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维戈塞尔塔vs皇家社会前瞻: 瓜蔞的組織培養方法.pdf

摘要
申請專利號:

维戈塞尔塔vs皇家社会 www.vmyqew.com.cn CN201810677701.7

申請日:

20180627

公開號:

CN108935099A

公開日:

20181207

當前法律狀態:

有效性:

審查中

法律詳情:
IPC分類號: A01H4/00 主分類號: A01H4/00
申請人: 蕪湖東源新農村開發股份有限公司
發明人: 汪錫文,裴寶平,邱許鳳
地址: 241300 安徽省蕪湖市南陵縣南翔路118號
優先權: CN201810677701A
專利代理機構: 代理人:
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法律狀態
申請(專利)號:

CN201810677701.7

授權公告號:

法律狀態公告日:

法律狀態類型:

摘要

本發明公開了一種瓜蔞的組織培養方法,包括:1)將瓜蔞莖切段作為外植體進行熱處理脫菌,接著置于酒精溶液中進行二次滅菌,然后置于初代培養基中進行誘導培養、于增殖培養基中進行增殖培養得到分化幼苗;2)將分化幼苗于生根培養基中進行生根培養、接著置于5℃以下進行低溫處理以得到組織培養苗;3)將組織培養苗煉苗;其中,初代培養基為含有萘乙酸NAA、6?芐基腺嘌呤6?BA和肌醇的MS培養基;增殖培養基為含有玉米素ZT、卡那霉素、2,4?D和番茄汁的MS培養基;生根培養基含有多效唑、吲哚丁酸IBA和香蕉泥的1/2MS培養基。該瓜蔞的組織培養方法具有優異的成活率以及繁殖率。

權利要求書

1.一種瓜蔞的組織培養方法,其特征在于,包括:1)將瓜蔞莖切段作為外植體進行熱處理脫菌,接著置于酒精溶液中進行二次滅菌,然后置于初代培養基中進行誘導培養、于增殖培養基中進行增殖培養得到分化幼苗;2)將所述分化幼苗于生根培養基中進行生根培養、接著置于5℃以下進行低溫處理以得到組織培養苗;3)將所述組織培養苗煉苗;其中,步驟1)-2)的培養條件均至少符合以下條件:無菌且透氣;所述初代培養基為含有萘乙酸NAA、6-芐基腺嘌呤6-BA和肌醇的MS培養基;所述增殖培養基為含有玉米素ZT、卡那霉素、2,4-D和番茄汁的MS培養基;所述生根培養基含有多效唑、吲哚丁酸IBA和香蕉泥的1/2MS培養基。2.根據權利要求1所述的組織培養方法,其特征在于,在所述初代培養基中,所述NAA的濃度為0.8-1.3mg/L,所述6-BA的濃度為0.2-0.4mg/L,所述肌醇的濃度為0.8-1.3mg/L;在所述增殖培養基中,所述ZT的濃度為0.2-0.4mg/L,所述卡那霉素的濃度為0.8-1.3mg/L,所述2,4-D的濃度為0.4-0.6mg/L,所述番茄汁的濃度為2-5mg/L;在所述生根培養基中,所述多效唑的濃度為0.05-0.1mg/L,所述IBA的濃度為0.3-0.6mg/L,所述香蕉泥的濃度為3-4.5g/L。3.根據權利要求1所述的組織培養方法,其特征在于,所述初代培養基、增殖培養基以及生根培養基均含有3-6g/L的瓊脂和14-18g/L的蔗糖,且pH值為6.0-7.0。4.根據權利要求1所述的組織培養方法,其特征在于,所述熱處理脫菌滿足以下條件:脫菌溫度為42-48℃,脫菌時間為3-6min。5.根據權利要求1所述的組織培養方法,其特征在于,所述二次滅菌滿足以下條件:滅菌時間為15-25min,滅菌溫度為15-35℃;所述酒精溶液中乙醇的濃度為60-70體積%。6.根據權利要求1-5中任意一項所述的組織培養方法,其特征在于,所述外植體的長度為0.25-0.35cm。7.根據權利要求1-5中任意一項所述的組織培養方法,其特征在于,所述誘導培養滿足以下條件:先暗培養1-2天,接著轉入光暗交替的條件下培養4-6天;其中,光暗交替條件為:光照時間為12-14h/天,光照強度為1400-1600lux,培養溫度為25-30℃,相對濕度為50-60%。8.根據權利要求1-5中任意一項所述的組織培養方法,其特征在于,所述增殖培養于光暗交替條件下培養8-10天,光暗交替條件為:光照時間為12-14h/天,光照強度為1700-1900lux,培養溫度為20-25℃,相對濕度為50-60%。9.根據權利要求1-5中任意一項所述的組織培養方法,其特征在于,所述生根培養于光暗交替條件下培養10-15天,光暗交替條件為:光照時間為12-14h/天,光照強度為2000-2200lux,培養溫度為20-25℃,相對濕度為50-60%;優選地,所述低溫處理的時間為8-12h。10.根據權利要求1-5中任意一項所述的組織培養方法,其特征在于,步驟1)-2)中的無菌且透氣條件通過以下操作獲得:培養環境為帶防菌透氣膜的組培瓶;優選地,透氣膜至少滿足以下條件:孔隙為0.2-0.3um,開孔率80-90﹪;更優選地,所述煉苗的條件為:光照時間為12-14h/天,黑暗時間為10-12h/天,光照強度為1800-2000lux,溫度為21-23℃,相對濕度為75-85%,時間為5-7天。

說明書

技術領域

本發明涉及組織培養,具體地,涉及一種瓜蔞的組織培養方法。

背景技術

瓜蔞是葫蘆科,又稱栝樓,屬多年生攀緣草本,長可達10米。根狀莖肥厚,圓柱狀,外皮黃色。莖多分枝,無毛;葉互生,近圓形或心形,雌雄異株;雄花數朵總狀花序,少有單生,花冠裂片倒卵形,雌花單生,子房卵形,果實近球形,熟時橙紅色,花果期7-11月。瓜蔞分布于中國遼寧、華北、華東、中南、陜西、甘肅、四川、貴州和云南。生于海拔200-1800米的山坡林下、灌叢中、草地和村旁田邊。因本種為傳統中藥天花粉和栝樓,故在其自然分布區內、外,廣為栽培,分布于朝鮮、日本、越南和老撾。瓜蔞有解熱止渴、利尿、鎮咳祛痰等作用。種子含脂花肪油;果實含三萜皂苷、有機酸、樹脂、糖類、色素;根含蛋白質、皂苷、酸類。

瓜蔞的繁殖方法有兩種,其中,分根繁殖:3月中下旬挖取3-5年生斷面白色新鮮的健壯雌株的老根,分成7-10cm的小段,穴栽,澆足水,約10余天出苗,每年結合中耕施追肥2-3次。種子繁殖:9-10月采收果實,待果皮稍軟,取出種子以草木灰拌種擦去果肉,干藏過冬;亦可帶果梗懸掛于通風處。冷床育苗在早春進行,將種子尖頭插入土中,常噴水保持苗床濕潤、待種子萌動時,開始通氣,床溫控制在22℃左右,約10日后出土,見真葉伸出即可上盆或分栽培育。直播在4月進行,選擇土壤肥沃,排水良好之地,開穴施足基肥,穴距30x40厘米。覆土后點播種子,再蓋厚2厘米泥,約半個月出土,當有真葉2片時每穴留苗1株,待蔓長至50厘米時插引桿。但是瓜蔞野生資源有限且遭嚴重破壞,盡管各地有少量引種栽培,但是其產量缺遠不能滿足市場要求。

發明內容

本發明的目的是提供一種瓜蔞的組織培養方法,該瓜蔞的組織培養方法具有優異的成活率以及繁殖率。

為了實現上述目的,本發明提供了一種瓜蔞的組織培養方法,包括:

1)將瓜蔞莖切段作為外植體進行熱處理脫菌,接著置于酒精溶液中進行二次滅菌,然后置于初代培養基中進行誘導培養、于增殖培養基中進行增殖培養得到分化幼苗;

2)將分化幼苗于生根培養基中進行生根培養、接著置于5℃以下進行低溫處理以得到組織培養苗;

3)將組織培養苗煉苗;

其中,步驟1)-2)的培養條件均至少符合以下條件:無菌且透氣;初代培養基為含有萘乙酸NAA、6-芐基腺嘌呤6-BA和肌醇的MS培養基;增殖培養基為含有玉米素ZT、卡那霉素、2,4-D和番茄汁的MS培養基;生根培養基含有多效唑、吲哚丁酸IBA和香蕉泥的1/2MS培養基。

在上述技術方案中,本發明以瓜蔞莖切段作為外植體,然后依次經過誘導培養、增殖培養、生根培養、煉苗以得到成熟的瓜蔞苗,在各個培養工序中采用特定的培養基進而使得得到的瓜蔞苗具有優異的成活率和高產率,在此基礎上能夠大面積的進行培育瓜蔞,從而為瓜蔞的組織培養的推廣奠定了堅實的基礎。

本發明的其他特征和優點將在隨后的具體實施方式部分予以詳細說明。

具體實施方式

以下對本發明的具體實施方式進行詳細說明。應當理解的是,此處所描述的具體實施方式僅用于說明和解釋本發明,并不用于限制本發明。

本發明提供了一種瓜蔞的組織培養方法,包括:

1)將瓜蔞莖切段作為外植體進行熱處理脫菌,接著置于酒精溶液中進行二次滅菌,然后置于初代培養基中進行誘導培養、于增殖培養基中進行增殖培養得到分化幼苗;

2)將分化幼苗于生根培養基中進行生根培養、接著置于5℃以下進行低溫處理以得到組織培養苗;

3)將組織培養苗煉苗;

其中,步驟1)-2)的培養條件均至少符合以下條件:無菌且透氣;初代培養基為含有萘乙酸NAA、6-芐基腺嘌呤6-BA和肌醇的MS培養基;增殖培養基為含有玉米素ZT、卡那霉素、2,4-D和番茄汁的MS培養基;生根培養基含有多效唑、吲哚丁酸IBA和香蕉泥的1/2MS培養基。

在上述組織培養方法中,各個培養基中的組分濃度可以在寬的范圍內選擇,但是為了進一步提高瓜蔞的的成活率和繁殖效率,優選地,在初代培養基中,NAA的濃度為0.8-1.3mg/L,6-BA的濃度為0.2-0.4mg/L,肌醇的濃度為0.8-1.3mg/L;在增殖培養基中,ZT的濃度為0.2-0.4mg/L,卡那霉素的濃度為0.8-1.3mg/L,2,4-D的濃度為0.4-0.6mg/L,番茄汁的濃度為2-5mg/L;在生根培養基中,多效唑的濃度為0.05-0.1mg/L,IBA的濃度為0.3-0.6mg/L,香蕉泥的濃度為3-4.5g/L。

在本發明的各種培養基中,為了更好地為各個組織提供優異的養分以及適宜的培養條件,優選地,初代培養基、增殖培養基以及生根培養基均含有3-6g/L的瓊脂和14-18g/L的蔗糖,且pH值為6.0-7.0。

在本發明中,熱處理脫菌的條件可以在寬的范圍內選擇,但是為了進一步提高滅菌效果,優選地,熱處理脫菌滿足以下條件:脫菌溫度為42-48℃,脫菌時間為3-6min。

在本發明中,二次滅菌的條件以及酒精溶液中各組分的濃度也可以在寬的范圍內選擇,但是為了進一步提高滅菌效果,優選地,二次滅菌滿足以下條件:滅菌時間為15-25min,滅菌溫度為15-35℃;酒精溶液中乙醇的濃度為60-70體積%。

在本發明中,外植體的大小可以在寬的范圍內選擇,但是為了進一步提高瓜蔞的成活率和繁殖效率,優選地,外植體的長度為0.25-0.35cm。

在本發明中,誘導培養的條件可以在寬的范圍內選擇,但是為了進一步提高瓜蔞的成活率和繁殖效率,優選地,誘導培養滿足以下條件:先暗培養1-2天,接著轉入光暗交替的條件下培養4-6天;其中,光暗交替條件為:光照時間為12-14h/天,光照強度為1400-1600lux,培養溫度為25-30℃,相對濕度為50-60%。

在本發明中,增殖培養的條件可以在寬的范圍內選擇,但是為了進一步提高瓜蔞的成活率和繁殖效率,優選地,增殖培養于光暗交替條件下培養8-10天,光暗交替條件為:光照時間為12-14h/天,光照強度為1700-1900lux,培養溫度為20-25℃,相對濕度為50-60%。

在本發明中,生根培養的條件可以在寬的范圍內選擇,但是為了進一步提高瓜蔞的成活率和繁殖效率,優選地,生根培養于光暗交替條件下培養10-15天,光暗交替條件為:光照時間為12-14h/天,光照強度為2000-2200lux,培養溫度為20-25℃,相對濕度為50-60%。

在本發明中,低溫處理的時間可以在寬的范圍內選擇,但是為了進一步提高瓜蔞的成活率和繁殖效率;優選地,所述低溫處理的時間為8-12h

在本發明中,無菌且透氣條件的獲取可以在寬的范圍內選擇,但是為了進一步提高瓜蔞的成活率和繁殖效率,優選地,步驟1)-2)中的無菌且透氣條件通過以下操作獲得:培養環境為帶防菌透氣膜的組培瓶;其中,透氣膜的具體條件也可以在寬的范圍內選擇,但是為了進一步提高多肉植物的成活率和繁殖效率,更優選地,透氣膜至少滿足以下條件:孔隙為0.2-0.3um,開孔率80-90﹪。

在本發明中,煉苗的條件可以在寬的范圍內選擇,但是為了進一步提高瓜蔞的成活率和繁殖效率,優選地,煉苗的條件為:光照時間為12-14h/天,黑暗時間為10-12h/天,光照強度為1800-2000lux,溫度為21-23℃,相對濕度為75-85%,時間為5-7天。

以下將通過實施例對本發明進行詳細描述。在以下實施例中,MS培養基以及1/2MS培養基的基本組分參見表1和2;其中,表1中為MS培養基以及1/2MS培養基中不同濃度組分的統計表,表2中為MS培養基以及1/2MS培養基中相同濃度組分的統計表。

表1

表2

實施例1

1)將長度為0.3cm的瓜蔞莖切段作為外植體進行熱處理脫菌(脫菌溫度為46℃,脫菌時間為5min),接著置于酒精溶液(乙醇的濃度為60-70體積%)中進行二次滅菌(滅菌時間為20min,滅菌溫度為20℃),然后置于初代培養基中進行誘導培養(先暗培養1.5天,接著轉入光暗交替的條件下培養5天;其中,光暗交替條件為:光照時間為13h/天,光照強度為1500lux,培養溫度為28℃,相對濕度為55%)、于增殖培養基中進行增殖培養(于光暗交替條件下培養9天,光暗交替條件為:光照時間為13h/天,光照強度為1800lux,培養溫度為22℃,相對濕度為55%)得到分化幼苗;

2)將分化幼苗于生根培養基中進行生根培養(于光暗交替條件下培養13天,光暗交替條件為:光照時間為13h/天,光照強度為2100lux,培養溫度為23℃,相對濕度為55%)、接著置于5℃以下進行低溫處理10h以得到組織培養苗;

3)將組織培養苗煉苗得到瓜蔞幼苗(光照時間為13h/天,黑暗時間為11h/天,光照強度為1900lux,溫度為22℃,相對濕度為79%,時間為6天);

其中,步驟1)-2)的培養條件均至少符合以下條件:無菌且透氣,于帶防菌透氣膜的組培瓶中進行,透氣膜滿足以下條件:孔隙為0.25um,開孔率85﹪;初代培養基為含有1mg/L NAA、0.3mg/L 6-BA、1mg/L肌醇的MS培養基;增殖培養基為含有0.3mg/L ZT、1mg/L卡那霉素、0.5mg/L 2,4-D的濃度為、3mg/L番茄汁的MS培養基;在生根培養基中,0.08mg/L多效唑、0.5mg/L IBA的濃度、3.5g/L香蕉泥的1/2MS培養基;初代培養基、增殖培養基以及生根培養基均含有5g/L的瓊脂和15g/L的蔗糖,且pH值為6.5。

實施例2

1)將長度為0.25cm的瓜蔞莖切段作為外植體進行熱處理脫菌(脫菌溫度為42℃,脫菌時間為6min),接著置于酒精溶液(乙醇的濃度為60體積%)中進行二次滅菌(滅菌時間為15min,滅菌溫度為35℃),然后置于初代培養基中進行誘導培養(先暗培養1天,接著轉入光暗交替的條件下培養4天;其中,光暗交替條件為:光照時間為12h/天,光照強度為1400lux,培養溫度為25℃,相對濕度為50%)、于增殖培養基中進行增殖培養(于光暗交替條件下培養8天,光暗交替條件為:光照時間為12h/天,光照強度為1700lux,培養溫度為20℃,相對濕度為50%)得到分化幼苗;

2)將分化幼苗于生根培養基中進行生根培養(于光暗交替條件下培養10天,光暗交替條件為:光照時間為12h/天,光照強度為2000lux,培養溫度為20℃,相對濕度為50%)、接著置于5℃以下進行低溫處理8h以得到組織培養苗;

3)將組織培養苗煉苗得到瓜蔞幼苗(光照時間為12h/天,黑暗時間為10h/天,光照強度為1800lux,溫度為21℃,相對濕度為75%,時間為5天);

其中,步驟1)-2)的培養條件均至少符合以下條件:無菌且透氣,于帶防菌透氣膜的組培瓶中進行,透氣膜滿足以下條件:孔隙為0.25um,開孔率85﹪;初代培養基為含有0.8mg/L NAA、0.2mg/L 6-BA、0.8mg/L肌醇的MS培養基;增殖培養基為含有0.2mg/L ZT、0.8mg/L卡那霉素、0.4mg/L 2,4-D的濃度為、2mg/L番茄汁的MS培養基;在生根培養基中,0.05mg/L多效唑、0.3mg/L IBA的濃度、3g/L香蕉泥的1/2MS培養基;初代培養基、增殖培養基以及生根培養基均含有3g/L的瓊脂和14g/L的蔗糖,且pH值為6.0。

實施例3

1)將長度為0.35cm的瓜蔞莖切段作為外植體進行熱處理脫菌(脫菌溫度為48℃,脫菌時間為3min),接著置于酒精溶液(乙醇的濃度為70體積%)中進行二次滅菌(滅菌時間為25min,滅菌溫度為35℃),然后置于初代培養基中進行誘導培養(先暗培養2天,接著轉入光暗交替的條件下培養6天;其中,光暗交替條件為:光照時間為14h/天,光照強度為1600lux,培養溫度為30℃,相對濕度為60%)、于增殖培養基中進行增殖培養(于光暗交替條件下培養10天,光暗交替條件為:光照時間為14h/天,光照強度為1900lux,培養溫度為25℃,相對濕度為60%)得到分化幼苗;

2)將分化幼苗于生根培養基中進行生根培養(于光暗交替條件下培養15天,光暗交替條件為:光照時間為14h/天,光照強度為2200lux,培養溫度為25℃,相對濕度為60%)、接著置于5℃以下進行低溫處理12h以得到組織培養苗;

3)將組織培養苗煉苗得到瓜蔞幼苗(光照時間為14h/天,黑暗時間為12h/天,光照強度為2000lux,溫度為23℃,相對濕度為85%,時間為7天);

其中,步驟1)-2)的培養條件均至少符合以下條件:無菌且透氣,于帶防菌透氣膜的組培瓶中進行,透氣膜滿足以下條件:孔隙為0.25um,開孔率85﹪;初代培養基為含有1.3mg/L NAA、0.4mg/L 6-BA、1.3mg/L肌醇的MS培養基;增殖培養基為含有0.4mg/L ZT、1.3mg/L卡那霉素、0.6mg/L 2,4-D的濃度為、5mg/L番茄汁的MS培養基;在生根培養基中,0.1mg/L多效唑、0.3-0.6mg/L IBA的濃度、4.5g/L香蕉泥的1/2MS培養基;初代培養基、增殖培養基以及生根培養基均含有6g/L的瓊脂和18g/L的蔗糖,且pH值為7.0。

應用例1

取上述各實施例中100株的煉苗后的幼苗于基質中進行培養直至50%以上的植株生長出5個葉片,然后統計幼苗的成活率(W),同時計算10個4cm的瓜蔞莖切段在一個組織培養周期后能夠獲取的成活瓜蔞的數量(N),具體結果如表3所示。

表3

W/% N/棵 實施例1 88 69 實施例2 79 59 實施例3 86 62

以上詳細描述了本發明的優選實施方式,但是,本發明并不限于上述實施方式中的具體細節,在本發明的技術構思范圍內,可以對本發明的技術方案進行多種簡單變型,這些簡單變型均屬于本發明的?;し段?。

另外需要說明的是,在上述具體實施方式中所描述的各個具體技術特征,在不矛盾的情況下,可以通過任何合適的方式進行組合,為了避免不必要的重復,本發明對各種可能的組合方式不再另行說明。

此外,本發明的各種不同的實施方式之間也可以進行任意組合,只要其不違背本發明的思想,其同樣應當視為本發明所公開的內容。

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瓜蔞 組織培養 方法
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