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韦斯卡vs维戈塞尔塔比分: 一種野生新食用菌的分離及其人工馴化栽培方法.pdf

摘要
申請專利號:

维戈塞尔塔vs皇家社会 www.vmyqew.com.cn CN201710366948.2

申請日:

20170523

公開號:

CN109220514A

公開日:

20190118

當前法律狀態:

有效性:

審查中

法律詳情:
IPC分類號: A01G18/00,A01G18/20 主分類號: A01G18/00,A01G18/20
申請人: 中國科學院微生物研究所
發明人: 趙瑞琳,王慧君,李國杰
地址: 100101 北京市朝陽區北辰西路1號院2號
優先權: CN201710366948A
專利代理機構: 北京紀凱知識產權代理有限公司 代理人: 關暢;白艷
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法律狀態
申請(專利)號:

CN201710366948.2

授權公告號:

法律狀態公告日:

法律狀態類型:

摘要

本發明公開了一種野生新食用菌的分離及其人工馴化栽培方法。本發明提供了卵孢側耳(Pleurotus?placentodes)的菌株(保藏號CGMCC?NO.13698)?;固峁┝松鮮雎焰卟嘍謚票甘稱分械撓τ?。本發明的實驗證明了,本實驗對野外采集側耳菌株進行形態學鑒定和分子的生物學分析鑒定該菌為卵孢側耳,在對卵孢側耳的馴化栽培中,發現卵孢側耳菌絲生長速度快,菇體口感好,且其中蛋白質和氨基酸含量均比平菇高,是一個具有潛在食用開發價值的可食用菌,對?;ひ吧種首試春鴕糯鐘兇胖匾庖?。

權利要求書

1.卵孢側耳(Pleurotusplacentodes),其保藏號為CGMCCNO.13698。2.權利要求1所述的卵孢側耳在制備食品中的應用。3.權利要求1所述的卵孢側耳在培育可食用卵孢側耳中的應用。4.一種栽培卵孢側耳的方法,包括如下步驟:先擴繁權利要求1所述的卵孢側耳的菌絲,得到擴繁后菌絲;再將所述擴繁后菌絲進行原種培養,得到原種;再將所述原種在栽培料上出菇培養,實現卵孢側耳栽培。

說明書

技術領域

本發明屬于生物技術領域,尤其涉及一種野生新食用菌的分離及其人工馴化栽培方法。

背景技術

側耳屬Pleurotus(Fr.)P.Kumm.真菌,隸屬于擔子菌門Basidiomycota、傘菌綱Agaricomycetes、傘菌目Agaricales、側耳科Pleurotaceae,具有極大食藥用潛質。該屬的許多物種都含有豐富的多糖、氨基酸、蛋白質、脂肪酸等生物活性物質,可以提高機體免疫力、延緩衰老、抗疲勞、抗腫瘤、調節血糖、調節血脂。側耳屬真菌也是一類利用基質最為廣泛的真菌,可以利用農業、工業廢棄物為基質進行栽培生產,且生物學效率較高,具有重要應用價值,對農業可持續發展具有重要意義。此外,側耳屬真菌還是一類具有生物修復功能的環保菌,通過產生木質素氧化酶、錳過氧化物酶和漆酶等酶類可以降解多環芳烴、染料、工農業廢棄物等有害物,廣泛應用于紡織廠、造紙廠、橄欖油廠廢水及城市廢水的處理。

據記載我國是世界上最早食用側耳屬真菌的國家,同時側耳屬真菌因其適應性強、分布廣泛、生物多樣性豐富也成為我國目前栽培種類和品種最多的一類食用菌。目前世界廣泛栽培的側耳屬真菌約有20種,主要包括糙皮側耳P.ostreatus(Jacq.)肺形側耳P.pulmonarius(Fr.)白黃側耳P.cornucopiae(Paulet)Rolland、刺芹側耳P.eryngii(DC.)金頂側耳P.citrinopileatus Singer、美味側耳P.sapidus(Schulzer)Sacc.、佛州側耳P.floridanus Singer、阿魏側耳P.ferulae(Lanzi)X.L.Mao、白靈側耳P.eryngii var.Tuoliensis(DC.)等。

發明內容

本發明的一個目的是提供一種卵孢側耳(Pleurotus placentodes)。

本發明提供的卵孢側耳(Pleurotus placentodes),來自野生卵孢側耳ZRL20152036,其保藏號為CGMCC NO.13698。

上述卵孢側耳在制備食品中的應用也是本發明?;さ姆段?。

上述卵孢側耳在培育可食用卵孢側耳中的應用也是本發明?;さ姆段?。

本發明提供一種栽培卵孢側耳的方法。

本發明提供的方法,包括如下步驟:先擴繁上述的卵孢側耳的菌絲,得到擴繁后菌絲;再將所述擴繁后菌絲進行原種培養,得到原種;再將所述原種在栽培料上出菇培養,實現卵孢側耳栽培。

擴繁所用的培養基為PDA培養基。

原種培養基配方:500g/瓶:麥粒85%、石膏粉1.5%、碳酸鈣0.5%,121℃下高壓滅菌2小時;

栽培料配方:2Kg/袋:棉籽皮43%、玉米芯43%、麥麩12%、石灰2%、pH值自然,121℃下高壓滅菌2小時;

擴繁條件25℃避光培養7天。

原種培養條件:22-26℃下避光培養30-32天;

出菇培養為:置于人工智能氣候培養室內培養,溫度18-22℃,空氣濕度60%左右,菌絲長滿袋后10d進行搔菌,8-10℃的低溫刺激,空氣濕度85%-90%,待原基出現后停止低溫刺激,出菇溫度15-22℃,出現原基后2-3周開始出菇。

來自野生卵孢側耳ZRL20152036(標本保存于中國菌物標本館,館藏號HMAS279131)的菌株(即菌絲體),于2017年03月24日,保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC,地址為:北京市朝陽區北辰西路1號院3號),菌株保藏編號為CGMCC NO.13698,分類命名為卵孢側耳(Pleurotus placentodes)。

本發明對野外采集標本,人工馴化后的栽培菇及菌株的形態學和基于真菌通用條形碼基因ITS序列的分子生物學分析,鑒定該菌為卵孢側耳。在對卵孢側耳的馴化栽培中,發現卵孢側耳菌絲生長速度快,菇體口感好,且其中蛋白質和氨基酸含量均比現廣泛商業栽培的平菇(P.ostreatus)高,是一個具有可開發價值的食用菌,對卵孢側耳的研究與開發對?;の夜吧種首試春褪秤鎂糯侄加兇胖匾庖?。

附圖說明

圖1為野外采集的卵孢側耳P.placentodes宏觀形態特征標尺為2cm。

圖2為人工栽培條件下不同生長時期卵孢側耳P.placentodes(館藏號HMAS255159、菌種保藏號CGMCC NO.13698)的形態特征。a菇體的原基形成;b-d人工栽培形成的子實體。

圖3為卵孢側耳P.Placentodes的菌落及微觀形態特征a.培養性狀;b.擔孢子,c.擔子,d.側生囊狀體

圖4為基于ITS1-5.8S-ITS2序列貝葉斯分析的側耳屬系統發育樹。其中序列KY967596自野生標本HMAS279131;序列KY967597來自野生標本的菌株CGMCC NO.13698;序列KY967598來自人工馴化后的菇體,標本號為HMAS255159。

具體實施方式

下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明,均為常規方法。

下述實施例中所用的材料、試劑等,如無特殊說明,均可從商業途徑得到。

實施例1、卵孢側耳可種植種的獲得

一、標本分離與鑒定

1、野外標本分離

野生標本于2015年7月采自西藏自治區日喀則市定結縣陳塘鎮,位于喜馬拉雅山脈中段南坡,珠峰東南側的原始森林地帶,標本采集號為ZRL20152036。

采用組織分離法分離菌種:野外采集側耳的子實體菌蓋和菌柄交接處組織,置于裝有PDA培養基的2ml離心管培養基斜面上,25℃避光培養,得到側耳菌絲,通過純化,即得到菌種。

PDA培養基:取新鮮馬鈴薯200g加入1L蒸餾水煮30min后過濾、定容至1L,加入葡萄糖20g、瓊脂18g。

2、標本鑒定

1)形態學鑒定首先觀察其子實體的組成部分及其形態特征

用解剖刀縱切野外采集新鮮側耳(ZRL20152036)的子實體觀察其菇蓋組成、菌肉的顏色、質地、菌褶形狀和著生情況、菌柄的組成,菌柄的質地,中實或中空等特征;

顯微形態觀察:用尖頭鑷取一塊2-3mm的野外采集新側耳的菌褶放在清潔的載片中央,滴半滴75%的酒精晾干后加一滴10%剛果紅染色劑,1min后用吸水紙將染色劑吸干,加入5%氫氧化鉀水溶液制成鏡檢材料,用鑷子加蓋玻,注意避免產生氣,在光學顯微鏡下觀察其微觀特性。

結果如圖1、2、3所示:野生擔子果單生(圖1),人工栽培條件下多簇生(圖2),鮮菇有海鮮氣味,菇蕾期菌蓋小而菌柄粗,淺灰色(圖2‐a),2‐5天后菌蓋圓盤形,扁平深灰色,直徑1.3‐3.5cm(圖2‐b),擔子果成熟后菌蓋逐漸形成凹面體,杯形或扇形,中央淺黃褐色,邊緣灰褐色,有波狀起伏的卷邊,直徑為4‐12cm(圖2‐c、d)。菌褶1‐3mm,延生不等長,中等稀疏,白色至淡黃色。菌柄棒狀,近基部稍細1.5‐7.5×0.5‐1.5cm,白色至淺棕色,表皮有縱紋,菌柄肉稍有韌性,菌柄基部有短絨毛,象牙白色。孢子印白色。在PDA培養基上,菌落白色(圖3‐a)。顯微鏡下,擔孢子4.3‐9.8×2.8‐5.6μm,橢圓至卵圓形,無色透明(圖3‐b)。擔子13‐24×5.5‐7.5μm,棒狀,小梗4個,小梗長2‐3.5μm(圖3‐c)。子實層體有側生囊狀體,8.5‐14.8×4.3‐6.8μm,無色,棒狀(圖3‐d)。

2)分子系統學分析

實驗室DNA提?。罕臼笛櫓薪巴獠杉甌綵RL20152036(館藏號HMAS279131)、野外獲得菌株(保藏號CGMCC NO.13698)、人工栽培的子實體(館藏號HMAS255159)采用CTAB法提取DNA,利用ITS1(5′‐TCCGTAGGTGAACCTGCGC‐3′)和ITS4(5′‐TCCTCCGCTTATTGATATGC‐3′)通用引物進行PCR擴增。

PCR反應體系(25)μl:2μlDNA模板、2μldNTP、1μlITS1、1μlITS4、2×TaqPCRMasterMix(200MdNTPsP、4.0mMMgCl2、2.5UTaqDNA聚合酶)、ddH2O補齊。擴增程序為94℃預變性4min,然后94℃變性40s、50℃退火50s、72℃延伸50s,35個循環,最后一個循環72℃延伸8分鐘,PCR擴增產物由北京博邁德測序公司進行測序。

來自野生標本(HMAS279131);菌株CGMCC NO.13698;及人工馴化后的菇體(HMAS255159)的ITS序列均一致(如序列1所示)。且根據構建的側耳屬系統發育圖譜(圖4),它們與已報道的卵孢側耳在一個系統發育分支里,并獲得0.99的后驗概率支持率,研究結果支持它們為同一物種卵孢側耳。

經過上述鑒定,來自野生卵孢側耳ZRL20152036的菌株(即菌絲體),于2017年03月24日,保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC,地址為:北京市朝陽區北辰西路1號院3號),菌株保藏編號為CGMCC NO.13698,分類命名為卵孢側耳(Pleurotus placentodes)。

實施例2、卵孢側耳可種植種的人工栽培

一、培養基配制

原種培養基配方:500g/瓶:麥粒85%、石膏粉1.5%、碳酸鈣0.5%,121℃下高壓滅菌2小時;

栽培料配方:2Kg/袋:棉籽皮43%、玉米芯43%、麥麩12%、石灰2%、pH值自然,121℃下高壓滅菌2小時;

二、栽培方法

1、母種擴繁:從實施例1的離心管斜面挑取少許卵孢側耳(CGMCC NO.13698)菌絲,置入裝有PDA培養基的90mm培養皿,25℃避光培養7天,得到擴繁后菌絲。

2、接種栽培

待菌絲在培養皿上長滿后,切1cm×1cm小菌塊接種于原種培養基中,25℃下避光培養32天,將長滿菌絲的原種接種在栽培料上,置于人工智能氣候培養室內培養,08:00-20:00溫度為22℃,20:00-08:00溫度為18℃空氣濕度60%,菌絲長滿袋后10d進行搔菌,8℃的低溫刺激,空氣濕度85%-90%,待原基出現后停止低溫刺激,出菇溫度08:00-20:00溫度為15℃,20:00-08:00溫度為22℃,出現原基后2-3周開始出菇。

結果顯示,實施例1獲得的卵孢側耳菌株可以在以木屑、棉籽殼為主料,玉米面、石膏、磷酸二氫鉀為輔料的聚丙烯袋裝的栽培料上正常生長發育,麥粒原種接種32d長滿瓶,栽培種接種約32d左右長滿袋,長滿后一周進行8℃持續10d的低溫刺原基分化,原基分化后2周開始摘鮮菇,從接種原種到子實體采收107d,得到人工栽培卵孢側耳子實體。

三、商品價值評價

1)營養成分分析

對上述二得到的人工栽培卵孢側耳的子實體中的多糖含量采用硫酸苯酚法,參照NY/T 1676-2008《食用菌中粗多糖含量的測定》,蛋白質采用凱氏定氮法,參照GB/T15673-2009《食用菌中粗蛋白含量的測定》。氨基酸采用日立L 8900型氨基酸自動分析儀,參考國標GB/T5009.124-2003《食品中氨基酸的測定》測定17種氨基酸含量。以已發表的文獻(張璐,弓志青,王文亮等.7種大宗食用菌的呈味物質分析及鮮味評價[J].食品科技,2017,42(03):274-278.)中香菇、金針菇、杏鮑菇、茶樹菇、雙孢菇相應營養成分作為對照。

結果見表1所示,卵孢側耳含有豐富的營養物質其中含有粗蛋白、粗多糖、含有16種氨基酸、8種必需氨基酸。卵孢側耳中氨基酸總量為18.54g/100g,8種必需氨基酸含量為7.07g/100g,必需氨基酸含量占氨基酸總量的38%。與香菇等人工栽培食用菌相比較,卵孢側耳中含人體必需氨基酸的量最高,天冬氨酸、蘇氨酸含量是香菇、平菇、金針菇、茶樹菇的2倍多,亮氨酸與苯丙氨酸的含量也都高于香菇、金針菇、杏鮑菇、茶樹菇、雙孢菇等。卵孢側耳的粗蛋白含量比平菇高。

表1.卵孢側耳和其它5種食用菌營養成分含量表g/100g干重

注:T為氨基酸總量;E為必需氨基酸總量;N為非必需氨基酸

2、毒性及風味驗證

將上述二得到的人工栽培卵孢側耳喂食給動物均無毒,試吃后確定該種為可食性側耳。

將上述二得到的人工栽培卵孢側耳鮮菇清香,菌蓋比市面上平菇薄,光滑有韌性,燉湯、清炒均有海鮮味。菌柄表皮纖維多,菌肉比菌蓋味道淡,可煎炸食用,有韌性,口感好。干菇香味濃更適宜煲湯,燉煮。

序列表

<110>中國科學院微生物研究所

<120>一種野生新食用菌的分離及其人工馴化栽培方法

<160> 1

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 633

<212> DNA

<213>卵孢側耳(Pleurotus placentodes)

<400> 1

atatatggag ttgttgctgg cctttagggg catgtgcacg cttcactagt ctttcaacca 60

cctgtgaacc tttgatagat ctgtgaagtc gattctcaag tcattgactt ggtttgctgg 120

gacttgatcg tctcggtgtg actacgcagt ctatttactt acacacccta aatgtatgtc 180

tacgaatgtc atttaatggg ccttgtgcct ataaaccata atacaacttt caacaacgga 240

tctcttggct ctcgcatcga tgaagaacgc agcgaaatgc gataagtaat gtgaattgca 300

gaattcagtg aatcatcgaa tctttgaacg caccttgcgc cccttggtat tccgaggggc 360

atgcctgttt gagtgtcatt aaattctcaa actcacgttg gttttgccaa ttgtgatgtt 420

tggatagttg ggggttgctg gctttaacaa gtcggctcct cttaaatgca ttagcaggac 480

ttctcattgc ctctgcgcat gatgtgataa ttatcactca tcaatagcac gcatgaatag 540

agtccagctc tctaacccgt ccgcaaggac aacttgacaa tttgacctca aatcaggtag 600

gactacccgc tgaacttaag catatcaata agc 633

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一種 野生 食用菌 分離 及其 人工 馴化 栽培 方法
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