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阿拉维斯维戈塞尔塔: Β諾達病毒在感染中的相互作用.pdf

摘要
申請專利號:

维戈塞尔塔vs皇家社会 www.vmyqew.com.cn CN201480030698.X

申請日:

20140526

公開號:

CN105431168A

公開日:

20160323

當前法律狀態:

有效性:

審查中

法律詳情:
IPC分類號: A61K39/12 主分類號: A61K39/12
申請人: 瑞士諾華動物保健有限公司,馬拉加大學
發明人: J·J·博雷戈,C·卡巴洛 佩雷斯,M·德爾 卡門 阿隆索,E·加西亞-羅薩多,B·洛佩斯-希梅納,J·F·羅德里格斯
地址: 瑞士巴塞爾
優先權: 13169590.0,13169591.8
專利代理機構: 北京市中咨律師事務所 代理人: 胡志君;黃革生
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法律狀態
申請(專利)號:

CN201480030698.X

授權公告號:

法律狀態公告日:

法律狀態類型:

摘要

公開了不同β諾達病毒在“體外”感染細胞期間和在歐洲海鱸中的相互作用。更具體地,施用了黃帶擬鲹神經壞死病毒(SJNNV)、隨后暴露于赤點石斑魚神經壞死病毒(RGNNV)的所述魚與在暴露于RGNNV之前沒有施用SJNNV的魚比較具有較少的RGNNV相關疾病癥狀和/或增加的存活。

權利要求書

1.SJNNV,用于?;び愕摯褂隦GNNV感染相關的疾病。2.根據權利要求1所述用途的SJNNV,其中SJNNV是i)具有這樣的核苷酸或氨基酸序列的SJNNV,所述核苷酸或氨基酸序列與SJNNV分離株SJNag93的核苷酸或氨基酸序列優選地至少90%同一,更優選地至少95%同一,特別優選地至少97%同一,更特別優選地至少99%同一,或者ii)這樣的SJNNV,其與SJNag93分離株的抗血清發生血清學反應,或者iii)這樣的SJNNV,其具有的核苷酸或氨基酸序列與SJNNV分離株SJNag933的核苷酸或氨基酸序列優選地至少90%同一,更優選地至少95%同一,特別優選地至少97%同一,更特別優選地至少99%同一,并且其與SJNag93分離株的抗血清發生血清學反應。3.根據權利要求2所述用途的SJNNV,其中SJNNV的核苷酸或氨基酸序列的百分同一性涉及SJNNV分離株SJNag93的RNA2區段中的T4可變區。4.根據權利要求2或3所述用途的SJNNV,其中將SJNNV以至少約1x10TCID/魚的量施用至魚。5.根據權利要求2至4中任一項所述用途的SJNNV,其中SJNNV的核苷酸序列的百分同一性涉及來自SJNNV分離株SJNag93的RNA2中第604到1030位核苷酸的序列。6.根據權利要求2至5中任一項所述用途的SJNNV,其中SJNNV的氨基酸序列的百分同一性涉及SJNNV分離株SJNag93的RNA2編碼的蛋白質的第204-331位氨基酸序列。7.根據權利要求6所述用途的SJNNV,其中氨基酸序列的百分同一性涉及SJNNV分離株SJNag93的RNA2編碼的蛋白質序列的第223-331位氨基酸。8.根據權利要求7所述用途的SJNNV,其中氨基酸序列的百分同一性涉及SJNNV分離株SJNag93的RNA2編碼的蛋白質序列的第235-315位氨基酸。9.根據權利要求1至8中任一項所述用途的SJNNV,其中?;び愕摯辜膊∩婕霸謨閎禾逯屑跎儆捎赗GNNV感染導致的死亡率。10.根據權利要求1至9中任一項所述用途的SJNNV,其中魚選自歐洲海鱸、塞內加爾鰨、金頭鯛、紅帶鯛、普通鯛、白鯛和野生白姑魚,優選地歐洲海鱸。11.根據權利要求1至10中任一項所述用途的SJNNV,其中SJNNV選自SJNag93、Jp/06/SJ、SJOri、SJ91Nag、SJ92Nag、SJ94Nag和RS95Hir3,優選地SJNag93。12.根據權利要求1至11中任一項所述用途的SJNNV,包括施用SJNNV給魚,其中隨后暴露于RGNNV的所述魚與沒有事先施用SJNNV而暴露于RGNNV的魚比較具有較少和/或減輕的疾病癥狀。13.SJNNV,用于魚抵抗由于RGNNV感染導致的病毒性神經壞死或病毒性腦病和視網膜病。14.疫苗,用于?;び愕摯褂蒖GNNV感染引起的魚的病毒性神經壞死或病毒性腦病和視網膜病,其中所述疫苗包含SJNNV。15.疫苗,其包含SJNNV,用于預防或治療魚的RGNNV感染。16.根據權利要求15所述的疫苗,其中SJNNV是i)具有這樣的核苷酸或氨基酸序列的SJNNV,所述核苷酸或氨基酸序列與SJNNV分離株SJNag93的核苷酸或氨基酸序列優選地至少90%同一,更優選地至少95%同一,特別優選地至少97%同一,更特別優選地至少99%同一,或者ii)這樣的SJNNV,其與SJNag93分離株的抗血清發生血清學反應,或者iii)這樣的SJNNV,其具有的核苷酸或氨基酸序列與SJNNV分離株SJNag933的核苷酸或氨基酸序列優選地至少90%同一,更優選地至少95%同一,特別優選地至少97%同一,更特別優選地至少99%同一,并且其與SJNag93分離株的抗血清發生血清學反應。17.根據權利要求16所述的疫苗,其中SJNNV的核苷酸或氨基酸序列的百分同一性涉及SJNNV分離株SJNag93的RNA2區段中的T4可變區。18.根據權利要求14到17中任一項所述的疫苗,其中將SJNNV以至少約1x10TCID/魚的量施用至魚。19.根據權利要求14至18中任一項所述的疫苗,其中將SJNNVRNA2施用至魚。20.根據權利要求19所述的疫苗,其中SJNNV包含SJNNVRNA1和SJNNVRNA2。21.根據權利要求19所述的疫苗,其中SJNNV是SJNNVRNA2,沒有SJNNVRNA1。22.根據權利要求14至21中任一項所述的疫苗,其中SJNNV是熱殺死或者化學滅活的SJNNV形式。23.根據權利要求22所述的疫苗,其中化學滅活的SJNNV是使用氮丙啶化合物,優選地二乙烯亞胺滅活的。24.根據權利要求14至22中任一項所述的疫苗,其中SJNNV是以DNA或RNA疫苗的形式施用,優選地以RNA疫苗的形式施用。25.根據權利要求14至24中任一項所述的疫苗,其中魚選自歐洲海鱸、塞內加爾鰨、金頭鯛、紅帶鯛、普通鯛、白鯛和野生白姑魚,優選地歐洲海鱸。26.根據權利要求14至25中任一項所述的疫苗,其中SJNNV選自SJNag93、Jp/06/SJ、SJOri、SJ91Nag、SJ92Nag、SJ94Nag和RS95Hir3,優選地SJNag93。27.用于?;び愕摯褂隦GNNV感染相關的疾病的方法,所述方法包括施用SJNNV至魚,其中隨后暴露于RGNNV的所述魚與沒有事先施用SJNNV而暴露于RGNNV的魚比較具有較少和/或減輕的疾病癥狀。28.根據權利要求27的方法,其中RGNNV能夠在魚中引起死亡。29.根據權利要求28的方法,其中施用了SJNNV且隨后暴露于RGNNV的所述魚與沒有事先施用SJNNV而暴露于RGNNV的魚比較具有較低的死亡率。30.根據權利要求27的方法,其中施用SJNNV后,將魚暴露于RGNNV達約6周。31.根據權利要求27的方法,其中施用SJNNV后,將魚暴露于RGNNV達約3周。32.根據權利要求27的方法,其中施用SJNNV后,將魚暴露于RGNNV達約72小時。33.根據權利要求27的方法,其中施用SJNNV后,將魚暴露于RGNNV達約24小時。34.根據權利要求27的方法,其中SJNNV包括分離株SJ93Nag。35.根據權利要求27的方法,其中SJNNV和RGNNV能夠感染魚的同一物種。36.根據權利要求35的方法,其中魚包括歐洲海鱸、塞內加爾鰨、金頭鯛、紅帶鯛、普通鯛、白鯛和野生白姑魚。37.根據權利要求27的方法,其中SJNNV的施用是通過對魚肌內注射或腹膜內注射病毒或者在含病毒的缸里浸泡魚而實施的。38.根據權利要求27的方法,其中施用至魚的SJNNV的量是至少約1x10TCID/魚。39.根據權利要求27的方法,其中施用至魚的SJNNV的量是約1x10至約1.5x10TCID/魚之間的量。40.根據權利要求27的方法,其中SJNNV的施用導致至少一個干擾素誘導基因轉錄表達的增加。41.根據權利要求40的方法,其中干擾素誘導基因包括Mx。42.減少海鱸與RGNNV感染相關的死亡率的方法,所述方法包括用SJNNV接種海鱸,其中隨后暴露于能夠引起死亡的RGNNV的所述海鱸與沒有接種過SJNNV且被暴露于RGNNV的海鱸比較具有減少的死亡率。43.根據權利要求42的方法,其中接種SJNNV并隨后暴露于RGNNV的海鱸在接種SJNNV后達約72小時具有降低的死亡率。44.用病毒感染魚的方法,其中包括:a)施用SJNNV至魚;和b)暴露魚至RGNNV;其中,所述魚與沒有施用過SJNNV而暴露于RGNNV的魚比較具有較少和/或減輕的與RGNNV相關的癥狀。45.用于抑制SJNNV在細胞中復制的方法,包括在用SJNNV感染細胞之前或同時,用RGNNV感染細胞。46.用于刺激RGNNV在細胞中復制的方法,包括在用RGNNV感染細胞之前或同時,用SJNNV感染細胞。47.SJNNV的用途,用于制備減少RGNNV感染導致的魚死亡數量的組合物。

說明書

發明領域

本發明總體上涉及黃帶擬鲹神經壞死病毒(Stripedjacknervousnecrosisvirus;SJNNV)用于?;び愕摯褂氤嗟閌哂閔窬鄧啦《?Red-spottedgroupernervousnecrosisvirus;RGNNV)感染相關的疾病。另一方面,本發明涉及用于?;び愕摯褂隦GNNV感染相關的疾病的方法,所述方法包括施用SJNNV至魚,其中隨后暴露于RGNNV的所述魚與那些沒有事先施用SJNNV而暴露于RGNNV的魚比較具有較少和/或減輕的疾病癥狀。

發明背景

諾達病毒科(Nodaviridae)β諾達病毒屬(Betanodavirus)的病毒(即,β諾達病毒)感染全球多種不同海水和淡水魚類,并且是魚的病毒性腦病和視網膜病的致病原。這種疾病,又稱為病毒性神經壞死病(VNN),可導致顯著的魚死亡。

致病的β諾達病毒是無被膜的,并且它們的基因組包含兩條單鏈正義RNA分子,稱為RNA1和RNA2。受感染的細胞包含三種ssRNAs:RNA1、RNA2和衍生自RNA1的亞基因組RNA3。RNA2區段中的T4可變區用來將β諾達病毒分為4個不同的基因型:黃帶擬鲹神經壞死病毒(SJNNV)、紅鰭東方鲀神經壞死病毒(TPNNV)、條斑星鰈神經壞死病毒和赤點石斑魚神經壞死病毒(RGNNV)(Nishizawa等人,1997)。名稱的NNV部分是指神經壞死病毒,名稱的初始部分是指其分離自的魚。這些是已接受的物種,其中基于SJNag93分離株的特征,黃帶擬鲹品種被稱為型物種(Iwamoto等人,2001)。其他可能是β諾達病毒屬的成員,但是還沒有被批準為獨立物種,并且可能是或可能不是以上這四種接受物種中任何一種的變體,其包括:大西洋鱈魚神經壞死病毒、大西洋比目魚諾達病毒、鱸魚腦炎病毒、龍躉比目魚神經壞死病毒、多脂比目魚神經壞死病毒、日本比目魚神經壞死病毒、晚期鈣化腦炎病毒、馬拉巴比目魚神經壞死病毒、海鱸神經壞死病毒、塞內加爾鰨神經壞死病毒和多寶魚諾達病毒(VirusTaxonomy,2012)。

不同基因型的β諾達病毒可能感染魚的不同宿主范圍。然而,已經在野生白姑魚(大西洋白姑魚(Argyrosomusregius))中顯示SJNNV和RGNNV在野生的單個魚中共存?;赗NA1和RNA2的遺傳分析也表明了在受感染的魚中重配病毒(reassortantviruses)(RGNNV/SJNNV和SJNNV/RGNNV)的存在。已經從塞內加爾鰨和金頭鯛中分離得到此類重配病毒株或分離株,其中所述重配病毒株或分離株包含一個來自SJNNV的基因組RNA分子和一個來自RGNNV的基因組RNA分子。重配株與臨床疾病的爆發有關。重配可以由于SJNNV和RGNNV共感染相同的細胞所致。雖然這個證據表明SJNNV和RGNNV的RNA均可以在同一受感染細胞中共同存在,但是這對復制和/或子代病毒產生有什么影響,或者對引起疾病癥狀的能力有何影響仍然是未知的。

已經分別在棲息于伊比利亞半島的魚種類中檢測了SJNNV和RGNNV,如歐洲海鱸(Dicentrarchuslabrax)、塞內加爾鰨(Soleasenegalensis)、金頭鯛(Sparusaurata)、紅帶鯛(Pagrusauriga)、普通鯛(Pagruspagrus)、石首魚(Shidrum)、(波紋短須石首魚(Umbrinacirrosa))和白鯛(Diploidussargus)。

RGNNV基因型似乎在地中海區域是最常見的,尤其是希臘,并且是魚業毀滅性損失的責任原因。據報道,歐洲海鱸的損失已達到60%。因此,存在找尋?;び?,特別是海鯛,免受RGNNV感染影響的方法的迫切需求。

發明概述

在第一個方面,本發明涉及黃帶擬鲹神經壞死病毒(SJNNV)用于?;び愕摯褂氤嗟閌哂閔窬鄧啦《?RGNNV)感染相關的疾病。

在一個優選的實施方案中,SJNNV是:

i)具有這樣的核苷酸或氨基酸序列的SJNNV,所述核苷酸或氨基酸序列與SJNNV分離株SJNag93的核苷酸或氨基酸序列優選地至少90%同一,更優選地至少95%同一,特別優選地至少97%同一,更特別優選地至少99%同一,

或者ii)這樣的SJNNV,其與SJNag93分離株的抗血清發生血清學反應,

或者iii)這樣的SJNNV,其具有的核苷酸或氨基酸序列與SJNNV分離株SJNag933的核苷酸或氨基酸序列優選地至少90%同一,更優選地至少95%同一,特別優選地至少97%同一,更特別優選地至少99%同一,并且其與SJNag93分離株的抗血清發生血清學反應。

在一個進一步優選的實施方案中,SJNNV的核苷酸或氨基酸序列的百分同一性涉及SJNNV分離株SJNag93的RNA2區段中的T4可變區。

在一個更優選的實施方案中,SJNNV的核苷酸序列的百分同一性涉及來自SJNag93SJNNV的RNA2中第604到1030位核苷酸的序列,或者SJNNV的氨基酸序列的百分同一性涉及SJNag93SJNNV的RNA2編碼的蛋白質的第204-331位氨基酸,優選地涉及SJNag93SJNNV的RNA2編碼的蛋白質的第223-331位氨基酸,更優選地涉及SJNag93SJNNV的RNA2編碼的蛋白質的第235-315位氨基酸。

優選地SJNNV選自SJNag93、Jp/06/SJ、SJOri、SJ91Nag、SJ92Nag、SJ94Nag和RS95Hir3,優選地SJNag93。

在一個優選的實施方案中,將SJNNV以至少約1x104TCID50/魚的量施用至魚。

還優選地,?;び愕摯辜膊∩婕霸謨閎禾逯屑跎儆捎赗GNNV感染導致的死亡率。

更優選地,魚選自歐洲海鱸、塞內加爾鰨、金頭鯛、紅帶鯛、普通鯛、白鯛和野生白姑魚,優選地歐洲海鱸。

在一個更優選的實施方案中,RGNNV是:

i)具有這樣的核苷酸或氨基酸序列的RGNNV,所述核苷酸或氨基酸序列與RGNNV分離株ERV378/102-5/04的核苷酸或氨基酸序列優選地至少90%同一,更優選地至少95%同一,特別優選地至少97%同一,更特別優選地至少99%同一,

或者ii)這樣的RGNNV,其與ERV378/102-5/04分離株的抗血清發生血清學反應。

或者iii)這樣的RGNNV,其具有的核苷酸或氨基酸序列與RGNNV分離株ERV378/102-5/04的核苷酸或氨基酸序列優選地至少90%同一,更優選地至少95%同一,特別優選地至少97%同一,更特別優選地至少99%同一,并且其與ERV378/102-5/04分離株的抗血清發生血清學反應。

在一個優選的實施方案中,RGNNV的核苷酸或氨基酸序列的百分同一性涉及RGNNV分離株ERV378/102-5/04的RNA2區段中的T4可變區。

又在另一個優選的實施方案中,本發明涉及SJNNV的使用,包括施用SJNNV至魚,隨后暴露于RGNNV的所述魚與那些沒有事先施用SJNNV而暴露于RGNNV的魚比較具有較少和/或減輕的疾病癥狀。

在另一方面,本發明涉及使用SJNNV?;び愕摯褂捎赗GNNV感染導致的病毒性神經壞死或病毒性腦病和視網膜病。

仍在另一方面,本發明涉及用于?;び愕摯褂隦GNNV感染相關的疾病的方法,所述方法包括施用SJNNV給魚,隨后暴露于RGNNV的所述魚與那些沒有事先施用SJNNV而暴露于RGNNV的魚比較具有較少和/或減輕的疾病癥狀。

在一個優選的實施方案中,與沒有施用過SJNNV或者沒有施用過與SJNNV分離株SJNag93優選地至少90%同一、更優選地至少95%同一、特別優選地至少97%同一、更特別優選地至少99%同一的病毒的魚、優選地海鱸比較,SJNNV用于減少后來暴露于RGNNV的魚、優選地海鱸的死亡率。

在本發明的另一個優選的方面,提供了減少魚、優選地海鱸與RGNNV感染相關的死亡率的方法,所述方法包括用SJNNV接種魚、優選地海鱸,其中隨后暴露于能夠引起致死的一株或者多株RGNNV的所述魚、優選地海鱸與那些沒有接種過SJNNV且被暴露于所述一株或者多株RGNNV的海鱸比較具有減少的死亡率。

優選地,在本發明的方法中,RGNNV能夠在魚中引起死亡。也優選地施用了SJNNV且隨后暴露于RGNNV的所述魚與沒有事先施用SJNNV而暴露于RGNNV的魚比較具有較低的死亡率。

在本發明方法的一個優選的實施方案中,在施用SJNNV至魚后,將魚暴露于RGNNV達約6周。更優選地在施用SJNNV至魚后,將魚暴露于RGNNV達約3周。特別優選地在施用SJNNV至魚后,將魚暴露于RGNNV達約72小時。更加特別優選地在施用SJNNV至魚后,將魚暴露于RGNNV達約24小時。在另一個優選的實施方案中,SJNNV包括分離株SJ93Nag。仍在另一個優選的實施方案中,SJNNV和RGNNV能夠感染魚的同一物種,其優選地包括歐洲海鱸、塞內加爾鰨、金頭鯛、紅帶鯛、普通鯛、白鯛和野生大西洋白姑魚。在本發明方法的另一個優選實施方案中,SJNNV的施用是通過對魚進行病毒的肌內注射或腹膜內注射或者在含病毒的缸里對魚進行浸泡。仍在本發明方法的另一個優選實施方案中,將SJNNV以至少約1x104TCID50/魚的量施用至魚。更優選地將SJNNV以每條魚約1x104至約1.5x104TCID50之間的量施用至魚。在本發明方法的一個優選實施方案中,SJNNV的施用導致至少一個干擾素誘導基因轉錄表達的增加,其中優選地干擾素誘導基因包括Mx。優選地,在本發明的方法中,接種SJNNV并隨后暴露于RGNNV的海鱸在接種SJNNV后達約72小時具有降低的死亡率。

在本發明方法的一個優選的實施方案中,SJNNV是

i)具有這樣的核苷酸或氨基酸序列的SJNNV,所述核苷酸或氨基酸序列與SJNNV分離株SJNag93的核苷酸或氨基酸序列優選地至少90%同一,更優選地至少95%同一,特別優選地至少97%同一,更特別優選地至少99%同一,

或者ii)這樣的SJNNV,其與SJNag93分離株的抗血清發生血清學反應,

或者iii)這樣的SJNNV,其具有的核苷酸或氨基酸序列與SJNNV分離株SJNag93的核苷酸或氨基酸序列優選地至少90%同一,更優選地至少95%同一,特別優選地至少97%同一,更特別優選地至少99%同一,并且其與SJNag93分離株的抗血清發生血清學反應。

在本發明方法的一個優選的實施方案中,核苷酸或氨基酸序列的百分同一性涉及SJNNV分離株SJNag93的RNA2區段中的T4可變區。

在本發明方法的一個進一步優選的實施方案中,RGNNV具有這樣的核苷酸或氨基酸序列,所述核苷酸或氨基酸序列與RGNNV分離株ERV378/102-5/04的核苷酸或氨基酸序列優選地至少90%同一,更優選地至少95%同一,特別優選地至少97%同一,更特別優選地至少99%同一,

或者ii)這樣的RGNNV,其與ERV378/102-5/04分離株的抗血清發生血清學反應,

或者iii)這樣的RGNNV,其具有的核苷酸或氨基酸序列與RGNNV分離株ERV378/102-5/04的核苷酸或氨基酸序列優選地至少90%同一,更優選地至少95%同一,特別優選地至少97%同一,更特別優選地至少99%同一,并且其與ERV378/102-5/04分離株的抗血清發生血清學反應。

在本發明方法的一個優選的實施方案中,核苷酸或氨基酸序列的百分同一性涉及RGNNV分離株ERV378/102-5/04的RNA2區段中的T4可變區。

又在本發明的另一個優選實施方案中,RGNNV的核苷酸序列與RGNNVRNA1和RNA2的核苷酸序列優選地至少90%同一,更優選地至少95%同一,特別優選地至少97%同一,更特別優選地至少99%同一。RGNNVRNA1的一個代表性的例子是在Genbank中的登錄號NC_008040.1下。RGNNVRNA2的一個代表性的例子是在Genbank中的登錄號NC_008041.1下。

在一個優選的實施方案中,核苷酸序列的百分同一性涉及RGNNV的RNA2區段中的T4可變區。RGNNVRNA2的一個代表性的例子是在Genbank中的登錄號NC_008041.1下。

在另一方面,本發明涉及用于預防或治療魚類RGNNV感染的包含SJNNV的疫苗。又在另一方面,本發明涉及一種用于?;び愕摯褂蒖GNNV感染引起的魚的病毒性神經壞死或病毒性腦病和視網膜病(retinopathy)的疫苗,其中所述疫苗包含SJNNV。

優選地,在所述疫苗中,SJNNV是

i)具有這樣的核苷酸或氨基酸序列的SJNNV,所述核苷酸或氨基酸序列與SJNNV分離株SJNag93的核苷酸或氨基酸序列優選地至少90%同一,更優選地至少95%同一,特別優選地至少97%同一,更特別優選地至少99%同一,

或者ii)這樣的SJNNV,其與SJNag93分離株的抗血清發生血清學反應,

或者iii)這樣的SJNNV,其具有的核苷酸或氨基酸序列與SJNNV分離株SJNag93的核苷酸或氨基酸序列優選地至少90%同一,更優選地至少95%同一,特別優選地至少97%同一,更特別優選地至少99%同一,并且其與SJNag93分離株的抗血清發生血清學反應。更優選地,核苷酸或氨基酸序列的百分同一性涉及SJNNV分離株SJNag93的RNA2區段中的T4可變區。在一個優選的疫苗實施方案中,將SJNNV以至少約1x104TCID50/魚的量施用至魚。在另一個優選的疫苗實施方案中,將SJNNVRNA2施用至魚?;褂叛〉豐JNNV包含SJNNVRNA1和SJNNVRNA2。在一個備選的實施方案中,SJNNV是SJNNVRNA2,沒有SJNNVRNA1。在一個優選的疫苗實施方案中,SJNNV是熱殺死或者化學滅活的SJNNV形式。一般地,化學滅活的SJNNV是使用氮丙啶化合物、優選地二乙烯亞胺(binaryethyleneimine)滅活。優選地,SJNNV是以DNA或RNA疫苗的形式施用,優選地RNA疫苗。在根據本發明疫苗的另一優選實施方案中,魚選自歐洲海鱸、塞內加爾鰨、金頭鯛、紅帶鯛、普通鯛、白鯛和野生白姑魚,優選地歐洲海鱸?;褂叛〉?,在本發明的疫苗中,SJNNV選自SJNag93、Jp/06/SJ、SJOri、SJ91Nag、SJ92Nag、SJ94Nag和RS95Hir3,優選地SJNag93。

在另一方面,本發明涉及SJNNV的用途,用于制備減少RGNNV感染導致的魚死亡數量的組合物。

又在另一方面,本發明涉及一種用于抑制SJNNV在細胞中復制的方法,包括細胞在感染SJNNV之前或感染SJNNV同時用RGNNV感染細胞。

本發明的另一方面涉及用病毒感染魚的方法,包括:

a)施用SJNNV至魚;和

b)暴露魚至RGNNV;

其中,所述魚與那些沒有施用過SJNNV而暴露于RGNNV的魚比較具有較少和/或減輕的與RGNNV相關的疾病癥狀。

又在另一方面,本發明涉及一種用于刺激RGNNV在細胞中復制的方法,包括細胞在感染RGNNV之前或感染RGNNV同時用SJNNV感染細胞。

附圖簡述

在納入和構成說明書一部分的附圖中,闡述了方法和組合物的實施方案或者所涉及的方法和組合物,所述附圖連同下面給出的詳細描述,都是為描述例子服務的。應該意識到,圖示的實施方案是用來闡述而不是用來限制本發明的。如以下所公開的那樣,應該意識到可以對圖中所示實施方案進行變更、修改和變化而不背離本發明的精神和范圍。

圖1示例了來自研究的實例數據,其中將不同的β諾達病毒基因型施用至5g的少年海鱸和隨后的魚死亡率。

圖2示例了來自研究的實例數據,其中將RGNNV的不同病毒株和接種物施用至海鱸和隨后的魚死亡率。陽性對照是RGNNV分離株ERV378/102-5/04。

圖3示例了來自研究的實例數據,其中將RGNNV病毒株施用至不同體重的海鱸和隨后的魚死亡率。

圖4示例了來自研究的實例數據,其中將RGNNV病毒株施用至已經施用過SJNNV的海鱸(例如,對SJNNV感染的魚,用RGNNV超感染)。隨后是魚死亡率。

圖5示例了來自研究的實例數據,其中在SJNNV感染的魚用RGNNV超感染后的多個時間定量RGNNV基因組RNA。在每一時間點的第一列是RG對照組(組3),并且每一時間點的第二列是SJ/RG組(組4)。

圖6示例了來自研究的實例數據,其中在SJNNV感染的魚用RGNNV超感染后的多個時間定量SJNNV基因組RNA。在每一時間點的第一列是SJ對照組(組2),并且每一時間點的第二列是SJ/RG組(組4)

圖7示例了來自研究的實例數據,其中(A)在細胞共感染SJNNV和RGNNV后,(B)在RGNNV超感染已經感染了SJNNV的細胞后,(C)在SJNNV超感染已經感染了RGNNV的細胞后,于多個時間定量SJNNV基因組RNA。

圖8示例了來自研究的實例數據,其中(A)在細胞共感染SJNNV和RGNNV后,(B)在RGNNV超感染已經感染了SJNNV的細胞后,(C)在SJNNV超感染已經感染了RGNNV的細胞后,于多個時間定量RGNNV基因組RNA。

圖9SJNNVRNA1(SEQIDNo.1),黃帶擬鲹神經壞死病毒的蛋白A和蛋白B的基因,完整的cds,核苷酸序列。

圖10aSJNNVRNA1(SEQIDNo.2),蛋白A的氨基酸序列。

圖10bSJNNVRNA1(SEQIDNo.3),蛋白B的氨基酸序列。

圖11SJNNVRNA2(SEQIDNo.4),黃帶擬鲹神經壞死病毒的外殼蛋白基因,完整的cds,核苷酸序列。

圖12SJNNVRNA2(SEQIDNo.5),外殼蛋白的氨基酸序列。

詳細描述

在這里,“SJNNV”指β諾達病毒中的黃帶擬鲹神經壞死病毒種或基因型。這里所公開的SJNNV病毒一般來講可以感染、或者至少可以吸附至這樣的細胞,所述細胞與一些RGNNV病毒種或基因型所感染或吸附的至少有一些是相同的細胞。SJNNV分離株的例子包括但不限于SJ93Nag、Jp/06/SJ、SJOri、SJ91Nag、SJ92Nag、SJ94Nag和RS95Hir。SJNNV的一個優選例子是分離株SJ93Nag。(見Genbank序列AB056571,圖9:SEQIDNo.1(RNA1:蛋白A和蛋白B的病毒基因),圖10a:SEQIDNO.2:蛋白A[帶擬鲹神經壞死病毒]的氨基酸序列,GenBank:BAB64329,圖10b:SEQIDNO.3:蛋白B[帶擬鲹神經壞死病毒]的氨基酸序列,GenBank:BAB64330。圖11SEQIDNo4黃帶擬鲹神經壞死病毒的外殼蛋白基因,完整的cds,GenBank:AB056572。圖12SEQIDNo5?;拼怊撋窬鄧啦《凈蟯飪塹鞍椎陌被嶁蛄?,完整的cds,GenBank:BAB64331)。

在這里,“RGNNV”指β諾達病毒中的赤點石斑魚神經壞死病毒種或基因型。這里所公開的RGNNV病毒一般來講可以感染、或者至少可以吸附至這樣的細胞,所述細胞與一些SJNNV病毒的物種或基因型所感染或吸附的至少有一些是相同的細胞。RGNNV分離株的例子包括但不限于ERV378/102-5/04、SpDI-IAusc1688.08、Mt/01/Sba、Gr/02/Sba、Gr/12/Sba、Pt/08/Sba、It/23/Sba、It/24/Sdr、It/19/Sba、Jp/15/Rp、Th/07/Bgr、Sg/14/Bar、Sp/20/Sba、Gr/16/Sba、SGWak97、SGMie95、RGOka94、JSOit98、KGOit97、HG0001、BGThA99、SBGre96、WSBUS99A、WSBUS99B、BAus94、JFHir92、JFHir96、JF93Hir、MR94Tha、RG94Oka、JF94Wak、JF95Oit、RG91Tok、SB95Ita、SG94Oit、JF95Tok、JS95Shi、JF95Sag、PA94Oit和KG95OIt。RGNNV的一個優選例子是分離株ERV378/102-5/04或者SpDI-IAusc1688.08,特別優選地ERV378/102-5/04。

在這里,“魚”通常是指能被SJNNV和RGNNV感染的魚的物種。這些物種可以包括但不限于歐洲海鱸、塞內加爾鰨、金頭鯛、紅帶鯛、普通鯛、白鯛石首魚和野生白姑魚。

在這里,當談及病毒時,“能夠引起”,通常指的是至少在某些條件或情況下能產生特定的效果(例如,癥狀和/或疾病,和/或死亡率)。

在這里,“癥狀”指的是動物或其體內可觀察到的和/或可測量的特性,所述特性通常認為對健康動物來說是不正常的特性。癥狀可以是疾病的征兆。在這里,動物通常是指魚類,并且癥狀可以是魚特性的變化(例如,身體變化,行為變化等),這些與認為的正?;蛘囈】堤卣魘遣煌?。在這里,癥狀可以是由于或認為是由病毒感染所引起。例如,β諾達病毒能夠是造成魚病毒性神經壞死(VNN)的原因。VNN的癥狀可以包括視網膜細胞的空泡和中樞神經系統(CNX)中的中樞神經系統神經元變性、厭食癥、異常的色素沉著、視力、膀胱控制和游泳行為。β諾達病毒引起的VNN可以導致受感染魚的死亡。因此,盡管死亡可以稱為是VNN的后果,但死亡仍然能認為是VNN的一個癥狀。癥狀可以用其他術語來表述,如臨床體征、病候等。

在這里,“減少癥狀”、“減少死亡”、“降低死亡率”等通常是指不同魚間或者不同魚組間特性的比較,其中在一組魚中觀察到的特性的程度在另一組中是下降的或減少的。一般而言,能將減少歸屬于行為或特征。在這里,例如,RGNNV感染的魚群通?;嵯允居捎赗GNNV感染引起的癥狀??剎舛康氖芨腥鏡撓憧贍芑崴?。RGNNV感染之前事先施用了SJNNV的魚在可比較的群體中顯示癥狀或死亡的魚數量可以少于沒有施用SJNNV的組。在這種情況下,事先施用SJNNV可以說已經減少了RGNNV引起的或相關的癥狀和/或死亡。SJNNV的施用引起性能如癥狀和死亡的減少可以表明對RGNNV引起的或者相關的疾病的?;?。

在這里,當談及病毒以及它們與魚和/或細胞的相互作用時,“施用”或“接種”通常是指病毒的有意給予、施加或引入至魚和/或細胞,從而病毒能感染或至少吸附到魚的細胞或體外培養的細胞中。一種施用或接種病毒的方法是將病毒注射到魚的身體內。

在這里,“暴露至”或“暴露于”通常是指這樣的情形,其中動物(例如,魚)接近感染性物質(如病毒)以至于有病毒感染動物細胞的可能性或機會。

在這里,“隨后施用”或“隨后接種”通常是指這樣的情況,其中在一些其他事件發生后將病毒施用至魚。在一個例子中,一種病毒(例如,RGNNV)在另一種病毒(例如,SJNNV)施用至魚后的一個時間點施用至魚。在這種情況下,相對于早先的SJNNV施用,RGNNV可以說是“隨后施用”。

在這里,“感染”指的是病毒與宿主細胞相互作用并倍增的過程,或者至少有機會在宿主細胞內倍增從而產生額外的病毒的過程。這個感染過程是可能被中斷或阻止在不同階段的。當感染過程被中斷或阻止時,可以抑制或減少額外病毒的產生。

在這里,“共感染”通常是指不同的病毒(例如,SJNNV和RGNNV)在大約相同的時間或同時與相同的宿主細胞相互作用。在一個例子中,兩種不同的病毒共感染細胞導致宿主細胞中兩種病毒的基因組共存。

在這里,“超感染”是指這樣的情況,其中兩種病毒在大致不同的時間與相同的宿主細胞相互作用。例如,在細胞暴露于SJNNV使得可以引發SJNNV感染細胞、并且一段時間后細胞暴露于RGNNV使得可以引發RGNNV感染的情形,SJNNV可以說是“感染”病毒,而RGNNV可以說是“超感染”病毒。因此超感染通常指的是病毒感染先前已經被一種病毒感染過的細胞。感染病毒可以說是在超感染病毒之前感染細胞。超感染病毒可以說是在一種感染病毒之后感染細胞。

在這里,“復制”通常指的是在宿主細胞內部復制病毒基因組的過程。一般而言,復制包括在感染期間發生的事件亞集。

在這里,“重配”通常是指有多方基因組的病毒(例如,多區段基因組),其中至少兩個基因組區段的起源能歸屬于不一樣的病毒。例如,β諾達病毒已知呈現有一個來源于SJNNV的基因組RNA分子和來源于RGNNV的第二基因組RNA分子。

在這里,“轉錄表達”是指從基因的DNA拷貝合成RNA。在一個例子中,特定基因在細胞內編碼的RNA穩態水平可以被測量和用來推斷基因轉錄水平的表達調控。在一個例子中,在不同的細胞群體中測定基因編碼的RNA水平,并且RNA水平的不同是由于該基因轉錄率的變化。

本發明公開了感染魚或者感染體外細胞的β諾達病毒之間的相互作用,以及相互作用的效果。所描述的β諾達病毒通常是SJNNV病毒物種和RGNNV病毒物種。在一個例子中,與那些沒有事先感染SJNNV而感染RGNNV的魚的疾病/癥狀/影響相比,用SJNNV感染魚能夠降低或者減少超感染RGNNV引起的疾病、疾病癥狀、疾病效果等。

可以在多種魚類中看到感染SJNNV對超感染RGNNV的影響。一般來說,所述魚包括任何能夠被SJNNV和RGNNV感染的物種。一些例子包括歐洲海鱸(Dicentrarchuslabrax)、塞內加爾鰨(Soleasenegalensis)、金頭鯛(Sparusaurata)、紅帶鯛(Pagrusauriga)、普通鯛(Pagruspagrus)和白鯛(Diploidussargus)。

一般來說,SJNNV可以是能感染魚物種的SJNNV,其中所述魚物種也能感染RGNNV。在一個例子中,與超感染RGNNV比較,感染SJNNV可以引起較少或較不嚴重的癥狀。在一個例子中,SJNNV可以是SJ93Nag病毒株或者分離株(Iwamoto等人,2001)。其他的SJNNV分離株可以包括SJOri、SJ91Nag、SJ92Nag、SJ94Nag和RS95Hir。

可以通過本領域公知的方法測試“與抗血清的血清學反應”。檢測血清學交叉反應試驗的例子是ELISA、血凝抑制試驗(HI)、血清中和試驗(SN)、交叉中和試驗和病毒中和試驗。一個優選的例子是交叉中和試驗。見Mori等人,2003,p21的方法,所述方法用于測試與諾達病毒分離株的抗血清進行的血清學交叉反應。

SJNNV可以純化自黃帶擬鲹患病魚的幼體,并且通過本領域公知的方法提取RNA,例如如Nishizawa等人1995年,p1564描述的那樣。

如Nishizawa等人,1997年,特別是在第1635頁,以及Nishizawa等人,1995年和Skiliris等人,第64頁所述,可以通過比較外殼蛋白基因序列的可變區從RNA2的第604到1030位核苷酸,或者氨基酸水平的第204到331位氨基酸,優選地第223到331位,更優選地第235到315位來建立將RNA病毒的身份歸屬于本發明的SJNNV基因型。

基于已知的SJNNV序列(見SEQIDNo.1-5),可備選地由本領域公知的方法制備SJNNV的感染性RNA轉錄本。Iwamoto等人,2001年,p2654-2656已經對此做了詳細介紹。

一般來說,RGNNV可以感染SJNNV也可以感染的魚類。在一個例子中,RGNNV引起感染魚的癥狀和/或疾病。在一個例子中,RGNNV能引起感染魚的死亡。RGNNV病毒株或者分離株的一個例子是ERV378/102-5/04(Lopez-Jimena等人,2011)。

可以通過多種方法繁殖β諾達病毒。例如,病毒可以在培養的細胞中生長??梢允褂枚嘀峙嘌南赴?。細胞系的一些例子包括E-11細胞系(ECACC,No.01110916;Iwamoto等人,2000)、SAF-1細胞(ECACC,No.00122301;Aquaculture150:143-153,1997)和SSN-1細胞(J.Gen.Virol.77,2067-2071,1996)。在該領域中病毒的繁殖技術是眾所周知的。

可以使用多種技術施用包括SJNNV在內的病毒給魚。例如,可將SJNNV施用至魚的幼體和/或年少的魚??山玈JNNV施用至成年或成熟的魚。在一個例子中,魚的體重在約2.5克到10克之間。SJNNV施用的途徑可以是不同的。例子包括肌內注射、腹膜內注射、口飼、在含病毒的缸里對魚進行浸泡、及其他。

一般來說,施用至魚的SJNNV的量是減少可由RGNNV造成的癥狀(包括死亡率)的量??捎啥嘀旨際趵慈范ú《鏡摹傲俊?。一般而言,可以使用檢測病毒感染活性的試驗。在一個例子中,可以通過測定TCID50來測量傳染性病毒。其他方法是可測量空斑形成單位。也可以使用額外的方法。SJNNV的施用量可以是每條魚的TCID50為102、103、105、106、107、或更多。在一個例子中,SJNNV施用至魚的量至少為每條魚約1x104TCID50。在一個例子中,SJNNV施用至魚的量約在每條魚1x104和1.5x104TCID50之間。感染魚的體積的例子可以是10、20、50、100、150、200、250或500微升。在一個例子中,體積是約10和200微升之間。在另一個例子中,注射50或者100微升。

可以使用多種方法制劑用于對魚施用的病毒。一般而言,直至把病毒施用至魚,該制劑都將保持病毒的感染性。在一個例子中,可以將病毒配制在生物緩沖劑中。

SJNNV對RGNNV造成魚中癥狀減少的效果通??梢允淺志瞇緣?。例如,施用SJNNV后由于不同時間點的后續RGNNV感染,施用了SJNNV的魚可顯示減少的癥狀。在多個實例中,施用SJNNV的6、5、4、3、2或者1周后,施用了SJNNV的所述魚在隨后的RGNNV感染中相比沒有施用SJNNV的魚可以有減少的癥狀。這些減輕的癥狀可以在SJNNV施用后持續6、5、4、3、2或者1天。這些減輕的癥狀可以在SJNNV施用后持續96、72、48、24、12或者6小時。

沒有SJNNV對RGNNV相關疾病和/或死亡率影響的作用機理可依賴或者提出。僅僅公開了實例結果表明魚和/或魚的或者來自魚的細胞的感染可導致一個或多個已知的受干擾素調控的基因的表達變化,或與此相關。在一個例子中,魚的SJNNV感染是與增加一個或者多個干擾素誘導基因的穩態RNA水平相關的。在一個例子中,干擾素誘導基因可以是Mx。在一個例子中,SJNNV是與干擾素誘導基因轉錄的增加有關的。

在一個例子中,SJNNV感染之前或同時用RGNNV感染細胞可以導致細胞中SJNNV復制的抑制。SJNNV超感染RGNNV感染的細胞可以引起SJNNV基因組復制的抑制作用。RGNNV和SJNNV對細胞的共感染可以引起SJNNV基因組復制的抑制作用。

在一個例子中,RGNNV感染之前或同時用SJNNV感染細胞可以導致細胞中RGNNV復制的刺激。RGNNV超感染SJNNV感染的細胞可以引起RGNNV基因組復制的刺激作用。SJNNV和RGNNV對細胞的共感染可以引起RGNNV基因組復制的刺激作用。

實施例

實施例是用于闡述例子的作用并且不構成說明限制。

實施例1-β諾達病毒、細胞系和病毒生長

根據Lopez-Jimena等人,2011所述,將病毒分離株ERV378/102-5/04(RGNNV基因型;Lopez-Jimena等人,2011)、SpDI-IAusc1688.08(RGNNV基因型;Olveira等人,2009)、SJ93Nag(SJNNV基因型,Iwamoto等人,2001)和SpSs-IAusc160.03(RGNNV型RNA1和SJNNV型RNA2重組重配株;Olveira等人,2009)于25℃生長在E-11細胞系中(歐洲細胞培養物保藏中心(EuropeanCollectionofCellCultures),英國,目錄號01110916)(Iwamoto等人,2000)。細胞于25℃生長在Leibovitz(L-15)培養基(Invitrogen)中,所述培養基中補充有1%青霉素-鏈霉素(Invitrogen)和5%胎牛血清,在接種病毒前直至細胞半匯片。如(TissueCulture:MethodsandApplications;Kruse和Patterson編著;pp.527-532,AcademicPress,NewYork,1973)所述,使用造成接種培養物50%細胞病變效應(TCID50)的最高稀釋度確定病毒滴度。

實施例2-海鱸

歐洲海鱸(Dicentrarchuslabrax)均維持在21-25℃。一定重量的海鱸通過肌內(i.m.)注射接種病毒(0.1毫升的L-15培養基作為對照接種物,用于對照)。在其他研究中,通過在含有病毒的缸里浸泡海鱸進行接種(L-15培養基用作對照接種物)。

實施例3-一些RGNNV病毒株引起的海鱸死亡率

平均體重2.5g的歐洲海鱸通過肌內注射病毒分離株SpDI-IAusc1688.08(RGNNV基因型),每條魚1.0×106、2.5×105、1.0×105或1.0×104TCID50。類似地,對魚注射每條魚2.5×105TCID50的病毒分離株ERV378/102-5/04RGNNV基因型(在圖2中列為陽性對照)。本研究中,ERV378/102-5/04分離株引起了69%的累積死亡率。

在另一個實驗中(Lopez-Jimena等人,2011)顯示,在少年的歐洲海鱸(平均體重10±0.3g;n=100)中,通過肌內注射ERV378/102-5/04RGNNV分離株106TCID50進行攻擊,累積的魚死亡率為37%。從細胞培養物接種的死魚的組織勻漿(腦和眼睛)分析顯示所有分析的樣品中RGNNV的存在。隨后病毒的身份用RT-PCR方法證實。

實施例4-不同的β諾達病毒基因型和魚死亡率

5克體重的海鱸肌內注射以下VNN病毒株:SJ93Nag(SJNNV基因型),分離株ERV378/102-5/04(RGNNV)和SpSs-IAusc160.03(RGNNVRNA1和SJNNVRNA2的重配株)進行攻擊。體積為0.1毫升的L-15培養基注射給對照組,而每條魚采用2.5×105TCID50劑量的不同病毒。每天測量溫度,并保持在約22-25℃之間。僅在接種RGNNV的魚中(47%累積死亡率),和接種重配病毒株的魚中(33%死亡率)記錄了典型的VNN癥狀和死亡率。SJ93Nag或者對照組沒有死亡記錄(圖1)。

實施例5-存活魚中抗VNNV抗體的測定

通過ELISA的方法,對實施例4中存活的5條魚的血清進行合并,為進行特異的抗β諾達病毒抗體的檢測對三個合并池進行了篩選。用SJ93Nag(SJNNV基因型)、SpSs-IAusc160.03(RGNNVRNA1/SJNNVRNA2重配株)或者RGNNV(Lopez-Jimena等人,2011)和合并的血清(1/32稀釋)包被ELISA平板,三次重復平行分析。在450nm處測定光密度值(OD)。將陰性對照孔(用PBS替代魚血清)(三次重復)的OD平均值視作截斷閾值。

表1顯示了OD值的三次重復平均值和標準差(SD)。截斷閾值是0.305。

表1.使用ELISA檢測特異的抗VNN抗體的OD平均值和標準差(SD)

盡管沒有死亡或者臨床表現,接種SJNNV分離株的存活魚的腦中仍然記錄到有高水平的病毒基因組和感染性病毒粒子。通過間接ELISA檢測到特異性抗體反應僅僅在VNN接種組中觀察到,RGNNV、SJNNV和重配株接種的魚分別有1/1024、1/4096和1/8192的滴度。

實施例6-海鱸大小對死亡率的影響

平均體重2.5g的歐洲海鱸通過肌內注射每條魚2.5×105TCID50的病毒分離株ERV378/102-5/04(RGNNV基因型)。每日記錄魚死亡率。RGNNV的病毒分離株ERV378/102-5/04造成的累積死亡率為69%。如實施例4中所提到的,同樣接種至平均5克重的海鱸導致47%的累積死亡率。2.5和5克魚的數據如圖3所示。在第三個試驗中,106TCID50的相同病毒接種至平均重量10克的海鱸中導致了37%的死亡率。因此魚的大小與RGNNV基因型感染的死亡率是成反比的。

實施例7-魚的超感染實驗

進行研究來監測當海鱸事先感染SJNNV后,RGNNV感染海鱸的疾病進程監控。

少年的歐洲海鱸(平均體重10-15克)分布在四個獨立的600升的缸中。

未感染的對照組(n=150):在0小時和24小時后的時間點肌內注射L-15培養基(0.1毫升);

1)未感染的對照組(n=150):在0小時和25小時后的時間點肌內注射L-15培養基0.1毫升;

2)SJNNV感染的對照組(n=150):在0小時肌內注射1.5x106TCID50的SJNNV(分離株SJ93Nag),并在24小時后注射L-15培養基(0.1毫升);

3)RGNNV感染的對照組(n=150):在0小時肌內注射L-15培養基(0.1毫升),并在24小時后注射1.5x106TCID50的RGNNV(分離株ERV378/102-5/04);

4)超感染組(n=150):在0小時肌內注射1.5x106TCID50的SJNNV(分離株SJ93Nag),并在24小時后注射1.5x106TCID50的RGNNV(分離株ERV378/102-5/04);

從每一實驗組中,分別維持50條魚用來確定累積死亡率。剩下的100條魚用來進行取樣(見實施例8-10數據)。在試驗期間水的溫度維持在22和24℃之間。每日記錄死亡數,并且將死亡的魚凍存在-80℃用于之后的病毒學試驗。

對于SJNNV感染的對照組(組2)和未感染的對照組(組1),沒有觀察到死亡(圖4)。

對于RGNNV接種的對照組(組3),約在感染后6天首次檢測到死亡。感染后15天,死亡率穩定在約76%。

在超感染組(組4)中,雖然魚表現出暗色和游泳行為異常,但是只有2只動物死亡(4%的累計死亡率)。相比RGNNV感染魚而沒有事先感染SNJJV的情形,在這個組中SJNNV感染大大地減少了死亡率(組3)。

實施例8-超感染實驗中來自RGNNV感染的死魚的病毒

從實施例7中所描述的,使用RGNNV感染的對照組的死魚(組3)檢測病毒的存在。合并在感染后第6天和第12天死亡的魚的腦和眼組織,并且在補充有1%青霉素-鏈霉素和2%胎牛血清的20%(w/v)L-15培養基中勻漿。勻漿物用10%青霉素-鏈霉素4℃過夜處理。然后勻漿物7500g,4℃,離心15分鐘,離心兩次,并且取100微升的上清液用來進行E-11細胞的病毒滴定測定,以確定TCID50。數據如下表2所示。

這些數據表明能從死魚中分離病毒。

實施例9-超感染實驗中來自SJNNV感染、RGNNV超感染的魚的病毒基 因組的定量

對魚中的病毒基因組進行了定量,所述魚來自實施例7中所述實驗的超感染組(組4)。在RGNNV超感染后12小時、3天和7天,從組4中隨機收集9條活魚。用過量麻醉劑(MS-222,Sigma)使魚死亡,并且每個時間點取3條魚的腦和眼睛合并在一起,立即在液氮中冷凍,并在-80℃存儲直到使用。

在補充有1%青霉素-鏈霉素和2%胎牛血清的L-15培養基(20%w/v)中勻漿合并的器官。將勻漿物7500g,4℃,離心15分鐘,離心兩次。使用在每一個采樣時間點的200微升體積的三個澄清的勻漿物進行總RNA提取。

使用(Invitrogen)進行RNA的提取。使用ND-1000系統(NanoDropThermoScientific)在260nm處確定獲得的RNA濃度。RNA存儲在-80℃直到使用。

從RNA合成cDNA使用的是TranscriptorFirst-StrandcDNASynthesis試劑盒(Roche)。使用1微克的總RNA進行反應。使用ND-1000系統在260nm處確定cDNA的濃度。cDNA存儲在-20℃直到使用。

使用基于SYBRGreen1的絕對實時PCR(qPCR)方法分別檢測RGNNV和SJNNV基因型的RNA2區段,對病毒基因組進行定量。具體來說,RGNNVRNA2的定量使用已經描述了的步驟(Lopez-Jimena等人,2011)。SJNNVRNA2區段的定量使用引物SJ-RNA2-F(5’-GACACCACCGCTCCAATTACTAC-3’,核苷酸665-687)(SEQIDNO.6)和SJ-RNA2-R(5’-ACGAAATCCAGTGTAACCGTTGT-3’,核苷酸739-717)(SEQIDNO.7),使用已經描述的PCR條件(Lopez-Jimena等人,2011),擴增出T4區(GenBank登錄號D30814)的75bp片段。

通過單因素方差分析(one-wayANOVA)、隨后Fisher最小顯著性差異(LSD)檢驗計算了每一病毒基因組區段在感染后不同時間的拷貝數之間的差異顯著性。采用IBMSPSS統計軟件進行了統計分析。認為p值小于0.05是差異顯著的。

對于RGNNV基因組的定量,數據(圖5)顯示在RGNNV超感染7天之后(感染SJNNV之后8天),在超感染組(組4)中RGNNV的復制相比RGNNV接種的對照組(組3)有顯著降低(圖5)。

相反,超感染組(組4)中SJNNV的復制相比SJNNV感染的對照組(組2)無顯著差異(圖6)。

實施例10-超感染實驗中干擾素(IFN)誘導的基因表達

來自實施例7中所述實驗的魚使用實時RT-qPCR的方法進行了干擾素誘導基因的轉錄表達檢測。數據顯示,RGNNV感染的對照組魚在感染后0至48小時Mx沒有轉錄表達(組3)。相反,SJNNV感染的對照組魚(組2)和超感染組魚(組4)中Mx的轉錄表達增加。這些數據表明,SJNNV對魚的感染可以誘導干擾素誘導基因Mx,而RGNNV不可以。這些結果暗示,由先前感染SJNNV引起的干擾素介導系統的誘導能對超感染組中記錄的死亡率降低負責,?;ずv悅饈苤驲GNNV感染的影響。

實施例11-培養細胞中的超感染實驗

調查研究了SJNNV和RGNNV共存對每種病毒復制和增殖的影響。對受感染的細胞中病毒的基因組拷貝數、及感染細胞產生的感染性病毒粒子進行了確定。E-11細胞生長在24孔板中。第二代細胞單層一式兩份地在SJNNV和RGNNV的最佳增殖溫度25℃處以感染復數為0.1進行感染。實驗組如下表3所示。在各實驗組中,未接種的E-11細胞為對照。

如表3中時間顯示,從各實驗組中收集2孔的細胞和上清液。在實驗結束時收集陰性對照組。如實施例9中所描述的那樣使用提取細胞中總RNA。使用用于RT-PCR的SuperScriptTMIIFirst-StrandSynthesisSystem(Invitrogen)合成cDNA,隨后按照制造商的說明書并在各反應中添加隨機六聚體(50ng)和1微克總RNA。使用基于SYBRGreen1的絕對實時PCR(qPCR)方法對病毒基因組進行定量,并且也如實施例9中所描述的那樣進行數據分析。

為測定病毒滴度,若干無細胞的上清液用來進行滴定,以測定TCID50(實施例1)。在組3至組5中,在病毒滴定前,使用如下的多克隆抗體進行中和試驗(在補充有1%青霉素-鏈霉素的L-15培養基中1/100稀釋):(i)抗NNVab26812抗體(Abcam),中和RGNNV基因型,和(ii)兔中產生的抗SJNNV抗體(T.Nakai博士,廣島大學,日本),中和SJNNV。

圖7顯示感染細胞中SJNNVRNA2拷貝數的測量。圖7A顯示相比SJNNV在SJNNV感染的對照組的拷貝數(組1),SJNNV在SJNNV+RGNNV共感染組的拷貝數(組3)。圖7B顯示相比在SJNNV感染的對照組的拷貝數(組1),SJNNV在SJNNV感染24小時后RGNNV共感染的組中的拷貝數(組4)。圖7C顯示相比在SJNNV感染的對照組的拷貝數(組1),SJNNV在RGNNV感染24小時后SJNNV超感染的組中的拷貝數(組5)。線顯示2個不同樣品的標準差。由星號代表統計學上的顯著變化(p<0.01)。

圖8顯示感染細胞中RGNNVRNA2拷貝數的測量。圖8A顯示相比RGNNV在RGNNV感染的對照組的拷貝數(組2),RGNNV在SJNNV+RGNNV共感染組的拷貝數(組3)。圖8B顯示相比在RGNNV感染的對照組的拷貝數(組2),RGNNV在SJNNV感染24小時后RGNNV共感染的組中的拷貝數(組4)。圖8C顯示相比在RGNNV感染的對照組的拷貝數(組2),RGNNV在RGNNV感染24小時后SJNNV超感染的組中的拷貝數(組5)。線顯示2個不同樣品的標準差。由星號代表統計學上的顯著變化(p<0.01)。

這些實驗的數據表明,在SJNNV和RGNNV感染的細胞中:i)SJNNV基因組的復制在RGNNV存在時部分受到抑制;ii)RGNNV基因組的復制在SJNNV存在時受到刺激,和iii)這些對基因組復制的影響與感染性病毒的產生不相關。

表明RGNNV對SJNNV復制的抑制作用的數據描述如下。在共感染組(組3),數據(圖7A)顯示相比對照組(組1)在12和48小時時間點,SJNNV基因組的拷貝數減少。這在RGNNV感染細胞24小時后超感染SJNNV的實驗中更明顯(組5)。在該實驗中,數據(圖7C)顯示相比對照組(組1),在0、12、24、48、72和96小時的時間點,SJNNV基因組拷貝數減少。這些SJNNV基因組拷貝數的減少并沒有與細胞產生的SJNNV病毒滴度明顯相關。

表明SJNNV對RGNNV復制的刺激作用的數據描述如下。在共感染組(組3),數據(圖8A)顯示相比對照組(組2)在24、48和72小時的時間點,RGNNV基因組的拷貝數增加。這在SJNNV感染細胞24小時后超感染RGNNV的實驗中更明顯(組4)。在該實驗中,數據(圖8B)顯示相比對照組(組2)在0、12、24和48小時的時間點,RGNNV基因組拷貝數顯示增加。然而,在96小時,RGNNV基因組拷貝數與對照組相比是減少的。RGNNV基因組拷貝數的增加并沒有與細胞產生的RGNNV病毒滴度明顯相關。

我們還發現,與不含SJNNV的細胞中的RGNNV復制相比,在RGNNV感染之前或者RGNNV感染的大致同時用SJNNV感染細胞至少開始刺激細胞中RGNNVRNA的復制。這種對復制的影響可能與感染細胞產生的感染性病毒無關。

我們還發現,與不含RGNNV的細胞中的SJNNV復制相比,在SJNNV感染之前或者SJNNV感染的大致同時用RGNNV感染細胞部分抑制了細胞中SJNNVRNA的復制。這種對復制的影響可能與感染細胞產生的感染性病毒無關。

實施例組成、方法等已經進行描述說明,并且描述已經相當詳細,但是約束或者以任何方式限制申請范圍并不是該申請的目的。當然,為了描述文中所述的組合物、方法等,不可能描述每一個可以想象的組合的組件或方法。額外的優點和修改對于本領域技術人員而言是顯而易見的。因此,公開不限于所示和描述的特定細節、代表性的儀器、說明性的實施例。因此,本申請的目的在于包括本申請范圍內的改變、修改和變化。此外,前面的描述并不意味著限制本發明的范圍。相反地,本發明的范圍是由所附的權利要求及其等價物決定的。

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