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巴塞罗那vs维戈塞尔塔比分预测: 小立碗蘚原絲體快速繁殖方法.pdf

摘要
申請專利號:

维戈塞尔塔vs皇家社会 www.vmyqew.com.cn CN201610772610.2

申請日:

20160830

公開號:

CN106359092B

公開日:

20181214

當前法律狀態:

有效性:

有效

法律詳情:
IPC分類號: A01H4/00 主分類號: A01H4/00
申請人: 中國科學院昆明植物研究所
發明人: 楊紅,李萍,劉莉,魯元學,章成君
地址: 650201 云南省昆明市藍黑路132號
優先權: CN201610772610A
專利代理機構: 昆明協立知識產權代理事務所(普通合伙) 代理人: 旃習涵
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法律狀態
申請(專利)號:

CN201610772610.2

授權公告號:

法律狀態公告日:

法律狀態類型:

摘要

本發明提供小立碗蘚原絲體快速繁殖方法,將生長5天的小立碗蘚原絲體材料經過機械打磨粉碎繼代,設置以BCD培養基為基礎培養基的不同鈣離子濃度的測試平板,經過打磨繼代后接種于各種不同濃度的CaCl2的BCD培養基平板上,進行生長狀態觀測,最終確定原絲體生長及分化狀態最佳的鈣離子濃度。本發明針對小立碗蘚的原絲體培養進行了培養及配方的改進實驗表明,在控制培養箱溫度為23℃,80μmol?photons?m?2s?1光強,16小時長日照下,5mM鈣離子濃度可獲得生長最旺盛、材料最多的植物原絲體,為后期原生質體制備及轉化重組實驗提供了技術基礎。

權利要求書

1.小立碗蘚原絲體快速繁殖方法,取小立碗蘚孢子,經過兩次植物組織快繁培養后,將繼代用的無菌培養小立碗蘚材料在23℃,16h光照,8h黑暗,光強80μmol·ms的培養箱中培養1周后,取其植株材料,經機械打磨粉碎后接種于BCD+CaCl的培養基平板中,CaCl濃度為5mM,置于23℃,16h光照,8h黑暗,光強80μmol·ms的培養箱中培養一周,期間定期顯微鏡進行原絲體生長狀態觀測,并進行原絲體生物量測量和分枝數統計;所述BCD培養基配方為:MgSO·7HO1μM,KHPO18.4μM,KNO10μM,FeSO·7HO45μM;CuSO.5HO0.22μM,HBO10μM,CoCl.6HO0.23μM,NaMoO·2HO0.1μM,ZnSO·7HO0.19μM,MnCl·4HO2μM,KI0.17μM,酒石酸銨5mM,瓊脂0.8%,121℃,20min滅菌。2.如權利要求1所述的小立碗蘚原絲體快速繁殖方法,其特征在于所述機器打磨是用勻漿儀打磨,采用10s/次、3次/材料打磨參數進行材料打磨與繼代快繁。3.如權利要求1所述的小立碗蘚原絲體快速繁殖方法,其特征在于所述小立碗蘚原絲體生長狀態觀測是采用光學顯微鏡及帶熒光通道的顯微鏡進行不同放大倍數下的原絲體生長狀態觀測,并每天拍照記錄,對比原絲體分枝及生長狀態。4.如權利要求1所述的小立碗蘚原絲體快速繁殖方法,其特征在于所述小立碗蘚原絲體生物量測量和分枝數統計是隨機挑選每個時間點每個濃度下不少于10個顯微照片,使用ImageJ測量生物量,統計分枝數,用student’st-test進行統計分析。

說明書

所屬領域

本發明屬于生物技術領域,具體涉及一種小立碗蘚原絲體組織培養快速繁殖方法,尤其涉及一種促進小立碗蘚原絲體快速大量繁殖的培養基。

背景技術

苔蘚是最古老的陸生植物之一,在進化地位上位于藻類之后、蕨類和種子植物之前,和微管植物屬于單起源系統上的姐妹進化支,具有極其重要的研究地位(Kidron,2014;曹同等,2014)。全世界約有21200種,遍布除海洋外的地球上每個角落,甚至生長于荒漠、凍原及巖石上,耐旱、耐寒、耐貧瘠,適應力極強,是大自然的先鋒與拓荒者(Kidron,2014;曹同等,2014)。

小立碗蘚是葫蘆蘚目(Funariales)葫蘆蘚科(Funariaceae)小立碗蘚屬(Physcomitrium)的蘚類。因其具有較高的核DNA同源重組率及較特殊的系統進化地位,已經成為研究植物功能基因組學等方面的模式植物。小立碗蘚是以單倍體世代占優勢的植物,作為基因組學研究模式系統主要是利用其原絲體階段進行原生質體制備及同源重組的外源基因轉化。以小立碗蘚為對象開展的基因組學和分子生物學研究發現,為適應陸地生活,小立碗蘚獲得耐干旱基因、耐高溫基因、感光基因、紫外修復基因等陸地脅迫響應基因(Rabara et al.,2013;Rensing et al.,2008)。此外,還具有易培養、生活周期短、基因組與外源基因具有極高的同源重組率、生活史中單倍體的配子體階段占優勢、基因敲除后突變表型易于觀察等獨特的研究優勢(Schaefer and1997)。而且由于其抗逆能力極強,能經歷長期脫水而迅速恢復再生,對于研究植物抗逆性形成機制和進化意義非常有價值(Hiss et al.,2014)。然而作為轉基因材料的主要來源原絲體的生長狀態和數量是限制轉基因效率的主要因素,現有技術的繁殖效率較低,急需改良方法來增加繁殖效率。

發明內容

本發明旨在提供一種小立碗蘚原絲體的組織培養方法,公開一種原絲體快速繁殖的培養基配方,為基因功能研究打下了基礎。該方法利用5mM終濃度的CaCl2與BCD完全培養基進行小立碗蘚的組織培養繁殖,使小立碗蘚原絲體在快繁3-5天分化效率最高,并在快繁5天仍能維持較高的繁殖效率。

為了實現本發明的上述目的,本發明提供了如下的技術方案:

小立碗蘚原絲體快速繁殖方法,取小立碗蘚孢子,經過兩次植物組織快繁培養后,將繼代用的無菌培養小立碗蘚材料在23℃,16h光照,8h黑暗,光強80μmol photons m-2s-1的培養箱中培養1周后,取其植株材料,經機械打磨粉碎后移液管接種于BCD+CaCl2的培養基平板中,設置0mM,1mM,3mM,5mM,10mM五種不同CaCl2濃度,置于23℃,16h光照,8h黑暗,光強80μmol photons m-2s-1的培養箱中培養一周,期間定期顯微鏡進行原絲體生長狀態觀測,并進行原絲體生物量測量和分枝數統計。

如所述的小立碗蘚原絲體快速繁殖方法,其中所述BCD培養基配方為:MgSO4.7H2O 1μM,KH2PO4 18.4μM,KNO3 10μM,FeSO4.7H2O 45μM;CuSO4.5H2O 0.22μM,H3BO3 10μM,CoCl2.6H2O0.23μM,Na2MoO4.2H2O 0.1μM,ZnSO4.7H2O 0.19μM,MnCl2.4H2O 2μM,KI 0.17μM,酒石酸銨5mM,瓊脂0.8%,121℃,20min滅菌。

如所述的小立碗蘚原絲體快速繁殖方法,其中所述的培養基中設置為含有5mMCaCl2濃度。

如所述的小立碗蘚原絲體快速繁殖方法,其中所述機器打磨是用勻漿儀打磨,采用10s/次,3次/材料打磨參數進行材料打磨與繼代快繁。

如所述的小立碗蘚原絲體快速繁殖方法,其中所述小立碗蘚原絲體生長狀態觀測是采用光學顯微鏡及帶熒光通道的顯微鏡進行不同放大倍數下的原絲體生長狀態觀測,并每天拍照記錄,對比原絲體分支及生長狀態。

如所述的小立碗蘚原絲體快速繁殖方法,其中所述小立碗蘚原絲體生物量測量和分枝數統計是隨機挑選每個時間點每個濃度下不少于10個顯微照片,使用ImageJ測量生物量,統計分枝數,用student’s t-test進行統計分析。

本發明的小立碗蘚組織培養快繁方法,是將繼代用的無菌培養小立碗蘚材料在23℃,16h光照,8h黑暗,光強80μmol photons m-2s-1的培養箱中培養1周左右,取其植株材料,經機械打磨粉碎后移液管接種于BCD+CaCl2的培養基平板中,設置0mM,1mM,3mM,5mM,10mM五種不同CaCl2濃度,置于23℃,16h光照,8h黑暗,光強80μmol photons m-2s-1的培養箱中培養一周左右。BCD培養基配方為:MgSO4.7H2O 1μM,KH2PO4 18.4μM,KNO3 10μM,FeSO4.7H2O 45μM;CuSO4.5H2O 0.22μM,H3BO3 10μM,CoCl2.6H2O 0.23μM,Na2MoO4.2H2O 0.1μM,ZnSO4.7H2O 0.19μM,MnCl2.4H2O 2μM,KI 0.17μM,酒石酸銨5mM,瓊脂0.8%,121℃,20min滅菌。培養條件為:23℃,16h光照,8h黑暗,光強80μmol photons m-2s-1的培養箱。小立碗蘚原絲體在5mM CaCl2濃度下,可以達到原絲體的最大量分枝生長,并在培養5天后依舊維持原絲體旺盛生長狀態。

與現有技術相比,本發明的原絲體的分枝數增加了3倍,生物量增加了1.6倍,極大的提高了后續作為轉基因材料的應用潛力。本發明通過培養材料的顯微觀測進行原絲體生長狀態的判斷及記錄。本發明方法的使用能以最適條件促進小立碗蘚原絲體的分枝及生長,在短時間內獲得最大量的小立碗蘚原絲體材料。

附圖說明:

圖1為本發明小立碗蘚原絲體生長狀態顯微鏡照片,從上至下對應機械粉碎繼代后生長1-6天;從左至右對應培養基中CaCl2濃度0mM,1mM,3mM,5mM,10mM;圖1為顯微鏡觀測目鏡16倍前提下,物鏡放大倍數20倍自然光下的原絲體生長形態;

圖2為不同鈣離子濃度梯度下原絲體生物量測量數;

圖3為不同鈣離子濃度梯度下原絲體分枝數鑒定統計數。

具體實施方式

下面結合附圖,用本發明的實施例來進一步說明本發明的實質性內容,但并不以此來限定本發明。

實施例1:

1.材料和方法:

1.1研究材料:

本發明使用材料為小立碗蘚(Physcomitrella patens)GD2004種,經過多代植物組織快繁培養保存在實驗室培養箱中。

1.2研究方法:

1.2.1實驗設計:將生長5天的小立碗蘚原絲體材料經過機械打磨粉碎繼代,設置以BCD培養基為基礎培養基的不同鈣離子濃度的測試平板,經過打磨繼代后接種于各種不同濃度的CaCl2的BCD培養基平板上,進行生長狀態觀測,最終確定原絲體生長及分化狀態最佳的鈣離子濃度。

1.2.2原絲體組織培養快繁技術:利用勻漿儀進行植物材料的機械打磨,將植物勻漿接種于培養基上,置于23℃,16h光照,8h黑暗,光強80μmol photons m-2s-1的培養箱,本發明使用勻漿儀為:IKA(ULTRA TURRAX Tube Drive),采用10s/次,3次/材料打磨參數進行材料打磨與繼代快繁。

1.2.3培養基設置:本發明利用BCD基礎培養基作為背景培養基,該培養基配方為:MgSO4.7H2O 1μM,KH2PO4 18.4μM,KNO3 10μM,FeSO4.7H2O 45μM;CuSO4.5H2O 0.22μM,H3BO310μM,CoCl2.6H2O 0.23μM,Na2MoO4.2H2O 0.1μM,ZnSO4.7H2O 0.19μM,MnCl2.4H2O2μM,KI 0.17μM,酒石酸銨5mM,瓊脂0.8%,121℃,20min滅菌。在該培養基基礎上進行0mM,1mM,3mM,5mM,10mM五種不同CaCl2濃度的設置。

1.2.4小立碗蘚原絲體生長狀態觀測:采用光學顯微鏡及帶熒光通道的顯微鏡進行不同放大倍數下的原絲體生長狀態觀測,并每天拍照記錄,對比原絲體分支及生長狀態。本發明使用顯微鏡為中國科學院昆明植物研究所生物技術平臺熒光顯微鏡,儀器型號:Leica DM5500B。

1.2.5小立碗蘚原絲體生物量測量和分枝數統計:隨機挑選每個時間點每個濃度下不少于10個顯微照片,使用ImageJ測量生物量,統計分枝數,用student’s t-test統計分析。

2.結果與分析

2.1不同鈣離子濃度下小立碗蘚原絲體形態:

小立碗蘚是單倍體占優勢的植物,其再生能力極強,經過植株材料的機械粉碎后無菌條件下接種培養基可進行大量繁殖。新生植物組織為小立碗蘚的原絲體形態,原絲體為在培養基表面匍匐生長,通過不斷地細胞分枝及細胞延長獲得生物量的增加。功能基因組學的研究一般是利用原絲體生長狀態的小立碗蘚進行原生質體的制備,進一步進行基因轉化。分枝越多和生物量越大是制備原生質體的最佳條件。我們利用顯微觀測的方式進行不同鈣離子濃度下小立碗蘚原絲體生長狀態觀測,依據同一視野下新生細胞分支判斷植物材料的活力及原絲體的生長狀態,發現0mM和10mM生長最緩慢,主枝延生,但基本上不新生分枝,在5mM鈣離子濃度下,小立碗蘚原絲體分枝及活力最為旺盛(圖1,箭頭顯示新生分枝)。標尺=100μm。

2.2不同鈣離子濃度下小立碗蘚原絲體生物量

統計結果顯示,置于23℃,16h光照,8h黑暗,光強80μmol photons m-2s-1的培養箱中時,在5mM鈣離子濃度下,小立碗蘚原絲體的生物量最高(圖2)。星號顯示t-test檢測5mM鈣離子濃度生物量與其他鈣離子濃度生物量在p<0.01水平上的顯著性差異;數據表示為平均值±標準誤,n≧10。

2.3不同鈣離子濃度下小立碗蘚原絲體分枝數統計

計數每一種培養下新生分枝或側枝數,發現0mM和10mM生長最緩慢,主枝延生,但基本上不新生分枝,在5mM鈣離子濃度下,小立碗蘚原絲體分枝最多(圖3)。星號顯示t-test檢測在5mM鈣離子濃度分枝數與其他鈣離子濃度分枝數p<0.01水平上的顯著性差異;數據表示為平均值±標準誤,n≧10。

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