液濃度和pH對樹脂吸附性能的影響:

qe=(C0-C1)×V1/W,(1)

E(%)=[(C0-C1)/C0]×100(2)

式中:qe—吸附量,mg/g;E—吸附率,%;C0—起始濃度,mg/mL;

C1—平衡濃度,mg/mL;V1—吸附溶液體積,mL;W—樹脂的重量,g。

(2)靜態解吸實驗:將已充分吸附后的樹脂用蒸餾水清洗,直至表面無樣品液殘留,再用濾紙吸干水分,置于三角瓶中,加入30mL不同濃度乙醇溶液,密封放置于160r/min振蕩器中,室溫下解吸2h,從上清液中取樣,測多酚含量。據以下公式計算解吸率和解吸量,考察洗脫液濃度和pH對樹脂洗脫性能的影響:

D(%)=C2×V2×100/(C0-C1)×V1(3)

qd=C2×V2/W(4)

式中:D—解吸率,%;qd—解吸量,mg/g;C0—起始濃度,mg/mL;

C1—平衡濃度,mg/mL;C2—解吸液中多酚濃度,mg/mL;V1—吸附溶液體積,mL;V2—解吸溶液體積,mL;W—樹脂取量,g。

3.5大孔樹脂動態吸附與解吸:

將預處理好的樹脂濕法裝入16mm×500mm的層析柱中,用蒸餾水平衡后,將樣品液以一定的速率上樣并收集流出液,每10mL為一管,檢測并計算流出液濃度,確定流速、體積等條件,得到最佳吸附條件,繪制動態吸附曲線。

將已吸附飽和的樹脂進行解吸實驗,用蒸餾水洗至無樣品液殘留,以一定的流速用適當濃度乙醇溶液進行洗脫,收集洗脫液,計算流出液濃度,確定洗脫流速、體積等條件,得到最佳洗脫條件,繪制動態洗脫曲線。

3.6核桃青皮中多酚類物質的組成及含量HPLC分析:

通過大孔樹脂分離純化后的核桃青皮多酚提取物采用HPLC法測定其單體酚的組成及含量。具體方法為:DiamonsilC18柱(5μm,250mm×4.6mm);檢測波長280nm;流速1.0ml/min;柱溫30℃;進樣量20uL;流動相A(0.1%甲酸高純水)和流動相B(0.1%甲酸乙腈);梯度洗脫程序:93%A、7%B,0min;82%A、18%B,30min;78%A、22%B,40min;50%A、50%B,45min;50%A、50%B,50min。樣品峰保留時間與標準品保留時間進行對比,判斷單體酚種類,按照峰面積計算單體酚含量。

實施例二:

3.1樣品溶液的制備:稱量一定量的核桃青皮干粉,用50%乙醇,在溫度37.5℃,料液比1g:17mL條件下超聲提取32.5min,提取2次。提取液真空抽濾,取濾液旋轉蒸發,得核桃青皮多酚粗提液,稀釋至相應濃度,冷藏備用。

3.2多酚含量的測定:核桃青皮中多酚總含量測定采用Folin-Ciocaileu法,移取0.2mL粗提液,加入到10mL容量瓶中,加入0.5mL的FC試劑,混合均勻,在1min內加入1.5mL20%的碳酸鈉溶液,混合,用去離子水定容;

將上述溶液在37.5℃下暗放置1.75h后,以不加粗提液的溶液作為空白對照,在760nm波長下測定吸光度值。

3.3大孔樹脂的預處理:大孔樹脂用4%NaOH溶液浸泡處理3h,蒸餾水不斷沖洗至中性;然后用4%HCl溶液浸泡3h,蒸餾水洗樹脂至中性;最后再用95%乙醇浸泡處理3h,蒸餾水洗至無醇味為止,備用。

3.4大孔樹脂靜態吸附與解吸:

(1)靜態吸附實驗:稱取1.0g樹脂于50mL三角瓶中,加入樣品液30mL,密封置于170r/min搖床上,室溫下振蕩4.5h,從上清液中取樣,測定多酚含量。據以下公式計算吸附量和吸附率,考察樣品液濃度和pH對樹脂吸附性能的影響:

qe=(C0-C1)×V1/W,(1)

E(%)=[(C0-C1)/C0]×100(2)

式中:qe—吸附量,mg/g;E—吸附率,%;C0—起始濃度,mg/mL;

C1—平衡濃度,mg/mL;V1—吸附溶液體積,mL;W—樹脂的重量,g。

(2)靜態解吸實驗:將已充分吸附后的樹脂用蒸餾水清洗,直至表面無樣品液殘留,再用濾紙吸干水分,置于三角瓶中,加入30mL不同濃度乙醇溶液,密封放置于170r/min振蕩器中,室溫下解吸2.5h,從上清液中取樣,測多酚含量。據以下公式計算解吸率和解吸量,考察洗脫液濃度和pH對樹脂洗脫性能的影響:

D(%)=C2×V2×100/(C0-C1)×V1(3)

qd=C2×V2/W(4)

式中:D—解吸率,%;qd—解吸量,mg/g;C0—起始濃度,mg/mL;

C1—平衡濃度,mg/mL;C2—解吸液中多酚濃度,mg/mL;V1—吸附溶液體積,mL;V2—解吸溶液體積,mL;W—樹脂取量,g。

3.5大孔樹脂動態吸附與解吸:

將預處理好的樹脂濕法裝入16mm×500mm的層析柱中,用蒸餾水平衡后,將樣品液以一定的速率上樣并收集流出液,每10mL為一管,檢測并計算流出液濃度,確定流速、體積等條件,得到最佳吸附條件,繪制動態吸附曲線。

將已吸附飽和的樹脂進行解吸實驗,用蒸餾水洗至無樣品液殘留,以一定的流速用適當濃度乙醇溶液進行洗脫,收集洗脫液,計算流出液濃度,確定洗脫流速、體積等條件,得到最佳洗脫條件,繪制動態洗脫曲線。

3.6核桃青皮中多酚類物質的組成及含量HPLC分析:

通過大孔樹脂分離純化后的核桃青皮多酚提取物采用HPLC法測定其單體酚的組成及含量。具體方法為:DiamonsilC18柱(5μm,250mm×4.6mm);檢測波長280nm;流速1.0ml/min;柱溫30℃;進樣量20uL;流動相A(0.1%甲酸高純水)和流動相B(0.1%甲酸乙腈);梯度洗脫程序:93%A、7%B,0min;82%A、18%B,30min;78%A、22%B,40min;50%A、50%B,45min;50%A、50%B,50min。樣品峰保留時間與標準品保留時間進行對比,判斷單體酚種類,按照峰面積計算單體酚含量。

實施例三:

3.1樣品溶液的制備:稱量一定量的核桃青皮干粉,用50%乙醇,在溫度40℃,料液比1g:17mL條件下超聲提取35min,提取2次。提取液真空抽濾,取濾液旋轉蒸發,得核桃青皮多酚粗提液,稀釋至相應濃度,冷藏備用。

3.2多酚含量的測定:核桃青皮中多酚總含量測定采用Folin-Ciocaileu法,移取0.2mL粗提液,加入到10mL容量瓶中,加入0.5mL的FC試劑,混合均勻,在1min內加入1.5mL20%的碳酸鈉溶液,混合,用去離子水定容;

將上述溶液在40℃下暗放置2h后,以不加粗提液的溶液作為空白對照,在760nm波長下測定吸光度值。

3.3大孔樹脂的預處理:大孔樹脂用4%NaOH溶液浸泡處理4h,蒸餾水不斷沖洗至中性;然后用4%HCl溶液浸泡4h,蒸餾水洗樹脂至中性;最后再用95%乙醇浸泡處理4h,蒸餾水洗至無醇味為止,備用。

3.4大孔樹脂靜態吸附與解吸:

(1)靜態吸附實驗:稱取1.0g樹脂于50mL三角瓶中,加入樣品液30mL,密封置于175r/min搖床上,室溫下振蕩5h,從上清液中取樣,測定多酚含量。據以下公式計算吸附量和吸附率,考察樣品液濃度和pH對樹脂吸附性能的影響:

qe=(C0-C1)×V1/W,(1)

E(%)=[(C0-C1)/C0]×100(2)

式中:qe—吸附量,mg/g;E—吸附率,%;C0—起始濃度,mg/mL;

C1—平衡濃度,mg/mL;V1—吸附溶液體積,mL;W—樹脂的重量,g。

(2)靜態解吸實驗:將已充分吸附后的樹脂用蒸餾水清洗,直至表面無樣品液殘留,再用濾紙吸干水分,置于三角瓶中,加入30mL不同濃度乙醇溶液,密封放置于175r/min振蕩器中,室溫下解吸3h,從上清液中取樣,測多酚含量。據以下公式計算解吸率和解吸量,考察洗脫液濃度和pH對樹脂洗脫性能的影響:

D(%)=C2×V2×100/(C0-C1)×V1(3)

qd=C2×V2/W(4)

式中:D—解吸率,%;qd—解吸量,mg/g;C0—起始濃度,mg/mL;

C1—平衡濃度,mg/mL;C2—解吸液中多酚濃度,mg/mL;V1—吸附溶液體積,mL;V2—解吸溶液體積,mL;W—樹脂取量,g。

3.5大孔樹脂動態吸附與解吸:

將預處理好的樹脂濕法裝入16mm×500mm的層析柱中,用蒸餾水平衡后,將樣品液以一定的速率上樣并收集流出液,每10mL為一管,檢測并計算流出液濃度,確定流速、體積等條件,得到最佳吸附條件,繪制動態吸附曲線。

將已吸附飽和的樹脂進行解吸實驗,用蒸餾水洗至無樣品液殘留,以一定的流速用適當濃度乙醇溶液進行洗脫,收集洗脫液,計算流出液濃度,確定洗脫流速、體積等條件,得到最佳洗脫條件,繪制動態洗脫曲線。

3.6核桃青皮中多酚類物質的組成及含量HPLC分析:

通過大孔樹脂分離純化后的核桃青皮多酚提取物采用HPLC法測定其單體酚的組成及含量。具體方法為:DiamonsilC18柱(5μm,250mm×4.6mm);檢測波長280nm;流速1.0ml/min;柱溫30℃;進樣量20uL;流動相A(0.1%甲酸高純水)和流動相B(0.1%甲酸乙腈);梯度洗脫程序:93%A、7%B,0min;82%A、18%B,30min;78%A、22%B,40min;50%A、50%B,45min;50%A、50%B,50min。樣品峰保留時間與標準品保留時間進行對比,判斷單體酚種類,按照峰面積計算單體酚含量。

參見圖1-6,需要注意的是:

1.核桃青皮粗多酚的提取過程中溫度選取35~40℃,以35℃為最佳。

2.粗多酚旋轉蒸發時溫度選取40~45℃。

3.大孔樹脂預處理時浸泡時間2~4h,以4h浸泡為最佳時間,時間過短導致樹脂內的雜質不能有效溶出。

4.將粗提液pH值分別調節為1.0~7.0,pH1.0為粗提液多酚吸附的最佳pH。

5.配制多酚濃度為0.246~0.708mg/mL粗提液,測定吸附濃度為0.574mg/mL。

6.將解吸液pH值分別調節為1.0~7.0,pH3.0作為解吸液的最佳pH。

7.用乙醇作解吸液,以50%乙醇為最佳解吸濃度。

8.NKA-9大孔樹脂動態吸附過程中,如果流速過快,樹脂和粗提液不能夠充分接觸,降低其吸附量;如果流速過慢,雖有利于酚類物質的吸附,但卻會降低生產效率,影響生產周期,故選用1.3mL/min為最佳上樣流速。

9.一般來說,洗脫速度對解吸效果有顯著地影響。洗脫流速要求慢,但如果流速過慢,則會引起解吸時間延長,且在流動過程中被洗脫的多酚可能會被重新吸附,兩相間會重新建立動態平衡,降低解吸量;如果流速過快,則會導致洗脫劑不能和吸附飽和的樹脂充分接觸而快速流出,使得解吸量降低,生產效率下降,故選擇0.43mL/min為最佳洗脫流速。

對比圖7和圖8,結果表明NKA-9樹脂是最佳的分離純化核桃青皮多酚類物質的樹脂,吸附條件為上樣液多酚濃度0.574mg/mL,pH1.0,上樣速率1.3mL/min,吸附率可達90.1%;洗脫條件為50%的乙醇洗脫劑,pH3.0,洗脫速率0.43mL/min,解吸率達87.9%。經HPLC鑒定和分析,核桃青皮酚類物質主要由原兒茶素、綠原酸、咖啡酸、表兒茶素、阿魏酸、蘆丁等單體組成。核桃青皮多酚純化前保留時間2-5min和48-50min之間的雜峰經過純化后被降低,且純化前后剩余峰基本被保留,說明此種樹脂適用于分離純化核桃青皮多酚。

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一種 用大孔 樹脂 分離 純化 核桃 青皮 中多酚類 物質 方法
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