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艾拉维斯VS维戈塞尔塔: 表面修飾.pdf

摘要
申請專利號:

维戈塞尔塔vs皇家社会 www.vmyqew.com.cn CN201480035004.1

申請日:

20140619

公開號:

CN105431181A

公開日:

20160323

當前法律狀態:

有效性:

有效

法律詳情:
IPC分類號: A61L31/08,A61L31/12,A61L29/12,A61L29/08,A61L27/28,A61L27/40,A61L27/34 主分類號: A61L31/08,A61L31/12,A61L29/12,A61L29/08,A61L27/28,A61L27/40,A61L27/34
申請人: 新加坡國立大學
發明人: 王榮,梁君儀,鐘俞明,康燕堂,淡馬亞
地址: 新加坡新加坡城
優先權: 1310985.5
專利代理機構: 北京集佳知識產權代理有限公司 代理人: 鄭斌;彭鯤鵬
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法律狀態
申請(專利)號:

CN201480035004.1

授權公告號:

法律狀態公告日:

法律狀態類型:

摘要

我們公開了用于修飾例如醫療裝置如導管、支架、套管或其他窄管的表面以防止細菌感染和結垢的新的組合物。

權利要求書

1.醫療裝置,其包含具有經修飾表面的支持基底,所述表面包含覆蓋所述裝置表面的全部或一部分的兩個或更多個層,所述層包括:包含與一種或更多種抗微生物金屬離子或納米顆粒締合之持續釋放聚合物的第一層,與所述第一層接觸并且包含持續釋放聚合物的第二層,并且還包括包含防污聚合物的生物相容性最上層,其中,在使用時,所述經修飾表面抑制所述醫療裝置的細菌粘附和/或生物膜形成以及結垢。2.根據權利要求1所述的裝置,其中所述裝置在所述第二層與所述最上層之間包含至少一個另外的層,所述另外的層包含持續釋放聚合物以及一種或更多種抗微生物金屬離子或納米顆粒。3.根據權利要求1或2所述的裝置,其中所述裝置表面包含多個第一層和第二層以提供多層的裝置表面。4.根據權利要求1至3中任一項所述的裝置,其中所述經修飾表面的厚度為2μm至20μm。5.根據權利要求4所述的裝置,其中所述經修飾表面的厚度為10μm+/-10%。6.根據權利要求1至5中任一項所述的裝置,其中所述第一層和所述第二層包含相同的持續釋放聚合物。7.根據權利要求1至5中任一項所述的裝置,其中所述第一層和所述第二層包含不同的持續釋放聚合物。8.根據權利要求1至6中任一項所述的裝置,其中所述持續釋放聚合物是聚多巴胺或其功能等同衍生物。9.根據權利要求1至8中任一項所述的裝置,其中所述離子或納米顆粒包含選自銀、金或銅的抗微生物金屬。10.根據權利要求9所述的裝置,其中所述抗微生物金屬離子或納米顆粒包含銀。11.根據權利要求1至10中任一項所述的裝置,其中所述抗微生物金屬包含至少12μg金屬離子/cm。12.根據權利要求11所述的裝置,其中所述抗微生物金屬包含12μg至25μg金屬離子/cm。13.根據權利要求1至12中任一項所述的裝置,其中所述生物相容性聚合物選自:聚(磺基甜菜堿甲基丙烯酸酯-共-丙烯酰胺)[聚(SBMA-共-AAm)]、其他兩性離子聚合物及衍生物、聚乙二醇、聚丙烯酸、聚(甲基丙烯酸2-羥乙酯)、瓊脂糖和藻酸鹽及其衍生物。14.根據權利要求13所述的裝置,其中在所述生物相容性層中包含聚(SBMA-共-AAm)。15.根據權利要求中1至14中任一項所述的裝置,其中所述支持基底包含選自以下的聚合物:硅酮、尼龍、鎳鈦諾、聚氨酯、膠乳、聚乙烯或熱塑性聚合物。16.根據權利要求15所述的裝置,其中所述支持基底包含硅酮。17.根據權利要求1至16中任一項所述的裝置,其中所述支持基底包含金屬。18.根據權利要求17所述的裝置,其中所述支持基底包含選自以下的金屬:不銹鋼、鈷-鉻(Co-Cr)和鈦及其合金。19.根據權利要求1至18中任一項所述的裝置,其中所述經修飾表面包含至少一種抗微生物劑,其中所述抗微生物劑不是抗微生物金屬。20.根據權利要求19所述的裝置,其中所述抗微生物劑是抗生素。21.根據權利要求19所述的裝置,其中所述抗微生物劑是抗微生物肽。22.根據權利要求1至21中任一項所述的裝置,其中所述醫療裝置是導管。23.根據權利要求1至21中任一項所述的裝置,其中所述醫療裝置是支架。24.根據權利要求23所述的裝置,其中所述支架是輸尿管支架或前列腺支架。25.根據權利要求1至21中任一項所述的裝置,其中所述醫療裝置是套管。26.用于制造裝置之基底表面的方法,其包括以下步驟:i)使所述基底的全部或一部分表面與包含至少一種持續釋放聚合物的流體接觸以使所述基底涂布有第一聚合物層;ii)使所述第一聚合物層與包含至少一種抗微生物金屬的流體接觸以使所述第一聚合物層涂布有所述抗微生物金屬;任選地iii)重復步驟i)和ii)一次或更多次;iv)使經雙層或多層涂布的基底與包含至少一種持續釋放聚合物的流體接觸以控制所述抗微生物金屬釋放并錨定隨后的防污層;以及v)使經涂布的基底與包含至少一種防污聚合物的流體接觸。27.根據權利要求26所述的方法,其中將所述基底浸入包含所述持續釋放聚合物的液體中,隨后將其浸入包含所述抗微生物金屬的液體中。28.根據權利要求26所述的方法,其中使所述基底與包含所述持續釋放聚合物的液體噴霧接觸,隨后將其與包含所述抗微生物金屬的霧化流體接觸。29.根據權利要求26至28中任一項所述的方法,其中所述持續釋放聚合物是聚多巴胺。30.根據權利要求26至29中任一項所述的方法,其中所述抗微生物金屬是銀。31.裝置,其包含通過根據權利要求26至30中任一項所述的方法獲得或可獲得的基底。32.根據權利要求31所述的裝置,其中所述裝置選自:導管、支架、輸尿管支架或前列腺支架或者套管。33.治療需要導管插入之對象的手術方法,其包括向所述對象植入根據權利要求1至25中任一項所述的醫療裝置。34.根據權利要求33所述的方法,其中將所述醫療裝置植入到所述對象的尿道中。35.根據權利要求33所述的方法,其中將所述醫療裝置植入到所述對象的前列腺。36.根據權利要求33所述的方法,其中將所述醫療裝置植入到所述對象的輸尿管中。

說明書

本公開內容涉及用于修飾(modify)例如醫療裝置(例如導管、支架、套管(cannula)或其他窄管)的表面以防止細菌感染和結垢(encrustation)的新的組合物;包含所述表面的醫療裝置;用于修飾所述表面的方法以及使用所述經修飾醫療裝置的治療方法。

背景技術

醫療裝置被植入到患者中以治療多種疾病和病癥。醫療裝置包括導管、支架(輸尿管支架或前列腺支架)、套管、假體和植入物。醫療裝置的植入必然需要患者經受植入裝置的免疫排斥以及由微生物病原體引起的病原感染(adventitiousinfection)的概率增加二者。此外,醫療裝置周圍和醫療裝置中碎片的積累可以以將患者的健康置于另外風險的程度阻礙裝置的功能。裝置表面與周圍環境之間的界面對于提供持續運行的裝置以及使患者不暴露于由微生物病原體引起的不必要的感染風險是至關重要的。特別地,抗生素抗性細菌病原體例如金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、艱難梭菌(Clostridiumdifficile)、銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa,P.aeruginosa)和大腸桿菌(Escherichiacoli,E.coli)的增加在醫院感染越來越普遍的醫院中引發了?;?。因此,持續期望提供減少由微生物病原體(特別是已變成抗生素抗性的微生物病原體)引起的機會性感染的醫療植入物。

對于患者而言,醫療裝置在體內停留的時間越長,感染的風險越高。幾乎所有經歷長期導管插入的患者將發生菌尿1,且導管相關的尿路感染(catheter-associatedurinarytractinfection,CAUTI)是最常見的護理相關感染。類似地,發現輸尿管支架僅在2周后就被細菌定殖(colonize)且速率隨著支架植入的時間變長而提高2。大腸桿菌和銅綠假單胞菌是在導管和輸尿管支架兩者相關的尿路感染中發現的兩種最常見的病原體3,4。

結垢是與導尿管和輸尿管支架相關的另一種并發癥,并且是CAUTI中死亡率和發病率的主要原因。如果導管中沒有阻塞,則CAUTI一般無癥狀。然而,如果發生阻塞,則上行性感染(即,腎盂腎炎或腎感染)、血流感染甚至死亡的風險將提高5。病原體如奇異變形菌(Proteusmirabilis,P.mirabilis)產生脲酶,其將尿素水解成氨,導致尿的pH值提高。在堿性條件下,形成磷酸鈣和磷酸鎂晶體并沉積在裝置表面上6。因此,導管或支架腔將被結垢阻塞,這導致裝置發生故障。

為了防止細菌感染和結垢,已經使用具有可擴散性抗微生物劑之導管的抗菌表面涂層(coating)??刮⑸錛?例如呋喃西林7和三氯生8,9)已用于制造抗菌導尿管和輸尿管支架,但有限數量的研究和呈現的短期結果并不能表明長期功效7-9,此外,當使用抗生素涂布的導管時,缺乏精確的劑量管理可促進細菌抗性。銀已經廣泛用于抗菌裝置涂層10,然而,市售的銀涂布的導尿管在抑制細菌生物膜形成7和結垢11-13方面功效有限。它們失敗的一個可能的原因是,銀從涂層的釋放有限12,這是由于低的固有銀釋放能力12或在導管表面上形成的條件化(conditioning)膜(含有來自尿的沉淀的鹽和/或來自裂解的細菌細胞的碎片)阻礙了銀擴散13。

醫療裝置的涂布是本領域中已知的并且用于使醫療裝置(例如導管)的表面涂布有抗菌材料和其他生物活性劑。US8308699公開了涂布有一種或更多種包含例如甲基丙烯酸酯衍生物之襯里涂層(undercoat)的基底(substrate)。所述襯里涂層提供非污(non-fouling)組分和綁定組分以使其固定在基底上并附著一個或更多個面涂層(topcoat)。包含兩性離子材料(例如甘氨酸甜菜堿或三甲胺氧化物)的面涂層可用來改善生物相容性和減少由蛋白質或細菌引起的污染。生物活性劑(例如熒光標簽或比色標簽、抗血栓形成標簽或抗微生物肽)也可附著至襯里涂層或面涂層。US20110305898公開了用于包含非污聚合物材料和銀顆粒之醫療裝置基底的生物相容性涂層。

已發現包含兒荼酚(DOPA)和胺(賴氨酸)基團的多巴胺(一種小分子化合物)具有優異的粘附性能并一直用于許多生物醫學應用。兒荼酚及其衍生的化合物可在多種無機材料和有機材料(包括貴金屬、金屬氧化物、云母、硅石、陶瓷以及甚至聚合物)上進行自組裝。

本公開內容涉及在基底(例如硅酮)上的雙層或多層中用于抗微生物劑持續釋放的聚合物(下文中稱為持續釋放聚合物,例如聚多巴胺(PDA))與作為離子或納米顆粒的抗微生物金屬(例如銀、金或銅)的組合,所述組合是用于有效地防止醫療裝置(例如導管)的表面上之細菌生長的有效手段。獨特的經多層經修飾表面提供了有效抗菌量的銀的持續釋放,當其與防污層(anti-foulinglayer)結合時,有效地阻礙了在經修飾醫療裝置中或其上的細菌粘附、生物膜形成和結垢。

發明內容

根據本發明的一個方面,提供了包含具有經修飾表面之支持基底的醫療裝置,所述表面包含覆蓋所述裝置表面的全部或一部分的一層或更多層,所述層包括與一種或更多種抗微生物金屬離子或納米顆粒相關的持續釋放聚合物和包含防污聚合物的生物相容性最上層,其中,當使用時,經修飾表面抑制醫療裝置的細菌粘附和/或生物膜形成以及結垢。

在本發明的一個優選實施方案中,所述裝置表面包括包含所述持續釋放聚合物和抗微生物金屬離子或納米顆粒的第一層以及與所述第一層接觸且包含持續釋放聚合物的第二層,其中所述第二層設置有包含防污聚合物的生物相容性最上層以提供經修飾醫療裝置表面。

在本發明的一個優選實施方案中,所述裝置表面包含多個第一層和第二層以提供多層的裝置表面。

在本發明的一個優選實施方案中,所述經修飾表面的厚度為2μm至20μm。優選地,所述經修飾表面的厚度為10μm+/-10%。

在本發明的一個優選實施方案中,第一層和第二層包含相同的持續釋放聚合物。

在本發明的一個替代優選實施方案中,第一層和第二層包含不同的持續釋放聚合物。

在本發明的一個優選實施方案中,所述持續釋放聚合物是聚多巴胺或其功能等同衍生物。

在本發明的一個優選實施方案中,所述離子或納米顆粒包括選自銀、金或銅的抗微生物金屬。

在本發明的一個優選實施方案中,所述離子或納米顆粒包含抗微生物金屬銀。

在本發明的一個優選實施方案中,所述抗微生物金屬包含至少12μg金屬離子/cm2。

在本發明的另一個實施方案中,所述抗微生物金屬包含12μg至25μg金屬離子/cm2。

在本發明的一個優選實施方案中,所述抗微生物金屬的濃度為4μg至40μg/cm2經修飾表面。

在本發明的一個優選實施方案中,所述生物相容性層包含選自以下的聚合物:聚(磺基甜菜堿甲基丙烯酸酯-共-丙烯酰胺)[聚(SBMA-共-AAm)]、其他兩性離子聚合物及衍生物、聚乙二醇、聚丙烯酸、聚(甲基丙烯酸2-羥乙酯)、瓊脂糖和藻酸鹽及其衍生物。

在本發明的一個優選實施方案中,所述生物相容性層包含聚(SBMA-共-AAm)。

在本發明的一個優選實施方案中,所述支持基底包含選自以下的生物相容性聚合物:硅酮、尼龍、鎳鈦諾(nitinol)、聚氨酯(polyurethane,PU)、熱塑性聚合物、膠乳和聚乙烯。

在本發明的一個優選實施方案中,所述支持基底包含硅酮。

在本發明的一個優選實施方案中,所述支持基底包含金屬。

在本發明的一個優選實施方案中,所述支持基底包含選自以下的金屬:不銹鋼、鈷-鉻(Co-Cr)、鈦及其合金。

在本發明的另一個優選實施方案中,所述經修飾表面包含至少一種抗微生物劑,其中所述抗微生物劑不是抗微生物金屬。

在本發明的一個優選實施方案中,所述抗微生物劑是抗生素。

有效控制細菌病原體的抗生素類的實例包括(僅舉例):青霉素類、頭孢菌素類、利福霉素類、磺胺類(sulphonomides)、大環內酯類和四環素類。

在本發明的一個替代優選實施方案中,所述抗微生物劑是抗微生物肽。

優選地,所述抗微生物肽是皮西丁蛋白(dermicidin)、殺菌肽或防衛素。

在本發明的一個優選實施方案中,所述醫療裝置是導管。

在本發明的一個優選實施方案中,所述醫療裝置是支架,例如輸尿管支架或前列腺支架。

在本發明的一個優選實施方案中,所述醫療裝置是套管。

根據本發明的另一個方面,提供了用于制造裝置之基底表面的方法,所述方法包括以下步驟:

i)使所述基底的全部或一部分表面與包含至少一種持續釋放聚合物的流體接觸以使所述基底涂布有第一聚合物層;

ii)使所述第一聚合物層與包含至少一種抗微生物金屬的流體接觸以使所述第一聚合物層涂布有所述抗微生物金屬;任選地

iii)重復步驟i)和ii)一次或更多次;

iv)使經雙層或多層涂布的基底與包含至少一種持續釋放聚合物的流體接觸以控制所述抗微生物金屬釋放并錨定隨后的防污層;以及

v)使經涂布的基底與包含至少一種防污聚合物的流體接觸。

在本發明的一種優選方法中,將所述基底浸入包含所述持續釋放聚合物的液體中,隨后將其浸入包含所述抗微生物金屬的液體中。

在本發明的一種替代方法中,使所述基底與包含所述持續釋放聚合物的液體噴霧接觸,隨后將其與包含所述抗微生物金屬的霧化流體接觸。

在本發明的一種優選方法中,所述持續釋放聚合物是聚多巴胺。

在本發明的一個優選實施方案中,所述抗微生物金屬是銀。

根據本發明的另一個方面,提供了包含根據本發明方法獲得或可獲得之基底的裝置。

根據本發明的另一個方面,提供了根據本發明的經修飾基底,其用于制造醫療裝置。

在本發明的一個優選實施方案中,所述裝置選自:導管、支架、輸尿管支架或前列腺支架、套管或者假體。

根據本發明的另一個方面,提供了治療需要導管插入之對象的手術方法,所述方法包括向所述對象中植入根據本發明的醫療裝置。

在本發明的一種優選方法中,將所述醫療裝置植入到所述對象的尿道中。

在本發明的一種替代優選方法中,將所述醫療裝置植入到所述對象的前列腺。

在本發明的一種替代優選方法中,將所述醫療裝置植入到所述對象的輸尿管中。

根據本發明的另一個方面,提供了藥盒,其包含:

i)包含基底的裝置;

ii)包含持續釋放聚合物的第一溶液;

iii)包含抗微生物金屬的第二溶液;和

iv)包含防污聚合物的第三溶液。

在本申請的整個說明書和權利要求書中,詞語“包括”和“包含”以及這些詞的變形,例如“含有”和“具有”,意指“包括但不限于”,且并非意在(并且不)排除其他部分、添加物、組分、整數或步驟?!盎舊嫌?.....組成”意指具有基本的整數,但包括實質上并不影響基本整數的功能的整數。

在本申請的整個本說明書和權利要求書中,除非上下文另有要求,否則單數涵蓋復數。特別地,當使用不定冠詞時,除非上下文另有要求,否則本申請應理解為考慮了復數以及單數。

除非互相矛盾,否則結合本發明的特定方面、實施方案或實施例所描述的特征、整數、特性、化合物、化學部分或基團應理解為適用于本文描述的任何其他方面、實施方案或實施例。

主附圖

圖1.說明了(A)聚(SBMA-共-AAm)的合成,(B)用于修飾硅酮導管表面的步驟和(C)P3涂布之導管的結構層的示意圖;

圖2.原始的(pristine)硅酮表面和PDA-、PDA-銀納米顆粒(AgNP)-、P1、P2和P3涂布的硅酮表面的X射線光電子能譜法(X-rayphotoelectronspectroscopy,XPS)寬掃描譜。插圖示出了各個表面的N1s芯能級譜(core-levelspectrum);

圖3.原始的硅酮表面和PDA-,PDA-AgNP-、P1、P2、P3涂布的硅酮表面的水接觸角(contactangle)。*表示與原始硅酮表面相比,具有顯著差異(P<0.05);

圖4.(i)DoverTM銀-涂布的導管,(ii)未經修飾的全硅酮導管,(iii)P2和(iv)P3涂布的硅酮導管的機械性質;

圖5.(A)不同導管段的銀含量;和(B)在所示位置(X1、X2、X3)得到的P3涂布的導管段的銀含量。上方的圖表明從6.5cm導管段切下X1、X2、X3段(各為1cm)的位置。丟棄在兩端的0.25cm的段。通過熱酸消化和電感耦合等離子體-質譜法(ICP-MS)來測定銀含量;

圖6.(A)在含有105個細胞/ml的培養基中將原始的、PDA-聚(SBMA-共-AAm)-和P3涂布的導管段孵育24小時后,其腔內表面上奇異變形菌生物膜的共聚焦激光掃描顯微術(CLSM)圖像(體積視圖)。比例尺代表100μm。(B)在含有108個細胞/ml的磷酸緩沖鹽水(PBS)中孵育4小時后(細菌粘附測定),或在含105個細胞/ml的培養基中孵育24小時后(生物膜形成測定),在1cm2的導管段表面上存活的細菌細胞。*和#分別表示與原始硅酮導管和DoverTM銀涂布的導管相比,具有顯著差異(P<0.05);

圖7.(A)在37℃下,在2ml的無菌人工尿中孵育7天和(B)在37℃下,在2ml的具有奇異變形菌(105個細胞/ml)的人工尿培養基中孵育7天后,從1cm導管段釋放的銀。(C)在37℃下,在具有奇異變形菌(105個細胞/ml)的2ml人工尿培養基中孵育48天后從1cmP3涂布的導管段釋放的銀。每天更換釋放培養基并使用ICP-MS測定釋放培養基中的銀濃度。箭頭指示結垢發生時的平均時間點;

圖8.(A)用105個細胞/ml奇異變形菌接種的新制備的人工尿(2ml)攻擊1cm導管段的結垢測定。樣品i、ii、iii、iv、v分別表示對照(無導管段的細菌懸浮液)、DoverTM銀涂布的導管以及P1、P2、P3涂布的導管。濁度指示晶體形成(樣品i在第1天和樣品i、ii在第7天)。在第1天通過離心從混濁的對照(樣品i)收集的材料之(B)掃描電子顯微術(SEM)圖像和(C)能量色散型X射線光譜法(energydispersiveX-rayspectroscopy,EDX)元素分析;

圖9.不同導管的平均無結垢期。*表示與DoverTM銀涂布的導管相比,具有顯著差異(P<0.05);以及

圖10.(A-F)腔內涂層和(G-I)腔內表面之截面的SEM圖像;(A-C)在結垢試驗前、(D-E&G-H)在結垢試驗7天后以及(F&I)在結垢試驗40天后的SEM圖像;(J-L)分別是(G-I)中所示的表面的EDX分析。(A、D、G、J):DoverTM銀涂布的導管;(B、E、H、K):P2涂布的導管;和(C、F、I、L):P3涂布的導管。比例尺代表10μm。

補充附圖

圖S1.在表面潤滑性試驗中使用的裝置(左:示意圖,右:實驗裝置的照片;插圖:裝置中導管段的頂視圖);

圖S2.(a)在熱酸消化之前和(b)熱酸消化之后DoverTM和P3涂布的導管段的腔內表面之XPSAg3d的芯能級譜;

圖S3.(A)在導管摩擦試驗中使用的裝置;(B)在摩擦試驗中導管通過裝置的運動;(C)在彎曲試驗中導管變形的示意圖;

圖S4.聚(SBMA-共-AAm)的XPS寬掃描譜和N1s芯能級譜;

圖S5.PDA-和PDA-AgNP-涂布的硅酮表面之場致發射掃描電子顯微術(FESEM)圖像和EDX銀圖。箭頭表示自聚合的PDA顆粒。在FESEM圖像和EDX圖中的比例尺代表1μm;

圖S6.原始硅酮導管、P2和P3涂布的導管和DoverTM銀涂布的硅酮導管之腔外表面的原子力顯微術(Atomicforcemicroscopy,AFM)3D圖像;

圖S7.不同導管段的表面潤滑性質;

圖S8.在原始導管和P3導管的腔外表面上奇異變形菌生物膜的CLSM圖像。導管段在含有105個細胞/ml的培養基中孵育24小時。比例尺代表100μm;

圖S9.在含有108個細胞/ml的人工尿中孵育4小時后,在1cm2的導管段表面上存活的大腸桿菌UTI89。*表示與原始硅酮導管相比,具有顯著差異(P<0.05);

圖S10.在含有105個細胞/ml的培養基中孵育24小時后,在1cm2原始和P3涂布的PU以及Co-Cr表面上存活的大腸桿菌DH5α和奇異變形菌。*表示與原始的基底表面相比,具有顯著差異(P<0.05);

圖S11.(A)在與導管段孵育24小時后,人工尿中顆粒的尺寸分布,和(B)在與導管段孵育24小時后,過濾之前和之后人工尿中的銀濃度,和載有銀的人工尿對奇異變形菌的殺菌效率;

圖S12.(A)在無菌人工尿中浸泡7天后DoverTM銀涂布的導管,(B)在無菌人工尿中浸泡7天后P2涂布的導管,以及(C)在無菌人工尿中浸泡40天后P3涂布的導管之腔內涂層的截面的SEM圖像。比例尺代表10μm;

圖S13.(A)在穩定性試驗之前和之后腔外導管表面的XPS寬掃描譜和Ag3d譜。(B)穩定性試驗后腔外導管表面上奇異變形菌生物膜的CLSM圖像。比例尺代表100μm。P3-F和P3-B分別表示在摩擦試驗和彎曲試驗后的P3導管段;和

圖S14.(A-B)在含有導管提取物的培養基中孵育后,3T3成纖維細胞的生存力。SA/Vol比是導管表面面積與在提取中使用的培養基的體積的比。(C)通過ICP-MS測定的提取培養基中的銀濃度。(D)在具有不同濃度的AgNO3的培養基中孵育24小時和72小時后,3T3成纖維細胞的生存力。將生存力表示為相對于用無毒對照獲得之結果的百分比。*表示與無毒對照相比,具有顯著差異(P<0.05)。

材料和方法

全硅酮弗利導管(14Ch/Fr(OD4.7mm))均購自C.R.BardInc.,Georgia,US,并且用于表面修飾實驗。銀涂布的100%硅酮弗利導管(DoverTM,14Ch/Fr(OD4.7mm))是從CovidienLLC,Massachusetts,US獲得的。根據制造商,弗利導管(Foleycatheter)在腔內和腔外兩個表面上均涂布有磷酸鹽離子銀水凝膠。醫用級硅酮片(厚度為1mm)是從BioplexusInc.,California,US獲得的。聚氨酯片(PU,厚度為2mm)購自CentralPolymerEngineeringSupply,Singapore。鈷-鉻合金箔(Co50/Cr20/W15/Ni10/Fe3/Mn2,Co-Cr,厚度為0.6mm)購自GoodfellowInc.,Huntingdon,UK。鹽酸多巴胺、硝酸銀、[2-(甲基丙烯酰氧基)乙基]二甲基-(3-磺丙基)氫氧化銨(磺基甜菜堿甲基丙烯酸酯,SBMA)、丙烯酰胺(AAm)、過硫酸銨、3-[4,5-二甲基-噻唑-2-基]-2,5-二苯基四唑溴化物(MTT)、胰蛋白酶大豆培養液(trypticsoybroth)、溶菌培養液(lysogenybroth)、營養培養液和瓊脂均購自Sigma-Aldrich,Missouri,US。使用的所有其他化學品均為分析純試劑(AR)且購自Sigma-Aldrich或MerckChemCo.(Darmstadt,Germany)。大腸桿菌(ATCCDH5α)、奇異變形菌(ATCC51286,一種分離自導尿管感染患者的菌株)以及3T3成纖維細胞從美國典型菌種保藏中心(AmericanTypeCultureCollection)(ATCC,Virginia,US)獲得。銅綠假單胞菌PAO1購自NationalCollectionofIndustrialFoodandMarineBacteria(NCIMB,Aberdeen,UK)。大腸桿菌UTI89(一種分離自單純性膀胱炎患者的尿路病原性菌株14)是由新加坡基因組研究所的SwaineChen博士友情提供的。

根據在文獻中報道的方法制備人工尿基礎溶液11。將氯化鈣(0.49g)、氯化鎂六水合物(0.65g)、氯化鈉(4.6g)、硫酸二鈉(2.3g)、脫水檸檬酸三鈉(0.65g)、草酸二鈉(0.02g)、磷酸二氫鉀(2.8g)、氯化鉀(1.6g)、氯化銨(1.0g)和尿素(25g)溶解于800ml蒸餾水中。使用1M氫氧化鈉溶液將pH調節至6.0并將溶液通過0.2μm膜過濾來除菌。為了制備用于測試銀從涂布的導管釋放的人工尿鹽溶液,向基礎溶液添加預高壓滅菌的蒸餾水以使最終的溶液體積達到1000ml。對于在結垢試驗中所用的人工尿培養基,單獨制備具有1.0g胰蛋白酶大豆培養液和5.0g明膠的200ml溶液并通過高壓滅菌進行滅菌,然后添加到無菌人工尿基礎溶液以補充至總體積為1000ml。將所制備的溶液保持在4℃冰箱中并在一個月內使用。

聚(SBMA-共-AAm)的合成

根據先前報道的方法通過自由基聚合來合成聚(SBMA-共-AAm)(圖1A)15。簡言之,將SBMA(3.35g,12mmol)、AAm(0.21g,3mmol)和蒸餾水(20ml)置于50ml的單頸圓底瓶中。將混合物以500rpm持續攪拌并用氮氣吹掃以脫氣20分鐘。添加過硫酸銨(23mg,0.1mmol)以起始反應并再保持脫氣10分鐘。然后將瓶密封,并在持續攪拌下,使反應在60℃的油浴中進行5小時。使用纖維素膜(分子量截斷值為12000,Sigma-Aldrich)使產物透析三天以除去未反應的試劑、鹽和低分子量產物,然后凍干。

表面修飾

在修飾前,將硅酮導尿管切成6.5cm的長度。如圖1B所示修飾導管段的表面。通過在室溫下將導管段浸入10mL的多巴胺溶液(在10mMTris緩沖液中2mg/ml,pH8.5)中振蕩24小時以使PDA層首先涂布在導管表面上16。隨后通過在室溫下將PDA涂布的段浸入10ml的50mMAgNO3水溶液中振蕩24小時在表面上形成AgNP。然后通過用10ml新鮮制備的多巴胺溶液(在10mMTris緩沖液中2mg/ml,pH8.5)將PDA-AgNP涂布的段處理24小時而接枝(graft)另一個PDA層。將這個具有PDA-AgNP-PDA層的經修飾導管表示為P1涂布的導管。在37℃水浴中,將P1涂布的導管再次浸入10ml的聚(SBMA-共-AAm)溶液(在10mMTris緩沖液中10mg/ml,pH8.5)中振蕩24小時,并將其表示為P2涂布的導管(PDA-AgNP-PDA-(pSBM-共-AAm))。通過將PDA涂布的段浸入聚(SBMA-共-AAm)溶液中以相同的方式同樣制備了PDA-聚(SBMA-共-AAM)涂布的導管。通過在如上所述的每個步驟中用AgNO3溶液、多巴胺溶液和聚(SBMA-共-AAm)溶液依次處理P1涂布的導管24小時來制備P3涂布的導管(PDA-(AgNP-PDA)2-(pSBMA-共-AAm),圖1C)。在每個處理步驟之后,用蒸餾水洗滌經涂布的導管段并且在涂布過程完成后,將所述段在氮氣流下干燥,并在黑暗中儲存直至進一步使用。在修飾6.5cm導管段之后,從導管的兩端切下0.25cm的段,并根據不同的實驗需求,將剩余的部分切成特定的長度(對于機械性質和涂層穩定性試驗為6cm,對于銀釋放和結垢試驗為1cm,而對于細菌粘附和生物膜形成試驗為1.5cm)。因此,僅對這些導管段的腔內和腔外表面進行了涂布。將DoverTM銀涂布的導管切割成相似的段并用于比較目的。

還對硅酮片和PU片(6.5×1cm2)和Co-Cr箔(1×1cm2)進行了表面修飾。在使用前每個步驟中,將Co-Cr箔在二氯甲烷、丙酮和水中進行超聲清洗10分鐘。涂布過程如以上對于導管段所述,對于硅酮片和PU片在每個步驟中使用10ml的試劑,而對于Co-Cr箔使用2ml的試劑。

表面表征

由于導管彎曲的表面,不易使用例如FESEM、XPS分析和接觸角測量技術進行其表面表征。因此,這些測量大多數是用以與硅酮導管相同的方式涂布的平坦硅酮片來進行。在裝配有單色化的AlKαX-射線源(1468.6eV光子)的AXISUltraDLD分光計(KratosAnalyticalLtd,Manchester,UK)上使用XPS來分析表面組分。使用伸縮式測角計(Rame-Hart,NewJersey,US)通過停滴法(sessiledropmethod)在室溫下測量不同表面的接觸角。將3μL水滴施加到表面上并記錄靜態接觸角。對于各類型的涂層,測試至少九個樣品并記錄接觸角的平均值和標準差(SD)。使用FESEM(JEOL,型號為JSM-6700,Tokyo,Japan)觀察PDA-和PDA-AgNP涂布的硅酮片的表面形態。用XPS和EDX(JEOL,來自OxfordInstrument,Oxford,UK的具有EDX檢測器的掃描電子顯微鏡,型號為5600LV)證實在這些表面上存在銀。在干燥狀態下,通過AFM(NanoscopeIIIaAFM,DigitalInstruments,Inc.,NewYork,US)對不同導管段的腔外表面的表面形貌進行了表征。從通過AFM測定的粗糙度譜計算出了表面的均方根(RMS)粗糙度。

機械性質和表面潤滑性試驗

使用Instron通用材料試驗機(型號5544,Massachusetts,US)進行導管段的拉伸試驗。將導管切成6cm的長度,并且在離各自端部2.5cm處夾住每段,使得鉗之間留下1cm段。在室溫下以10mm/分鐘拉該段,直至斷裂點。記錄每個導管段的應力(每截面面積的力)相對于應變的曲線。

使用圖S1中所示的裝置以如較早的報道17的類似方式(進行了略微的改進)進行表面潤滑性測定。在試驗之前,將導管切成4cm的段并在蒸餾水中平衡10分鐘。在Instron通用材料試驗機中垂直地夾住導管段(1cm長)的一端。將導管段的剩余部分(3cm)夾在兩片硅酮片(厚度:1mm,L×W:5.5cm×3cm)之間,其被預先固定在Instron鉗正下方位置處的兩片聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)板(L×W:5.5cm×3cm)上。兩個PMMA板形成6mm直徑的通道。因為每個硅酮片的厚度為1mm,所以導管的通道直徑將為~4mm。因此,導管段(導管直徑:4.7mm)的表面與通道中的硅酮片充分接觸。使用在底部具有壓載配重(ballastingweight)的金屬螺絲鉗緊緊地固定PMMA板、硅酮片及導管段。整個實驗中,將蒸餾水流(0.5ml/分鐘)對準導管段和在PMMA板頂部的通道以保持潮濕環境。以5mm/s拉該段,并且記錄每個段的力相對于移動距離。使用Origin8.1軟件從每條曲線下積分面積計算從固定的硅酮片之間拉出所述段所需的功。對于每種類型導管進行三次重復測量。

細菌粘附和生物膜形成測定

在培養液中過夜培養細菌(對于大腸桿菌UTI89和銅綠假單胞菌用溶菌培養液、對于奇異變形菌用胰蛋白酶大豆培養液、對于大腸桿菌DH5α用營養培養液),然后通過離心(2700rpm,10分鐘)收獲,接著用PBS(10mM,pH7.4)洗滌兩次。將細菌細胞以108個細胞/ml的濃度重懸于PBS(10mM,pH7.4)中,對應于如在我們之前工作16中測定的在540nm處0.1的光密度。將這種細菌懸浮液直接用于細菌粘附測定。至于生物膜形成測定,將收獲的細菌細胞以105個細胞/ml的濃度重懸于合適的培養液中。將1.5cm的導管段(原始的和經修飾的)置于具有2ml細菌懸浮液的15ml離心管中并在100rpm振蕩下,于37℃水浴中進行孵育。對于細菌粘附測定,孵育的持續時間為4小時,而對于生物膜形成測定為24小時。在孵育期之后,除去細菌懸浮液并用PBS將將該段洗滌三次以除去任何非粘附的或松散粘附的細菌。對于平板涂布法,為了忽視在導管段端部粘附于未涂布的截面表面的細菌,切掉導管段的兩端(各自0.25cm)。將剩下的1cm段放入具有3mlPBS的新15ml離心管中。將具有段的PBS溶液進行超聲7分鐘并渦旋20秒以除去粘附的細菌細胞。將細菌溶液連續稀釋,涂在適當的瓊脂板上(對于大腸桿菌UTI89和銅綠假單胞菌為溶菌瓊脂(lysogenyagar),對于奇異變形菌為胰蛋白酶大豆瓊脂,對于大腸桿菌DH5α為營養瓊脂)并過夜培養以確定細菌細胞的數目。用無菌人工尿代替用于制備細菌懸浮液的PBS以相同的方式進行人工尿中導管表面上的細菌粘附。用三個樣品以一式兩份進行所有的實驗并計算平均值。

也用原始的和P3涂布的PU片和Co-Cr箔進行了生物膜形成測定。一般的方法類似于以上對于導管段所描述的方法。將1×1cm2的PU片或Co-Cr箔在2ml大腸桿菌DH5α或奇異變形菌懸浮液(在上面提到的適當培養液中105個細胞/ml)中孵育24小時,然后使用平板涂布法測定基底表面上細菌細胞的數目。

使用CLSM還觀察到了導管的腔內和腔外表面上的生物膜。在生物膜測定后,用PBS將導管段洗滌三次并縱向切割且用雙面膠帶固定到玻璃載片上以暴露所選擇的表面(腔內或腔外)。然后根據制造商的說明書施加組合染料(LIVE/DEADBaclight細菌生存力試劑盒,MolecularProbes,L13152,LifeTechnologies,California,US)。在生物膜中,具有完整膜的活細菌將被染成綠色,然后在具有A1共聚焦系統的NikonTi-E顯微鏡(Nikon,Tokyo,Japan)下進行觀察。使用多氬488激光器作為照明源,對于綠信號,將濾波器設置為:488nm激發和長通500-530nm發射。使用NIS-ElementsC軟件來生成生物膜的體積視圖圖像。

測定無菌人工尿中的銀含量和釋放譜

使用略微改進的酸消化法提取導管涂層中的銀,并使用ICP-MS(型號HP7500a,Agilent,California,US)測定含量18。簡言之,在具有觀察玻璃蓋的玻璃瓶中將1cm的導管段浸入10ml的50%HNO3中。通過在油浴中將酸溶液加熱至100℃來消化導管段的腔內和腔外兩者表面上的銀涂層,將該溫度保持1小時以完成消化過程。消化后,銀涂布的導管的原始顏色(對于DoverTM銀涂布的導管為橙色,而對于P1、P2和P3涂布的導管為深棕色)褪色并且該段變脆。使用XPS對經消化的導管段的腔內表面進行了測試以檢查來自涂層的銀的完全溶解(圖S2)。將經消化的溶液用蒸餾水稀釋,并基于由標準銀溶液(在硝酸中1,000mg/l銀,Sigma-Aldrich)制備之不同銀濃度的溶液產生的參照校準曲線,使用ICP-MS對銀進行定量。測定三個重復,并將結果表示為平均值±SD。

通過在15ml離心管中將1cm導管段浸入2ml的無菌人工尿中來進行銀釋放。在37℃水浴中以100rpm振蕩孵育溶液。每24小時,取出導管段并浸入于新鮮的人工尿溶液中。收集含有釋放的銀的溶液并儲存在4℃冰箱中。在ICP-MS測量前,向收集的溶液添加1ml的2%HNO3。通過將每天釋放的量合計來確定7天內銀釋放的總量。測定三個重復,并將結果表示為平均值±SD。

確定人工尿中的銀物質及其殺菌性質

在15ml離心管中,將1cm導管段浸入2ml的無菌人工尿中,然后將其在37℃水浴中以100rpm振蕩進行孵育,24小時后,取出導管段并收集含有釋放的銀的人工尿。使用Zetasizer納米系統(MalvernInstrument,Worcestershire,UK)記錄人工尿中任何顆粒的尺寸分布?;雇ü?.2μm膜過濾含有釋放的銀的人工尿,并使用ICP-MS確定濾液中銀的濃度。為了評估銀物質的殺菌效率,在15ml離心管中,(在通過0.2μm的膜過濾之前和之后)將0.9ml具有釋放的銀的人工尿與0.1ml的奇異變形菌懸浮液(在人工尿中5×107個細胞/ml)混合。在37℃水浴中以100rpm振蕩4小時后,將細菌懸浮液涂在胰蛋白酶大豆瓊脂板上并過夜培養以確定活細菌的數目。通過將0.9ml的無菌人工尿與0.1ml的奇異變形菌懸浮液(在人工尿中5×107個細胞/ml)混合來進行對照實驗。與對照實驗中的活細菌數目相比,由具有銀物質的人工尿中活細菌數目的減少來計算釋放的這些物質的殺菌效率。

結垢測定

將1cm導管段浸入2ml具有濃度為105個細胞/ml之奇異變形菌的人工尿培養基中。將溶液在37℃水浴中以100rpm振蕩進行孵育。每24小時后,將該段取出并浸入另一個2ml新制備的具有105個細胞/ml奇異變形菌的人工尿培養基中。細菌的攻擊一直持續直到肉眼觀察到培養基由于沉淀形成而變得渾濁。認為這個階段是結垢的開始。對于各種類型的涂層,對五個獨立制備的樣品進行了試驗,并記錄結垢發生所用的時間。每天收集在試驗中使用的人工尿培養基并儲存在4℃冰箱中。向各管添加1ml的10%HNO3,并如上所述使用ICP-MS測定溶液中的銀濃度。測定三個重復,并將結果表示為平均值±SD。使用SEM(JEOL,型號5600LV,Tokyo,Japan)觀察結垢試驗之前和之后導管段的截面和腔內表面。使用NanoMeasurer軟件由各類型涂層的三個圖像來測量涂層厚度,并且在每個圖像中測量六個不同的位置。使用EDX測定結垢試驗后存在于導管段之腔內表面的元素。

穩定性試驗

進行摩擦和彎曲試驗以評估P3涂布的導管之表面涂層的穩定性。在摩擦試驗中使用的裝置在圖S3A中示意性地示出。切開新鮮的豬膀胱以接近內部空腔并夾在兩片PMMA板(L×W:5.5cm×3cm)之間。這兩個PMMA板形成6mm直徑的通道以使導管通過裝置。用兩根扎帶(cabletie)將PMMA板和豬膀胱緊緊地固定。使6cm的導管段從一側插入膀胱空腔,然后從另一側拉出(圖S3B)。將該過程重復5次以實現30cm的總移動距離,這大約等于導管插入期間導管在尿道中的通過距離。通過向上和向下15次將6cm的導管段反復彎曲成環進行彎曲試驗(圖S3C)。在彎曲試驗后從6cm導管段的中間部分切下2cm的段用于隨后的研究。在試驗后將導管段用大量的蒸餾水洗滌并在氮氣流下干燥。使用XPS分析來比較摩擦試驗(P3-F)和彎曲試驗(P3-B)之前和之后P3涂布的導管的表面組成。為了在穩定性試驗后進一步評估導管的抗菌功效,將導管切成1.5cm的段并進行生物膜形成測定。24小時后,將導管縱向切割并使用雙面膠帶以腔外表面朝上的方式將其固定到玻璃載片上。使用LIVE/DEADBaclight染料對在腔外表面上形成的生物膜進行染色并使用CLSM進行觀察(具體參見上述XPS表征和生物膜形成測定)。

細胞毒性測定

根據在ISO10993-5(Biologicalevaluationofmedicaldevices-Part5:Testsforinvitrocytotoxicity)中指出的標準方案19,使用MTT測定對經修飾導管對于哺乳動物細胞的細胞毒性作用進行了評估。首先將待測試的導管段在UV輻照下滅菌1小時。為了提取任何潛在的毒性物質,將所述導管段置于含有3T3成纖維細胞培養基(下文進行了描述)的15ml管中。使用不同的導管表面面積/培養基體積(SA/Vol)比(在2ml培養基中一個1cm的導管段,SA/Vol比=~1.25cm2/mL;在1.7ml培養基中兩個1cm的導管段,SA/Vol比=~3cm2/ml)。在37℃下,在5%CO2和95%空氣的潮濕氣氛下將導管段孵育72小時。如上所述使用ICP-MS測定培養基中提取的Ag的濃度。

在補充有10%胎牛血清、1mML-谷氨酰胺,100IU/ml青霉素的Dulbecco改良的Eagle培養基(DMEM)中培養3T3成纖維細胞。將100μl的細胞懸浮液以每孔104個細胞的密度接種于96孔板中并于37℃在5%CO2和95%空氣的潮濕氣氛下孵育24小時。然后使用100μl的導管提取培養基來替換各個孔中的培養基并將細胞在37℃下再孵育24小時或72小時。僅使用培養基(培養基也在相同條件下進行了預孵育但沒有任何導管段)作為無毒對照且使用1%TritonX-100(Sigma-Aldrich)作為毒性對照以類似的孵育時間進行了對照實驗。在孵育期結束時,除去每孔中的培養基并向每個孔添加100μl的MTT溶液(在培養基中0.5mg/ml)。在37℃下孵育4小時后,除去培養基并將甲晶體溶解于100μl的二甲基亞砜中15分鐘。然后在微板讀數器(TecanGENios,Switzerland)上于570nm處測量光學吸光度。將結果表示為相對于在無毒對照實驗中得到的光學吸光度的百分比。為了確定銀的細胞毒性,將AgNO3以不同的濃度溶解于培養基中。然后使用這種含Ag的培養基來培養預先接種于96孔板中的細胞,并使用如上所述的MTT測定來測定細胞生存力。

統計學分析

將結果記錄為平均值±SD并使用單因素方差分析(ANOVA)和Tukey事后檢驗進行統計學評估。接受的統計學顯著性為P<0.05。

實施例1

聚(SBMA-共-AAm)的組成

圖S4示出了聚(SBMA-共-AAm)的XPS寬掃描譜和N1s芯能級譜。由XPS分析,在[SBMA]/[AAm]為4∶1的單體進料比時,確定聚(SBMA-共-AAm)的[N+]/[N]比為3.2。因為在每個SBMA單元中有一個-N+(CH3)3基團并且在每個AAm單元中有一個-NH2基團,所以認為在聚(SBMA-共-AAm)中[SBMA]/[AAm]的比為3.2。與單體進料比相比,在共聚合物中更低的SBMA含量是由于空間位阻所引起的SBMA單體反應性的降低,與較小的AAm單體相比,空間位阻限制了更大的SBMA單體接近生長中的聚合物鏈20。

實施例2

涂布過程

我們之前的工作已經表明多巴胺可以自聚合至PDA并在硅酮表面上形成高度穩定性的層以用于錨定其他部分16。將PDA涂布的表面浸入AgNO3水溶液中將Ag+離子還原為納米顆粒。FESEM圖像和EDX分析證實AgNP以高密度均勻地分布在該表面上(圖S5)。然后通過與下面的PDA層接枝和/或與AgNP結合,可將第二個PDA層涂布在AgNP之上21,22。由于PDA提供的柔性,從而可在PDA-AgNP-PDA表面的頂部形成另外的AgNP-PDA雙層。也可通過邁克爾加成(Michaeladdition)和席夫堿反應(Schiff-basereaction)在聚(SBMA-共-AAm)的氨基基團和PDA層中的兒荼酚/鄰醌基團之間接枝為防污聚合物的聚(SBMA-共-AAm)(在聚(SBMA-共-AAm)中[SBMA]/[AAm]的比被確定為3.2,如圖S4)16,21。

實施例3

原始的和經修飾的硅酮片的XPS分析

圖2示出了在多個涂布步驟之后,原始的和經修飾的硅酮片表面的XPS寬掃描和N1s芯能級信號??梢鑰闖?,在原始硅酮表面沒有可檢測的氮信號。在用PDA處理24小時后,觀察到在~400eV處有強N1s峰,這表明接枝了PDA層。在PDA涂層上形成AgNP后,可觀察到在~374.1eV和~368.1eV處有Ag3d峰。在~400eV處PDA-AgNP的N1s峰的減少是由于PDA被AgNP所覆蓋。當將另一個PDA層涂布在PDA-AgNP涂層上時,N1s信號增加且Ag3d信號相應地降低。在P2和P3涂布的表面上,通過在寬掃描中的S2p和S2s峰(~167.5eV和~231.5eV)以及在~402.5eV處另外的N1s峰(對應于-N+(CH3)3基團)表明存在聚(SBMA-共-AAm)接枝層(圖2)。

實施例4

原始的和經修飾的硅酮片的接觸角

原始的和經修飾的硅酮片表面的接觸角差異很大(圖3)。當用PDA涂布疏水的硅酮表面時,其親水性非常顯著地提高(接觸角從原始表面的106.1±1.6°降低至PDA涂布表面的52.7±2.6°),并且隨著AgNP的沉積,接觸角示出進一步輕微降低至46.0±3.7°。在AgNP層(P1)上的另外PDA涂層將接觸角降低至30.2±3.8°。在用聚(SBMA-共-AAm)層(P2&P3)涂布后,表面在水中完全水合(接觸角<10°),這是因為在表面上有大量的兩性離子基團23,24。

實施例5

原始的和經修飾硅酮導管的表面粗糙度

在多個修飾步驟后,導管的表面粗糙度示出顯著的變化(圖S6)。原始的硅酮導管表面相對光滑,粗糙度為12.5nm。由于P2和P3涂層,導管表面變得更粗糙且粗糙度值分別提高至147nm和179nm。相比之下,在DoverTM導管表面上的磷酸銀離子水凝膠涂層具有112nm的表面粗糙度。

實施例6

機械性質和表面潤滑性

內置裝置(例如導尿管和輸尿管支架)在其體內放置期間不得不經受身體運動,因此,在表面修飾后導管必須保持其機械完整性。圖4示出了DoverTM銀涂布的硅酮導管、未經修飾的全硅酮導管以及P2和P3涂布的硅酮導管之機械性質的比較。P2和P3涂布的導管的應力-應變關系與未修飾的全硅酮導管的應力-應變關系并沒有太大的不同。因此,我們的涂布方法并沒有顯著改變硅酮的機械性質。另一方面,DoverTM銀涂布的硅酮導管需要更高的應力以產生類似于全硅酮和P2、P3導管的應變,并且在較低的應變后它也達到斷裂點。

DoverTM導管段、原始導管段、P2和P3導管段之表面潤滑性的比較示于圖S7中。對于原始導管段,將所述導管段從固定的硅酮片拉出所需要的功為1033.5±57.9N·mm(曲線下的積分面積)。對于P2和P3涂層,分別需要485.5±26.3N·mm和481.3±35.3N·mm。由于導管段是由為彈性體的硅酮制成的,所以該段在固定的硅酮片之間被拉動時可伸長。在圖S7中可以看出,哪里的通過距離大于初始導管段的長度。然而,由于原始導管、P2和P3導管的機械性質相當(圖4),因此潤滑性曲線之間的差異主要是由于外部的摩擦力。這些結果表明與原始導管的表面相比,涂布的導管表面變得更加潤滑。報道了在水存在下,PDA涂層被水合并且具有低的摩擦力25。類似地,聚(SBMA-共-AAm)層也被高度水合。因此,可以預期,在體內環境中,P2和P3涂層將賦予導管表面潤滑性,這在導管插入和移出過程期間將是有利的。對于DoverTM導管段,將其從固定的硅酮片中移出需要277.6±22.7N·mm。如圖4所示,因為DoverTM導管比未經修飾的、P2或P3硅酮導管具有更大剛性,所以在潤滑性試驗期間,DoverTM導管經歷了更小程度的變形并通過更短的距離。因此,比較DoverTM導管和在圖S7中所示的其他導管所需要的功不能給出表面潤滑性方面差異的準確指示。

實施例7

導管涂層中銀含量的定量

圖5A示出了在不同導管段中的銀含量。DoverTM銀涂布的導管具有10.2±0.6μg/cm2的銀含量,而P1和P2涂布的導管具有略微更高的量(分別為13.2±0.5μg/cm2和12.8±0.8μg/cm2)并且P3涂布的導管具有高得多的銀含量(21.9±0.7μg/cm2)。圖5B示出了從6.5cmP3涂布的導管段的不同位置切下的1cm段之間的銀含量沒有顯著差異,這證實了導管段上涂層的均勻性。

實施例8

細菌粘附和生物膜形成測定

如圖6A中原始導管的腔內表面上之奇異變形菌生物膜的CLSM圖像(體積視圖)所示,在原始導管上很容易粘附細菌和形成生物膜。PDA-聚(SBMA-共-AAm)涂層減少了生物膜形成,但在表面上仍然可以觀察到一層細菌細胞。由于涂層(P3涂布的導管)中銀的存在,因此進一步抑制了生物膜的形成且在表面上存在少得多的活細菌。與原始導管的相應表面上生物膜的形成相比,在P3涂布的導管的腔外表面上也觀察到生物膜形成的類似減少(圖S8)。

圖6B中給出了不同類型的經修飾導管表面抑制細菌定殖的功效??梢鑰闖?,在PDA涂布的導管表面上的細菌粘附和生物膜形成與在原始硅酮導管上的類似。另一方面,與原始的硅膠導管相比,PDA-聚(SBMA-共-AAm)涂布的導管減少了細菌粘附和生物膜形成,對于大腸桿菌UTI89減少了>96%,對于大腸桿菌DH5α減少了>97%,對于奇異變形菌減少了>92%且對于銅綠假單胞菌減少了>94%。這些結果與早先的發現(即兩性離子聚SBMA涂層可有效地減少細菌粘附和生物膜形成)一致26。由于聚(SBMA-共-AAm)涂層的抗粘附性和釋放的銀物質之殺菌性質的組合,P2和P3涂布的導管上四種細菌菌株的粘附減少了≥99%。大腸桿菌UTI89、大腸桿菌DH5α和銅綠假單胞菌生物膜形成的程度也減少了≥99%。雖然已報道奇異變形菌比大腸桿菌具有更高的形成生物膜的傾向3,16,但是P2和P3涂布的導管仍然可以實現將奇異變形菌生物膜形成減少≥98%。對于四種細菌菌株,市售的DoverTM銀涂布的導管將細菌粘附減少≥99%,且生物膜形成減少≥97%。圖6B中示出的細菌粘附結果是使用PBS中的細菌懸浮液獲得的。使用人工尿代替PBS中的大腸桿菌UTI89懸浮液進行類似的測定。所獲得的結果類似于用PBS獲得的結果,且與原始的硅酮導管相比,DoverTM和P3涂布的導管將大腸桿菌UTI89粘附減少了>99%(圖S9)。此外,使用多AgNP-PDA雙層與聚(SBMA-共-AAm)的最后接枝層偶聯的策略可適于涂布其他材料,例如PU和Co-Cr,且與各自未修飾的表面相比,在涂布的表面上由大腸桿菌DH5α和奇異變形菌引起的生物膜形成減少了至少97%(圖S10)。

實施例9

無菌人工尿中的銀釋放譜

來自無菌人工尿中涂布的導管段的銀釋放譜示于圖7A中。在7天內來自P1、P2和P3涂布的導管段的銀釋放譜是完全線性的。P1和P2涂布的導管段具有相似的銀含量(分別為13.2±0.5μg/cm2和12.8±0.8μg/cm2,圖5),且前兩天中釋放的銀的量相當,但之后,后者保持更恒定的釋放速率。在P2涂布的導管段中聚(SBMA-共-AAm)層的防污性可抑制來自尿之沉淀的鹽在表面上的沉積,因此使得更自由地發生Ag+的擴散。雖然在P3涂層中的銀含量遠遠高于在P1和P2涂層中的銀含量(在P3中為21.9±0.7μg/cm2),但是在7天內從P3涂層釋放的銀的量僅略高于其他兩個涂層。對于AgNP-PDA涂布的導管段(P1、P2和P3),在PDA層中銀以AgNP而存在,且AgNP在其擴散出去之前必須被氧化成Ag+離子。PDA層穩定了AgNP并阻礙了其氧化27。此外,在AgNP涂層頂部另外的PDA層充當障礙以抑制擴散過程。DoverTM銀涂布的導管比P1和P2涂布的導管具有更少的銀(在DoverTM中為10.2±0.6μg/cm2),但其在試驗開始時的釋放速率更高,雖然釋放速率在3天后下降。因此,磷酸鹽水凝膠涂層不像P2和P3涂層一樣有效地確保線性釋放。在無菌人工尿中的銀釋放速率可能并不是實際應用條件的良好代表。因此,也研究了在接種有奇異變形菌的人工尿中的銀釋放,并與實施例10中所討論的無菌人工尿中的銀釋放進行了比較。

尿含有高濃度的氯離子和磷酸根離子(在本研究使用的人工尿中有~126mM的Cl-和~20mM的PO43-),其可與銀離子反應以形成不溶性銀鹽(例如,AgCl、磷酸銀)。當在人工尿中孵育銀涂布的導管(DoverTM、P2和P3)時,形成~1-6μm的不溶性鹽(圖S11A)。在使用0.2μm的過濾器除去不溶性鹽后,發現~80%的銀殘留在濾液中,表明它們主要是可溶性Ag物質(圖S11B)。細菌測定也證實濾液保留>99%的殺菌效率(圖S11B)。報道稱溶液中可溶性Ag物質的性質作為Ag和Cl濃度的函數而變化,并且隨著Cl/Ag之比例的增加,AgClx(x-1)-物質與固體AgCl相比開始占優勢28。24小時后,從1cm銀涂布的導管段(DoverTM、P2和P3)釋放到2ml無菌人工尿中的銀的量為0.18μg/ml至0.34μg/ml(1.7μM至3.2μM,圖S11B)。在人工尿中Cl/Ag之比被計算為3.9×104-7.4×104,在該范圍內,預期可形成可溶性AgClx(x-1)-物質,且它們甚至可以是主要的Ag物質28。因此,從涂層向尿中釋放的Ag可以以Ag+、不溶性Ag鹽和可溶性AgClx(x-1)-物質而存在,并且所有這些都有殺菌作用28,29。

實施例10

在接種有奇異變形菌的人工尿培養基中的銀釋放

還在接種有奇異變形菌的人工尿培養基(105個細胞/ml)中測試了銀從DoverTM銀涂布的導管段、P1、P2和P3涂布的導管段的釋放,結果示于圖7B&C中。DoverTM銀涂布的導管僅在前5天中持續釋放銀。5天之后,隨著銀釋放速率的急劇下降,在第6天和第7天之間該導管發生結垢(參見實施例11中的結垢測試結果)并不令人感到意外。這種釋放行為與在無菌人工尿條件下的釋放行為不同(圖7A),其中觀察到7天內幾乎為線性的釋放速率。這種差異可能是由于形成條件化層(含有裂解的細菌細胞和培養基成分)以及隨后在涂層上形成結垢,這阻礙銀的釋放(在實施例11中討論)。在7天后,P1、P2和P3涂布的導管段持續釋放銀,但是在此期間觀察到P1和P2涂布的導管的釋放速率逐漸降低。將在感染細菌的人工尿中的釋放速率(圖7B和C)與在無菌人工尿中的釋放速率(圖7A)相比,可以看出,在結垢發生之前的時間段內,在前者中從所有的四個導管中釋放出更多的銀。銀物質洗脫的增加可能是由于其在培養基和/或細菌膜中與硫化物或SH-基團相互作用,以及由于如實施例11所討論的細菌作用引起的涂層聚合物組分的生物降解。

實施例11

結垢測定

為了模擬持續感染的情況,將接種有105個細胞/ml濃度的奇異變形菌的人工尿用于結垢測定,并且每天更換接種該細菌的培養基。在24小時內觀察到此培養基由于晶體沉淀而變混濁,這是由于奇異變形菌引起的尿素水解而使培養基的pH提高6,如圖8A中的樣本i所示。圖8B&C示出了通過從樣品i離心所收集的晶體的形態和EDX元素分析??梢鑰吹?,所述晶體主要是從尿沉淀的磷酸鈣和磷酸鎂。在第1天和第7天,用浸入在接種奇異變形菌的人工尿培養基中之導管段獲得的結果示于圖8A中。在第1天,所有具有銀涂布的導管的人工尿樣品(樣品ii、iii、iv、v,分別包含DoverTM、P1、P2、P3導管段)均保持透明,無沉淀的跡象。這可歸因于釋放的銀物質以及導管涂層上AgNP的殺菌作用。然而,在第7天,具有DoverTM銀涂布的導管段的人工尿(樣品ii)變混濁,而具有AgNP-PDA修飾的導管段的培養基(樣品iii、iv、v)則保持透明。在圖9中給出用不同的導管段觀察到的結垢前的平均持續時間。DoverTM銀涂布的導管抑制結垢<7天。用P1和P2涂布的導管,培養基分別在8和12天內保持無沉淀。P3涂布的導管保持其抵抗結垢的能力長達45天,這比短期導管插入所需的時期(30天)還長。

圖10A至10F示出了結垢試驗之前和之后,導管段之腔內涂層的截面。DoverTM銀涂布的導管具有5.1±0.4μm厚度的磷酸銀水凝膠涂層(圖10A)。P2和P3涂布的導管分別具有8.6±0.4μm和13.1±1.2μm厚度的涂層(圖10B&C)。結垢試驗(在接種奇異變形菌的尿培養基中持續孵育)7天和40天后,P2和P3導管段上的聚合物涂層分別變薄和變得更多孔(圖10E&F)。這可能歸因于Ag+從AgNP釋放,以及聚合物層的生物降解。與此相反,當在無菌人工尿中孵育相同的時間段時,這些涂層保持相對完整(圖S12)。對于DoverTM銀涂布的導管,7天后在培養基中觀察到在其表面上有大量的晶體形成,并且不能將該涂層與結晶塊區分開(圖10D)。SEM圖像(圖10G)和EDX分析(圖10J)也證實了7天后在DoverTM銀涂布的導管上有大量的鹽沉淀。與此相反,7和40天后,P2和P3涂布的導管表面各自相對無晶體(圖10H&I)。在培養基中7天后,P2涂布的導管表面和40天后P3涂布的表面的EDX譜示出來自下方硅酮基底的Si信號(圖10K&L),這與示出這些表面相對無結晶沉淀的SEM圖像一致(圖10H&I)。應當指出,結垢發生并不是因為導管涂層中的銀被耗盡。從圖5和圖7可計算出在結垢發生之前,在DoverTM導管中僅有~14%的銀被釋放。對于P3涂布的導管,雖然所釋放的銀的比例高于DoverTM導管釋放的銀的比例,但45天后在涂層中仍保留~50%的銀。因此,銀釋放的速率(而不只是涂層中銀的量)在抑制結垢方面發揮重要作用。

因為具有兩個AgNP-PDA雙層的P3涂層比具有一個雙層的P2涂層具有顯著好得多的性能(P3在45天內無結垢相對于P2為12天,圖9),所以可做出這樣的合理假設:如果在涂層中包含更多的AgNP-PDA雙層,則銀釋放譜可延長甚至更長的時間。這特別有希望用于開發長期應用的導尿管和輸尿管支架。

實施例12

穩定性試驗

在患者的導管插入或支架植入期間,可以預期導管或支架要經受摩擦力和彎曲力。因此,重要的是確認當經受這樣的力時,裝置表面上的涂層是穩定的。XPS分析表明,在摩擦和彎曲試驗之前和之后,P3導管段的腔外表面組成幾乎沒有變化(圖S13A)。在穩定性試驗后,歸因于聚(SBMA-共-AAm)涂層的S2p和S2s峰在XPS寬掃描譜中保持清晰可辨。試驗前P3導管的表面[Ag]/[C]之比為0.21%,而在摩擦試驗和彎曲試驗后分別為0.19%和0.21%。此外,已證明在這些穩定性試驗之前和之后,P3導管段在抑制奇異變形菌生物膜形成方面具有類似的功效(比較圖S8與S13B)。因此,可得出結論,在經修飾的導管表面上的涂層是穩定的并且可預期其在應用期間經受摩擦和彎曲運動。

實施例13

細胞毒性測定

細胞毒性測定的結果表明,在孵育72小時中用1.25cm2/ml的SA/Vol比獲得的導管提取物對成纖維細胞造成最小的細胞毒性,但是,當SA/Vol比提高至3cm2/ml時,含有來自P3和DoverTM導管段之提取物的培養基對細胞示出一定的細胞毒性(圖S14A&B)。之前已證明PDA和聚SBMA涂層表現出最小的細胞毒性16,31。從用不同SA/Vol比獲得的提取培養基中Ag濃度的測定(圖S14C),可得出結論,當培養基中洗脫的銀濃度為≤1.5μg/ml時,則具有最小的細胞毒性作用(即,≥90%細胞生存力)。使用含有不同濃度之來自AgNO3的Ag物質的培養基以細胞生存力試驗進一步證實了這些結果(圖S14D)。

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