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马德里竞技对维戈塞尔塔: 一種高致病性豬繁殖與呼吸綜合征偽狂犬病二聯活疫苗耐熱?;ぜ良爸票阜椒?pdf

摘要
申請專利號:

维戈塞尔塔vs皇家社会 www.vmyqew.com.cn CN201210230732.0

申請日:

20120704

公開號:

CN102727904B

公開日:

20130828

當前法律狀態:

有效性:

有效

法律詳情:
IPC分類號: A61K47/42,A61K47/18,A61K47/26,A61K47/36,A61K47/32,A61K47/22,A61P31/14,A61P31/22,A61K39/245,A61K39/12 主分類號: A61K47/42,A61K47/18,A61K47/26,A61K47/36,A61K47/32,A61K47/22,A61P31/14,A61P31/22,A61K39/245,A61K39/12
申請人: 廣東大華農動物保健品股份有限公司,中國動物疫病預防控制中心
發明人: 陳瑞愛,田克恭,練炳洲,遇秀琳,邵定勇,翟新驗,鄧小熊,周智,林綺萍,曲萍
地址: 527400 廣東省云浮市新興縣新城鎮東堤北路溫氏科技園2號之三
優先權: CN201210230732A
專利代理機構: 廣州市越秀區哲力專利商標事務所(普通合伙) 代理人: 湯喜友
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法律狀態
申請(專利)號:

CN201210230732.0

授權公告號:

法律狀態公告日:

法律狀態類型:

摘要

本發明公開了一種高致病性豬繁殖與呼吸綜合征-偽狂犬病二聯活疫苗耐熱?;ぜ良爸票阜椒?,本發明的高致病性豬繁殖與呼吸綜合征-偽狂犬病二聯活疫苗耐熱?;ぜ漣粗亓堪俜直燃樸擅鶻?.8~1.2%、大豆蛋白胨4~6%、甘氨酸0.5~1.5%、蔗糖3~5%、海藻糖2~3%、聚乙烯吡咯酮1~2%、甘露醇0.5~1%、維生素E0.1~0.2%,余量為注射用水通過高溫滅菌、微孔濾膜過濾除菌、混合步驟制備。本發明的高致病性豬繁殖與呼吸綜合征-偽狂犬病二聯活疫苗耐熱?;ぜ良跎僦破吩誒潿掣稍錒討懈髦擲砘蛩乜贍芏圓《凈钚緣乃鶘?,具有較好的?;すδ?,有效解決了常規?;ぜ粱鉅咼縲櫪潿吃聳?、儲存不便等問題。

權利要求書

1.一種高致病性豬繁殖與呼吸綜合征-偽狂犬病二聯活疫苗耐熱?;ぜ?,其特征在于由按重量百分比計的以下組分組成:明膠0.8~1.2%、大豆蛋白胨4~6%、甘氨酸0.5~1.5%、蔗糖3~5%、海藻糖2~3%、聚乙烯吡咯酮1~2%、甘露醇0.5~1%、維生素E0.1~0.2%,余量為注射用水。2.如權利要求1所述的高致病性豬繁殖與呼吸綜合征-偽狂犬病二聯活疫苗耐熱?;ぜ?,其特征在于由按重量百分比計的以下組分組成:明膠1%、大豆蛋白胨5%、甘氨酸1%、蔗糖5%、海藻糖2%、聚乙烯吡咯酮2%、甘露醇0.8%、維生素E0.1%,余量為注射用水。3.權利要求1或2所述的高致病性豬繁殖與呼吸綜合征-偽狂犬病二聯活疫苗耐熱?;ぜ戀鬧票阜椒?,其特征在于包括以下步驟:1)高溫滅菌:將明膠、大豆蛋白胨、蔗糖、海藻糖、聚乙烯吡咯酮、甘露醇溶于注射用水中,于110~116℃條件下高溫滅菌10~20min;2)微孔濾膜過濾除菌:甘氨酸、維生素E溶于注射用水中,用微孔濾膜過濾除菌;3)混合:將步驟1)、步驟2)制得的兩種溶液混合,制得耐熱?;ぜ?。4.如權利要求3所述的高致病性豬繁殖與呼吸綜合征-偽狂犬病二聯活疫苗耐熱?;ぜ戀鬧票阜椒?,其特征在于:步驟1)高溫滅菌的條件為115℃,15min。5.如權利要求3所述的高致病性豬繁殖與呼吸綜合征-偽狂犬病二聯活疫苗耐熱?;ぜ戀鬧票阜椒?,其特征在于:步驟1)所使用的注射用水為總注射用水的1/2,步驟2)所使用的注射用水為總注射用水的1/2。6.如權利要求3所述的高致病性豬繁殖與呼吸綜合征-偽狂犬病二聯活疫苗耐熱?;ぜ戀鬧票阜椒?,其特征在于:步驟2)所使用的微孔濾膜的孔徑為0.22μm。

說明書

技術領域

本發明涉及獸用生物制品技術領域,具體涉及用于高致病性豬繁殖與呼吸綜合征-偽狂犬病二聯活疫苗的耐熱?;ぜ良捌渲票阜椒?。

背景技術

豬繁殖與呼吸綜合征又稱藍耳病,是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒引起的一種豬的高度接觸性傳染病。該病毒能感染不同年齡、品種和性別的豬,尤其是對妊娠母豬和1個月齡以內仔豬的感染力最強。該病以母豬流產、死胎、弱胎、木乃伊胎以及仔豬呼吸困難、敗血癥、高死亡率等為主要特征。高致病性豬藍耳病是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒變異株引起的一種急性、高致死性傳染病,臨床表現為體溫高、發病率高和死亡率高的“三高”為主要特點。2006年夏季,該病在我國較大范圍流行,使我國養殖豬業遭受前所未有的慘重經濟損失。由于目前尚無治療該病的特效藥物,因此,使用特異性疫苗成為防控該病的主要措施。

豬偽狂犬病是由皰疹病毒科豬皰疹病毒型偽狂犬病病毒引起的一種急性傳染病,可導致懷孕母豬發生流產、死亡、產木乃伊胎及弱仔;新生仔豬發生大批急性死亡、伴有嘔吐、腹瀉及發抖、震顫和運動失調等神經癥狀。豬偽狂犬病是危害養豬業最嚴重的傳染病之一,給養豬業造成巨大的經濟損失。該病尚無特效治療藥物,緊急情況下,用高免血清治療,可降低死亡率。疫苗免疫接種是預防和控制該病的根本措施。

而預防和控制上述藍耳病、豬偽狂犬病的疫苗在保存、運輸和使用均需要使用到耐熱?;ぜ?。常規的疫苗?;ぜ林饕閻D?、蔗糖、明膠等,組方簡單、配制簡便、易溶性良好,但熱穩定性和?;すδ懿?,產品的保存條件較為苛刻,大多需要在-15℃以下保存。在疫苗生產、運輸以及使用過程中,如果冷鏈系統控制不當,疫苗保存環境溫度升高,常常導致疫苗效力下降或失效,造成免疫失敗。耐熱?;ぜ簾瘸9嫻謀;ぜ糧艿降乜悸橇司哂猩锘钚緣鬧破吩誚細呶露群徒銑な奔潯4嫻那榭魷?,凍干物質可能產生的物理和化學變化對活疫苗存活的影響,通過填充、防凍、抗氧化、酸堿調整、羥基中和等一系列機制,確保病毒在2~8℃條件下,保存期可達24個月,效價無明顯下降,即使是較高的常溫甚至37℃也可以保存十天以上,因而其?;ば閱芤卻潮;ぜ糧帕?,從而使活苗的儲存、運輸和使用更方便、經濟。

目前,針對豬繁殖與呼吸綜合征-偽狂犬二聯活疫苗耐熱凍干?;ぜ戀難芯磕殼吧形醇ǖ?。而被廣泛應用的高致病性豬繁殖與呼吸綜合征活疫苗的耐熱凍干?;ぜ林饕擅鶻?、海藻糖、胰蛋白胨、酶解酪蛋白、聚乙烯吡咯烷酮、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀、山梨醇、谷氨酸鈉、精氨酸鹽配制成,而豬偽狂犬病活疫苗的耐熱凍干?;ぜ林饕擅鶻?、蔗糖、牛血清白蛋白、胰蛋白胨、EDTA、谷氨酸單鈉、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀配制成。這些耐熱凍干?;ぜ輛嬖諗浞焦詬叢?、生產成本高、?;ば閱懿煥硐氳熱畢?,不利于批量生產。

發明內容

本發明的目的在于克服上述現有技術的缺陷,提供一種高致病性豬繁殖與呼吸綜合征-豬偽狂犬病二聯活疫苗耐熱?;ぜ?,其具有良好的?;ば閱?,能確保疫苗在常溫甚至37℃有效保存。

為實現上述目的,本發明采用如下技術方案:

一種高致病性豬繁殖與呼吸綜合征-豬偽狂犬病二聯活疫苗耐熱?;ぜ?,其由按重量百分比計的以下組分組成:明膠0.8~1.2%、大豆蛋白胨4~6%、甘氨酸0.5~1.5%、蔗糖3~5%、海藻糖2~3%、聚乙烯吡咯酮1~2%、甘露醇0.5~1%、維生素E0.1~0.2%,余量為注射用水。

胰蛋白胨、酶解酪蛋白、牛血清白蛋白等均為動物源性外來蛋白質,起到填充劑的作用,可防止有效組分隨水蒸氣一起升華逸散,但不可避免血清蛋白質潛在的血源性病原體污染疫苗帶來的風險;采用大豆蛋白胨等植物源性蛋白質替代動物源性外來蛋白,則生產成本將會大大降低。而在眾多的氨基酸中,甘氨酸是最好的填充劑,低濃度甘氨酸可通過抑制10或100mmol/L磷酸緩沖鹽結晶所致PH值的改變而阻止蛋白質藥物變性。山梨醇是一種多元醇,具有和糖一樣的作用,溶解度大,常溫下呈粘稠的透明狀液體,有旋光性,常作填充劑,但具有吸濕性,高溫下不穩定;而甘露醇是山梨糖醇的異構化體,雖價格比山梨醇略貴、溶解性比山梨醇略小,但其沒有吸濕性,干燥快且穩定性好,凍干后制品不易回潮,復水迅速,也常用作填充劑。海藻糖是一種穩定的非還原性二糖,具有較高的玻璃化轉變溫度,水化能力雖與蔗糖基本相同,但?;ぷ饔萌叢陡哂謖崽?,常和聚乙烯吡咯酮(PVP)聯合使用,可起到良好的低溫、干燥?;ぜ磷饔?。同時,蔗糖、PVP、甘油可作為凍干劑,能防止和減少冷凍過程結晶水的形成。在耐熱?;ぜ僚浞街刑砑右歡康目寡躉寥縹谽、維生素C、硫脲、硫代硫酸鈉等,可防止保存過程中的氧化反應。

優選地,上述各組分按重量百分比計為:明膠1%、大豆蛋白胨5%、甘氨酸1%、蔗糖5%、海藻糖2%、聚乙烯吡咯酮2%、甘露醇0.8%、維生素E0.1%,余量為注射用水。

本發明的另一目的在于提供上述高致病性豬繁殖與呼吸綜合征-偽狂犬病二聯活疫苗耐熱?;ぜ戀鬧票阜椒?,其包括以下步驟:

1)高溫滅菌:將明膠、大豆蛋白胨、蔗糖、海藻糖、聚乙烯吡咯酮、甘露醇溶于注射用水中,于110~116℃條件下高溫滅菌10~20min;

2)微孔濾膜過濾除菌:甘氨酸、維生素E溶于注射用水中,用微孔濾膜過濾除菌;

3)混合:將步驟1)、步驟2)制得的兩種溶液液混合,制得耐熱?;ぜ?。

優選地,步驟1)高溫滅菌的條件為115℃,15min。

優選地,步驟1)所使用的注射用水為總注射用水的1/2,步驟2)所使用的注射用水為總注射用水的1/2。

優選地,步驟2)所使用的微孔濾膜的孔徑為0.22μm。

與現有技術相比,本發明的有益效果是:

1、本發明的耐熱?;ぜ聊芄患跎僦破吩誒潿掣稍錒討懈髦擲砘蛩乜贍芏圓《凈钚緣乃鶘?,使凍干前后兩種病毒的損失率均較低,各不超過0.2個滴度;

2、本發明的耐熱?;ぜ粱鉅咼縋屠匣潭雀?,在37℃條件下保存10天兩種病毒的損失率均不超過0.3個滴度,在2~8℃保存24個月,兩種病毒的病毒含量仍不發生明顯改變,有效解決了常規?;ぜ粱鉅咼縲櫪潿吃聳?、儲存不便等問題;

3、本發明的耐熱?;ぜ獵詒Vつ腿刃閱芎?、能有效?;せ鉅咼緄那疤嵯?,還具有配方成分及配制方法簡單、成本低、可實現大量生產等優點,有效解決了現耐熱?;ぜ了嬖詰某煞指叢雍統殺靖叩熱畢?。

具體實施方式

下面通過具體實施例子對本發明一種高致病性豬繁殖與呼吸綜合征-豬偽狂犬病二聯活疫苗耐熱?;ぜ良捌渲票阜椒ㄗ鶻徊較晗桿得?。

一種高致病性豬繁殖與呼吸綜合征-豬偽狂犬病二聯活疫苗耐熱?;ぜ?,其按以下步驟制得:

1)高溫滅菌:將明膠、大豆蛋白胨、蔗糖、海藻糖、聚乙烯吡咯酮、甘露醇溶于注射用水中,注射用水的量為總注射用水的1/2,并于110~116℃條件下高溫滅菌10~20min,高溫滅菌的條件優選為115℃,15min;

2)微孔濾膜過濾除菌:甘氨酸、維生素E溶于注射用水中,注射用水的量為總注射用水的1/2,用孔徑為0.22μm微孔濾膜過濾除菌;

3)混合:將步驟1)、步驟2)制得的兩種溶液液混合,制得本發明的耐熱?;ぜ?。

上述制備方法中各組分的用量見表1。

表1??本發明的耐熱?;ぜ糧魘凳├吶浞獎?/p>

應用本發明的耐熱?;ぜ簾4娓咧虜⌒災矸敝秤牒粑酆險?豬偽狂犬病二聯活疫苗的實施例

分別取檢驗合格的兩種病毒液,按凍干后每頭份PRRSV病毒含量不少于105TCID50、PRV病毒含量不少于5000TCID50的量,計算兩種成分的配苗用量,置于同一滅菌容器內混合均勻,即為配苗用混合病毒抗原。

將本發明實施例1、2和3所制備的耐熱?;ぜ劣肷鮮齷旌喜《究乖?∶1比例充分搖勻,定量分裝后立即進行冷凍干燥。同時設5%蔗糖脫脂乳?;ぜ烈咼繾鞫哉兆?。采用凍干曲線如下:

首先將凍干機預冷至5℃,將分裝好的疫苗裝入凍干機箱體內,再以1℃/min的速度降溫至-45℃,在此溫度下維持3個小時后,抽真空至5Pa后,再開始在1小時內升溫至-5℃,在此溫度下維持11個小時,之后以每小時12℃的速度升溫至30℃,維持6小時加塞出箱;凍干全程為26小時。凍干后疫苗每頭份PRRSV病毒含量應≥105TCID50,PRV病毒含量應≥5000TCID50。

1.病毒含量測定

1.1豬繁殖與呼吸綜合征部分

將成品疫苗用無血清培養基稀釋為0.02頭份/0.1ml,與等量豬偽狂犬病病毒特異性陽性血清混合,37℃作用1小時,然后再做10倍系列稀釋,取10-1、10-2、10-33個稀釋度,分別接種于已長成單層Marc-145細胞的96孔細胞板,每個稀釋度接種6孔,每孔0.1ml,在含5%CO2、37℃下培養箱培養觀察3~5日,根據Reed-Muench法計算TCID50,每頭份病毒含量應≥105TCID50,同時與對照組的病毒含量作比較,結果見表2。

1.2豬偽狂犬病部分

將成品疫苗用PBS稀釋為0.2頭份/0.1ml,然后用乳漢液再做10倍系列稀釋,取10-3、10-4、10-53個稀釋度,各接種雞胚成纖維細胞4小瓶,每瓶0.1ml,補充維持液0.9ml,使之總量為1ml,在含5%CO2、37℃下培養箱培養觀察5~7日,根據Reed-Muench法計算TCID50,每頭份病毒含量應≥5000TCID50,同時與對照組的病毒含量作比較,結果見表2。

表2??各實施例耐熱?;ぜ粱鉅咼綞掣汕昂蟛《競勘浠????TCID50/頭份

從試驗結果可以看出,采用本發明耐熱?;ぜ林票傅母咧虜⌒災矸敝秤牒粑酆險?偽狂犬二聯活疫苗凍干前后兩種病毒損失率均不超過0.2個滴度。

2.疫苗保存期試驗

將上述制得的混合病毒抗原分別置-15℃、2~8℃、37℃條件下保存,定期取出若干瓶,觀察其性狀變化,并按分別測定PRRSV和PRV的TCID50以監測疫苗病毒含量變化情況。結果3組耐熱?;ぜ潦匝橐咼繚?15℃或2~8℃條件下保存24個月、37℃條件下保存30天,其性狀均未發生改變;病毒含量測定結果見表3~表8。

表3??疫苗在-15℃條件下保存12、18、24個月PRRSV病毒含量測定結果TCID50/頭份

?組別 ??基礎效價 ??12個月 ??18個月 ??24個月 ?實施例1疫苗組 ??106.1 ??106.0 ??106.0 ??105.9

??實施例2疫苗組 ??106.2 ??106.2 ??106.1 ??106.0 ??實施例3疫苗組 ??106.2 ??106.1 ??106.0 ??105.9 ??常規疫苗對照組 ??105.7 ??105.4 ??105.2 ??104.5

表4??疫苗在-15℃條件下保存12、18、24個月PRV病毒含量測定結果??TCID50/頭份

??組別 ??基礎效價 ??12個月 ??18個月 ??24個月 ??實施例1疫苗組 ??104.3 ??104.3 ??104.0 ??104.0 ??實施例2疫苗組 ??104.4 ??104.5 ??104.3 ??104.2 ??實施例3疫苗組 ??104.3 ??104.2 ??104.1 ??104.0 ??常規疫苗對照組 ??104.0 ??103.8 ??103.7 ??103.3

表5??疫苗在2~8℃條件下保存12、18、24個月PRRSV病毒含量測定結果??TCID50/頭份

??組別 ??基礎效價 ??12個月 ??18個月 ??24個月 ??實施例1疫苗組 ??106.1 ??106.0 ??105.8 ??105.6 ??實施例2疫苗組 ??106.2 ??106.1 ??106.0 ??105.8 ??實施例3疫苗組 ??106.2 ??106.0 ??105.8 ??105.7 ??常規疫苗對照組 ??105.7 ??105.3 ??104.4 ??103.9

表6疫苗在2~8℃條件下保存12、18、24個月PRV病毒含量測定結果??TCID50/頭份

??組別 ??基礎效價 ??12個月 ??18個月 ??24個月 ??實施例1疫苗組 ??104.3 ??104.2 ??104.0 ??103.9 ??實施例2疫苗組 ??104.4 ??104.2 ??104.1 ??104.0 ??實施例3疫苗組 ??104.3 ??104.1 ??103.9 ??103.8 ??常規疫苗對照組 ??104.0 ??103.5 ??<103.0 ??<103.0

表7??疫苗在37℃條件下保存10、20、30天PRRSV病毒含量測定結果??TCID50/頭份

??組別 ??基礎效價 ??10天 ??20天 ??30天 ??實施例1疫苗組 ??106.1 ??105.9 ??105.8 ??105.5 ??實施例2疫苗組 ??106.2 ??106.1 ??106.0 ??105.8 ??實施例3疫苗組 ??106.2 ??106.0 ??105.8 ??105.6 ??常規疫苗對照組 ??105.7 ??104.5 ??103.2 ??<103.0

表8??疫苗在37℃條件下保存10、20、30天PRV病毒含量測定結果??TCID50/頭份

??組別 ??基礎效價 ??10天 ??20天 ??30天 ??實施例1疫苗組 ??104.3 ??104.3 ??104.1 ??103.8 ??實施例2疫苗組 ??104.4 ??104.3 ??104.2 ??103.9 ??實施例3疫苗組 ??104.3 ??104.2 ??104.0 ??103.7 ??常規疫苗對照組 ??104.0 ??<103.0 ??<103.0 ??<103.0

從以上試驗結果可以看出,在不同環境溫度條件下,本發明耐熱?;ぜ煉愿咧虜⌒災矸敝秤牒粑酆險?偽狂犬二聯活疫苗具有良好的?;ばЧ?,?;ばЧ饗雜龐謨貿9?%蔗糖脫脂乳配制的?;ぜ煉愿咧虜⌒災矸敝秤牒粑酆險?偽狂犬二聯活疫苗的?;ばЧ?。

上述實施例僅為本發明的優選實施案例不能以此來限定本發明的?;し段?,本領域的技術人員在發明的基礎上所做的任何非實質性的變化換及替換均屬于本發明所要求?;さ姆段?。

關 鍵 詞:
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