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巴塞罗那vs维戈塞尔塔: 一種干細胞濾液蛋白活性的保存方法及凍存?;ぜ?pdf

摘要
申請專利號:

维戈塞尔塔vs皇家社会 www.vmyqew.com.cn CN201710376012.8

申請日:

20170525

公開號:

CN108935441A

公開日:

20181207

當前法律狀態:

有效性:

審查中

法律詳情:
IPC分類號: A01N1/02,C12N5/0775 主分類號: A01N1/02,C12N5/0775
申請人: 陜西博鴻生物科技集團有限公司
發明人: 諶智鑫,徐佳潔,賀曉靜
地址: 710000 陜西省西安市灞橋區紡織產業園區標準廠房小區B1棟3-4層
優先權: CN201710376012A
專利代理機構: 代理人:
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法律狀態
申請(專利)號:

CN201710376012.8

授權公告號:

法律狀態公告日:

法律狀態類型:

摘要

本發明實施例提供一種干細胞濾液蛋白活性的保存方法及凍存?;ぜ?,涉及生物醫學美容領域,該干細胞濾液蛋白活性的保存方法操作簡單,成本低,同時能夠保證蛋白活性不受影響。該干細胞濾液蛋白活性的保存方法包括:獲取低傳代倍數的細胞培養上清液;對低傳代倍數的細胞培養上清液進行超濃縮,獲得細胞濃縮液;在細胞濃縮液中加入凍存?;ぜ?,其中,凍存?;ぜ廖?%(m/v)的甘露醇和0.5%(m/v)海藻糖。

權利要求書

1.一種干細胞濾液蛋白活性的保存方法,其特征在于,包括:獲取低傳代倍數的細胞培養上清液;對所述低傳代倍數的細胞培養上清液進行超濃縮,獲得細胞濃縮液;在所述細胞濃縮液中加入凍存?;ぜ?,其中,所述凍存?;ぜ廖?%(m/v)的甘露醇和0.5%(m/v)海藻糖。2.根據權利要求1所述的干細胞濾液蛋白活性的保存方法,其特征在于,在所述細胞濃縮液中加入凍存?;ぜ?,具體包括:將所述甘露醇和所述海藻糖用超純水加熱至80℃溶解,并冷卻至室溫,得到所述凍存?;ぜ?,其中,所述甘露醇和所述海藻糖的用量分別為濾液終體積的1%(m/v)和0.5%(m/v);將所述凍存?;ぜ良尤胨魷赴ㄋ躋褐?。3.根據權利要求1或2所述的干細胞濾液蛋白活性的保存方法,其特征在于,所述獲取低傳代倍數的細胞培養上清液,具體包括:分離提取健康的人臍帶間充質干細胞;對所述人臍帶間充質干細胞進行體外培養、擴增,收集低傳代倍數的細胞培養上清液。4.根據權利要求3所述的干細胞濾液蛋白活性的保存方法,其特征在于,所述對所述人臍帶間充質干細胞進行體外培養、擴增,收集低傳代倍數的細胞培養上清液,具體包括:將P1代人臍帶間充質干細胞在50ml培養瓶中培養,當生長到90%匯合度時,消化,廢棄含血清的培養基,并使用不含血清的培養基繼續擴大培養;傳代時,收集不含血清的培養基并與等體積的新鮮的不含血清培養基混合,繼續用于細胞的擴大培養,如此反復至細胞傳代至10代,收集全部細胞培養上清液。5.根據權利要求3或4所述的干細胞濾液蛋白活性的保存方法,其特征在于,所述人臍帶間充質干細胞的傳代倍數在2-10代之間。6.根據權利要求1、2或4中任意一項所述的干細胞濾液蛋白活性的保存方法,其特征在于,所述對所述低傳代倍數的細胞培養上清液進行超濃縮,獲得細胞濃縮液,具體包括:對所述低傳代倍數的細胞培養上清液采用0.22μm濾膜過濾;再通過30KD超濾膜,收集透析液;將所述透析液通過3KD超濾膜,收集得到所述細胞濃縮液。7.一種干細胞濾液蛋白活性的凍存?;ぜ?,其特征在于,所述干細胞濾液蛋白活性的凍存?;ぜ劣τ糜諶縟ɡ?-5中任意一項所述的干細胞濾液蛋白活性的保存方法,所述干細胞濾液蛋白活性的凍存?;ぜ廖?%(m/v)的甘露醇和0.5%(m/v)海藻糖。

說明書

技術領域

本發明涉及生物醫學美容領域,尤其涉及一種干細胞濾液蛋白活性的保存方法及凍存?;ぜ?。

背景技術

現代生物基因工程技術的長足發展對生命科學的方方面面都產生了影響,同時也給美容化妝品行業都帶來了全新的發展機遇,化妝品已經從傳統的化學美容、植物美容向生物美容與基因美容發展。生物美容原料也有了較大的發展契機。

人臍帶間充質干細胞(human Umbilical Cord-Mesenchymal Stromal Cells,hUC-MSCs)是一類具有多向分化能力和自我更新能力的干細胞。它在胚胎時期的第4~12天進入華氏膠組織(Wharton’s jelly)并且活躍至胎兒娩出。因臍帶具有取材容易,不容易被污染,不涉及道德、倫理和法律方面的問題等諸多優點,被廣泛用于hUC-MSCs的提取。同時,人臍帶間充質干細胞培養液(上清液)含有大量的具有多種生物活性的蛋白質、多肽及細胞因子,它們能夠參與細胞結構的維持運動信息交流以及組織修復與再生,具有較好的抗光老化、抗氧化、抗皺、美白肌膚、傷口愈合、細胞修復等功效。

然而,液態的干細胞培養上清液在常溫保存時間短,蛋白活性不高,這就阻礙了它的推廣和應用。中國專利申請201510033971.0公開了人臍帶間充質干細胞培養上清液活性因子及細胞裂解液的制備方法、產品與應用,該制備方法采用磁性無損分選方法進行健康人臍帶間充質干細胞的分選提取,然后進行傳代培養,收集2~10代之間全部細胞培養上清液及細胞裂解液,最后經低溫真空制備得到細胞培養上清液及細胞裂解液的凍干粉,該發明以凍干粉形式有效地保存了人間充質干細胞培養上清中的各種具有生物活性的細胞因子混合物,為人間充質干細胞培養上清的產業化應用奠定了基礎。但是作為一款具有生物活性的原料以凍干粉的方式保存,對所需設備有一定的要求,原料制備需要一定時間,同時使用也不大方便。

發明內容

本發明實施例提供了一種干細胞濾液蛋白活性的保存方法及凍存?;ぜ?,干細胞濾液蛋白活性的保存方法操作簡單,成本低,同時能夠保證蛋白活性不受影響。

為達到上述目的,本發明實施例采用如下技術方案:

第一方面,本發明實施例提供一種干細胞濾液蛋白活性的保存方法,包括:

獲取低傳代倍數的細胞培養上清液;

對低傳代倍數的細胞培養上清液進行超濃縮,獲得細胞濃縮液;

在細胞濃縮液中加入凍存?;ぜ?,其中,凍存?;ぜ廖?%(m/v)的甘露醇和0.5%(m/v)海藻糖。

進一步地,在細胞濃縮液中加入凍存?;ぜ?,具體包括:

將甘露醇和海藻糖用超純水加熱至80℃溶解,并冷卻至室溫,得到凍存?;ぜ?,其中,甘露醇和海藻糖的用量分別為濾液終體積的1%(m/v)和0.5%(m/v);

將凍存?;ぜ良尤胂赴ㄋ躋褐?。

進一步地,獲取低傳代倍數的細胞培養上清液,具體包括:

分離提取健康的人臍帶間充質干細胞;

對人臍帶間充質干細胞進行體外培養、擴增,收集低傳代倍數的細胞培養上清液。

進一步地,對人臍帶間充質干細胞進行體外培養、擴增,收集低傳代倍數的細胞培養上清液,具體包括:

將P1代人臍帶間充質干細胞在50ml培養瓶中培養,當生長到90%匯合度時,消化,廢棄含血清的培養基,并使用不含血清的培養基繼續擴大培養;傳代時,收集不含血清的培養基并與等體積的新鮮的不含血清培養基混合,繼續用于細胞的擴大培養,如此反復至細胞傳代至10代,收集全部細胞培養上清液。

進一步地,人臍帶間充質干細胞的傳代倍數在2-10代之間。

進一步地,對低傳代倍數的細胞培養上清液進行超濃縮,獲得細胞濃縮液,具體包括:

對低傳代倍數的細胞培養上清液采用0.22μm濾膜過濾;再通過30KD超濾膜,收集透析液;將透析液通過3KD超濾膜,收集得到細胞濃縮液。

第二方面,本發明實施例提供一種干細胞濾液蛋白活性的凍存?;ぜ?,干細胞濾液蛋白活性的凍存?;ぜ劣τ糜諶緄諞環矯嬤腥我庖幌畹母上赴艘旱鞍諄钚緣謀4娣椒?,干細胞濾液蛋白活性的凍存?;ぜ廖?%(m/v)的甘露醇和0.5%(m/v)海藻糖。

根據上述方法進行制備得到的一種人臍帶間充質干細胞濾液,可以在具有生物學活性功能的產品中應用。檢測濾液中的蛋白活性,主要通過檢測抗氧化活性實現。按照實驗方案,成纖維細胞給予樣品,孵育24h后,檢測相關抗氧化基因的變化,從而確保濾液的抗氧化能力,進而反應其蛋白活性。

與現有技術相比,本發明的有益效果是:將細胞濃縮液添加1%(m/v)甘露醇與0.5%(m/v)的海藻糖配伍作為凍存?;ぜ?,細胞濃縮液可以作為一種原料使用,直接放于-20℃長期保存,保存方法簡單且蛋白活性不受影響,設備要求不高,細胞濃縮液即使是以試劑的形態保存,保存時間也可以長達12個月。具體使用時,37℃水浴快速回溫溶解即用。

附圖說明

圖1為本發明實施例提供的一種干細胞濾液蛋白活性的保存方法的流程示意圖;

圖2為本發明實施例提供的一種各基因的具體變化趨勢示意圖。

具體實施方式

下面將結合本發明實施例中的附圖,對本發明實施例中的技術方案進行詳細地描述。

實施例1

本發明實施例提供一種干細胞濾液蛋白活性的保存方法,如圖1所示,該干細胞濾液蛋白活性的保存方法具體包括:

S101、獲取低傳代倍數的細胞培養上清液。

具體的,步驟S101可以包括:步驟a和步驟b:

步驟a、分離提取健康的人臍帶間充質干細胞。

步驟b、對人臍帶間充質干細胞進行體外培養、擴增,收集低傳代倍數的細胞培養上清液。

具體的,步驟b可以按照下述步驟實現:將P1代人臍帶間充質干細胞在50ml培養瓶中培養,當生長到90%匯合度時,消化,廢棄含血清的培養基,并使用不含血清的培養基繼續擴大培養;傳代時,收集不含血清的培養基并與等體積的新鮮的不含血清培養基混合,繼續用于細胞的擴大培養,如此反復至細胞傳代至10代,收集全部細胞培養上清液。

S102、對低傳代倍數的細胞培養上清液進行超濃縮,獲得細胞濃縮液。

具體的,步驟S102可以按照下述步驟實現:對低傳代倍數的細胞培養上清液采用0.22μm濾膜過濾;再通過30KD超濾膜,收集透析液;將透析液通過3KD超濾膜,收集得到細胞濃縮液。

S103、在細胞濃縮液中加入凍存?;ぜ?,其中,凍存?;ぜ廖?%(m/v)的甘露醇和0.5%(m/v)海藻糖。

還需要說明的是,人臍帶間充質干細胞的傳代倍數在2-10代之間。

示例性的,本發明實施例提供一種干細胞濾液蛋白活性的保存方法可以包括:

(1)UCMSCs的分離與培養

取新生兒臍帶(長度不少于15cm)數根,置臍帶保存液,4℃儲存(時間不超過8小時)。超凈臺內取出臍帶,75%乙醇消毒臍帶表面2-3 min,剪開兩端結扎絲線,生理鹽水充分洗滌殘留的血液,將臍帶剪成2cm小段,再次漂洗,剖開臍帶,剔除臍靜脈、臍動脈,剝離華通氏膠。將華通氏膠剪成1mmx1mmx1mm大小,接種于含10%FBS的α-MEM培養皿內,放入37℃、5%CO2培養箱中培養,整個過程嚴格無菌操作。倒置顯微鏡每天觀察細胞生長情況。

結果顯示:1~2d見組織塊部分貼壁,6d左右組織塊周圍有細胞爬出,10d左右細胞已有成片聚集。細胞多為雙突起的長梭形、短棒狀或扁平形的成纖維樣細胞,核仁明顯。待細胞融合達80-90%,此時消化、傳代,去除組織塊,用不含血清的α-MEM培養基。傳代后細胞生長能力明顯增強,至P2代以后,隔天細胞即需傳代。

(2)培養上清液的收集:

P0代人間充質干細胞在10cm培養皿中培養(含有10%FBS的α-MEM),當生長到80-90%匯合度時,廢棄培養基,用不含血清的α-MEM培養基傳代培養,P1代以后收集培養上清液,并與等體積的新鮮培養基混合,繼續用于細胞的擴大培養,如此反復至細胞傳代至10代,收集全部細胞培養上清液,用于后續干細胞濾液的制備;

(3)干細胞濾液的制備:

對收集的無血清上清液先采用0.22μm濾膜過濾,去除混在上清液中的細胞碎片;再采用分級無菌超濾分離機進行截留。

培養上清液通過濾膜的順序為,先通過30KD有機濾膜,收集低于30KD的干細胞濾液;然后將濾液用泵再次打入3KD有機濾膜,收集到1L-2L濾液,根據需要,通過反復過濾可以將濾液體積濃縮為原培養上清液體積的1/10-1/50,即制備得到人臍帶間充質干細胞濾液。

將藥用級甘露醇和海藻糖用超純水加熱至80℃溶解,用量分別為濾液終體積的1%(m/v)和0.5%(m/v),冷卻至室溫(25℃),加入干細胞濾液中,混合均勻,置于-20℃長期保存。

使用時,37℃水浴快速溶解即用。

將干細胞濾液、干細胞濾液+0.5%海藻糖、干細胞濾液+1%甘露醇+0.5%海藻糖于-20℃凍存。1個月后,37℃水浴快速溶解,檢測干細胞濾液的抗氧化活性(蛋白活性)。qRT- PCR檢測具體實驗步驟:

a)將成纖維細胞接種于6孔板中,待鋪板率達到60%時,即可進行給藥試驗;

b)實驗組采用既定的藥物濃度(如表1)刺激,對照組(陰性組)采用空白培養液進行孵育。在孵育后24h收集細胞;

c)按照Trizol試劑說明書(Invitrogen)進行RNA提??;

d)按照反轉錄試劑盒操作說明書(TaKaRa)進行RNA反轉錄、并在此基礎上,對擬選用的4種基因(Cu/Zn-SOD、Mn-SOD、CAT、GSH-Px)進行qRT-PCR檢測;

e)所得數據采用2-ΔΔCt計算方法進行統計分析。

表1 實驗分組及給藥方法

實驗結果如下:

與對照組和陽性對照組相比,抗氧化基因的擴增倍數如表2所示(示意數據),各基因的具體變化趨勢如圖2所示。

表2. 藥物刺激24h后基因擴增倍數

其中,Cu-SOD為銅超氧化物歧化酶;Mn-SOD為錳超氧化物歧化酶;CAT為過氧化氫酶;GSH-Px為谷胱甘肽過氧化物酶。

與對照組相比,2號液、3號液不同程度的上調SOD家族基因,Cu-SOD、Mn-SOD、CAT、GSH-Px分別上調1.43、1.84倍;1.85、2.02倍;1.24、1.34倍;1.63、1.52倍,且均有顯著性差異,有統計學意義。

因此,與不做任何處理直接保存相比,添加1%甘露醇和0.5%海藻糖蛋白活性更好。

將該人臍帶間充質干細胞濾液與其他輔料或者試劑、保健物質等結合,得到具有生物學活性功能的產品。

實施例2

本發明實施例還提供一種,干細胞濾液蛋白活性的凍存?;ぜ?,干細胞濾液蛋白活性的凍存?;ぜ劣τ糜諶縭凳├腥我馓卣韉母上赴艘旱鞍諄钚緣謀4娣椒?,干細胞濾液蛋白活性的凍存?;ぜ廖?%(m/v)的甘露醇和0.5%(m/v)海藻糖。

本發明實施例提供一種干細胞濾液蛋白活性的保存方法及凍存?;ぜ?,該干細胞濾液蛋白活性的保存方法包括:獲取低傳代倍數的細胞培養上清液;對低傳代倍數的細胞培養上清液進行超濃縮,獲得細胞濃縮液;在細胞濃縮液中加入凍存?;ぜ?,其中,凍存?;ぜ廖?%(m/v)的甘露醇和0.5%(m/v)海藻糖。根據上述方法進行制備得到的一種人臍帶間充質干細胞濾液,可以在具有生物學活性功能的產品中應用。檢測濾液中的蛋白活性,主要通過檢測抗氧化活性實現。按照實驗方案,成纖維細胞給予樣品,孵育24h后,檢測相關抗氧化基因的變化,從而確保濾液的抗氧化能力,進而反應其蛋白活性。與現有技術相比,本發明的有益效果是:將細胞濃縮液添加1%(m/v)甘露醇與0.5%(m/v)的海藻糖配伍作為凍存?;ぜ?,細胞濃縮液可以作為一種原料使用,直接放于-20℃長期保存,保存方法簡單且蛋白活性不受影響,設備要求不高,細胞濃縮液即使是以試劑的形態保存,保存時間也可以長達12個月。具體使用時,37℃水浴快速回溫溶解即用。

上面對本專利的較佳實施方式作了詳細說明,但是本專利并不限于上述實施方式,在本領域的普通技術人員所具備的知識范圍內,還可以在不脫離本專利宗旨的前提下作出各種變化。

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一種 干細胞 濾液 蛋白 活性 保存 方法 ?;?
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