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塞维利亚对维戈塞尔塔: 關節護理組合物.pdf

摘要
申請專利號:

维戈塞尔塔vs皇家社会 www.vmyqew.com.cn CN201480034375.8

申請日:

20140514

公開號:

CN105431159A

公開日:

20160323

當前法律狀態:

有效性:

審查中

法律詳情:
IPC分類號: A61K36/82,A61K38/00,A61K45/06,A61K31/05,A61K31/353,A61P19/02 主分類號: A61K36/82,A61K38/00,A61K45/06,A61K31/05,A61K31/353,A61P19/02
申請人: 馬斯公司
發明人: S·塞里西耶,F·孔布萊恩,Y·昂羅廷
地址: 美國弗吉尼亞州
優先權: 13305609.3,13305615.0
專利代理機構: 北京市路盛律師事務所 代理人: 馮云;李宓
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法律狀態
申請(專利)號:

CN201480034375.8

授權公告號:

法律狀態公告日:

法律狀態類型:

摘要

本發明涉及一種用于預防或治療骨關節炎用途的組合物,所述組合物包含姜黃色素與綠茶多酚,或與甘氨酸、脯氨酸和羥脯氨酸的組合。本發明還涉及一種在哺乳動物中預防或治療骨關節炎的方法,所述方法包括對所述哺乳動物給藥一種組合物,所述組合物包含姜黃色素與綠茶多酚,或它們與甘氨酸、脯氨酸和羥脯氨酸的組合。

權利要求書

1.一種用于預防和/或治療骨關節炎用途的組合物,所述組合物包含姜黃色素與綠茶多酚,以及與甘氨酸、脯氨酸和羥脯氨酸的組合。2.如權利要求1所述用途的組合物,其中,所述預防和/或治療是用于人類或者如貓、犬或馬的寵物伴侶。3.如權利要求1-2中任一項所述用途的組合物,其中,所述甘氨酸、脯氨酸和羥脯氨酸的組合是水解膠原。4.如權利要求1-3中任一項所述用途的組合物,其中,所述姜黃色素是姜黃素。5.如權利要求1-4中任一項所述用途的組合物,其中,所述組合物是以食料的形式。6.如權利要求1-5中任一項所述用途的組合物,其中,所述姜黃色素以干物質為基礎以約0.005%至1.1%的量存在。7.如權利要求1-6中任一項所述用途的組合物,其中,所述綠茶多酚以干物質為基礎以約0.01%至1.1%的量存在。8.如權利要求1-7中任一項所述用途的組合物,其中,所述甘氨酸、脯氨酸和羥脯氨酸的組合以干物質為基礎以約0.5%至10%的量存在。9.如權利要求1-8中任一項所述用途的組合物,其中,所述姜黃色素是姜黃素,并以干物質為基礎以約0.005%至0.15%的量存在。10.一種預防或治療哺乳動物中的骨關節炎的方法,所述方法包括對所述哺乳動物給藥一種組合物的步驟,所述組合物包含姜黃色素與綠茶多酚以及與甘氨酸、脯氨酸和羥脯氨酸的組合。11.如權利要求10所述的方法,其中所述哺乳動物是人類或者如貓、犬或馬的寵物伴侶。12.如權利要求10-11中任一項所述的方法,其中所述甘氨酸、脯氨酸和羥脯氨酸的組合是水解膠原。13.如權利要求10-12中任一項所述的方法,其中所述姜黃色素是姜黃素。14.如權利要求10-13中任一項所述的方法,其中所述組合物是以食料的形式。15.如權利要求10-14中任一項所述的方法,其中,所述姜黃色素以干物質為基礎以約0.005%至1.1%的量存在。16.如權利要求10-15中任一項所述的方法,其中,所述綠茶多酚以干物質為基礎以約0.01%至1.1%的量存在。17.如權利要求10-16中任一項所述的方法,其中,所述甘氨酸、脯氨酸和羥脯氨酸的組合以干物質為基礎以約0.5%至10%的量存在。18.如權利要求10-17中任一項所述的方法,其中,所述姜黃色素是姜黃素,并以干物質為基礎以0.005%至0.15%的量存在。19.一種組合物,所述組合物包含姜黃色素、綠茶多酚以及甘氨酸、脯氨酸和羥脯氨酸的組合。20.如權利要求19所述的組合物,其中,所述甘氨酸、脯氨酸和羥脯氨酸的組合是水解膠原。21.如權利要求19或20所述的組合物,其中,所述姜黃色素是姜黃素。22.如權利要求19-21中任一項所述組合物,其中,所述組合物是以食料的形式。23.如權利要求19-22中任一項所述的組合物,其中,所述姜黃色素以干物質為基礎以約0.005%至1.1%的量存在。24.如權利要求19-23中任一項所述的組合物,其中,所述綠茶多酚以干物質為基礎以約0.01%至1.1%的量存在。25.如權利要求19-24中任一項所述的組合物,其中,所述甘氨酸、脯氨酸和羥脯氨酸的組合以干物質為基礎以約0.5%至10%的量存在。26.如權利要求19-25中任一項所述的組合物,其中,所述姜黃色素是姜黃素,并以干物質為基礎以約0.005%至0.15%的量存在。27.一種制備權利要求19-26中任一項所述的組合物的方法,所述方法包括將配料混合在一起,并任選地以適合組合物和給藥的形式呈現混合物。28.如權利要求27所述的方法,其中,將所述組合物以噴霧、涂層或淀粉囊基質的形式添加至混合物中。29.權利要求19-26中任一項所述的組合物用在藥物中的用途。

說明書

本發明涉及一種用于預防或治療骨關節炎用途的組合物,其包含姜黃色素(curcuminoid)與綠茶多酚,或與甘氨酸、脯氨酸和羥脯氨酸的組合。本發明還涉及一種在哺乳動物中預防或治療骨關節炎的方法,所述方法包括對所述哺乳動物給藥一種組合物,所述組合物包含姜黃色素與綠茶多酚,或與甘氨酸、脯氨酸和羥脯氨酸的組合。

軟骨退化可由幾種原因引起,如反復運動、關節的不穩定性等,其可能導致關節的炎癥。雖然較大部分患有關節炎的人類具有類風濕性關節炎,但是發生在伴侶動物中的大部分關節炎是骨關節炎。

現今,對骨關節炎的治愈并不存在,并且藥物治療限于減輕癥狀。最常用的是非甾體抗炎藥,但是這些藥物與不良反應相關。較安全的治療是所期望的。

本發明的第一方面涉及一種用于預防或治療骨關節炎用途的組合物,其包含姜黃色素與綠茶多酚,或與甘氨酸、脯氨酸和羥脯氨酸的組合。治療骨關節炎包括減輕骨關節炎的癥狀。

本發明對于所有方面涉及任何哺乳動物,包括人類。具體而言,本發明涉及患有或易于患有骨關節炎的伴侶動物,如犬、貓或馬科動物(例如馬)或任何其它這種動物。

本發明的組合物包含姜黃色素。姜黃色素(curcuminoid)是姜黃素(curcumin)或姜黃素的衍生物。多種姜黃色素的化學結構在它們官能團上存在不同。

姜黃色素包括姜黃素、去甲氧基姜黃素(demethoxycurcumin)、雙去甲氧基姜黃素(bis-methoxycurcumin)和/或四氫姜黃素(tetrahydrocurcumin)。

姜黃色素是天然酚類,其特別存在于印度香料姜黃(turmeric)中。姜黃來源于植物姜黃(Curcumalonga)的根。姜黃色素還存在于姜科(Zingiberaceae)姜黃屬(Curcumagenus)植物的其它種的根中。姜黃色素明顯具有土味、苦味、辛辣味和芥末的氣味。

具體而言,姜黃含有60-80%姜黃素、15-30%去甲氧基姜黃素和2-6%雙去甲氧基姜黃素。

本發明的組合物中的姜黃色素可以是任何形式的,包括粉末或脂質提取物。

在一些實施方案中,姜黃色素可以與磷脂和/或纖維素、淀粉或其衍生物混合,以形成復合物。這可以有助于穩定性和/或進一步增加姜黃色素的溶解性和生物利用度。

姜黃色素可以與精油(essentialoils)、胡椒堿或菠蘿蛋白酶混合。姜黃色素可以與磷脂酰膽堿例如卵磷脂混合。

優選地,本發明的姜黃色素是姜黃素,其是最具活性的姜黃色素。根據本發明的姜黃素包括去甲氧基姜黃素、雙去甲氧基姜黃素和/或四氫姜黃素。

本發明的組合物包含姜黃色素和綠茶多酚。

茶(茶樹(Camelliasinensis)),特別是綠茶,具有高含量的類黃酮,包括多酚,特別是兒茶精類(catechins)。茶中的兒茶精類包括表沒食子酸兒茶素-3-沒食子酸酯(epigallocatechin-3-gallate,EGCG)、表兒茶素(epicatechin,EC)、表兒茶素-3-沒食子酸酯(epicatechin-3-gallate,ECG)、表沒食子酸兒茶素(epigallocatechin,EGC)、兒茶素和沒食子兒茶素(gallocatechin,GC)。

優選地,綠茶多酚包括兒茶素。優選地,兒茶素包括EGCG。綠茶提取物通常含有至少約25%多酚、約12.5%兒茶精類和約9.3%EGCG。

表沒食子酸兒茶素沒食子酸酯(epigallocatechingallate,EGCG)是表沒食子酸兒茶素和沒食子酸的酯。EGCG是茶中最豐富的兒茶素并且是強抗氧化劑。其特別存在于綠茶中。EGCG是主要的綠茶多酚并顯示抗氧化、抗腫瘤和抗誘變活性。

本發明的組合物包含姜黃素以及甘氨酸、脯氨酸和羥脯氨酸的組合。

甘氨酸、脯氨酸和羥脯氨酸的組合占水解膠原的總氨基酸含量的50%。優選地,甘氨酸、脯氨酸和羥脯氨酸的組合是水解膠原。水解膠原的氨基酸組成列于下表中:

表1

氨基酸 百分比 脯氨酸/羥脯氨酸 25% 甘氨酸 20% 谷氨酸 11% 精氨酸 8% 丙氨酸 8% 其它必需氨基酸 16% 其它非必需氨基酸 12%

水解膠原是通過存在于動物如牛、魚、馬、豬和兔的骨、皮(skin)和結蹄組織中的膠原組織的酶法水解獲得。水解膠原是好消化的,并優先積累在軟骨中。

優選的組合物包括姜黃色素、綠茶多酚以及甘氨酸、脯氨酸和羥脯氨酸的組合。優選地,該組合物包括姜黃素、綠茶多酚和水解膠原。

本發明優選地是食料。其可以是任何食料,如干食品、半潮濕食品或濕食品。特別是,所述食料可以是寵物食品。

寵物食料優選地是商品化的寵物食品。這種產品優選作為用于喂給寵物動物特別是寵物貓或寵物犬的產品而售賣。

典型的寵物食料含有約20-30%粗蛋白和約10-20%脂肪,余量為碳水化合物,包括膳食纖維和灰分。典型的濕或潮濕產品包含(以干物質為基礎):約40%脂肪、50%蛋白質和余量的纖維和灰分。本發明的食料可以是干產品(具有約5%至約15%水分)、半潮濕產品(具有約15%至約70%水分)或濕產品(具有約70%至約90%水分)。

食料的剩余組分對本發明不是必需的,并且典型的標準產品可以被包括在內。根據本發明的食料的組合成分可提供針對所討論的特定動物的所有建議的維生素和礦物質(完全且均衡的食物)。

根據本發明的食料包括寵物在其飲食中消耗的任何產品。因此,本發明涵蓋了標準食品,包括液體,以及寵物食物點心(snacks)(例如,點心棒(snackbar)、寵物咀嚼物、松脆零食、谷物棒(cerealbar)、點心(snacks)、餅干和甜味產品)和補充劑。

食料可以作為食物補充劑提供。食物補充劑可以是可與其它食料或不與其它食料一同給予的粉末、調味汁、頂料(topping)、餅干、粗粒物(kibble)、囊(pocket)或小塊(tablet)。當食物補充劑與其它食料一同給予時,食物補充劑可以順序地同時或分開給予。食物補充劑可以與食料混合、撒在食料上或分開食用?;蛘?,可將食物補充劑加入為飲用而提供的液體如水或奶中。

食料優選地是熟食(cookedfood)。其可以包括肉或動物來源的材料(如牛肉、雞肉、火雞肉、羔羊肉、魚肉、血漿、髓性骨(marrowbone)等,或它們的一種或多種)。該產品或者可以是不含肉的(優選地包括肉替代物,如大豆、玉米麩質或大豆制品),以便提供蛋白質源。食料可以含有其它蛋白質源,如大豆蛋白濃縮物、奶蛋白、麩質等。食料還可以含有淀粉源,如一種或多種谷物(例如小麥、玉米、大米、燕麥、大麥等),或者可以是無淀粉的。

本發明的食料優選地生產成含有約5%至約15%水分的干產品。優選的干食物更優選地以小餅干-樣粗粒物出現。

下表具體描述了根據本發明的組合物的量和根據本發明的為犬食用的組合物的量:

表2

在本發明的第一方面中的組合物可以包含姜黃色素,按食物的“現狀(asis)”重量百分比以姜黃色素的重量計,其量的范圍為約0.005%至1.1%。姜黃色素的量可以是0.005%至1.1%(現狀)的任意量。姜黃色素的量可以是0.1%至1%(現狀)的任意量。姜黃色素的量可以是0.1%至0.6%(現狀)的任意量。姜黃色素的量可以是0.3%至0.6%(現狀)的任意量。

在本發明的第一方面中的組合物可以包含姜黃色素,按食物的“現狀”重量百分比以姜黃色素的重量計,其量的范圍為約0.005%至0.15%。姜黃色素的量可以是0.005%至0.15%(現狀)(7至99mg/400kcal)的任意量。

當食物是干的時,“現狀”重量與“干物質重量”相同。

優選地,姜黃色素在組合物中的量的范圍是約0.01%至0.07%(現狀)(14至46mg/400kcal)。更優選地,姜黃色素的量是0.035%(現狀)(36mg/400kcal)。

在一些實施方案中,組合物中的姜黃色素是姜黃素,姜黃素的量按食物的“現狀”重量百分比以姜黃素的重量計范圍為約0.005%至0.15%。姜黃素的量可以是0.005%至0.15%(現狀)(7至99mg/400kcal)的任意量。優選地,姜黃素的量的范圍是約0.01%至0.05%(現狀)(14至32mg/400kcal)。最優選地,姜黃素的量是0.026%(現狀)(27mg/400kcal)。

在本發明的第一方面中的組合物可以包含綠茶多酚,按食物的“現狀”重量百分比以綠茶多酚的重量計,其量的范圍為約0.01%至1.1%。綠茶多酚的量可以是0.01%至1.1%(現狀)的任意量。綠茶多酚的量可以是0.1%至1%(現狀)的任意量。綠茶多酚的量可以是0.1%至0.6%(現狀)的任意量。綠茶多酚的量可以是0.3%至0.6%(現狀)的任意量。

在本發明的第一方面中的組合物可以包含綠茶多酚,按食物的“現狀”重量百分比以綠茶多酚的重量計,其量的范圍為約0.01%至0.3%。綠茶多酚的量可以是0.01%至0.3%(現狀)(14至197mg/400kcal)的任意量。優選地,綠茶多酚的量的范圍是約0.03%至0.17%(現狀)(43至113mg/400kcal)。最優選地,綠茶多酚的量是0.085%(現狀)(87mg/400kcal)。

在一些實施方案中,綠茶多酚是EGCG,EGCG的量按食物的“現狀”重量百分比以EGCG的重量計范圍為約0.005%至0.2%。EGCG的量可以是0.01%至0.06%(現狀)(14至39mg/400kcal)的任意量。最優選地,EGCG的量是0.032%(現狀)(33mg/400kcal)。

在本發明的第一方面中的組合物可以包含甘氨酸、脯氨酸和羥脯氨酸的組合,按食物的“現狀”重量百分比以組合的甘氨酸、脯氨酸和羥脯氨酸的重量計,其量的范圍為約0.5%至10%。組合的甘氨酸、脯氨酸和羥脯氨酸的量可以是0.5%至10%(現狀)(720至6591mg/400kcal)的任意量。優選地,組合的甘氨酸、脯氨酸和羥脯氨酸的量的范圍是約1.2%至5%(現狀)(1736至3295mg/400kcal)。最優選地,組合的甘氨酸、脯氨酸和羥脯氨酸的量是2.7%(現狀)(2780mg/400kcal)。

在一些實施方案中,甘氨酸、脯氨酸和羥脯氨酸的組合是水解膠原,按食物的“現狀”重量百分比以組合的甘氨酸、脯氨酸和羥脯氨酸的重量計,其量的范圍是約0.5%至5%。水解膠原的量可以是0.5%至5%(現狀)(720至3295mg/400kcal)的任意量。優選地,水解膠原的量的范圍是約0.7%至3.2%(現狀)(1016至2138mg/400kcal)。最優選地,水解膠原的量是1.7%(現狀)(1750mg/400kcal)。

在其它實施方案中,組合物可包含約27mg/400kcal(35mg/400kcal的姜黃色素)的姜黃素和約87mg/400kcal的綠茶多酚以及約2757mg/400kcal的組合的甘氨酸、脯氨酸和羥脯氨酸,其中,甘氨酸、脯氨酸和羥脯氨酸的組合是水解膠原。優選地,其中甘氨酸、脯氨酸和羥脯氨酸的組合是水解膠原,且在組合物中存在的量為約1747mg/400kcal。

在其它實施方案中,組合物可包含約33mg/400kcal的姜黃素(43mg/400kcal的姜黃色素)和約106mg/400kcal的綠茶多酚以及約3295mg/400kcal的組合的甘氨酸、脯氨酸和羥脯氨酸,其中,甘氨酸、脯氨酸和羥脯氨酸的組合是水解膠原。優選地,其中甘氨酸、脯氨酸和羥脯氨酸的組合是水解膠原,且在組合物中存在的量為約2108mg/400kcal。

在其它實施方案中,組合物可包含約15mg/400kcal的姜黃素(22mg/400kcal的姜黃色素)和約51mg/400kcal的綠茶多酚以及約1736mg/400kcal的組合的甘氨酸、脯氨酸和羥脯氨酸,其中,甘氨酸、脯氨酸和羥脯氨酸的組合是水解膠原。優選地,其中甘氨酸、脯氨酸和羥脯氨酸的組合是水解膠原,且在組合物中存在的量為約1016mg/400kcal。

這些值適用于喂給哺乳動物、特別是伴侶動物的組合物。

本發明的第二方面涉及一種預防或治療哺乳動物中的骨關節炎的方法。

骨關節炎(OA)是影響哺乳動物中的關節的退行性且炎性的病癥。其也被稱為退行性關節炎或退行性關節疾病。骨關節炎是一類涉及關節包括關節軟骨和軟骨下骨的退化的異常。

骨關節炎是分解代謝和合成代謝的不平衡的結果,其中,分解代謝增加;合成代謝降低,導致軟骨細胞的炎癥。軟骨細胞是健康軟骨中僅存的細胞。它們產生并維持軟骨基質,軟骨基質主要由膠原和蛋白聚糖組成。本發明的組合物已證明在體外炎癥誘導的軟骨細胞和體內健康軟骨細胞中提供了尤其是減少的炎癥、降低的分解代謝和增加的合成代謝。因此本發明的組合物預防和/或治療動物中的骨關節炎。

本發明對于所有方面涉及任何哺乳動物,包括人類。具體而言,本發明涉及患有或易于患有骨關節炎的伴侶動物,如犬、貓或馬科動物(例如馬)或任何其它這種動物。

具體而言,在寵物食料和伴侶動物健康領域中所期望的是提供包括適合支持伴侶動物的健康的補充劑。具體而言,期望的是提供適合促進或維持已經健康的伴侶動物的健康的飲食。

具體而言,本發明的第二方面提供一種用于預防和治療哺乳動物、特別是伴侶動物中的骨關節炎的方法,包括減輕骨關節炎的癥狀。所述方法包括給予所述動物一種組合物,所述組合物包含姜黃素與綠茶多酚,或與甘氨酸、脯氨酸和羥脯氨酸的組合。所述動物可能是需要該組合物的。因為顯著數量的犬在其一生中患有骨關節炎,因此所有犬可被認為需要預防。

在具體實施方案中,所述方法包括給予所述動物一種組合物,所述組合物包括姜黃素、綠茶多酚以及甘氨酸、脯氨酸和羥脯氨酸的組合。更優選地,所述甘氨酸、脯氨酸和羥脯氨酸的組合是水解膠原。

并且,所述方法優選地給藥至患有骨關節炎和需要減輕骨關節炎的癥狀或需要進一步預防骨關節炎的癥狀或需要治療骨關節炎的動物,特別是伴侶動物。這可以施用于例如幼年寵物動物,如幼犬,或大齡伴侶動物。在組合物是食料的情況下,食料可按照伴侶動物平時的飲食方案(dietaryregime)而被給予至飲食方案中。根據所需的預防或治療的水平,食料可包括100%的伴侶動物的飲食,或少于該比例。食料允許容易地給藥組合物,由此避免補充伴侶動物的食物的需要。此外,食料可通過動物的主人給予,由此避免持續的獸醫監督。食料可以從售賣寵物食品的任何零售商店(outlet)獲得,或者從獸醫處獲得。食料可以是根據本發明的第一方面的如上所述的食料。

本文使用的“給藥”還包括喂食或任何其它的口服給藥方法。給藥的其它方式還包括片劑、膠囊、注射、栓劑或任何其它適合的方式。

本發明的第二方面的優選特征在進行必要的變化的情況下適用于第一方面。

本發明包括用于制備本發明的第一方面的組合物的方法。

食料可通過本領域中的例如帕加馬牛津出版社出版的由ATB埃德尼編輯、A·瑞博德分章節的犬與貓的營養叢書中第57-74頁中的標題為“平衡飲食”的文章(WalthamBookofDogandCatNutrition,Ed.ATBEdney,ChapterbyA.Rainbird,entitled"ABalancedDiet"onpages57to74,PergamonPressOxford)中的任何已知的方法制成。

例如,本文所限定的用于制造食料的方法包括將配料與組合物混合在一起,所述組合物包含姜黃色素與綠茶多酚或與甘氨酸、脯氨酸和羥脯氨酸的組合物,并形成食料,特別是寵物食料。在混合之前、之中或之后,可將加熱/烹調應用于任意一種或多種配料。

組合物可被噴灑在食料上,與食料混合或摻入基質中的食料中。將組合物包含在內的方法是本領域中已知的。

本發明的重要性在于姜黃色素與綠茶多酚或與甘氨酸、脯氨酸和羥脯氨酸的組合(任選地作為水解膠原)的有益性質。特別是,可觀察到比累加效應更大的效果。

對于姜黃色素、綠茶多酚以及甘氨酸、脯氨酸和羥脯氨酸(任選地作為水解膠原)的三重成分組合,觀察到了進一步的益處。

本發明的組合物的化合物的組合在降低炎癥、降低分解代謝和提高合成代謝中的一個或多個方面上可提供協同效應。

現通過參考以下實施例進一步描述本發明,這些實施例僅出于說明的目的提供,不應視為限制本發明。

實施例1:化合物的單獨篩選

進行實驗以評價幾種化合物對牛軟骨細胞的原代培養(primaryculture)的作用,其中,通過白細胞介素-1β誘導炎癥和分解代謝過程,以模擬關節炎軟骨細胞的作用。

下表具體描述了貫穿整個實驗中測定的生物標記,以示出化合物對軟骨細胞上的三種代謝途徑的作用。

表3:檢測的生物標記

單層牛軟骨細胞的原代培養

從1歲至2歲的死后不久的公牛的掌指關節(metacarpal-phalangealjoint)獲得正常的牛關節軟骨。全厚(full-depth)關節軟骨被切除并浸入補充有N-(2-羥乙基)哌嗪-N’-(2-乙磺酸)(HEPES)10mM、青霉素(100U/ml)和鏈霉素(0.1mg/ml)(均來自龍沙(Lonza)韋爾維耶,比利時)的達爾伯克氏改良伊格爾培養基(Dulbecco’sModifiedEagleMedium,DMEM)(含酚紅和4.5g/L葡萄糖)中。在三次洗滌后,通過在37℃下用0.5mg/ml透明質酸酶IVS型(西格瑪-奧德里奇(Sigma-Aldrich),博爾內姆,比利時)進行30min,在37℃下用1mg/ml鏈霉蛋白酶E(默克,魯汶(Leuven),比利時)進行1h和在37℃下用0.5mg/ml梭菌膠原酶(clostridialcollagenase)IA(西格瑪-奧德里奇,博爾內姆,比利時)進行16h至20h的連續的酶消化從軟骨中釋放出軟骨細胞。然后將酶解分離的細胞通過尼龍網(70μm)過濾,洗滌三次,計數并填充至DMEM(含酚紅和4.5g/L葡萄糖)的0.25x106個細胞/ml的密度,所述DMEM補充有10%胎牛血清、10mMHEPES、100U/ml青霉素、0.1mg/ml鏈霉素、2mM谷氨酰胺(均來自龍沙,韋爾維耶,比利時)和20μg/ml脯氨酸(西格瑪-奧德里奇,博爾內姆,比利時)。通過加入2ml的前述培養基/孔,將細胞以0.5X106個細胞/孔接種于6孔板中并以單層培養5天。然后,在補充有1%胎牛血清、10mMHEPES、100U/ml青霉素、0.1mg/ml鏈霉素、2mM谷氨酰胺和20μg/ml脯氨酸的DMEM(無酚紅并僅含有1g/L葡萄糖)(龍沙,韋爾維耶,比利時),以單層培養軟骨細胞直到匯合(confluence)(進行約2天)。僅使用原代培養物以確保軟骨細胞表型的穩定性。

當細胞實現匯合時,去除培養基并由新鮮培養基(補充有1%胎牛血清、10mMHEPES、100U/ml青霉素、0.1mg/ml鏈霉素、2mM谷氨酰胺和20μg/ml脯氨酸的無酚紅且僅含有1g/L葡萄糖的DMEM)替換,所述新鮮培養基含有一些營養物質(nutraceuticals)(其中的每一種為12.5μg/ml)并且無或有重組豬IL-1β(10-11M)(RD系統,阿賓頓,UK)。

通過測量軟骨細胞的生存力(viability)和PGE2與NO的產生來測試化合物的抗炎效力(首先單獨測試,然后組合測試)。

將化合物或者在炎癥前(預防效果測定)或者在炎癥同時(治療效果測定)加入培養基中。

篩選的化合物的列表:

1)魚油:18%EPA+10%DHA(DSM)

2)EPA99%(西格瑪(Sigma))

3)DHA99%(西格瑪)

4)蘆薈(納圖瑞克斯(Naturex))

5)蕁麻葉提取物(納圖瑞克斯)

6)高純度反式白藜蘆醇(Resvida):99%白藜蘆醇(Resvératrol)(DSM)

7)綠茶提取物:25%多酚,其中12.5%是兒茶素(catéchines),8%是EGCG(納圖瑞克斯)

8)松樹皮提取物:碧蘿芷(Pycnogenol):65%-75%原花青素(procyanidines)(碧歐藍德(Biolandes))

9)維生素預混料,包括維生素D3

10)GLM(阿若馬NZ(AromaNZ))

11)膠原水解物(富迪格嘉利達(FortigeldeGelita)[3.3kDa]:水解豬肉膠原)

12)ASU(索齊姆(Sochim))

13)姜黃粉:85%姜黃色素(納圖瑞克斯)

結果顯示,使用的3種化合物為姜黃提取物、水解膠原和綠茶提取物,其顯示出針對不同參數的顯著效果。之后,對這3種化合物的反應-劑量進行測試。

實施例2:劑量反應

按照實施例1的方法進行。根據分子重量,測試4個不同濃度:0.5μg/ml、2.5μg/ml、12.5μg/ml和62.5μg/ml,以覆蓋對應于10-5M的濃度范圍。

結果顯示,對于每個化合物,給出最佳效果且沒有給出毒性作用的濃度是12.5μg/ml。這是12.5μg/ml的濃度相互組合地被用于測試化合物的原因。

實施例3:測試化合物的特定組合和協同效應

進行實施例1的方法。

化合物的補充

當細胞實現匯合時,去除培養基并由新鮮培養基(補充有1%胎牛血清、10mMHEPES、100U/ml青霉素、0.1mg/ml鏈霉素、2mM谷氨酰胺和20μg/ml脯氨酸的無酚紅且僅含有1g/L葡萄糖的DMEM)替換,所述新鮮培養基含有一些化合物(其中的每一種為12.5μg/ml)并且無或有重組豬IL-1β(10-11M)(RD系統,阿賓頓,UK)。測試了三種化合物,即姜黃提取物(納圖瑞克斯,阿維尼翁,法國)、水解膠原(嘉利達,埃貝爾巴赫,德國)和綠茶提取物(納圖瑞克斯,阿維尼翁,法國)。姜黃提取物制備成12.5mg/ml在四氫呋喃(默克,魯汶,比利時)中的溶液,然后在細胞培養基中進一步稀釋1000倍。將水解膠原和綠茶提取物以12.5mg/ml的濃度溶解于水中,通過無菌網(0.20μm)過濾,然后在細胞培養基中進一步稀釋1000倍。在無或有重組豬IL-1β(10-11M)時,在12.5μg/ml的終濃度下化合物得到單獨測試,或者組合測試(12.5μg/ml姜黃提取物+12.5μg/ml水解膠原;12.5μg/ml姜黃提取物+12.5μg/ml綠茶提取物;12.5μg/ml姜黃提取物+12.5μg/ml水解膠原+12.5μg/ml綠茶提取物)。將化合物的效果與對照(僅DMEM或DMEM+IL-1β)進行對比。

培養停止

在這些條件下培養24h后,收集每種條件的三個孔的條件培養基,并在-20℃下儲存。解體這些對應的孔的細胞,使用RNeasy迷你試劑盒(RNeasyminikit)(凱杰(Qiagen),芬洛,荷蘭)進行RNA提取,使用LightCycler480(羅氏(Roche),韋爾維耶,比利時)實施逆轉錄酶聚合酶鏈反應(areversetranscriptasepolymerasechainreaction),然后實施定量實時聚合酶鏈反應(aquantitativerealtimepolymerasechainreaction),以分析基因表達。

在這些條件下培養48h后,收集剩余孔(每種條件三個孔)的條件培養基(乳酸脫氫酶釋放試驗),并在-20℃下儲存,直到進行分析(亞硝酸鹽和前列腺素E2試驗)。解體細胞,并通過在4℃下超聲解離20s在500μlTris-HCl緩沖液中均質化,以測定DNA含量。

乳酸脫氫酶釋放試驗

通過在培養上清液中定量乳酸脫氫酶(LDH)的釋放來估計細胞生存力。將100μl上清液樣品或標準溶液(來自兔肌肉的LDH)的稀釋液與含有800nM乳酸鹽的50μlTris緩沖液(10mMTris-HCl(pH8.5)、0.1%牛血清白蛋白)混合。然后加入50μl比色試劑、1.6mg/ml碘硝基氯化四氮唑藍(iodonitrotetrazoliumchloride)(西格瑪-奧德里奇,博爾內姆,比利時)、4mg/ml煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(羅氏診斷(RocheDiagnostics),布魯塞爾,比利時)和0.4mg/ml吩嗪硫酸甲酯(西格瑪-奧德里奇,博爾內姆,比利時),在室溫下孵育10min后讀取492nm下的吸光度。

DNA試驗

通過在4℃下超聲解離15s在500μlTris-HCl緩沖液中使軟骨細胞均化。使用赫斯特(Hoechst)熒光法在細胞提取液中測定DNA含量。

亞硝酸鹽試驗

基于格里斯反應(Griessreaction)使用分光光度法在培養上清液中,通過定量一氧化氮的衍生產物亞硝酸鹽來測定一氧化氮(NO)的產生量。簡言之,將100μl上清液或亞硝酸鈉(NaNO2)標準稀釋液與100μl格里斯試劑(Griessreagent)(0.5%磺胺、0.05%萘基乙二胺二鹽酸鹽、2.5%H3PO4)混合。測定在540nm處的吸收。NO的產生量由每毫克DNA表示。

PGE2試驗

使用DetectXPGE2高靈敏度免疫試劑盒(DetectXPGE2HighSensitivityImmunoassaykit)(阿伯試驗(ArborAssays),密歇根州,美國)在培養上清液中測定前列腺素E2(PGE2)的產生量。簡言之,將100μl上清液或PGE2標準稀釋液用移液器滴入包被有捕獲小鼠IgG的抗體的清潔的微量滴定板中。將PGE2-過氧化物酶綴合物(25μl)加入孔中的標準液和上清液中。通過加入25μl抗PGE2單克隆抗體來起始結合反應。在4℃下孵育過夜后,洗滌板,并加入100μl底物。底物與結合的PGE2-過氧化物酶綴合物反應。在短暫的孵育后,停止反應,在450nm波長下檢測產生的顏色的強度。PGE2的產生量由每毫克DNA表示。

定量實時逆轉錄酶聚合酶鏈反應(Quantitativereal-timereversetranscriptasepolymerasechainreaction,RTPCR)

使用RNeasy迷你試劑盒(凱杰,芬洛,荷蘭)分離來自每種條件的3個孔的細胞的RNA。然后,逆轉錄RNA。通過使用SYBRPremixExTaq(帶有預先混合SYBR染料的DNA聚合酶ExTaq)(TliRNaseHPlus)(維斯特博格(Westburg),勒斯登,荷蘭)進行定量實時聚合酶鏈反應(PolymeraseChainReaction,PCR)。PCT模板源為第一鏈cDNA或純化的DNA標準鏈。用于擴增所需cDNA的引物序列如下:牛HPRT正向和反向引物:5’-AGTTTGGAAATACCTGGCG-3’和5’-AGTCTTTAGGCTCGTAGTGC-3’;牛白細胞介素(IL)-6正向和反向引物:5’-TGGTGATGACTTCTGCTTTCC-3’和5’-TGCCAGTGTCTCCTTGC-3’;?;費趺?COX)2正向和反向引物:5’-GTCTGATGATGTATGCCACC-3’和5’-ACGTAGTCTTCAATCACAATCT-3’;牛誘導型一氧化氮合成酶(iNOS)正向和反向引物:5’-GGCAAGCACCACATTGAGA-3’和5’-TGCGGCTGGATTTCGGA-3’;牛聚集蛋白聚糖(aggrecans)(AGG)正向和反向引物:5’-TGCCTTTGACGTGAGC-3’和5’-GCATTGTTGTTGACAAACT-3’;牛II型膠原(COL2)正向和反向引物:5’-CTGCGTCTACCCCAAC-3’和5’-GGGTGCAATGTCAATGAT-3’;牛金屬蛋白酶(MMP)-3正向和反向引物:5’-TCTATGAAGGAGAAGCTGACATAAT-3’和5’-TTCATGGGCAGCAACAAG-3’;牛的帶有血小板反應蛋白模體的解整合素及金屬蛋白酶(ADisintegrinandMetalloproteinasewithThrombospondinMotifs,ADAMTS)4正向和反向引物:5’-CTTTCAATGTCCCACAGGC-3’和5’-CAGGAACGGAAGCGGGTA-3’;牛ADAMTS5正向和反向引物:5’-GACACCCTGGGAATGGCA-3’和5’-CACAGAACTTGGAATCGTCA-3’。

用分光熒光熱循環儀(spectrofluorometricthermalcycler)(LightCycler480,羅氏診斷,韋爾維耶,比利時)進行擴增。為了標準化mRNA水平,擴增作為內部對照的管家基因HPRT。通過計算IL-6、COX2、iNOS、AGG、COL2、MMP-3、ADAMTS4、ADAMTS5和HPRT的cDNA拷貝數量之間的比例標準化基因表達。

結果表示為與對照相比的平均增加百分比。使用t-測試評價統計顯著性。p<0.05時的偏差被認為是統計上顯著的。下表詳細記載了在結合化合物與觀察到的協同作用時所提供的結果。

表4

(*有益作用;**負作用;***比預期的更有益)

討論

組合的結果比每個化合物的疊加效果要好。一種解釋是因為化合物對相關的不同代謝途徑起作用,當有炎癥時,分解代謝增加而合成代謝降低。因此,我們的非限定性假設是,姜黃素抑制由IL-1β誘導的炎癥(并且也由膠原和綠茶誘導)。一旦炎癥被抑制,分解代謝降低,并且膠原和綠茶多酚可對合成代謝具有其正向作用。由于關節炎是惡性循環(炎癥誘導分解代謝,分解代謝誘導炎癥等),當分解代謝降低(且合成代謝增加)時,會有炎癥的降低,并彌補惡性循環。

然而,通常,在健康細胞中,分解代謝和合成代謝之間總有平衡??杉?,該組合可對健康細胞的代謝具有正向作用(沒有通過IL-1β誘導炎癥)。非常有趣的是,在關節炎或關節炎之前的情況中,仍處于良好健康的細胞可被這些組合所?;?。

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