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西甲埃瓦尔对维戈塞尔塔: 一種用于治療冠心病心絞痛的中藥組合物及其制備方法.pdf

摘要
申請專利號:

维戈塞尔塔vs皇家社会 www.vmyqew.com.cn CN201510894354.X

申請日:

20151208

公開號:

CN105395747A

公開日:

20160316

當前法律狀態:

有效性:

審查中

法律詳情:
IPC分類號: A61K36/8888,A61P9/10 主分類號: A61K36/8888,A61P9/10
申請人: 中國中醫科學院廣安門醫院
發明人: 王階,張翠英,郭麗麗,陳恒文,任偉光,張盈穎,何慶勇,魏本君,袁蓉
地址: 100053 北京市宣武區北線閣5號
優先權: CN201510894354A
專利代理機構: 北京正理專利代理有限公司 代理人: 張文祎
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法律狀態
申請(專利)號:

CN201510894354.X

授權公告號:

法律狀態公告日:

法律狀態類型:

摘要

本發明公開了一種用于治療冠心病心絞痛的中藥組合物,該中藥組合物的有效成分是由如下重量配比的原料藥制成的:丹參10-20份、黃連2-8份、人參3-9份、三七1-5份、葛根10-20份、赤芍7-17份、肉蓯蓉5-15份、法半夏3-9份。本發明同時公開了該中藥組合物三種不同且有效的制備方法。該中藥組合物對冠心病心絞痛瘀熱痰互結證具有顯著效果。

權利要求書

1.一種用于治療冠心病的中藥組合物,其特征在于該中藥組合物是由如下重量配比的原料藥制成的:丹參10-20份、黃連2-8份、人參3-9份、三七1-5份、葛根10-20份、赤芍7-17份、肉蓯蓉5-15份、法半夏3-9份。2.根據權利要求1所述的中藥組合物,其特征在于各原料藥的配比為:丹參12-18份、黃連3-7份、人參4-8份、三七2-4份、葛根12-18份、赤芍9-15份、肉蓯蓉7-13份、法半夏4-8份。3.根據權利要求2所述的中藥組合物,其特征在于各原料藥的配比為:丹參15份、黃連5份、人參6份、三七3份、葛根15份、赤芍12份、肉蓯蓉10份、法半夏6份。4.根據權利要求1、2或3所述的中藥組合物,其特征在于用等量的酒蓯蓉代替肉蓯蓉。5.制備權利要求1至4中任一項所述中藥組合物的方法,其特征在于該方法可以是以下三種工藝中的任一種:工藝一:將全部原料藥以水煎煮提取,提取液濃縮至相對密度1.1-1.2,加入乙醇至含醇量達60%-80%,靜置后取上清液,回收乙醇,余液即得;工藝二:將丹參、黃連一起用60%-80%乙醇提取,提取液回收乙醇,得余液,備用;將其余原料藥一起以水煎煮提取,提取液濃縮至相對密度1.1-1.2,加入乙醇至含醇量達50%-70%,靜置后取上清液,回收乙醇,得余液;將兩種余液合并即得;工藝三:將丹參、黃連、人參和三七一起用60%-80%乙醇提取,提取液回收乙醇,得余液,備用;將其余原料藥一起以水煎煮提取,提取液濃縮至相對密度1.1-1.2,加入乙醇至含醇量達50%-70%,靜置后取上清液,回收乙醇,得余液;將兩種余液合并即得。6.制備權利要求1至4中任一項所述中藥組合物的方法,其特征在于該方法可以是以下三種工藝中的任一種:工藝一:將全部原料藥煎煮提取3次,每次加水10倍量、煮沸0.5小時,提取液合并后濃縮至相對密度1.12,加入乙醇至含醇量達70%,放置24小時,取上清液,回收乙醇,余液即得;工藝二:將丹參、黃連一起用70%乙醇提取3次,每次加10倍量乙醇溶液、提取0.5小時,合并提取液,回收乙醇,得余液,備用;將其余原料藥一起煎煮提取3次,每次加水8倍量、煮沸1小時,提取液合并后濃縮至相對密度1.12,加入乙醇至含醇量達60%,放置24小時,取上清液,回收乙醇,得余液;將兩種余液合并,即得;工藝三:將丹參、黃連、人參和三七一起用70%乙醇提取3次,每次加10倍量乙醇溶液、提取1小時,合并提取液,回收乙醇,得余液,備用;將其余原料藥一起煎煮提取3次,每次加水10倍量、煮沸1小時,提取液合并后濃縮至相對密度1.18,加入乙醇至含醇量達60%,放置24小時,取上清,回收乙醇,得余液;將兩種余液合并,即得。7.權利要求1至4中任一項所述中藥組合物在制備用于治療冠心病心絞痛的藥物中的應用。8.權利要求1至4中任一項所述中藥組合物在制備用于治療冠心病心絞痛瘀熱痰互結證的藥物中的應用。9.權利要求1至4中任一項所述中藥組合物在制備用于治療瘀熱痰互結所致胸痹心痛的藥物中的應用。

說明書

技術領域

本發明涉及一種用于治療冠心病心絞痛的中藥組合物及其制備方法,屬于中醫藥領域。

背景技術

近年來我國冠心病發病率呈現加速上升的趨勢,根據《中國心血管病報告2011》,我國心血管疾病現患病人數2.3億,每10個成人中就有2個患有心血管疾病。中醫藥在冠心病的治療上有一定優勢,通過對冠心病的中醫病因病機分析,從整體出發進行辨證論治,在冠心病系統治療的整個過程中均能有較好的調節作用。

冠心病心絞痛屬于中醫胸痹心痛范疇。中醫對冠心病心絞痛的認識很早,最早追溯到馬王堆漢墓出土的《五十二病方》,其中就有對“心痛”的描述。對于胸痹心痛病機的論述,最經典的是《金匱要略》,其中以“陽微陰弦”概括了其病機特點,“陽虛知在上焦,所以胸痹、心痛者,以其陰弦故也”,即心陽虛衰,陰邪占于陽位,而為胸痹心痛?;詿寺?,筆者認為胸痹病機分為“標”與“本”兩個方而:“本”在于正氣虧虛,胸中陽氣不振,即“陽微”,“標”是實邪內阻,即瘀血與痰濁阻滯脈道,即“陰弦”。

血瘀和痰濁阻滯心脈是胸痹心痛的核心病機。心主血脈,血液的狀態與心臟的功能相互影響,胸痹為心胸之痹證,《黃帝內經·素問》中指出了胸痹病因:“心痹者,脈不通”,“痹在于脈則血凝而不流”,提示了血瘀和心脈痹阻是胸痹的發病基礎,血凝聚于脈道,使得心脈受阻,不通則痛。心與血脈的關系密切,故血瘀在冠心病心絞痛病因病機中處于一個根本的位置,無論如何辨證分型,血瘀證都作為其背景式證候。除此之外,《脈因證治》中認為:“胸痹,皆痰水宿飲,停留不散”;“胸痹為氣實,氣分挾痰飲”,現代人生活壓力大、飲食營養不均衡,容易傷于脾胃,脾胃運化失常而導致痰濕內生,痰濁內阻于心脈,而為胸痹心痛。古代很多醫家亦偏向于從痰濁的角度來辨治胸痹,《金匱要略·胸痹心痛短氣病脈證治第九》中治療“胸痹不得臥,心痛徹背者”,用瓜萎薤白半夏湯,即認識到痰濁對于胸痹的影響,從通陽化痰的角度治療胸痹心痛。胸痹心痛是因于瘀血痰濁的阻滯,而瘀血與痰濁產生的根本原因是心陽虧虛:正氣存內、邪不可干,而正氣虧虛是“邪”產生的根本原因,瘀和痰這樣的內生病理產物也是如此:心氣虧虛,不足以推動血脈,血脈勢緩而成瘀,形成瘀血;上焦氣機失調,或中焦脾胃運化失常,使得痰濁內生,困阻于心脈。

冠心病患者都伴有不同程度的血液流變學及微循環異常,表現為血液黏度增高,纖維蛋白原增加,血沉上升,微循環障礙等,這些變化與中醫的血瘀證較為契合,即血液凝滯不行而瘀阻于脈道,多項現代研究直接表明血液流變學變化與血瘀證的形成具有一定關系。同時,冠心病痰濁證患者亦存在著血液流變學異常以及血脂代謝紊亂,根據現代研究結果,普遍認為痰濁和血脂在內涵上有高度聯系性,亦有基于臨床與基礎研究的推斷認為痰瘀是冠狀脈脂質斑塊的主要病理基礎。

發明內容

第一部分:處方組成

本發明所述用于治療冠心病心絞痛的中藥組合物,其有效成分是由如下重量配比的原料藥制成的:丹參10-20份、黃連2-8份、人參3-9份、三七1-5份、葛根10-20份、赤芍7-17份、肉蓯蓉5-15份、法半夏3-9份。

確切的,所述原料藥的重量配比為:丹參12-18份、黃連3-7份、人參4-8份、三七2-4份、葛根12-18份、赤芍9-15份、肉蓯蓉7-13份、法半夏4-8份。

更準確的,所述原料藥的重量配比為:丹參15份、黃連5份、人參6份、三七3份、葛根15份、赤芍12份、肉蓯蓉10份、法半夏6份。

上述所有原料藥,均符合現行中國藥典的相關標準,并且其中的肉蓯蓉也可用等量酒蓯蓉代替。

本發明中藥組合物具有活血化瘀,清熱滌痰之功效,可用于治療瘀熱痰互結所致胸痹心痛,癥見胸痛胸悶,或痛引肩背、心悸氣短、心煩難眠、口干乏力、舌質紫暗、苔黃膩、大便干、小便黃,或冠心病心絞痛瘀熱痰互結證,見上述癥狀者。該中藥組合物具有活血祛痰、宣痹止痛、寧心安神的作用,對缺血性冠心病、心肌梗死及心絞痛具有顯著的治療作用。

依據中醫理論,本發明中藥組合物的可做以下方解。丹參:味苦,微寒,歸心、肝經,功擅活血祛瘀,涼血消癰,為君藥;其色赤入心,能破宿血,補新血,一味而兼具活血、養血之功?;屏何犢?,寒;歸心、肝、胃、大腸經,清熱燥濕,瀉火解毒,為臣藥;其尤長于清濕火郁結。法半夏:辛溫,入肺、脾、胃經,可燥濕化痰,消痞散結,為臣藥,合黃連辛開苦降,通利泄濁,降逆散結。赤芍:味苦,微寒,歸肝經,清熱涼血,散瘀止痛,亦為臣藥,可助丹參以活血,合黃連以涼血。君一臣三,相合無間,直達病所,化瘀清熱,滌痰祛濁,使瘀熱痰邪,豁然得解。三七:甘溫、微苦,入肝、胃經,化瘀止血,活血定痛,既可助丹參通脈行瘀,又可防諸藥化瘀太過,而致出血,故為佐藥。葛根:辛甘性涼,入脾胃經,解肌退熱,生津止渴,亦為佐藥。人參:甘、微苦、溫,歸心、肺、脾經,大補元氣、補脾益肺,生津安神,同為佐藥,可補瘀熱耗傷之氣津,也可助黃連以除煩助眠。肉蓯蓉:甘、咸、溫,歸腎、大腸經,可補腎陽、益精血、潤腸通便,亦為佐藥。諸藥相伍,活血與清熱滌痰并用,祛邪與扶正共舉,活血而不致出血,祛邪而不致傷正,使瘀血得散,里熱得清,痰濕得化,邪去而正復,為胸痹心痛之瘀熱痰互結者標本兼治之劑。

第二部分:制備方法

在臨床使用時,本發明中藥組合物可以按傳統工藝以水煎煮取汁服用,為方便攜帶、儲存、服用等目的,也可按以下任一工藝進行提取精制。

工藝一:將全部原料藥以水煎煮提取,提取液濃縮至相對密度1.1-1.2(20℃測),加入乙醇至含醇量達60%-80%,靜置后取上清液,回收乙醇,余液即得。

工藝二:將丹參、黃連一起用60%-80%乙醇提取,提取液回收乙醇,得余液,備用;將其余原料藥一起以水煎煮提取,提取液濃縮至相對密度1.1-1.2(20℃測),加入乙醇至含醇量達50%-70%,靜置后取上清液,回收乙醇,得余液;將兩種余液合并即得。

工藝三:將丹參、黃連、人參和三七一起用60%-80%乙醇提取,提取液回收乙醇,得余液,備用;將其余原料藥一起以水煎煮提取,提取液濃縮至相對密度1.1-1.2(20℃測),加入乙醇至含醇量達50%-70%,靜置后取上清液,回收乙醇,得余液;將兩種余液合并即得。

確切的,該中藥組合物的制備工藝可以是以下任一種。

工藝一:將全部原料藥煎煮提取3次,每次加水10倍量、煮沸0.5小時,提取液合并后濃縮至相對密度1.12(20℃測),加入乙醇至含醇量達70%,放置24小時,取上清液,回收乙醇,余液即得。

工藝二:將丹參、黃連一起用70%乙醇提取3次,每次加10倍量乙醇溶液、提取0.5小時,合并提取液,回收乙醇,得余液,備用;將其余原料藥一起煎煮提取3次,每次加水8倍量、煮沸1小時,提取液合并后濃縮至相對密度1.12(20℃測),加入乙醇至含醇量達60%,放置24小時,取上清液,回收乙醇,得余液;將兩種余液合并,即得。

工藝三:將丹參、黃連、人參和三七一起用70%乙醇提取3次,每次加10倍量乙醇溶液、提取1小時,合并提取液,回收乙醇,得余液,備用;將其余原料藥一起煎煮提取3次,每次加水10倍量、煮沸1小時,提取液合并后濃縮至相對密度1.18(20℃測),加入乙醇至含醇量達60%,放置24小時,取上清,回收乙醇,得余液;將兩種余液合并,即得。

使用時,患者可以直接服用上述方法制得的藥液;為解決口感、便攜、儲存等問題,也可以將所得藥液按常規制劑工藝進一步制成顆粒劑、片劑、膠囊劑等劑型。

第三部分:工藝研究實例

以下內容為發明人進行本發明中藥組合物制備工藝篩選研究的技術內容,用以說明發明人的創造性貢獻。

一、對工藝1的研究

1儀器與材料

1.1儀器(略)

1.2藥材與試劑(略,均符合中國藥典標準)

2實驗方法

2.1水提取正交實驗設計

影響中藥成分提取效率的因素有很多,包括溶劑的選擇、浸泡時間、提取時間、提取次數、溶劑用量等等,考慮到醫院制劑的提取溶劑不能作改變,因此在不改變全水的條件下設計制劑的提取工藝。選擇加水量為藥材的6倍、8倍和10倍,提取時間選擇為0.5h、1.0h、1.5h,提取次數按常規方法選擇提取1次、2次、3次。

為了確定全方水提的最佳工藝條件,我們擬以正交試驗表L9(34)進行正交試驗,從而確定最優工藝,因素水平見下表1-1。

表1-1全方水提的因素水平表

2.2水提取工藝驗證

為了進一步驗證所選最優工藝,按照處方(72g)30倍藥量進行水提取工藝,每批樣品2160g,共3批樣品,按照最優工藝進行提取,測定提取液中各成分的含量和出膏率。

2.3醇沉工藝的優選

為了提高本藥的藥物治療效果、減少病人服用量,適用于大工業化生產,最大量除去大分子雜質而又使有效成分損失最小,選擇水提后醇沉除雜的方法以除去大分子雜質。因素水平見表1-2

表1-2醇沉因素水平表

取提取液濃縮,分別濃縮至密度為1.06、1.12和1.18,按照醇沉因素表進行正交試驗,每個樣品30mL,共9個樣品?;夯杭尤胍掖際購劑糠直鶇锏?0%,60%、70%,分別放置不同時間,過濾,定容,測定各指標成分及干膏量。

2.4醇沉工藝的驗證

為了進一步驗證所選醇沉最優工藝,分別取優選的相對密度的濃縮液,緩慢加入使達到一定醇沉濃度,放置一定時間,取上清液測定指標成分含量。

2.5各活性成分或指標成分的色譜條件

丹酚酸B含量測定:色譜柱:TCC18(4.6×250mm,5μm),檢測波長286nm,柱溫30℃,進樣量5μL,流速1.0mL·min-1,流動相:甲醇∶乙腈∶(甲酸∶水)=37∶13∶50(1∶59)(標準曲線Y=6170X+80.724,R2=0.9995)。

人參皂苷含量測定:色譜柱:安捷倫TCC18(4.6×250mm,5μm)色譜柱;檢測波長:203nm;流速:1.0mL·min-1;進樣量:10μL,以乙腈為流動相B,以水為流動相D。三七皂苷Rb1(標準曲線Y=1440.8X+3.1665,R2=0.9993)。

黃連生物堿含量測定:色譜柱:安捷倫TCC18(4.6×250mm,5μm)色譜柱;以乙腈-0.025mol·L-1磷酸二氫鉀溶液(27∶73)為流動相;檢測波長為345nm。流速:1.0mL·min-1;進樣量:10μL。包括鹽酸小檗堿、巴馬汀、黃連堿和表小檗堿四種生物堿(標準曲線Y=45834X+145.91,R2=0.9999)。

赤芍中芍藥苷含量測定:色譜柱:安捷倫HCC18(4.6×250mm,5μm)色譜柱;流動相:甲醇∶0.025mol·L-1磷酸二氫鉀=46∶54;檢測波長:230nm;流速:1.0mL·min-1;進樣量:10μL(標準曲線Y=12962X+49.026,R2=0.999)。

肉蓯蓉中松果菊苷含量測定:色譜柱:安捷倫TCC18(4.6×250mm,5μm)色譜柱;以甲醇為流動相A,以0.1%甲酸溶液為流動相B,進行梯度洗脫;檢測波長:330nm;流速:mL·min-1;進樣量:5μL(標準曲線Y=7111.3X+19.938,R2=0.9997)。

葛根中葛根素含量測定:色譜柱:安捷倫TCC18(4.6×250mm,5μm)柱;流動相:以甲醇-水(25∶75)為流動相;檢測波長為250nm。;流速:1.0mL·min-1;進樣量:10μL(標準曲線Y=43027X+174.87,R2=0.9998)

2.6提取液中活性成分的含量測定

精確量取各待測夜25mL,過濾后按照2.5中各指標成分色譜條件進行含量測定,每個樣品重復測定2次。

2.7干膏量的測定

取100mL提取液,先在95℃水浴鍋上蒸干,再置于60℃減壓干燥廂中干燥至稱重,計算干膏得率。

3結果與分析

3.1水提取正交實驗結果

由于正交試驗以6種成分為指標和干膏率結果共7項考察指標,選擇綜合加權評分法對試驗結果進行方差分析。設定滿分為100分,按照本發明中藥組合物君臣佐使組方原則,賦予各藥材指標成分的比重分數為:丹參含量20、黃連含量15、赤芍15、人參和三七15、葛根15、法半夏10、肉蓯蓉10,在此基礎上進行總加權評分,利用綜合評分值(Pi)對試驗結果進行方差分析:以Mij表示第j個指標成分下第i個指標成分的測定值,以各指標的最大值作為參照對同一指標各數據進行標準化處理;Dij表示第j個指標成分下的第i個測定值的標準化數據。Dij=Mij/(Mj)max,以Ni表示第i次試驗中干膏率的測定值,以干膏率的最大值作為參照對干膏率數據進行標準化處理,Ei=Ni/(Ni)max,其中i=1,2,……,9;j=1,2,……,6。綜合評分Pi=Σ比重分數×Dij+Σ10×Ei,將總分結果帶入正交試驗結果中,即得。結果分析見表1-3-表1-5。

表1-3L9(34)水煎煮正交實驗設計表與結果分析(綜合指標)

表1-4水煎煮提取工藝參數均值響應表

表1-5水煎煮提取工藝參數方差分析表

由實驗結果可以看出:以綜合指標進行方差分所得的最佳條件均是:A3B1C3,從這個結果來看影響水煎的顯著因素是提取次數(P﹤0.05),其次是加水量、提取時間,因此確定最佳工藝為A3B1C3,即加水量為藥材的10倍,煎煮時間為0.5h,煎煮次數為3次。

3.2水提取正交實驗工藝驗證

為了進一步驗證所選最優工藝為A3B1C3,按照處方30倍藥量進行水提取工藝,藥材提取及處理方法同2.1正交實驗方法,各指標成分測定方法、結果分析及賦予權重同2.5,多指標成分分析見表1-6。

表1-6水煎煮提取驗證結果分析(綜合指標)

由表1-6可知,三批試驗數據之間無明顯差異,最后確定水煎煮提取的最佳工藝條件為A3B1C3,即加水量10倍,提取時間為0.5h,提取3次。

3.3醇沉正交實驗測定結果

采用多指標成分進行測定及分析,方法同2.5,并根據配方原則賦予各指標成分一定權重,結果見表1-7-表1-9。

表1-7L9(34)醇沉正交結果分析(綜合指標)

表1-8醇沉工藝參數均值響應表

表1-9醇沉工藝參數方差分析表

由表中實驗結果可以看出:以多指標綜合得分進行分析,所以最佳條件為A3B3C3,以極差R值和離均差平方和SS值為指標進行分析,影響干膏量較大的因素是藥液相對密度B,其次是醇沉濃度A、醇沉時間C。各因素影響并不顯著,因此從節省能源、有利于工業化生產的角度,選擇條件A3B2C2進行下一步的驗證實驗。

3.4醇沉工藝驗證結果

各指標成分測定方法、結果分析及賦予權重同表1-3,多指標成分分析見下表。

表1-10水煎煮提取醇沉驗證結果分析(綜合指標)

由表可知,三批試驗數據之間無明顯差異,最后確定水提醇沉的最佳工藝條件為A3B2C2,即水提取液濃縮至相對密度約為1.12(20℃測)時,加入乙醇使含醇量達到70%,放置24h,離心,取上清液,回收乙醇,干燥即可。

二、對工藝2的研究

1.丹參、黃連醇提的正交試驗

將丹參、黃連藥材按照處方半量進行乙醇提取,影響提取效果的因素有醇濃度、加醇量、提取時間、提取次數。

醇濃度的選擇:根據單因素考察結果,選擇60%、70%、80%。加醇量的選擇:取一定量的藥材,加入6倍醇即可浸沒藥材,故選擇加醇量為藥材的6倍、8倍和10倍。提取時間的選擇:考慮到工廠化生產時提取時間太短,有效成分提取不完全,提取時間太長,成本高,而且有效成分會受到破壞,故時間選擇為0.5h、1h、1.5h。提取次數的選擇:按常規方法選擇,提取1次、2次、3次。

按為了確定醇提的最佳工藝條件,我們擬以正交試驗表L9(3*4)進行正交試驗,從而確定最優工藝,因素水平見下表2-1。

表2-1工藝2醇提取因素水平表

分別稱取丹參粉末7.5g黃連粉末2.5g,按正交實驗設計分別加入6、8、10倍60%、70%、80%濃度的乙醇溶液回流提取1次、2次、3次。過濾合并提取液,加溶劑定容至500ml,測定,結果見表2-3。

表2-2各試驗中測試成分回歸方程及線性范圍

采取綜合加權評分的方法對丹參黃連醇提工藝進行優選,丹參作為主藥,丹酚酸B和丹參酮IIA的加權分分別為0.3,黃連4種生物堿總和與干膏得率的加權分分別為0.2,根據加權分等于每項含量除以最高含量乘以100,可以得出總的權重積分。

表2-3工藝2正交實驗設計表與結果分析

表2-4方差分析結果

以丹酚酸B、丹參酮IIA、4種生物堿的提取率為考察指標,本實驗通過極差和方差分析表明:因素B(加溶劑量)與因素D(提取次數)對提取效果影響非常顯著,因素A(醇濃度)也有顯著影響,因素C(提取時間)影響可忽略不計,故作為誤差項。根據極差和方差分析結果,考慮較少的較低溶劑濃度和最短的提取時間,減少濃縮的麻煩,結合表2-4的結果,最終確定其最佳提取條件A2B3C1D3,即10倍量的70%乙醇提取3次,每次0.5h。

2.丹參、黃連醇提正交最佳工藝驗證試驗

稱取處方中10倍量丹參、黃連,按最佳提取工藝10倍70%乙醇提取3次,每次0.5h,平行提取三份,供試液分別含量測定。

表2-5醇提工藝驗證試驗

以最佳工藝進行提取,丹參和黃連中各主要成分的含量均較高。正交試驗所得結論符合實際提取結果,且結果穩定可靠。

3.赤芍、三七、葛根、法半夏、肉蓯蓉、人參6味藥水提

3.1水提的正交試驗

將赤芍、三七、葛根、法半夏、肉蓯蓉、人參按照處方半量進行水提取,影響提取效果的因素有加水量、提取時間、提取次數。

同樣,加水量的選擇6倍、8倍和10倍,提取時間的選擇0.5h、1h、1.5h,提取次數的選擇1次、2次、3次。

采用正交試驗表L9(3*4)進行正交試驗,從而確定最優工藝,因素水平見下表2-6。

表2-6工藝2水提取因素水平表

分別稱取赤芍粉末6g、三七粉末1.5g、葛根粉末7.5g、法半夏粉末3g、肉蓯蓉粉末5g、人參粉末3g,按正交實驗設計分別加入6、8、10倍水回流提取1次、2次、3次。過濾合并提取液,加溶劑定容至500ml,測定。結果見表2-8、2-9。

表2-7各試驗中測試成分回歸方程及線性范圍

采取綜合加權評分的方法對水提工藝進行優選,芍藥作為臣藥,芍藥苷和干膏得率的加權分分別為0.275,葛根、肉蓯蓉、人參、三七4種藥材作為佐藥加權分為0.15,根據加權分等于每項含量除以最高含量乘以100,可以得出總的權重積分。

表2-8工藝2正交水提實驗設計表與結果分析

表2-9方差分析結果

以葛根素、毛瑞花糖苷和松果菊苷總量、4種皂苷總量、芍藥苷的含量、干膏提取率為考察指標,按綜合加權評分法判定,直觀分析顯示各因素作用可見C(提取次數)>A(加水量)>B(提取時間),因素C有顯著性差異,因素A和B的影響均無顯著性差異,確定水提的最佳工藝為A2B2C3,即加8倍量水,提取3次,每次提1h。

3.2水提的正交最佳工藝驗證試驗

稱取處方中30倍量赤芍、半夏、三七、葛根、肉蓯蓉、人參,按最佳提取工藝即8倍量提取3次,每次1h,合并提取液,平行提取三份,供試液分別含量測定。

表2-10正交水提工藝驗證試驗

以最佳工藝進行提取各主要成分的含量均較高。正交試驗所得結論符合實際提取結果,且結果穩定可靠。

3.3水提醇沉正交試驗

根據藥物特性和結合生產實際,優選對醇沉影響較大的醇濃度、藥液相對密度、醇沉時間,選用正交試驗表L9(3*4)進行正交試驗。

表2-11工藝2醇沉因素水平表

按最佳提取工藝-8倍量提取3次,每次1h,合并提取液,提取液取1500ml分成3份(每份500ml)分別濃縮為相對密度1.06、1.12、1.18,分別取30ml加入不同體積的乙醇使醇沉濃度為50%、60%、70%,按正交試驗表中的時間沉淀。

采取綜合加權評分的方法對水提工藝進行優選,芍藥作為臣藥,芍藥苷的加權分為0.30,葛根、肉蓯蓉、人參、三七4種藥材作為佐藥加權分為0.20,干膏得率的加權分為0.10,根據加權分等于每項含量除以最高含量乘以100,可以得出總的權重積分。

表2-12工藝2醇沉實驗設計表與結果分析

表2-13方差分析結果

以葛根素、毛瑞花糖苷和松果菊苷總量、4種皂苷總量、芍藥苷的含量、干膏提取率為考察指標,按綜合加權評分法判定,直觀分析顯示各因素作用可見B(相對密度)>A(醇沉濃度)>B(沉淀時間),因素A、B、C的影響均無顯著性差異,確定水提的最佳工藝為A2B2C2,即醇沉濃度60%,藥液相對密度1.12,沉淀24h。

3.4醇沉的正交最佳工藝驗證試驗

量取300ml提取液,按最佳醇沉工藝即相對密度1.12醇沉濃度60%沉淀24h,平行三份,供試液分別含量測定。

表2-14工藝2醇沉工藝驗證試驗(30ml)

三、對工藝3的研究

1.丹參、黃連、人參、三七醇提

1.1醇提部分正交試驗

將丹參、黃連、人參、三七藥材按照處方半量進行乙醇提取,影響提取效果的因素有醇濃度、加醇量、提取時間、提取次數。

醇濃度的選擇:根據單因素考察結果,選擇60%、70%、80%。加醇量的選擇:為藥材的6倍、8倍和10倍。提取時間的選擇:為0.5h、1h、1.5h。提取次數的選擇:為1次、2次、3次。以正交試驗表L9(3*4)進行正交試驗,從而確定最優工藝,因素水平見下表3-1。

表3-1工藝3醇提取部分因素水平表

分別稱取丹參粉末7.5g黃連粉末2.5g、人參3g、三七1.5g,按正交實驗設計分別加入6、8、10倍60%、70%、80%濃度的乙醇溶液回流提取1次、2次、3次。過濾合并提取液,加溶劑定容至500ml,測定。結果見表3-2。

采取綜合加權評分的方法對丹參黃連醇提工藝進行優選,丹參作為主藥,丹酚酸B、丹參4種脂溶性成分總量和干膏得率的加權分分別為0.2,黃連4種生物堿總量加權分為0.25、4種皂苷總量加權分為0.15,根據加權分等于每項含量除以最高含量乘以100,可以得出總的權重積分。

表3-2工藝3醇提部分的正交實驗設計表與結果分析

表3-3方差分析結果

以丹酚酸B、丹參酮IIA、4種生物堿的提取率為考察指標,本實驗通過極差和方差分析表明:因素D(提取次數)對提取效果影響顯著,因素A(醇濃度)因素B(加溶劑量)對提取效果影響不顯著,因素C(提取時間)影響可忽略不計,故作為誤差項。根據極差和方差分析結果,考慮較少的較低溶劑濃度和最短的提取時間,減少濃縮的麻煩,結合表4的結果,最終確定其最佳提取條件A2B3C2D3,即10倍量的70%乙醇提取3次,每次1h。

1.2工藝3醇提部分正交最佳工藝驗證試驗

稱取處方中15倍量丹參、黃連、人參、三七,按最佳提取工藝10倍70%乙醇提取3次,每次1h,平行提取三份,供試液分別含量測定。

表3-4工藝3醇提部分工藝驗證試驗

以最佳工藝進行提取,丹參和黃連中各主要成分的含量均較高。正交試驗所得結論符合實際提取結果,且結果穩定可靠。

2赤芍、葛根、酒蓯蓉、法半夏水提醇沉工藝研究

2.1水提取正交實驗設計

影響中藥成分提取效率的因素有很多,包括溶劑的選擇、浸泡時間、提取時間、提取次數、溶劑用量等等,考慮到醫院制劑的提取溶劑不能作改變,因此在不改變全水的條件下設計制劑的提取工藝。選擇加水量為藥材的6倍、8倍和10倍,提取時間選擇為0.5h、1.0h、1.5h,提取次數按常規方法選擇提取1次、2次、3次。

為了確定全方水提的最佳工藝條件,我們擬以正交試驗表L9(34)進行正交試驗,從而確定最優工藝,因素水平見下表3-5。

表3-5全方水提的因素水平表

2.2水提取工藝驗證

為了進一步驗證所選最優工藝,按照處方15倍藥量進行水提取工藝,每批樣品645g,共3批樣品,按照最優工藝進行提取,測定提取液中各成分的含量和出膏率。

2.3醇沉工藝的優選

為了提高本藥的藥物治療效果、減少病人服用量,適用于大工業化生產,最大量除去大分子雜質而又使有效成分損失最小,選擇水提后醇沉除雜的方法以除去大分子雜質。因素水平見表3-6

表3-6醇沉因素水平表

取提取液濃縮,分別濃縮至密度為1.06、1.12和1.18,按照醇沉因素表進行正交試驗,每個樣品30mL,共9個樣品?;夯杭尤胍掖際購劑糠直鶇锏?0%,60%、70%,分別放置不同時間,過濾,定容,測定各指標成分及干膏量。

2.4醇沉工藝的驗證

為了進一步驗證所選醇沉最優工藝,分別取優選的相對密度的濃縮液,緩慢加入使達到一定醇沉濃度,放置一定時間,取上清液測定指標成分含量。

2.5各活性成分或指標成分的色譜條件

赤芍中芍藥苷含量測定:色譜柱:安捷倫HCC18(4.6×250mm,5μm)色譜柱;流動相:甲醇∶0.025mol·L-1磷酸二氫鉀=46∶54;檢測波長:230nm;流速:1.0mL·min-1;進樣量:10μL(標準曲線Y=12962X+49.026,R2=0.999)。

肉蓯蓉中松果菊苷含量測定:色譜柱:安捷倫TCC18(4.6×250mm,5μm)色譜柱;以甲醇為流動相A,以0.1%甲酸溶液為流動相B,進行梯度洗脫;檢測波長:330nm;流速:mL·min-1;進樣量:5μL(標準曲線Y=7111.3X+19.938,R2=0.9997)。

葛根中葛根素含量測定:色譜柱:安捷倫TCC18(4.6×250mm,5μm)柱;流動相:以甲醇-水(25∶75)為流動相;檢測波長為250nm。;流速:1.0mL·min-1;進樣量:10μL(標準曲線Y=43027X+174.87,R2=0.9998)

3結果與分析

3.1水提取正交實驗結果

由于正交試驗以3種成分為指標和干膏率結果共4項考察指標,選擇綜合加權評分法對試驗結果進行方差分析。設定滿分為100分,按照本發明中藥組合物君臣佐使組方原則,賦予各藥材指標成分的比重分數為:赤芍25、葛根25、法半夏25、肉蓯蓉25,在此基礎上進行總加權評分,利用綜合評分值(Pi)對試驗結果進行方差分析:以Mij表示第j個指標成分下第i個指標成分的測定值,以各指標的最大值作為參照對同一指標各數據進行標準化處理;Dij表示第j個指標成分下的第i個測定值的標準化數據。Dij=Mij/(Mj)max,以Ni表示第i次試驗中干膏率的測定值,以干膏率的最大值作為參照對干膏率數據進行標準化處理,Ei=Ni/(Ni)max,其中i=1,2,……,9;j=1,2,……,6。綜合評分Pi=Σ比重分數×Dij+Σ10×Ei,將總分結果帶入正交試驗結果中,即得。結果分析見表7-表9。

表3-7L9(34)水煎煮正交實驗設計表與結果分析(綜合指標)

表3-8水煎煮提取工藝參數均值響應表

表3-9水煎煮提取工藝參數方差分析表

由實驗結果可以看出:以綜合指標進行方差分所得的最佳條件均是:A3B2C3,從這個結果來看影響水煎的顯著因素是提取次數(P﹤0.01),其次是加水量、提取時間,結合生產要求確定最佳工藝為A3B1C3,即加水量為藥材的10倍,煎煮時間為1.0h,煎煮次數為3次。

3.2水提取正交實驗工藝驗證

為了進一步驗證所選最優工藝為A3B2C3,按照處方15倍藥量進行水提取工藝,藥材提取及處理方法同1.1正交實驗方法,各指標成分測定方法、結果分析及賦予權重同1.5,多指標成分分析見表3-10。

表3-10水煎煮提取驗證結果分析(綜合指標)

由表6可知,三批試驗數據之間無明顯差異(RSD1.71%),最后確定水煎煮提取的最佳工藝條件為A3B2C3,即加水量10倍,提取時間為1.0h,提取3次。

3.3醇沉正交實驗測定結果

采用多指標成分進行測定及分析,并根據配方原則賦予各指標成分一定權重,結果見表11-表13。

表3-11L9(34)醇沉正交結果分析(綜合指標)

表3-12醇沉工藝參數均值響應表

表3-13醇沉工藝參數方差分析表

由表中實驗結果可以看出:以多指標綜合得分進行分析,所以最佳條件為A2B3C2,以極差R值和離均差平方和SS值為指標進行分析,影響干膏量較大的因素是藥液相對密度B(P﹤0.01),其次是醇沉濃度A、醇沉時間C。各因素影響并不顯著,因此從節省能源、有利于工業化生產的角度,選擇條件A2B3C2進行下一步的驗證實驗。

3.4醇沉工藝驗證結果

各指標成分測定方法、結果分析及賦予權重同表3-8,多指標成分分析見下表。

表3-14水煎煮提取醇沉驗證結果分析(綜合指標)

由表可知,三批試驗數據之間無明顯差異(RSD1.18%),最后確定水提醇沉的最佳工藝條件為A2B3C2,即水提取液濃縮至相對密度約為1.18(20℃測)時,加入乙醇使含醇量達到60%,放置24h,離心,取上清液,回收乙醇,干燥即可。

第四部分:效果驗證

結扎大鼠冠脈前降支誘導的心肌梗死模型是篩選和評價心肌?;ひ┪锏某S枚錟P?,為了驗證本發明中藥組合物治療冠心病的效果,發明人進行了如下實驗研究。

1.材料和方法

1.1主要材料和儀器

HX-300小動物呼吸機,成都泰盟科技有限公司產品;PowerLab4/30多導生理記錄儀,澳大利亞AD公司產品;LabChart6軟件,澳大利亞AD公司產品。

受試藥物:分別按本發明三種工藝(即實施例1、2、3)制得的中藥組合物。

1.2實驗動物和分組

Wistar大鼠150只,雄性,體質量200±20g,適應性飼養3天,隨機分為假手術組、模型組、工藝1組(2.2g提取物/kg/d)、工藝2組(2.2g提取物/kg/d)、工藝3組(2.2g提取物/kg/d)。假手術10只,其余每組35只大鼠。假手術組和模型組灌胃0.5%CMCC-Na液10ml/kg/d,其它各受試物混懸于0.5CMCC-Na液中,給藥劑量為70kg體重成人等效劑量(按體表面積折算)。按提取率折算成提取物重量,灌胃體積為10ml/kg/d,灌胃1h后進行冠脈結扎手術。術后繼續灌胃給藥,直至實驗結束。

1.3急性心肌梗死大鼠模型的制備

2%戊巴比妥鈉30~45mg/kg腹腔注射麻醉后,于第3~4肋間開胸,暴露心臟,在左心耳下緣距肺動脈弓根部2mm處結扎,結扎深度<1mm,寬度1.5mm,裸眼觀察見結扎線下方心肌顏色變灰白搏動減弱為結扎成功。假手術組只穿線不結扎,其它操作同模型組。手術完畢后皮下注射青霉素溶液40萬u/只,連續2天。

1.4檢測指標

術后7天、28天B超檢測心功能。術后29天,10%水合氯醛腹腔注射麻醉,取血,取心臟,用4%甲醛固定,將結扎線下的心臟均勻分成3部分,切成4μm厚片,HE及MASSON染色,觀察心臟組織結構改變及纖維化程度。計算壞死心肌占左心室面積的百分比,計算心肌纖維化的面積占左心室面積的百分比。取全血分離血清-20℃保存全自動生化分析儀檢測肌酐(Cr)和尿素氮(Bun)含量

1.5統計方法

采用SPSS17.0統計軟件,方差齊性用單因素方差分析(one-wayanova)方差不齊時采用非參數檢驗

2.結果

表4-1本發明不同工藝不同劑量提取物對心梗后不同時間大鼠心功能參數EF值的影響

注:▲▲P<0.01與正常組比較;***p<0.001與模型組比較,**p<0.01與模型組比較

(續表)

注:**p<0.01與模型組比較;*p<0.05與模型組比較

3.結論

本發明3種工藝制備的中藥組合物對心肌梗死緩解期心臟均有確切的?;ぷ饔?,其中工藝1的效果最好。

具體實施方式

以下各實施例所制得的中藥組合物,均可不同程度地實現本發明所聲稱的效果。

實施例1:

處方:丹參1500g、黃連500g、人參600g、三七300g、葛根1500g、赤芍1200g、酒蓯蓉1000g、法半夏600g。

制法:將全部原料藥煎煮提取3次,每次加水10倍量、煮沸0.5小時,提取液合并后濃縮至相對密度1.12(20℃測),加入乙醇至含醇量達70%,放置24小時,過濾,濾液回收乙醇,余液繼續濃縮成稠膏,即得。

實施例2:

處方:同實施例1。

制法:取原料藥,將丹參、黃連一起用70%乙醇提取3次,每次加10倍量乙醇溶液、提取0.5小時,合并提取液,回收乙醇,得余液,備用;將其余原料藥一起煎煮提取3次,每次加水8倍量、煮沸1小時,提取液合并后濃縮至相對密度1.12(20℃測),加入乙醇至含醇量達60%,放置24小時,過濾,濾液回收乙醇,得余液;將上述兩種余液合并,繼續濃縮成稠膏,即得。

實施例3:

處方:同實施例1。

制法:取原料藥,將丹參、黃連、人參和三七一起用70%乙醇提取3次,每次加10倍量乙醇溶液、提取1小時,合并提取液,回收乙醇,得余液,備用;將其余原料藥一起煎煮提取3次,每次加水10倍量、煮沸1小時,提取液合并后濃縮至相對密度1.18(20℃測),加入乙醇至含醇量達60%,放置24小時,過濾,濾液回收乙醇,得余液;將兩種余液合并,繼續濃縮成稠膏,即得。

實施例4:

處方:丹參1000g、黃連200g、人參300g、三七100g、葛根1000g、赤芍700g、肉蓯蓉500g、法半夏300g。

制法:將全部原料藥煎煮提取3次,每次加水10倍量、煮沸0.5小時,提取液合并后濃縮至相對密度1.10(20℃測),加入乙醇至含醇量達60%,放置24小時,過濾,濾液回收乙醇,余液繼續濃縮成稠膏,干燥、粉碎,加入適宜的輔料,制成顆粒劑。

實施例5:

處方:丹參2000g、黃連800g、人參900g、三七500g、葛根2000g、赤芍1700g、肉蓯蓉1500g、法半夏900g。

制法:將全部原料藥煎煮提取3次,每次加水10倍量、煮沸0.5小時,提取液合并后濃縮至相對密度1.20(20℃測),加入乙醇至含醇量達80%,放置24小時,過濾,濾液回收乙醇,余液繼續濃縮成稠膏,干燥、粉碎,加入適宜的輔料,制成顆粒劑。

實施例6:

處方:丹參1200g、黃連300g、人參400g、三七200g、葛根1200g、赤芍900g、肉蓯蓉700g、法半夏400g。

制法:取原料藥,將丹參、黃連一起用60%乙醇提取2次,每次加10倍量乙醇溶液、提取0.5小時,合并提取液,回收乙醇,得余液,備用;將其余原料藥一起煎煮提取2次,每次加水8倍量、煮沸1小時,提取液合并后濃縮至相對密度1.10(20℃測),加入乙醇至含醇量達50%,放置24小時,過濾,濾液回收乙醇,得余液;將上述兩種余液合并,繼續濃縮成稠膏,干燥、粉碎,加入適宜的輔料,制成片劑。

實施例7:

處方:丹參1800g、黃連700g、人參800g、三七400g、葛根1800g、赤芍1500g、肉蓯蓉1300g、法半夏800g。

制法:取原料藥,將丹參、黃連一起用80%乙醇提取3次,每次加8倍量乙醇溶液、提取0.5小時,合并提取液,回收乙醇,得余液,備用;將其余原料藥一起煎煮提取3次,每次加水10倍量、煮沸1小時,提取液合并后濃縮至相對密度1.20(20℃測),加入乙醇至含醇量達70%,放置24小時,過濾,濾液回收乙醇,得余液;將上述兩種余液合并,繼續濃縮成稠膏,干燥、粉碎,加入適宜的輔料,制成片劑。

實施例8:

處方:丹參1000g、黃連200g、人參400g、三七100g、葛根1800g、赤芍1500g、酒蓯蓉1000g、法半夏600g。

制法:取原料藥,將丹參、黃連、人參和三七一起用60%乙醇提取3次,每次加10倍量乙醇溶液、提取1小時,合并提取液,回收乙醇,得余液,備用;將其余原料藥一起煎煮提取3次,每次加水8倍量、煮沸1小時,提取液合并后濃縮至相對密度1.10(20℃測),加入乙醇至含醇量達50%,放置24小時,過濾,濾液回收乙醇,得余液;將兩種余液合并,繼續濃縮成稠膏,干燥、粉碎,加入適宜的輔料,制成膠囊劑。

實施例9:

處方:丹參1500g、黃連700g、人參600g、三七300g、葛根1000g、赤芍700g、酒蓯蓉700g、法半夏800g。

制法:取原料藥,將丹參、黃連、人參和三七一起用80%乙醇提取2次,每次加10倍量乙醇溶液、提取1小時,合并提取液,回收乙醇,得余液,備用;將其余原料藥一起煎煮提取2次,每次加水10倍量、煮沸1小時,提取液合并后濃縮至相對密度1.20(20℃測),加入乙醇至含醇量達70%,放置24小時,過濾,濾液回收乙醇,得余液;將兩種余液合并,繼續濃縮成稠膏,干燥、粉碎,加入適宜的輔料,制成膠囊劑。

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