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2019西班牙人对维戈塞尔塔集锦: Α1蛋白酶抑制劑組合物、方法和試劑盒.pdf

摘要
申請專利號:

维戈塞尔塔vs皇家社会 www.vmyqew.com.cn CN201080054535.7

申請日:

20101102

公開號:

CN102655876A

公開日:

20120905

當前法律狀態:

有效性:

有效

法律詳情:
IPC分類號: A61K38/17,A61K38/16,A61K31/195,A61K31/185,A61K9/08,A61P1/16,A61P1/00 主分類號: A61K38/17,A61K38/16,A61K31/195,A61K31/185,A61K9/08,A61P1/16,A61P1/00
申請人: 基立福療法公司
發明人: 郭建新,安東尼·克洛什,B·科爾德倫,D·巴尼特,馬克·曼寧
地址: 美國北卡羅萊納州
優先權: 61/257,711
專利代理機構: 北京派特恩知識產權代理事務所(普通合伙) 代理人: 武晨燕;遲姍
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法律狀態
申請(專利)號:

CN201080054535.7

授權公告號:

法律狀態公告日:

法律狀態類型:

摘要

本發明提供包含API和至少一種氨基酸的組合物,特別是包含氨基酸的液體API制劑,以及與其相關的方法和試劑盒。當這些氨基酸摻入到API組合物中時使得API制劑穩定。

權利要求書

1.一種組合物,包含:(a)α1-蛋白酶抑制劑(API);和(b)至少一種氨基酸。2.權利要求1的組合物,其中所述至少一種氨基酸在組合物中以足以使得當組合物暴露于溫度一段時間時API保留至少50%的活性的總氨基酸量存在。3.權利要求2的組合物,其中所述溫度是大約5℃至大約40℃。4.權利要求2的組合物,其中所述時間是至少大約6個月。5.權利要求1的組合物,其中所述至少一種氨基酸是中性氨基酸或親水氨基酸。6.權利要求1的組合物,其中所述至少一種氨基酸選自丙氨酸、蘇氨酸、絲氨酸、羥脯氨酸、甘氨酸、脯氨酸、亮氨酸和組氨酸。7.權利要求1的組合物,其中所述氨基酸是丙氨酸。8.權利要求1的組合物,其中所述至少一種氨基酸在組合物中以大約0.01M至大約3M的總氨基酸量存在。9.權利要求1的組合物,還包含一種或更多種賦形劑。10.權利要求1的組合物,其中所述一種或更多種賦形劑選自蔗糖、甘露醇、甘油、山梨糖醇、葡聚糖、海藻糖、羥乙基淀粉(HES)、和1,2-丙二醇。11.權利要求1的組合物,其中所述組合物還包含藥學上可接受的載體。12.權利要求1的組合物,其中所述組合物適于向受試者靜脈內施用。13.權利要求1的組合物,其中所述至少一種氨基酸在組合物中以足以在組合物暴露于溫度達一段時間之后維持小于大約5%的總蛋白質聚集的總氨基酸量存在。14.權利要求13的組合物,其中所述溫度是大約25℃,其中所述一段時間是大約6個月。15.權利要求13的組合物,其中所述溫度是大約5℃,其中所述一段時間是大約6個月。16.權利要求15的組合物,其中所述至少一種氨基酸在組合物中以足以在組合物暴露于溫度達一段時間之后維持小于大約2%的總蛋白質聚集的總氨基酸量存在。17.權利要求13的組合物,其中組合物的pH為大約6.3至大約7.4。18.權利要求13的組合物,其中組合物的pH為大約6.7至大約7.1。19.權利要求1的組合物,其中組合物是凍干形式。20.試劑盒,包含權利要求1的組合物作為適于靜脈內施用的藥物組合物。

說明書

相關申請的交叉引用

本申請要求于2009年11月3日提交的美國申請號61/257,711的權益,該美國申請全文通過引用并入本文。

技術領域

本發明涉及包含α1-蛋白酶抑制劑(API)的組合物,特別是穩定的API組合物。本發明還涉及用于向受試者提供API,特別是向受試者提供治療或預防有效量API的方法和試劑盒。

背景技術

API缺陷是相對常見的遺傳病,其使受累個體易感肝臟疾病和/或肺氣腫。稱作蛋白酶抑制劑類型Z(PiZ)的最常見類型API缺陷作為常染色體隱性性狀遺傳,并且在大多數北歐和北美人群中大約1700個活產新生兒中有一例受影響。PiZ突變是導致單氨基酸替代的單核苷酸替代(谷氨酸342變成賴氨酸)。

人API具有394個氨基酸,一個半胱氨酸殘基,和3個糖側鏈,總分子量為52kDa。單活性中心環(RCL)位于位置358-359上的Met-Ser序列。API的三級結構包含8個確定的α-螺旋(A-H)和3個大的β-折疊(A-C)。據認為,舍平類(serpins)通過不可逆的“自殺-底物”機制起作用。當舍平被蛋白酶切割時經歷構象改變,由此RCL被切割并插入到Aβ-折疊的中心中,并且蛋白酶轉位到分子的遠端。該結構轉變導致舍平的穩定化和蛋白酶三級結構的全面變形,這使其催化結構失活。據信,API的生物學活性會受例如化學修飾影響,包括分子間或分子內聚合作用、氧化作用、復合體形成和/或被非特異性蛋白酶切割。

據認為,API的主要生理功能是抑制中性白細胞彈性蛋白酶、組織蛋白酶G和蛋白酶3。PiZ?API缺陷個體中所產生的API在功能上是有活性的,盡管它們的特異性彈性蛋白酶抑制能力會降低。API合成的主要位點在肝臟,然而,它還在肝外細胞類型,包括巨噬細胞、腸上皮細胞和腸帕內特細胞中合成。

API缺陷中肺損傷的發病機制是因為可利用的API活性的顯著減少。已經發現,API構成超過90%的肺泡灌洗液內中性白細胞彈性蛋白酶抑制劑活性。因此,很明顯,在許多API缺陷個體中所見的破壞性肺疾病是因為肺內彈性蛋白酶與API之間凈平衡的混亂。反過來,中性白細胞彈性蛋白酶、組織蛋白酶G和蛋白酶3的不受抑制的活性導致肺結締組織完整性的緩慢破壞。結締組織的這種破壞導致過度膨脹和肺回縮力的降低,這導致呼出的空氣流減少。吸煙因為引起API存在下的氧化失活而使問題惡化。

當前,對于具有API缺陷相關病理學的個體的治療選擇是有限的。與API缺陷相關的肝臟疾病已經通過原位肝移植治療。已經討論了替換缺陷的API基因的體細胞基因治療,但是仍沒有成功使用。

因此,仍然需要穩定的且提供在向受試者施用后具有所希望的API血漿生物利用率水平的API組合物。

發明內容

本文在一個方面中提供組合物,包含:(a)α1-蛋白酶抑制劑(API);和(b)至少一種氨基酸。

在另一個方面中,本發明提供用于制備組合物的方法。

在其它方面中,提供包含組合物的試劑盒。

附圖說明

圖1是顯示在實施例1中表1中所示液體API制劑的聚集特性的圖。

圖2是顯示包含丙氨酸、蔗糖、或者蔗糖/丙氨酸的API制劑的聚集特性的圖。

圖3是顯示包含丙氨酸、甘露醇、或者甘露醇/丙氨酸的API制劑的聚集特性的圖。

圖4是顯示包含丙氨酸、蔗糖、或者海藻糖的API制劑的聚集特性的圖。

圖5是顯示氨基酸濃度對在40℃下孵育1周后API制劑聚集影響的圖。

圖6是顯示氨基酸濃度對在40℃下孵育2周后API制劑聚集影響的圖。

圖7是顯示包含丙氨酸和包含或不包含不同濃度氧清除劑的API制劑的聚集特性的圖。

圖8是顯示實施例6中所述API制劑在5℃下的效能特性的圖:“甘氨酸”指制劑1(API(50mg/ml)/甘氨酸(250mM));“丙氨酸”指制劑2(API(50mg/ml)/L-丙氨酸(250mM));“丙氨酸/蔗糖”指制劑3(API(50mg/ml)/L-丙氨酸(125mM)/蔗糖(125mM));并且“NaCl”指制劑4(API(50mg/ml)/NaCl(250mM))。

圖9是顯示實施例6中所述API制劑在5℃下濁度(NTU)特性的圖:“甘氨酸”指制劑1(API(50mg/ml)/甘氨酸(250mM));“丙氨酸”指制劑2(API(50mg/ml)/L-丙氨酸(250mM));“丙氨酸/蔗糖”指制劑3(API(50mg/ml)/L-丙氨酸(125mM)/蔗糖(125mM));并且“NaCl”指制劑4(API(50mg/ml)/NaCl(250mM))。

圖10是顯示實施例6中所述API制劑在5℃下比活性特性的圖:“甘氨酸”指制劑1(API(50mg/ml)/甘氨酸(250mM));“丙氨酸”指制劑2(API(50mg/ml)/L-丙氨酸(250mM));“丙氨酸/蔗糖”指制劑3(API(50mg/ml)/L-丙氨酸(125mM)/蔗糖(125mM));并且“NaCl”指制劑4(API(50mg/ml)/NaCl(250mM))。

圖11是顯示實施例6中所述API制劑在5℃下脫酰胺作用特性的圖:“甘氨酸”指制劑1(API(50mg/ml)/甘氨酸(250mM));“丙氨酸”指制劑2(API(50mg/ml)/L-丙氨酸(250mM));“丙氨酸/蔗糖”指制劑3(API(50mg/ml)/L-丙氨酸(125mM)/蔗糖(125mM));并且“NaCl”指制劑4(API(50mg/ml)/NaCl(250mM))。

圖12是顯示實施例6中所述API制劑在5℃下聚集增加特性的圖:“甘氨酸”指制劑1(API(50mg/ml)/甘氨酸(250mM));“丙氨酸”指制劑2(API(50mg/ml)/L-丙氨酸(250mM));“丙氨酸/蔗糖”指制劑3(API(50mg/ml)/L-丙氨酸(125mM)/蔗糖(125mM));并且“NaCl”指制劑4(API(50mg/ml)/NaCl(250mM))。

圖13是顯示實施例6中所述API制劑在5℃下聚集特性的圖:“甘氨酸”指制劑1(API(50mg/ml)/甘氨酸(250mM));“丙氨酸”指制劑2(API(50mg/ml)/L-丙氨酸(250mM));“丙氨酸/蔗糖”指制劑3(API(50mg/ml)/L-丙氨酸(125mM)/蔗糖(125mM));并且“NaCl”指制劑4(API(50mg/ml)/NaCl(250mM))。

圖14是顯示實施例6中所述API制劑在5℃下寡聚體水平特性的圖:“甘氨酸”指制劑1(API(50mg/ml)/甘氨酸(250mM));“丙氨酸”指制劑2(API(50mg/ml)/L-丙氨酸(250mM));“丙氨酸/蔗糖”指制劑3(API(50mg/ml)/L-丙氨酸(125mM)/蔗糖(125mM));并且“NaCl”指制劑4(API(50mg/ml)/NaCl(250mM))。

圖15是顯示實施例6中所述API制劑在5℃下單體水平特性的圖:“甘氨酸”指制劑1(API(50mg/ml)/甘氨酸(250mM));“丙氨酸”指制劑2(API(50mg/ml)/L-丙氨酸(250mM));“丙氨酸/蔗糖”指制劑3(API(50mg/ml)/L-丙氨酸(125mM)/蔗糖(125mM));并且“NaCl”指制劑4(API(50mg/ml)/NaCl(250mM))。

圖16是顯示實施例6中所述API制劑在25℃下效能特性的圖:“甘氨酸”指制劑1(API(50mg/ml)/甘氨酸(250mM));“丙氨酸”指制劑2(API(50mg/ml)/L-丙氨酸(250mM));“丙氨酸/蔗糖”指制劑3(API(50mg/ml)/L-丙氨酸(125mM)/蔗糖(125mM));并且“NaCl”指制劑4(API(50mg/ml)/NaCl(250mM))。

圖17是顯示實施例6中所述API制劑在25℃下NTU特性的圖:“甘氨酸”指制劑1(API(50mg/ml)/甘氨酸(250mM));“丙氨酸”指制劑2(API(50mg/ml)/L-丙氨酸(250mM));“丙氨酸/蔗糖”指制劑3(API(50mg/ml)/L-丙氨酸(125mM)/蔗糖(125mM));并且“NaCl”指制劑4(API(50mg/ml)/NaCl(250mM))。

圖18是顯示實施例6中所述API制劑在25℃下比活性特性的圖:“甘氨酸”指制劑1(API(50mg/ml)/甘氨酸(250mM));“丙氨酸”指制劑2(API(50mg/ml)/L-丙氨酸(250mM));“丙氨酸/蔗糖”指制劑3(API(50mg/ml)/L-丙氨酸(125mM)/蔗糖(125mM));并且“NaCl”指制劑4(API(50mg/ml)/NaCl(250mM))。

圖19是顯示實施例6中所述API制劑在25℃下脫酰胺作用特性的圖:“甘氨酸”指制劑1(API(50mg/ml)/甘氨酸(250mM));“丙氨酸”指制劑2(API(50mg/ml)/L-丙氨酸(250mM));“丙氨酸/蔗糖”指制劑3(API(50mg/ml)/L-丙氨酸(125mM)/蔗糖(125mM));并且“NaCl”指制劑4(API(50mg/ml)/NaCl(250mM))。

圖20是顯示實施例6中所述API制劑在25℃下聚集增加特性的圖:“甘氨酸”指制劑1(API(50mg/ml)/甘氨酸(250mM));“丙氨酸”指制劑2(API(50mg/ml)/L-丙氨酸(250mM));“丙氨酸/蔗糖”指制劑3(API(50mg/ml)/L-丙氨酸(125mM)/蔗糖(125mM));并且“NaCl”指制劑4(API(50mg/ml)/NaCl(250mM))。

圖21是顯示實施例6中所述API制劑在25℃下聚集特性的圖:“甘氨酸”指制劑1(API(50mg/ml)/甘氨酸(250mM));“丙氨酸”指制劑2(API(50mg/ml)/L-丙氨酸(250mM));“丙氨酸/蔗糖”指制劑3(API(50mg/ml)/L-丙氨酸(125mM)/蔗糖(125mM));并且“NaCl”指制劑4(API(50mg/ml)/NaCl(250mM))。

圖22是顯示API制劑在25℃下寡聚體特性的圖?!案拾彼帷敝鋼萍?(API(50mg/ml)/甘氨酸(250mM));“丙氨酸”指制劑2(API(50mg/ml)/L-丙氨酸(250mM));“丙氨酸/蔗糖”指制劑3(API(50mg/ml)/L-丙氨酸(125mM)/蔗糖(125mM));并且“NaCl”指制劑4(API(50mg/ml)/NaCl(250mM))。

圖23是顯示API制劑在25℃下單體特性的圖?!案拾彼帷敝鋼萍?(API(50mg/ml)/甘氨酸(250mM));“丙氨酸”指制劑2(API(50mg/ml)/L-丙氨酸(250mM));“丙氨酸/蔗糖”指制劑3(API(50mg/ml)/L-丙氨酸(125mM)/蔗糖(125mM));并且“NaCl”指制劑4(API(50mg/ml)/NaCl(250mM))。

圖24是pH和蛋白質濃度對于在40℃下API溶液中1周、2周和3周聚集的2D-等值線圖。

圖25是40℃下1周、2周和3周的API溶液的pH和聚集相互作用圖。

圖26顯示pH對40℃下1周、2周和3周的API溶液中聚集的影響。

圖27顯示蛋白質濃度對40℃下1周、2周和3周API溶液中聚集特性的影響。

發明詳述

本發明基于這樣一個發現,即通過在組合物中還包含一種或更多種氨基酸制備相對穩定的包含API的組合物。在具體實施方案中,本發明包括適于提供API用于向受試者施用以起治療或者預防作用的穩定的、包含API的藥物組合物。與API相關(例如低于正常血漿API水平)以及本實施方案對其特別有用的病癥和疾病的非限定性實例包括但不限于,肺疾病例如慢性阻塞性肺疾病(COPD)(例如肺氣腫)、肝疾病、血管疾病(例如顱內動脈瘤、動脈肌纖維發育不良、嚴重出血病癥和高血壓)、脂膜炎、眼疾病(例如前葡萄膜炎)、系統性壞死性血管炎和Wegener肉芽腫病。

I.組合物

在一個方面中,本發明提供一種組合物,包含:

(i)API;和

(ii)至少一種氨基酸。

在一些實施方案中,組合物由API和至少一種氨基酸組成或者基本上由API和至少一種氨基酸組成。

本發明的組合物可以以相對純的形式提供。例如,在一些實施方案中,組合物可表征為制藥級。

組合物可以是固體、液體或者半固體形式。例如,組合物可以是液體制劑,包括但不限于水性溶液、水性混懸液、油混懸液等。備選地,組合物可以是凍干制劑、干粉末、固體顆粒等。其它實例包括但不限于膠體、乳劑、凝膠和軟膏。

在一個實施方案中,組合物是液體制劑,優選水性溶液。在另一實施方案中,組合物適宜制藥用途,例如包含藥學上可接受的載體或稀釋劑的藥物組合物。

在一個實施方案中,組合物是包含API、氨基酸和藥學上可接受的載體的藥物組合物。如本文所使用“藥學上可接受的載體”包括生理上相容的任何的和全部的溶劑、分散介質、包衣等。載體類型可以基于預期施用途徑選擇。在一些實施方案中,載體適宜通過但不限于靜脈內、吸入、腸胃外、皮下、肌內、靜脈內、關節內、支氣管內、腹內、囊內、軟骨內、腔內、體腔內、小腦內、腦室內、結腸內、子宮頸內、胃內、肝內、心肌內、骨內、骨盆內、心包內、腹膜內、胸膜內、前列腺內、肺內、直腸內、腎內、視網膜內、椎管內、滑膜內、胸內、子宮內、膀胱內、推注、陰道、直腸、頰、舌下、鼻內、或經皮方式的途徑施用。藥學上可接受的載體包括無菌水性溶液或分散液和用于制備無菌可注射溶液或分散液的無菌粉末。

在一些實施方案中,組合物是無菌的并且在一種或更多種制造和儲存條件下是穩定的。組合物可以配制成為溶液、微乳劑、脂質體、或者其它有序結構。例如,無菌的可注射溶液可以通過過濾除菌制備??梢醞ü獳PI混合到包含分散介質的無菌媒介物中制備分散液。在用于制備無菌可注射溶液的無菌粉末的情況下,優選的制備方法是真空干燥和冷凍干燥,其優選從先前無菌過濾溶液提供包含API和氨基酸加上任何額外期望成分的粉末的組合物。

示例性的稀釋劑(例如用于組合物的稀釋、重構等)可以包括,但不限于,無菌水、注射用制菌水(BWFI)、pH緩沖溶液(例如磷酸鹽緩沖鹽水)、無菌鹽溶液和Ringer溶液或右旋糖溶液。稀釋劑任選包含防腐劑。所采用的防腐劑的量通過評價不同防腐劑濃度與API的兼容性和防腐劑功效測試確定。

吸入治療包括向呼吸道施用氣溶膠形式的藥物。氣溶膠遞送基于這樣的概念,即如果分子是生物可利用時,則向占肺上皮95%的肺深部區(肺泡)的遞送可以顯著增強蛋白質跨上皮細胞膜的轉運。液體氣溶膠可以通過將API溶液噴霧產生。備選地,固體顆??梢允譴蛹屏課肫魘┯玫腦諭平林謝煨姆勰┬問?,或者僅作為從干粉末吸入器施用的粉末。例如,可以通過從溶液凍干(冷凍干燥)API、然后將凍干的藥物磨成或研成用于肺施用的期望粒度大小分布來制備固體顆粒氣溶膠。另一技術包括噴霧干燥,它是利用來自熱氣流(通常是空氣)的熱將通過連續液體給料的噴霧所產生的分散微滴蒸發的脫水過程。使用這些方法,包含API的組合物可以干燥成細顆粒,優選含有例如充當水替代劑的適宜的賦形劑類型和量。

增壓計量吸入器是目前本領域眾所周知的??梢允褂檬室訟蚧頰叻位蟣親佑τ靡┪锏娜魏臥鲅辜屏課肫???梢匝≡衿芙褐萍梁圖屏糠乓蘊峁┲瘟蘋蛘咴し烙行Я康腁PI。

A.API

術語“API”,如本文所使用,旨在是廣義的,除非另外明確說明。該術語指API的所有天然存在的多形體。該術語還包括API的功能片段、包含API的嵌合蛋白質或者其功能片段、通過API的一個或更多個氨基酸的相似替代所得到的同源物、和物種同源物。該術語還指其為重組DNA技術產物的所有API多肽,包括其為轉基因技術產物的API。例如,編碼API的基因可以以如此的方式插入到編碼乳乳清蛋白的哺乳動物基因中,使得DNA序列在乳腺中表達,如例如美國專利號5,322,775中所述,其關于產生蛋白質性質化合物的教導通過引用并入本文。該術語還指通過本領域已知的方法,諸如例如固相肽合成化學合成的所有API蛋白質。該術語還指從血漿制備的API。該術語還指可以商業上得到的API。API可以對應于人或者非人API。

在一個實施方案中,API是血漿來源的API。在另一實施方案中,API從Cohn級分IV-1糊制備。在另外的實施方案中,API從白蛋白耗竭的血漿級分、Cohn?V沉淀物、或者預純化的API制備級分制備。美國專利號6,974,792關于制備API的方法的教導通過引用并入本文。

在另外的實施方案中,API是重組API。API的氨基酸和核苷酸序列和/或重組API的產生描述于例如美國專利號4,711,848;4,732,973;4,931,373;5,079,336;5,134,119;5,218,091;6,072,029;和Wright等,Biotechnology,9:830(1991);以及Archibald等,PNAS,87:5178(1990)中,每一文獻關于API序列、重組API、和/或API的重組表達的教導通過引用并入本文。

在一個實施方案中,組合物表征為包含具有大于90%純度的API。在另外的實施方案中,API具有大于95%,優選至少大約99%的純度。在一些實施方案中,組合物中所有API的至少大約50%,示例性地大約50%至大約100%,大約60%至大約90%,大約70%至大約80%是活性的API。

在一個實施方案中,組合物包含治療有效量的API?!爸瘟樸行Я俊敝岡諦枰募亮亢褪奔浣錐斡行У卮锏狡諭瘟平峁?諸如例如,與先天性API缺陷相關的肺氣腫的減少或者抑制)的量。API的治療有效量會根據因素例如疾病狀態、年齡、性別、和個體受試者體重、和API引起受試者中期望反應的能力而改變。治療有效量還可以是其中API的治療有益效果大于任何毒性或有害作用的量。

在另外的實施方案中,組合物包含預防有效量的API?!霸し烙行Я俊敝岡諦枰募亮亢褪奔浣錐蝸掠行迪制諭し瀾峁?諸如例如,防止或者抑制與API先天性缺陷相關的肺氣腫)的量。預防有效量可以如上對于確定治療有效量所述確定。

當確定API的治療或預防有效量時要考慮的一個因素是接受治療的受試者生物腔室中,諸如例如受試者下呼吸道或者上皮內襯液(ELF)中表達的功能活性API的濃度。當確定API的治療或者預防有效量時還考慮的另一因素是API的藥理學(例如藥物動力學)。

API的藥物動力學指受試者血液中的API濃度或者水平。血液中API水平的藥物動力學參數或量度包括曲線下面積(AUC)、Cmin(即波谷)、和Cmax。AUC是在固定的給藥階段內(例如8、12和24小時)受試者血液內API的總暴露。Cmin(即波谷水平)是在固定的給藥階段期間API的最低血液水平。Cmax是在固定的給藥階段內受試者血液內達到的API最高或者峰值水平。

在一個實施方案中,施用的治療或者預防有效量足以達到或者維持高于靶閾值水平的API血液(例如血漿)波谷水平。在一個實施方案中,靶閾值水平是至少大約10mg/dL,示例性地大約10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、和200mg/dL。

在另一實施方案中,治療或預防有效量足以達到或者維持至少大約50mg/dL的API血液波谷水平。在另外的實施方案中,API的治療或預防有效量足以維持至少大約80mg/dL的血液API波谷水平。

在一個實施方案中,組合物中API濃度是至少大約0.1mg/ml,示例性地至少大約0.1、1、5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、和1000mg/ml。在一個實施方案中,組合物中API的比活性是至少大約0.05mg活性API每mg總蛋白,示例性地,至少大約0.05、0.1、0.2mg、0.3mg、0.4mg、0.5mg、0.6mg、0.7mg、或更多活性API每mg總蛋白。

在一些實施方案中,組合物中包含的API的濃度以重量百分比計(w/v)為至少大約1%,示例性地大約1至大約60%,大約5至大約55%,大約10至大約45%,大約20至大約30%(w/v)。

B.氨基酸

應當理解,本文明確描述的氨基酸僅是為了說明的目的并且不旨在對可以根據本發明使用的氨基酸進行限制。本文沒有明確描述的其它氨基酸可以基于所觀察到的物理和化學特性容易地分類。此外,本文所描述的一些氨基酸已經就遺傳編碼的氨基酸而言進行了例證,然而,氨基酸無需局限于遺傳編碼的氨基酸,而且還可以包括遺傳上非編碼氨基酸。例如,氨基酸還可以包括天然存在的非編碼氨基酸和合成的氨基酸(例如β-丙氨酸、羥脯氨酸)?;箍悸橇薒-對映體氨基酸(L-氨基酸)和D-氨基酸以及游離氨基酸形式和/或生理可接受鹽形式和/或其混合物。

表1列出了氨基酸的一些非限定性實例。

表1.氨基酸

??氨基酸 ??三字母碼 ??單字母碼 ??甘氨酸 ??Gly ??G ??丙氨酸 ??Ala ??A ??纈氨酸 ??Val ??V ??亮氨酸 ??Leu ??L ??異亮氨酸 ??Ile ??I

??甲硫氨酸 ??Met ??M ??苯丙氨酸 ??Phe ??F ??色氨酸 ??Trp ??W ??脯氨酸 ??Pro ??P ??絲氨酸 ??Ser ??S ??蘇氨酸 ??Thr ??T ??半胱氨酸 ??Cys ??C ??酪氨酸 ??Tyr ??Y ??天冬酰胺 ??Asn ??N ??谷氨酰胺 ??Gln ??Q ??賴氨酸 ??Lys ??K ??精氨酸 ??Arg ??R ??組氨酸 ??His ??H ??天冬氨酸 ??Asp ??D ??谷氨酸 ??Glu ??E

在一個實施方案中,組合物包含至少一種氨基酸,其各自選自:Ala(A)、Thr(T)、羥脯氨酸、Gly(G)、Ser(S)、Gln(Q)、Phe(F)、Trp(W)、Met(M)、乙酰半胱氨酸、Leu(L)、Ile(I)、Val(V)、Lys(K)、Pro(P)、Tyr(Y)、His(H)、Glu(E)、Asn(N)、Asp(D)、和Arg(R)。

在另一實施方案中,所述至少一種氨基酸各自選自:Ala(A)、Thr(T)、羥脯氨酸、Gly(G)、和Ser(S)。

在另外的實施方案中,所述至少一種氨基酸是Ala(A)或Gly(G)。

在一些實施方案中,氨基酸是中性氨基酸或者親水氨基酸。在另一實施方案中,親水氨基酸是表征為根據共同疏水性標度(consensus?hydrophobicity?scale)表現出小于零的疏水性的氨基酸。

在一個實施方案中,至少一種氨基酸在組合物中以足以提供穩定的API組合物的總氨基酸量存在,例如如相對于不含至少一種氨基酸的API組合物所確定。

在另一實施方案中,總氨基酸量是足夠的量使得API在一定溫度下一段時間保留至少大約5%的API活性,示例性地,在一定溫度下一段時間保留至少大約5%至大約100%、大約10%至大約95%、大約20%至大約90%、大約30%至大約80%、大約40%至大約70%、和大約50%至大約60%的API活性。在一些實施方案中,時間期間和/或溫度表征為儲存時間和/或溫度(例如貨架期)。在一個實施方案中,時間期間是至少大約:1天、1周、2周、3周、1個月、2個月、3個月、4個月、5個月、6個月、8個月、1年、2年、和3年。在另一實施方案中,溫度等于或者大于大約:-120℃、-70℃、-20℃、0℃、5℃、25℃、37℃、40℃、和50℃。

在一個實施方案中,API活性可以通過豬胰彈性蛋白酶的抑制確定,如例如Coan等,Vox?Sang.,48:333(1985)中所述,其全文通過引用并入本文。在一些實施方案中,API活性可以通過體外、體內、和/或離體確定法(例如治療指數、LD50、ED50等)評價為在動物內的效能或者毒性。例如,在從本體溶液或儲存溶液系列稀釋后,或者凍干或者真空干燥的包含API的組合物重構后,在重構的或者水性組合物中存在的API(在至少一種氨基酸和/或總的至少一種氨基酸量存在下)具有在摻入到組合物中之前生物學活性API所具有的效能或毒性的大于至少大約5%至大約100%。

在另外的實施方案中,API的穩定性可可以通過例如確定API降解確定,包括但不限于,氧化、蛋白水解和/或脫酰胺產物的形成,分子量分布的變化,效能的變化,功能性的變化,不溶性物質如聚集物的增加或者由于賦形劑的存在導致的產物修飾,例如非酶促糖化作用。此外,穩定性可以確定為由于例如揮發作用、吸附作用、化學修飾等等引起的濃度變化。因此,在一些實施方案中,儲存穩定的API組合物是表現出小于5、10、15、20、25、30、40、50、60、70%API降解的那些組合物。儲存穩定的組合物還可以表現出這些特征的任何組合。

在另一實施方案中,組合物中氨基酸總量是相對于不含至少一種氨基酸的組合物而言足以增加API熔點的量。本領域普通技術人員可以使用例如差示掃描量熱儀(DSC)確定熔點。在一個實施方案中,組合物中的氨基酸總量足以使熔點增加至少大約:0.01℃、0.1℃、1℃、1.2℃、1.4℃、1.6℃、1.8℃和2℃。

在另外的實施方案中,組合物的氨基酸總量是在組合物于一定溫度下儲存一段時間后足以使組合物中的單體API百分數為至少大約50%,示例性地,大約50%至大約100%、大約60%至大約99%、大約98%、大約70%至大約98%、大約80%至大約95%、和大約85%至大約90%的量。在一個實施方案中,時間期間是至少大約1天、1周、2周、3周、4周、5周、2個月、3個月、4個月、5個月、6個月、8個月、1年、2年、和3年。在另一實施方案中,溫度等于或者大于大約:-120℃、-70℃、-20℃、0℃、5℃、25℃、37℃、40℃和50℃。

在另一實施方案中,組合物的氨基酸總量是在組合物于一定溫度下儲存一段時間后足以使組合物中的蛋白質聚集體百分數小于或等于大約:50%、40%、30%、20%、10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%、0.5%和0%的量。在一個實施方案中,一段時間是至少大約:1天、1周、2周、3周、4周、5周、2個月、3個月、4個月、5個月、6個月、8個月、1年、2年和3年。在另一實施方案中,溫度等于或者大于大約:-120℃、-70℃、-20℃、0℃、5℃、25℃、37℃、40℃和50℃。

組合物中的蛋白質聚集水平可以由本領域普通技術人員通過例如使用大小排阻高效液相層析(SE-HPLC)確定。

在一個實施方案中,組合物中存在的氨基酸總量是至少大約0.01M,示例性地,大約0.01至大約3M、大約0.03至大約1M、大約0.05至大約0.5M、和大約0.1至大約0.3M。

在另一實施方案中,組合物中存在的氨基酸總量是至少大約0.01M、至少大約0.03、或者至少大約0.3M。

在另外的實施方案中,組合物包含至少大約0.01M丙氨酸(示例性地,大約0.01至大約1M和大約0.01至大約0.75M丙氨酸)的總丙氨酸濃度的丙氨酸。在一些實施方案中,至少一種氨基酸是丙氨酸,其中組合物不包含除丙氨酸之外的氨基酸。

在一個實施方案中,組合物包含至少大約0.01M蘇氨酸(示例性地,大約0.01至大約1M和大約0.1至大約0.3M蘇氨酸)的總蘇氨酸濃度的蘇氨酸。在一些實施方案中,至少一種氨基酸是蘇氨酸,其中組合物不包含除蘇氨酸之外的氨基酸。

在另一實施方案中,組合物包含至少大約0.01M羥脯氨酸(示例性地,大約0.01至大約1M和大約0.1至大約0.3M羥脯氨酸)的總羥脯氨酸濃度的羥脯氨酸。在一些實施方案中,至少一種氨基酸是羥脯氨酸,其中組合物不包含除羥脯氨酸之外的氨基酸。

在一個實施方案中,組合物包含至少大約0.01M甘氨酸(示例性地,大約0.01至大約1M和大約0.1至大約0.3M甘氨酸)的總甘氨酸濃度的甘氨酸。在一些實施方案中,至少一種氨基酸是甘氨酸,其中組合物不包含除甘氨酸之外的氨基酸。

在另外的實施方案中,組合物包含至少大約0.01M絲氨酸(示例性地,大約0.01至大約1M和大約0.1至大約0.3M絲氨酸)的總絲氨酸濃度的絲氨酸。在一些實施方案中,至少一種氨基酸是絲氨酸,其中組合物不包含除絲氨酸之外的氨基酸。

在一個實施方案中,組合物包含至少大約0.01M谷氨酰胺(示例性地,大約0.01至大約1M和大約0.1至大約0.3M谷氨酰胺)的總谷氨酰胺濃度的谷氨酰胺。在一些實施方案中,至少一種氨基酸是谷氨酰胺,其中組合物不包含除谷氨酰胺之外的氨基酸。

在另外的實施方案中,組合物包含至少大約0.01M苯丙氨酸(示例性地,大約0.01至大約1M和大約0.1至大約0.3M苯丙氨酸)的總苯丙氨酸濃度的苯丙氨酸。在一些實施方案中,至少一種氨基酸是苯丙氨酸,其中組合物不包含除苯丙氨酸之外的氨基酸。

在一個實施方案中,組合物包含至少大約0.01M色氨酸(示例性地,大約0.01至大約1M和大約0.1至大約0.3M色氨酸)的總色氨酸濃度的色氨酸。在一些實施方案中,至少一種氨基酸是色氨酸,其中組合物不包含除色氨酸之外的氨基酸。

在另一實施方案中,組合物包含至少大約0.01M甲硫氨酸(示例性地,大約0.01至大約1M和大約0.1至大約0.3M甲硫氨酸)的總甲硫氨酸濃度的甲硫氨酸。在一些實施方案中,至少一種氨基酸是甲硫氨酸,其中組合物不包含除甲硫氨酸之外的氨基酸。

在另外的實施方案中,組合物包含至少大約0.01M乙酰半胱氨酸(示例性地,大約0.01至大約1M和大約0.1至大約0.3M乙酰半胱氨酸)的總乙酰半胱氨酸濃度的乙酰半胱氨酸。在一些實施方案中,至少一種氨基酸是乙酰半胱氨酸,其中組合物不包含除乙酰半胱氨酸之外的氨基酸。

在一個實施方案中,組合物包含至少大約0.01M亮氨酸(示例性地,大約0.01至大約1M和大約0.03至大約0.15M亮氨酸)的總亮氨酸濃度的亮氨酸。在一些實施方案中,至少一種氨基酸是亮氨酸,其中組合物不包含除亮氨酸之外的氨基酸。

在另一實施方案中,組合物包含至少大約0.01M異亮氨酸(示例性地,大約0.01至大約1M和大約0.1至大約0.3M異亮氨酸)的總異亮氨酸濃度的異亮氨酸。在一些實施方案中,至少一種氨基酸是異亮氨酸,其中組合物不包含除異亮氨酸之外的氨基酸。

在另外的實施方案中,組合物包含至少大約0.01M纈氨酸(示例性地,大約0.01至大約1M和大約0.1至大約0.3M纈氨酸)的總纈氨酸濃度的纈氨酸。在一些實施方案中,至少一種氨基酸是纈氨酸,其中組合物不包含除纈氨酸之外的氨基酸。

在一個實施方案中,組合物包含至少大約0.01M賴氨酸(示例性地,大約0.01至大約1M和大約0.1至大約0.3M賴氨酸)的總賴氨酸濃度的賴氨酸。在一些實施方案中,至少一種氨基酸是賴氨酸,其中組合物不包含除賴氨酸之外的氨基酸。

在另一實施方案中,組合物包含至少大約0.01M脯氨酸(示例性地,大約0.01至大約1M和大約0.1至大約0.3M脯氨酸)的總脯氨酸濃度的脯氨酸。在一些實施方案中,至少一種氨基酸是脯氨酸,其中組合物不包含除脯氨酸之外的氨基酸。

在另外的實施方案中,組合物包含至少大約0.01M酪氨酸(示例性地,大約0.01至大約1M和大約0.1至大約0.3M酪氨酸)的總酪氨酸濃度的絲氨酸。在一些實施方案中,至少一種氨基酸是酪氨酸,其中組合物不包含除酪氨酸之外的氨基酸。

在一個實施方案中,組合物包含至少大約0.01M組氨酸(示例性地,大約0.01至大約1M和大約0.1至大約0.3M組氨酸)的總組氨酸濃度的組氨酸。在一些實施方案中,至少一種氨基酸是組氨酸,其中組合物不包含除組氨酸之外的氨基酸。

在另一實施方案中,組合物包含至少大約0.01M谷氨酸(示例性地,大約0.01至大約1M和大約0.1至大約0.3M谷氨酸)的總谷氨酸濃度的谷氨酸。在一些實施方案中,至少一種氨基酸是谷氨酸,其中組合物不包含除谷氨酸之外的氨基酸。

在另外的實施方案中,組合物包含至少大約0.01M天冬酰胺(示例性地,大約0.01至大約1M和大約0.1至大約0.3M天冬酰胺)的總天冬酰胺濃度的天冬酰胺。在一些實施方案中,至少一種氨基酸是天冬酰胺,其中組合物不包含除天冬酰胺之外的氨基酸。

在一個實施方案中,組合物包含至少大約0.01M天冬氨酸(示例性地,大約0.01至大約1M和大約0.1至大約0.3M天冬氨酸)的總天冬氨酸濃度的天冬氨酸。在一些實施方案中,至少一種氨基酸是天冬氨酸,其中組合物不包含除天冬氨酸之外的氨基酸。

在另一實施方案中,組合物包含至少大約0.01M精氨酸(示例性地,大約0.01至大約1M和大約0.17至大約0.3M精氨酸)的總精氨酸濃度的精氨酸。在一些實施方案中,至少一種氨基酸是精氨酸,其中組合物不包含除精氨酸之外的氨基酸。

C.賦形劑

在另外的實施方案中,本發明提供一種組合物,包含:

(i)API;

(ii)至少一種氨基酸,其中組合物還包含一種或更多種賦形劑。賦形劑的非限定性實例包括多元醇、糖、表面活性劑、抗氧化劑、鹽(例如無機鹽)、金屬螯合劑、聚合物(例如聚乙二醇(PEG)、環糊精、葡聚糖)、尿素、胍氯化物、多肽(例如抗體)、及其組合。因此,本領域技術人員將理解,術語“賦形劑”如本文所使用旨在是廣義的,并且可以包括如本領域普通技術人員通常使用以制備包含蛋白質的組合物的試劑。

在一些實施方案中,賦形劑是多元醇或糖。例如,多元醇或糖可以是,但不限于,蔗糖、甘露醇、海藻糖、山梨糖醇、山梨糖、松三糖、甘油、果糖、甘露糖、麥芽糖、乳糖、阿拉伯糖、木糖、核糖、鼠李糖、半乳糖、葡萄糖、木糖醇、赤藻糖醇、蘇糖醇、棉子糖等等。

在一個實施方案中,一種或更多種賦形劑各自選自:蔗糖、甘露醇、甘油、山梨糖醇、葡聚糖、海藻糖、羥乙基淀粉(HES)、糖精鈉、聚乙二醇(PEG)(例如PEG?3350、PEG?2000、PEG?8000)、和1,2-丙二醇。在另一實施方案中,賦形劑是蔗糖或者甘露醇。

在另外的實施方案中,如果組合物中存在的話,蔗糖的總量為小于20%(w/v),示例性地,大約0%至大約15%(w/v)、大約2.5%至大約7.5%、和大約4%至大約5%(w/v)。在一個實施方案中,組合物不包含蔗糖。

組合物的每一賦形劑的總量和/或賦形劑總量會取決于例如所使用賦形劑類型和/或數量、和/或包含API的組合物中存在的其它成分的類型和/或數量而改變。

在一個實施方案中,組合物包含至少大約0.01M糖(示例性地,大約0.01至大約1M和大約0.125至大約0.75M糖)的總糖濃度的糖。在一些實施方案中,糖是蔗糖。在另外的實施方案中,糖是蔗糖,其中組合物不包含除蔗糖之外的糖。

在另一實施方案中,組合物包含至少大約0.01M多元醇(示例性地,大約0.01至大約1M和大約0.25至大約0.75M多元醇)的總多元醇濃度的多元醇。在一些實施方案中,多元醇是甘露醇。在另外的實施方案中,多元醇是甘露醇,其中組合物不包含除甘露醇之外的多元醇。

在另外的實施方案中,組合物包含至少大約0.25%(w/v)多元醇(示例性地,大約0.25至大約5%(w/v)多元醇)的總多元醇濃度的多元醇。在一些實施方案中,多元醇是甘油。在另外的實施方案中,多元醇是甘油,其中組合物不包含除甘油之外的多元醇。

在一個實施方案中,組合物包含至少大約0.01M多元醇(示例性地,大約0.01至大約1M和大約0.27至大約0.55M多元醇)的總多元醇濃度的多元醇。在一些實施方案中,多元醇是山梨糖醇。在另外的實施方案中,多元醇是山梨糖醇,其中組合物不包含除山梨糖醇之外的多元醇。

在另一實施方案中,組合物包含至少大約0.25%(w/v)聚合物(示例性地,大約0.25至大約5%(w/v)聚合物)的總聚合物濃度的聚合物。在一些實施方案中,多元醇是葡聚糖。在另外的實施方案中,聚合物是葡聚糖,其中組合物不包含除葡聚糖之外的聚合物。

在另外的實施方案中,組合物包含至少大約0.01M糖(示例性地,大約0.01至大約1M和大約0.15至大約0.75M糖)的總糖濃度的糖。在一些實施方案中,糖是海藻糖。在另外的實施方案中,糖是海藻糖,其中組合物不包含除海藻糖之外的糖。

在一個實施方案中,組合物包含至少大約0.25%(w/v)HES(示例性地,大約0.25至大約5%(w/v)HES)的總HES濃度的HES。

在另一實施方案中,組合物包含至少大約0.01M糖精鈉(示例性地,大約0.01至大約1M和大約0.15至大約0.75M糖精鈉)的總糖精鈉濃度的糖精鈉。

在另外的實施方案中,組合物包含至少大約0.25%(w/v)PEG(示例性地,大約0.25至大約10%(w/v)PEG和大約1至大約5%(w/v)PEG)的總PEG濃度的PEG。在一些實施方案中,PEG是PEG?3350。在另外的實施方案中,PEG是大約5%(w/v)PEG?3350,其中組合物不包含除PEG?3350之外的PEG。

在一個實施方案中,組合物包含至少大約0.01M?1,2-丙二醇(示例性地,大約0.01至大約1M和大約0.125至大約0.3M?1,2-丙二醇)的總1,2-丙二醇濃度的1,2-丙二醇。

表面活性劑可以包括,但不限于,例如聚乙烯和聚丙二醇的嵌段聚合物(例如Pluronic?F68);或者聚乙二醇山梨醇酐單月桂酸酯(例如Tween?80),聚氧乙烯山梨醇酐一油酸酯(例如Tween?20),等等。在一個實施方案中,表面活性劑是Pluronic?F68或Tween?80(即聚山梨醇酯80)。

在一個實施方案中,組合物還包含至少大約0.0025%(v/v)表面活性劑(示例性地,大約0.0025至大約1%(v/v)、大約0.025至大約0.1%(v/v)、和大約0.05至大約0.075%(v/v)表面活性劑)的總表面活性劑濃度的表面活性劑。在一些實施方案中,表面活性劑是Pluronic?F68或Tween?80。

在另一實施方案中,本發明提供一種組合物,包含:

(i)API;

(ii)至少一種氨基酸,其中組合物還包含鹽,優選無機鹽。無機鹽的實例包括但不限于氯化鈉或磷酸鈉。

在一個實施方案中,無機鹽在組合物中以至少0.01M無機鹽(示例性地,大約0.01至大約0.5M、大約0.05至大約0.4M、和大約0.1至大約0.15M無機鹽)的總無機鹽的量存在。在一些實施方案中,無機鹽是氯化納、磷酸鈉或其組合。

如本文所使用,術語“抗氧化劑”指減少或者防止氧化的試劑?!翱寡躉痢卑ǖ幌抻詡琢虬彼?、谷胱甘肽、乙?;腚裝彼?、抗壞血酸、丁基羥基苯甲醚(BHA)、丁基羥基甲苯(BHT)和馬來酸。

在一個實施方案中,本發明提供一種組合物,包含:

(i)API;

(ii)至少一種氨基酸,其中組合物還包含抗氧化劑。在一些實施方案中,抗氧化劑是甲硫氨酸。在另外的實施方案中,抗氧化劑是谷胱甘肽。在另一實施方案中,抗氧化劑在組合物中以至少大約0.01%(w/v)(示例性地,大約0.01至大約5%(w/v),和大約0.05至大約0.7%(w/v))的總抗氧化劑量存在。

金屬螯合劑的非限定性實例包括乙二胺四乙酸(EDTA),(0.1-0.5%)、乙二醇雙(氨乙基醚)四乙酸(EGTA)、1,2-雙(2-氨基苯氧基)乙烷-N,N,N’,N’-四乙酸(BAPTA)、羥乙基乙二胺三乙酸(HEDTA)、或其鹽。在一個實施方案中,金屬螯合劑是二價金屬螯合劑。在另一實施方案中,金屬螯合劑是EDTA、EGTA、BAPTA、HEDTA或其鹽。在一些實施方案中,組合物包含金屬螯合劑的組合。在另外的實施方案中,金屬螯合劑在組合物中以至少大約0.01%(w/v)(示例性地,大約0.01至大約1%(w/v)、大約0.05至大約0.5%(w/v)、和大約0.1至大約0.25%)的總螯合劑的量存在。

在另一實施方案中,本發明提供一種組合物,包含:

(i)API;

(ii)至少一種氨基酸,其中組合物還包含金屬螯合劑。

因此,在另外的實施方案中,本發明提供一種組合物,包含:

(a)API;和

(b)氨基酸,

其中組合物還包含,或者任選地還包含,一種或更多種賦形劑。

根據本發明提供許多種不同的包含API的組合物。此類制劑中的活性成分是API,其可以是人或非人的重組API,但是如上面所指出還可以包括從血漿來源提取的API。雖然API可以自身作為單獨的活性成分存在,但是API還可以與一種或更多種額外的活性成分一起存在。

II.用于制備組合物的方法

在另外的方面中,本發明提供制備包含API和至少一種氨基酸的組合物的方法。

在一個實施方案中,所述方法包括將包含API的第一組合物透析以除去鹽,如果組合物中存在鹽的話。

例如,第一組合物可以是在緩沖液中制備或者與緩沖液接觸的包含API的組合物,其中第一組合物包含鹽。組合物可以是,但不限于從用于從血漿(例如人血漿)制備API或者制備重組API制劑的批量制造過程中所得到的組合物。

在一個實施方案中,第一組合物包含在磷酸緩沖液(例如20mM磷酸鈉,pH?7)中的API,其中氯化納在緩沖液中以例如大約100mM的NaCl存在。在一些實施方案中,透析使用超濾/滲濾(UF/DF)開展。

在一些實施方案中,所述方法還包括在透析步驟之后向組合物提供至少一種氨基酸。賦形劑和/或任何其它試劑等可以與氨基酸一起加入、在氨基酸加入之后加入或者在氨基酸加入隨后加入。

在另外的實施方案中,所述方法包括將包含API的第一組合物針對包含至少一種氨基酸和/或賦形劑和/或任何其它試劑的緩沖液(例如磷酸緩沖液20mM,pH7)透析。

在一個實施方案中,所述方法還包括維持包含API的組合物的pH于大約6.0至大約8.0,優選大約6.6至大約7.4。例如,在另一實施方案中,可以首先加入緩沖鹽以達到有效的pH范圍,然后加入氨基酸和/或賦形劑和/或任何其它試劑/成分。在另外的實施方案中,氨基酸和/或賦形劑和/或其它試劑可以組合加入到包含API的組合物中。

III.試劑盒

在另外的方面中,本發明還提供試劑盒,例如用于治療與API表達或活性相關疾病或病癥的試劑盒。在一個實施方案中,試劑盒包含根據本發明的組合物,特別是包含API和氨基酸的藥物組合物;并且任選地,用于治療或者預防API相關疾病或病癥,例如與低于正常血漿API水平相關或由其引起的疾病或病癥的使用說明書。

在另外的實施方案中,所述試劑盒提供單獨的容器,其中至少一個容器包含含有API的組合物,并且在一個或更多個另外的容器中包含不同的組合物,特別是包含除API之外的活性成分的組合物。任選地,試劑盒還可包含與活性成分組合的和/或在單獨的容器中與活性成分分開的藥學上可接受的載體和稀釋劑。

本發明將通過實施例的方式更加詳細地說明,但是應當注意本發明不限于這些實施例。

實施例

實施例1

包含API的液體制劑的穩定性

開展促進穩定性研究以確定包含API的液體制劑的穩定性。

從級分IV-1生產和Microbench批次(Macro?bench?lot)制備的API針對磷酸鹽緩沖液(20mM,pH?7)透析以去除鹽,然后濃縮至100mg/ml。在透析之后,通過加入包含其它成分的2-倍溶液得到包含其它成分的多種API制劑。然后,通過將大約2ml的最終制劑加入到10ml管瓶中,然后在溫度控制箱內于40℃孵育~3-4周,測試最終的API制劑的API穩定性。每周收集樣品以使用SEC-HPLC確定聚集體水平。

結果示于圖1中并總結于表2中。

表2.API液體制劑聚集體水平百分數

如圖1和表2中所示,僅包含API的制劑和包含0.1M?NaCl的制劑表現出最大量的聚集。包含蔗糖的API制劑最穩定,并且隨著時間的推移形成的聚集體的量最低。

還在40℃下對包含API(50mg/mL);API(50mg/mL)加丙氨酸(0.25M)或蔗糖(0.25M);以及API(50mg/mL)加丙氨酸(0.125M)/蔗糖(0.125M)的液體API制劑開展促進穩定性研究。

如圖2中所示,單獨的丙氨酸為包含API的組合物提供一定程度的穩定性,如通過隨時間的推移聚集體水平百分數所確定。此外,組合有限量的蔗糖與丙氨酸也提供一定程度的穩定性,其大于單獨的丙氨酸。

實施例2

包含API的液體制劑的穩定性

還在40℃下對包含API(50mg/mL);API(50mg/mL)加丙氨酸(0.25M)或甘露醇(0.25M);以及API(50mg/mL)加丙氨酸(0.125M)/甘露醇(0.125M)的液體API制劑開展在實施例1中所述的促進穩定性研究。

如圖3中所示,單獨的丙氨酸為包含API的組合物提供一定程度的穩定性,如通過隨時間的推移聚集體水平百分數所確定。此外,組合有限量的甘露醇與丙氨酸還提供一定程度的穩定性,其大于單獨的丙氨酸。

實施例3

包含API的液體制劑的穩定性

還在40℃下開展在實施例1中所述的促進穩定性研究以確定不同濃度的蔗糖、海藻糖和丙氨酸的穩定作用。為了評價蔗糖、海藻糖和丙氨酸的穩定作用,制備分別包含0.25M、0.5M、和0.75M這些成分的10種制劑,并且無菌性地充入到5ml管瓶中。測試這些樣品在40℃下的聚集4周。

結果示于圖4中。起始聚集體水平為0。在4周孵育過程中,在0.75M蔗糖或者0.75M海藻糖制劑中沒有檢測到API聚集。在40℃下在第一周時沒有檢測到聚集。不存在所述不同成分的API在第一周時聚集并且在每一時間點聚集水平最高。隨著所加入成分濃度的增加聚集體水平降低。海藻糖提供抗聚集的最佳穩定作用,其次是蔗糖和丙氨酸。

實施例4

包含API的液體制劑的穩定性

還在40℃下開展在實施例1中所述的促進穩定性研究,以確定丙氨酸或甘氨酸濃度對API制劑的影響。向API液體制劑中加入0M、0.1M、0.15M、0.2M、0.25M、或0.3M的丙氨酸或甘氨酸并且以不同時間間隔比較40℃下的聚集體水平。所有制劑開始時為大約1.3-1.4%的聚集體水平。

圖5顯示在以不同濃度丙氨酸或甘氨酸配制的API液體溶液在40℃孵育1周后的聚集體水平。隨著丙氨酸或者甘氨酸濃度的增加聚集體水平降低。圖6顯示2周時的聚集體水平。結果與1周時的數據一致。隨著丙氨酸或者甘氨酸濃度的增加聚集體水平降低。在3周和4周內的聚集也表明,隨著加入丙氨酸或甘氨酸的增加聚集更少(數據未顯示)。

實施例5

包含API的液體制劑的穩定性

還在40℃下開展在實施例1中所述的促進穩定性研究以確定氧清除劑對聚集的影響。因此,制備包含API(50mg/ml)和丙氨酸(0.25M)且還包含0.3%、0.5%、和0.7%甲硫氨酸的液體制劑。

圖7顯示在40℃下的聚集特性。甲硫氨酸抗聚集的作用是最小的。沒有觀察到聚集體水平顯著降低。

實施例6

包含API的液體制劑的穩定性

在包含100mM氯化鈉的20mM磷酸鈉緩沖液中得到包含α-1蛋白酶抑制劑(API)(從人血漿制備;65mg/ml效能)的本體溶液。使用超濾/滲濾(UF/DF)將該本體溶液(30L)透析進入磷酸鹽緩沖液(20mM,pH?7)中,其中使用240L的磷酸鹽緩沖液達到終點。然后加入氨基酸和/或其它成分并且調節最終蛋白質濃度至50mg/ml。最終的制劑溶液經0.22μm濾器過濾并且在層流通風櫥下填充。填充體積為20.0ml。將小瓶密封并標記。

制劑1包含250mM甘氨酸;制劑2包含250mM?L-丙氨酸;制劑3包含125mM?L-丙氨酸和4.2%蔗糖;并且制劑4包含100mM氯化鈉。對于每一制劑,API是50mg/ml并且緩沖液是20mM磷酸鈉緩沖液(單堿式和二堿式磷酸鹽七水合物的混合物)。對于凍干產物,開展額外的測定包括重構后的溶解時間/目視外觀以及塊水分。

分析樣品于5℃和25℃下的穩定性。對于每一制劑,最初(時間0)樣品開展下列測試:外觀、纖絲、效能、pH、SEC-HPLC、測量A280下的光吸收、濁度法(NTU)測量、通過毛細管區帶電泳(CZE)分析蛋白質組成、脫酰胺作用和動態光散射(DLS)。通過原子吸收分光光度法開展鈉的測定;通過離子層析開展蔗糖測定;濁度法:使用HACH比濁度計開展濁度測定;以及使用基于96-孔板的效能測定開展API的定量測定。

表3顯示來自最初分析性測試的結果。

表3:最初分析測試的結果

灰白色餅,無蛋白質顆粒,澄清,120(淺黃),溶解時間:1分鐘。

5℃穩定性數據:在5℃下,在3和6個月時在含丙氨酸/蔗糖的API制劑(制劑3)觀察到少量的纖絲。在任何其它制劑中對于任何時間點沒有記錄到纖絲。對于效能(圖8)、NTU(圖9)、pH、比活性(圖10)、DLS和脫酰胺作用測量(圖11),沒有觀察到顯著的變化。對于效能(BCS),最終容器精確度是5%。對于NTU和脫酰胺作用,中間精確度分別為3.0%和18.5%。所觀察到的差異在測定差異性之內。

尺寸排阻層析(SEC-HPLC)基于分子的流體力學體積將樣品中的蛋白質分離。在SEC-HPLC中,具有大的流體力學體積的分子與柱填充物具有最小(如果有的話)相互作用并且在柱的空隙體積時(V0)洗脫。具有較小的流體力學體積的分子與柱填充物相互作用更大并且在空隙體積之后洗脫。

根據穩定性數據,使用NaCl配制的API(制劑4)與其它制劑相比表現出稍微更高的聚集體水平,如通過SEC-HPLC所測定。在6個月時,NaCl(制劑4)、甘氨酸(制劑1)、丙氨酸(制劑2)和丙氨酸/蔗糖(制劑3)樣品中聚集體水平分別增加0.66%、0.58%、0.43%和0.42%(圖12和13);寡聚體峰似乎保持未變(圖14);并且單體水平分別降低0.87%、0.61%、0.57%和0.65%(圖15)。

25℃穩定性數據:在25℃下,在6個月時在所有制劑中沒有觀察到纖絲。對于效能(圖16)、pH和DLS觀察到小的變化。使用NaCl使NTU增加達到最大值7.88(圖17)。

在6個月的期間內所有制劑的比活性降低0.2-0.3(圖18)。這種降低源于A280吸光度的增加,在在6個月的期間內在所有制劑中其從25AU增加至大約28AU(圖19)。

脫酰胺作用可能在批量生產過程中發生,這可以解釋原材料中約6%的脫酰胺水平。脫酰胺作用在6個月內從6%的最初平均值增加至20%(圖19)。盡管制劑4表現出相對于其它制劑(約20%)稍低的脫酰胺水平(17%),但是該差異處于18.5%的測定差異性之內。

聚集體水平和寡聚體水平增加(圖21-23)。隨著時間的推移,單體水平降低(圖23)。單體水平的降低與聚集物和寡聚體增加總數相當。在6個月內,在制劑4、制劑1、制劑2、和制劑3中聚集體水平分別增加3.52%、3.12%、2.6%和2.25%(圖20)。

在于5℃孵育6個月后,對于效能、NTU、pH、比活性、DLS和脫酰胺作用測量沒有觀察到明顯的變化。存在聚集體水平的稍微增加(<1%)和單體水平的相應降低。這些結果顯示了API制劑在5℃下6個月的穩定性。

在于25℃孵育6個月后,在制劑4(即API加NaCl)中觀察到聚集體水平和NTU顯著增加。甘氨酸、丙氨酸以及丙氨酸/蔗糖降低聚集和NTU,其中丙氨酸/蔗糖是最有效的穩定劑。脫酰胺作用顯著增加。這些結果表明,包含API的液體制劑在25℃下經歷聚集作用和脫酰胺作用,并且氨基酸提供抗聚集的?;ぷ饔?。從在5℃下的聚集數據(圖13)進行的外推顯示,達到5%聚集物水平的預期時間對于制劑4為~25個月,對于制劑2為44個月,并且對于制劑3為51個月。因此預期氨基酸賦予顯著的蛋白質穩定性,并且相當大地提高了貨架期。

實施例7

包含API的液體制劑的熔點

開展DSC以測量多種API制劑的轉變中點(Tm),以便確定它們的熔點。

制備包含多種成分的含API(50mg/ml)的API制劑。簡言之,API溶液針對包含表4中所列每一成分的磷酸鹽緩沖液(20mM,pH7)透析。結果示于表4中。

表4:API制劑的熔點

??成分 ??濃度(mM) ??熔點(℃) ??_ ??0 ??61.54 ??丙氨酸 ??300 ??64.10 ??蘇氨酸 ??300 ??64.36 ??羥脯氨酸 ??300 ??64.07 ??甘氨酸 ??300 ??64.43 ??絲氨酸 ??300 ??64.37 ??蔗糖 ??300 ??64.29 ??谷氨酰胺 ??30 ??62.13 ??苯丙氨酸 ??30 ??62.02 ??色氨酸 ??30 ??61.26 ??甲硫氨酸 ??30 ??61.32 ??乙酰半胱氨酸 ??30 ??63.91 ??亮氨酸 ??30 ??62.24 ??異亮氨酸 ??30 ??62.50 ??纈氨酸 ??300 ??62.70 ??賴氨酸 ??30 ??63.61 ??精氨酸 ??300 ??62.88

API蛋白質在pH7磷酸鹽緩沖液中的熔點是61.54℃。熔點的增加可以充當API蛋白質構象穩定性增加的指示劑。

實施例8

pH和蛋白質濃度對包含API的液體制劑的影響

為了確定pH和蛋白質濃度對聚集的影響,在不同pH和蛋白質濃度制備的API溶液于40℃下孵育,并將聚集數據進行E-CHIP分析。通過測量280nm下的光吸收計算蛋白質濃度,其中A280/0.53對應于50mg/ml的濃度數值。對于表5中列出的實驗確定40℃下的聚集。

表5:關于pH和蛋白質濃度對API制劑聚集影響的研究

??試驗 ??API濃度(mg/ml) ??pH ??3 ??50 ??6.3 ??9A ??50 ??6.7 ??9B ??50 ??6.7 ??6 ??25 ??7.1 ??4 ??50 ??7.1 ??8 ??25 ??6.3 ??5 ??75 ??7.1 ??7 ??75 ??6.3 ??9C ??50 ??6.7 ??9D ??50 ??6.7 ??1 ??25 ??6.7 ??2 ??75 ??6.7 ??9E ??50 ??6.7

E-CHIP模型表明,對于50mg/ml?API,最小聚集的最適pH是6.9(圖24)。在pH?6.3下觀察到聚集并且在pH6.7和7.1下聚集體的量少得多(圖25)。隨著pH增加聚集降低并且在pH?6.9時達到最小值(圖26)。圖27顯示聚集幾乎隨著蛋白質濃度線性增加。

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