• / 55
  • 下載費用:30 金幣  

维戈塞尔塔与皇家贝蒂斯预测: 具有降低的免疫原性的改進的假單胞菌外毒素A.pdf

摘要
申請專利號:

维戈塞尔塔vs皇家社会 www.vmyqew.com.cn CN201080049559.3

申請日:

20100910

公開號:

CN102655882B

公開日:

20141119

當前法律狀態:

有效性:

失效

法律詳情:
IPC分類號: A61K47/48,C07K14/21 主分類號: A61K47/48,C07K14/21
申請人: 美國政府健康及人類服務部
發明人: 艾拉·H·帕斯坦,理查德·比爾斯,恩田正德
地址: 美國馬里蘭州
優先權: 61/241,620
專利代理機構: 北京英賽嘉華知識產權代理有限責任公司 代理人: 王達佐;洪欣
PDF完整版下載: PDF下載
法律狀態
申請(專利)號:

CN201080049559.3

授權公告號:

法律狀態公告日:

法律狀態類型:

摘要

本發明提供具有高的細胞毒性和降低的免疫原性的改進的假單胞菌外毒素A(PE)分子、含有所述改進的假單胞菌外毒素A的組合物以及使用方法。

權利要求書

1.分離的假單胞菌(pseudomonas)外毒素A(“PE”),包含PE氨基酸序列,在所述PE氨基酸序列中去除了SEQ?ID?NO:1所限定的氨基酸殘基1-273和285-394,并且SEQ?ID?NO:1所限定的氨基酸殘基D406、R432、R467、R490、R513、E548、K590和Q592被獨立地取代為丙氨酸、甘氨酸或絲氨酸。2.如權利要求1所述的假單胞菌外毒素A,其中SEQ?ID?NO:1所限定的氨基酸殘基D403、R412、R427、E431、R458、D461、R505、E522、R538、R551、R576和L597中的一個或多個還被獨立地取代為丙氨酸、甘氨酸或絲氨酸。3.如權利要求1所述的假單胞菌外毒素A,其中所述假單胞菌外毒素A包含SEQ?ID?NO:2。4.如權利要求1或3所述的假單胞菌外毒素A,其中所述假單胞菌外毒素A包含SEQ?ID?NO:3。5.嵌合分子,包含與(b)假單胞菌外毒素A(“PE”)偶聯或融合的(a)靶向部分,所述假單胞菌外毒素A包含PE氨基酸序列,在所述PE氨基酸序列中去除了SEQ?ID?NO:1所限定的氨基酸殘基1-273和285-394,并且SEQ?ID?NO:1所限定的氨基酸殘基D406、R432、R467、R490、R513、E548、K590和Q592被獨立地取代為丙氨酸、甘氨酸或絲氨酸。6.如權利要求5所述的嵌合分子,其中SEQ?ID?NO:1所限定的氨基酸殘基D403、R412、R427、E431、R458、D461、R505、E522、R538、R551、R576和L597中的一個或多個還被獨立地取代為丙氨酸、甘氨酸或絲氨酸。7.如權利要求5所述的嵌合分子,其中所述假單胞菌外毒素A包含SEQ?ID?NO:2。8.如權利要求5所述的嵌合分子,其中所述假單胞菌外毒素A包含SEQ?ID?NO:3。9.如權利要求5至8中任一項所述的嵌合分子,其中所述靶向部分是HA22的Fv部分。10.如權利要求5至8中任一項所述的嵌合分子,其中所述靶向部分是抗體。11.如權利要求10所述的嵌合分子,其中所述抗體選自scFv、dsFv、Fab、單結構域抗體和F(ab’)。12.如權利要求10所述的嵌合分子,其中所述抗體能特異性結合選自以下的細胞表面抗原:CD19、CD21、CD22、CD25、CD30、CD33、CD79b、轉鐵蛋白受體、EGF受體、間皮蛋白、鈣粘蛋白和Lewis?Y。13.如權利要求10所述的嵌合分子,其中所述抗體選自B3、RFB4、SS1、MN、HN1、HN2和HB21。14.如權利要求10所述的嵌合分子,其中所述抗體包含含有3個互補決定區(CDR)的可變輕鏈(VL)和含有3個CDR的可變重鏈(VH),其中(i)所述VL?CDR1包含QDIXXY(SEQ?ID?NOS:4-8),其中XX選自SN、HG、GR、RG和AR;(ii)所述VL?CDR2包含YTS;(iii)所述VL?CDR3包含QQGNTLPWT(SEQ?ID?NO:9);(iv)所述VH?CDR1包含GFAFSIYD(SEQ?ID?NO:10);(v)所述VH?CDR2包含ISSGGGTT(SEQ?ID?NO:11);(vi)所述VH?CDR3包含ARHSGYGXXXGVLFAY(SEQ?ID?NOS:12-16),其中XXX選自SSY、THW、YNW、TTW和STY。15.如權利要求10所述的嵌合分子,其中所述抗體包含含有3個互補決定區(CDR)的可變輕鏈(VL)和含有3個CDR的可變重鏈(VH),其中(i)所述VL?CDR1包含QDIHGY(SEQ?ID?NO:5);(ii)所述VL?CDR2包含YTS;(iii)所述VL?CDR3包含QQGNTLPWT(SEQ?ID?NO:9);(iv)所述VH?CDR1包含GFAFSIYD(SEQ?ID?NO:10);(v)所述VH?CDR2包含ISSGGGTT(SEQ?ID?NO:11);(vi)所述VH?CDR3包含ARHSGYGTHWGVLFAY(SEQ?ID?NO:13)。16.如權利要求5至8中任一項所述的嵌合分子,其中所述靶向部分是細胞因子。17.如權利要求5至8中任一項所述的嵌合分子,其中所述靶向部分是淋巴因子或生長因子。18.組合物,包含(a)嵌合分子,所述嵌合分子包含與(b)假單胞菌外毒素A(“PE”)偶聯或融合的(a)靶向部分,所述假單胞菌外毒素A包含PE氨基酸序列,在所述PE氨基酸序列中去除了SEQ?ID?NO:1所限定的氨基酸殘基1-273和285-394,并且SEQ?ID?NO:1所限定的氨基酸殘基D406、R432、R467、R490、R513、E548、K590和Q592被獨立地取代為丙氨酸、甘氨酸或絲氨酸;以及(b)藥學可接受的載體。19.如權利要求18所述的組合物,其中SEQ?ID?NO:1所限定的氨基酸殘基D403、R412、R427、E431、R458、D461、R505、E522、R538、R551、R576和L597中的一個或多個還被獨立地取代為丙氨酸、甘氨酸或絲氨酸。20.如權利要求18所述的組合物,其中所述假單胞菌外毒素A包含SEQ?ID?NO:2。21.如權利要求18所述的組合物,其中所述假單胞菌外毒素A包含SEQ?ID?NO:3。22.如權利要求18至21中任一項所述的組合物,其中所述靶向部分是HA22的Fv部分。23.如權利要求18至21中任一項所述的組合物,其中所述靶向部分是抗體。24.如權利要求23所述的組合物,其中所述抗體選自scFv、dsFv、Fab、單結構域抗體和F(ab’)。25.如權利要求23所述的組合物,其中所述抗體能特異性結合選自以下的細胞表面抗原:CD19、CD21、CD22、CD25、CD30、CD33、CD79b、轉鐵蛋白受體、EGF受體、間皮蛋白、鈣粘蛋白和Lewis?Y。26.如權利要求23所述的組合物,其中所述抗體選自B3、RFB4、SS1、HN1、HN2、MN和HB21。27.如權利要求23所述的組合物,其中所述抗體包含含有3個互補決定區(CDR)的可變輕鏈(VL)和含有3個CDR的可變重鏈(VH),其中(i)所述VL?CDR1包含QDIXXY(SEQ?ID?NOS:4-8),其中XX選自SN、HG、GR、RG和AR;(ii)所述VL?CDR2包含YTS;(iii)所述VL?CDR3包含QQGNTLPWT(SEQ?ID?NO:9);(iv)所述VH?CDR1包含GFAFSIYD(SEQ?ID?NO:10);(v)所述VH?CDR2包含ISSGGGTT(SEQ?ID?NO:11);(vi)所述VH?CDR3包含ARHSGYGXXXGVLFAY(SEQ?ID?NOS:12-16),其中XXX選自SSY、THW、YNW、TTW和STY。28.如權利要求23所述的組合物,其中所述抗體包含含有3個互補決定區(CDR)的可變輕鏈(VL)和含有3個CDR的可變重鏈(VH),其中(i)所述VL?CDR1包含QDIHGY(SEQ?ID?NO:5);(ii)所述VL?CDR2包含YTS;(iii)所述VL?CDR3包含QQGNTLPWT(SEQ?ID?NO:9);(iv)所述VH?CDR1包含GFAFSIYD(SEQ?ID?NO:10);(v)所述VH?CDR2包含ISSGGGTT(SEQ?ID?NO:11);(vi)所述VH?CDR3包含ARHSGYGTHWGVLFAY(SEQ?ID?NO:13)。29.如權利要求18至21中任一項所述的組合物,其中所述靶向部分是細胞因子。30.如權利要求18至21中任一項所述的組合物,其中所述靶向部分是淋巴因子或生長因子。31.分離的核酸,其編碼修飾的假單胞菌外毒素A(“PE”),所述假單胞菌外毒素A包含PE氨基酸序列,在所述PE氨基酸序列中去除了SEQID?NO:1所限定的氨基酸殘基1-273和285-394,并且SEQ?ID?NO:1所限定的氨基酸殘基D406、R432、R467、R490、R513、E548、K590和Q592被獨立地取代為丙氨酸、甘氨酸或絲氨酸。32.如權利要求31所述的分離的核酸,其中SEQ?ID?NO:1所限定的氨基酸殘基D403、R412、R427、E431、R458、D461、R505、E522、R538、R551、R576和L597中的一個或多個還被獨立地取代為丙氨酸、甘氨酸或絲氨酸。33.如權利要求31所述的分離的核酸,其中所述假單胞菌外毒素A包含SEQ?ID?NO:2。34.如權利要求31所述的分離的核酸,其中所述假單胞菌外毒素A包含SEQ?ID?NO:3。35.如權利要求31至34中任一項所述的分離的核酸,其中所述核酸還編碼靶向部分。36.如權利要求35所述的分離的核酸,其中所述靶向部分是HA22的Fv部分。37.如權利要求35所述的分離的核酸,其中所述靶向部分是抗體。38.如權利要求37所述的分離的核酸,其中所述抗體選自scFv、dsFv、Fab、單結構域抗體和F(ab’)。39.如權利要求37所述的分離的核酸,其中所述抗體能特異性結合選自以下的細胞表面抗原:CD19、CD21、CD22、CD25、CD30、CD33、CD79b、轉鐵蛋白受體、EGF受體、間皮蛋白、鈣粘蛋白和Lewis?Y。40.如權利要求37所述的分離的核酸,其中所述抗體選自B3、RFB4、SS1、HN1、HN2、MN和HB21。41.如權利要求37所述的分離的核酸,其中所述抗體包含含有3個互補決定區(CDR)的可變輕鏈(VL)和含有3個CDR的可變重鏈(VH),其中(i)所述VL?CDR1包含QDIXXY(SEQ?ID?NOS:4-8),其中XX選自SN、HG、GR、RG和AR;(ii)所述VL?CDR2包含YTS;(iii)所述VL?CDR3包含QQGNTLPWT(SEQ?ID?NO:9);(iv)所述VH?CDR1包含GFAFSIYD(SEQ?ID?NO:10);(v)所述VH?CDR2包含ISSGGGTT(SEQ?ID?NO:11);(vi)所述VH?CDR3包含ARHSGYGXXXGVLFAY(SEQ?ID?NOS:12-16),其中XXX選自SSY、THW、YNW、TTW和STY。42.如權利要求37所述的分離的核酸,其中所述抗體包含含有3個互補決定區(CDR)的可變輕鏈(VL)和含有3個CDR的可變重鏈(VH),其中(i)所述VL?CDR1包含QDIHGY(SEQ?ID?NO:5);(ii)所述VL?CDR2包含YTS;(iii)所述VL?CDR3包含QQGNTLPWT(SEQ?ID?NO:9);(iv)所述VH?CDR1包含GFAFSIYD(SEQ?ID?NO:10);(v)所述VH?CDR2包含ISSGGGTT(SEQ?ID?NO:11);(vi)所述VH?CDR3包含ARHSGYGTHWGVLFAY(SEQ?ID?NO:13)。43.如權利要求35所述的分離的核酸,其中所述靶向部分是細胞因子。44.如權利要求35所述的分離的核酸,其中所述靶向部分是淋巴因子或生長因子。45.抑制攜帶靶分子的細胞的生長的方法,所述方法包括將所述細胞與嵌合分子接觸,所述嵌合分子包含(a)能特異性結合所述靶分子的靶向部分,和(b)假單胞菌外毒素A(“PE”),其包含PE氨基酸序列,在所述PE氨基酸序列中去除了SEQ?ID?NO:1所限定的氨基酸殘基1-273和285-394,并且SEQ?ID?NO:1所限定的氨基酸殘基D406、R432、R467、R490、R513、E548、K590和Q592被獨立地取代為丙氨酸、甘氨酸或絲氨酸,其中將所述細胞與所述嵌合分子接觸能抑制所述細胞的生長,并且所述方法是非治療目的的。46.如權利要求45所述的方法,其中SEQ?ID?NO:1所限定的氨基酸殘基D403、R412、R427、E431、R458、D461、R505、E522、R538、R551、R576和L597中的一個或多個還被獨立地取代為丙氨酸、甘氨酸或絲氨酸。47.如權利要求45所述的方法,其中所述假單胞菌外毒素A包含SEQ?ID?NO:2。48.如權利要求45所述的方法,其中所述假單胞菌外毒素A包含SEQ?ID?NO:3。49.如權利要求45至48中任一項所述的方法,其中所述靶向部分是HA22的Fv部分。50.如權利要求45至48中任一項所述的方法,其中所述靶向部分是抗體。51.如權利要求50所述的方法,其中所述抗體選自scFv、dsFv、Fab、單結構域抗體和F(ab’)。52.如權利要求50所述的方法,其中所述抗體能特異性結合選自以下的細胞表面抗原:CD19、CD21、CD22、CD25、CD30、CD33、CD79b、轉鐵蛋白受體、EGF受體、間皮蛋白、鈣粘蛋白和Lewis?Y。53.如權利要求50所述的方法,其中所述抗體選自B3、RFB4、SS1、HN1、HN2、MN和HB21。54.如權利要求50所述的方法,其中所述抗體包含含有3個互補決定區(CDR)的可變輕鏈(VL)和含有3個CDR的可變重鏈(VH),其中(i)所述VL?CDR1包含QDIXXY(SEQ?ID?NOS:4-8),其中XX選自SN、HG、GR、RG和AR;(ii)所述VL?CDR2包含YTS;(iii)所述VL?CDR3包含QQGNTLPWT(SEQ?ID?NO:9);(iv)所述VH?CDR1包含GFAFSIYD(SEQ?ID?NO:10);(v)所述VH?CDR2包含ISSGGGTT(SEQ?ID?NO:11);(vi)所述VH?CDR3包含ARHSGYGXXXGVLFAY(SEQ?ID?NOS:12-16),其中XXX選自SSY、THW、YNW、TTW和STY。55.如權利要求50所述的方法,其中所述抗體包含含有3個互補決定區(CDR)的可變輕鏈(VL)和含有3個CDR的可變重鏈(VH),其中(i)所述VL?CDR1包含QDIHGY(SEQ?ID?NO:5);(ii)所述VL?CDR2包含YTS;(iii)所述VL?CDR3包含QQGNTLPWT(SEQ?ID?NO:9);(iv)所述VH?CDR1包含GFAFSIYD(SEQ?ID?NO:10);(v)所述VH?CDR2包含ISSGGGTT(SEQ?ID?NO:11);(vi)所述VH?CDR3包含ARHSGYGTHWGVLFAY(SEQ?ID?NO:13)。56.如權利要求45至48中任一項所述的方法,其中所述靶向部分是細胞因子。57.如權利要求45至48中任一項所述的方法,其中所述靶向部分是淋巴因子或生長因子。58.嵌合分子在制備用于抑制攜帶靶分子的細胞的生長的藥物中的用途,所述嵌合分子包含(a)能特異性結合所述靶分子的靶向部分,和(b)假單胞菌外毒素A(“PE”),其包含PE氨基酸序列,在所述PE氨基酸序列中去除了SEQ?ID?NO:1所限定的氨基酸殘基1-273和285-394,并且SEQ?ID?NO:1所限定的氨基酸殘基D406、R432、R467、R490、R513、E548、K590和Q592被獨立地取代為丙氨酸、甘氨酸或絲氨酸。59.如權利要求58所述的用途,其中SEQ?ID?NO:1所限定的氨基酸殘基D403、R412、R427、E431、R458、D461、R505、E522、R538、R551、R576和L597中的一個或多個還被獨立地取代為丙氨酸、甘氨酸或絲氨酸。60.如權利要求58所述的用途,其中所述假單胞菌外毒素A包含SEQ?ID?NO:2。61.如權利要求58所述的用途,其中所述假單胞菌外毒素A包含SEQ?ID?NO:3。62.如權利要求58至61中任一項所述的用途,其中所述靶向部分是HA22的Fv部分。63.如權利要求58至61中任一項所述的用途,其中所述靶向部分是抗體。64.如權利要求63所述的用途,其中所述抗體選自scFv、dsFv、Fab、單結構域抗體和F(ab’)。65.如權利要求63所述的用途,其中所述抗體能特異性結合選自以下的細胞表面抗原:CD19、CD21、CD22、CD25、CD30、CD33、CD79b、轉鐵蛋白受體、EGF受體、間皮蛋白、鈣粘蛋白和Lewis?Y。66.如權利要求63所述的用途,其中所述抗體選自B3、RFB4、SS1、HN1、HN2、MN和HB21。67.如權利要求63所述的用途,其中所述抗體包含含有3個互補決定區(CDR)的可變輕鏈(VL)和含有3個CDR的可變重鏈(VH),其中(i)所述VL?CDR1包含QDIXXY(SEQ?ID?NOS:4-8),其中XX選自SN、HG、GR、RG和AR;(ii)所述VL?CDR2包含YTS;(iii)所述VL?CDR3包含QQGNTLPWT(SEQ?ID?NO:9);(iv)所述VH?CDR1包含GFAFSIYD(SEQ?ID?NO:10);(v)所述VH?CDR2包含ISSGGGTT(SEQ?ID?NO:11);(vi)所述VH?CDR3包含ARHSGYGXXXGVLFAY(SEQ?ID?NOS:12-16),其中XXX選自SSY、THW、YNW、TTW和STY。68.如權利要求63所述的用途,其中所述抗體包含含有3個互補決定區(CDR)的可變輕鏈(VL)和含有3個CDR的可變重鏈(VH),其中(i)所述VL?CDR1包含QDIHGY(SEQ?ID?NO:5);(ii)所述VL?CDR2包含YTS;(iii)所述VL?CDR3包含QQGNTLPWT(SEQ?ID?NO:9);(iv)所述VH?CDR1包含GFAFSIYD(SEQ?ID?NO:10);(v)所述VH?CDR2包含ISSGGGTT(SEQ?ID?NO:11);(vi)所述VH?CDR3包含ARHSGYGTHWGVLFAY(SEQ?ID?NO:13)。69.如權利要求58至61中任一項所述的用途,其中所述靶向部分是細胞因子。70.如權利要求58至61中任一項所述的用途,其中所述靶向部分是淋巴因子或生長因子。

說明書

優先權

本申請要求于2009年9月11日提交的美國臨時申請第61/241,620號的權益,通過引用將其全部內容并入本文。

發明領域

本發明提供具有高細胞毒性和降低的免疫原性的改進的假單胞菌(pseudomonas)外毒素A(PE)分子、含有所述改進的假單胞菌外毒素A的組合物以及使用方法。

發明背景

在過去的數年中,免疫偶聯物已被開發為治療惡性腫瘤的備選治療方法。免疫偶聯物最初由抗體與植物或細菌毒素通過化學偶聯組成,該免疫偶聯物為一種被稱為免疫毒素的形式??固逵氚邢赴媳澩锏目乖岷?,并且毒素被內化,從而通過阻止蛋白合成和誘導凋亡引起細胞死亡(Brinkmann,U.,Mol.Med.Today,2:439-446(1996))。最近,已經將編碼抗體和毒素的基因融合,并將免疫毒素表達為融合蛋白。

已有很多研究在利用稱為假單胞菌外毒素A(“PE”)的細菌毒素作為毒性部分的免疫毒素上進行。通常,將PE截短或突變,從而降低其非特異性毒性,但又不會破壞其對于被免疫毒素的靶向部分所靶向的細胞的毒性。目前,對利用基于PE的免疫毒素作為多種癌癥的治療手段的測試正進行臨床試驗。

目前的基于PE的免疫毒素的免疫原性很強。經證實,這一點在血液學惡性腫瘤的治療中不是問題,因為在血液學惡性腫瘤中,免疫系統產生應答的能力通常遭受破壞。通??梢越庖叨舅囟啻胃柩貉Ф裥災琢齷頰?。然而,實體瘤患者通常在首次給藥后的數周內產生對基于PE的免疫毒素的中和抗體。因為很多方案要求在免疫毒素給藥之間具有3周的時間,所以該時間段內抗體的產生實際上意味著,對于實體瘤而言,在患者的抗體致使基于PE的免疫毒素失效之前,通常僅可以對其進行一次給藥。盡管如此,基于PE的免疫毒素的單次給藥也能非常有助于減小患者的腫瘤負荷、消滅較小的轉移灶和緩解癥狀。但是,仍希望能擁有可降低患者的免疫原性應答的抗原性較低形式的基于PE的免疫毒素。

本發明滿足這些需要,并且還滿足其它需要。

發明概述

本發明提供具有降低的免疫原性的改進的假單胞菌外毒素A(“PE”)。在結構上,本發明的改進的PE中去除了結構域I和大部分的結構域II,并且結構域III中的氨基酸殘基位置D406、R432、R467、R490、R513、E548、K590和Q592被取代為甘氨酸,丙氨酸或絲氨酸。在功能上,本發明的改進的PE分子保留高的細胞毒性活性,同時去除了B細胞表位。接受了5次注射本發明的改進PE的小鼠不會產生針對所述毒素的免疫應答。用本文中稱為LR-8M(之前稱為LR-8X)的本發明具體實施方案對所述改進的PE分子進行舉例說明。

因此,一方面,本發明提供了分離的假單胞菌外毒素A(“PE”),其中對應SEQ?ID?NO:1的氨基酸殘基,所述假單胞菌外毒素A中去除了殘基1-273和285-394,并且氨基酸殘基D406、R432、R467、R490、R513、E548、K590和Q592被取代為丙氨酸、甘氨酸或絲氨酸。

在相關方面中,本發明提供了嵌合分子,其包含與(b)假單胞菌外毒素A(“PE”)偶聯或融合的(a)靶向部分,其中對應SEQ?ID?NO:1的氨基酸殘基,所述假單胞菌外毒素A中去除了殘基1-273和285-394,并且氨基酸殘基D406、R432、R467、R490、R513、E548、K590和Q592被取代為丙氨酸、甘氨酸或絲氨酸。

另一方面,本發明提供了組合物,其包含

(a)嵌合分子,所述嵌合分子包含與假單胞菌外毒素A(“PE”)偶聯或融合的靶向部分,其中對應SEQ?ID?NO:1的氨基酸殘基,所述假單胞菌外毒素A中去除了殘基1-273和285-394,并且氨基酸殘基D406、R432、R467、R490、R513、E548、K590和Q592被取代為丙氨酸、甘氨酸或絲氨酸;和

(b)藥學可接受的載體。

在相關方面中,本發明提供編碼修飾的假單胞菌外毒素A(“PE”)的分離的核酸,其中對應SEQ?ID?NO:1的氨基酸殘基,所述假單胞菌外毒素A中去除了殘基1-273和285-394,并且氨基酸殘基D406、R432、R467、R490、R513、E548、K590和Q592被取代為丙氨酸、甘氨酸或絲氨酸。在一些實施方案中,所述核酸還編碼靶向部分。

另一方面,本發明提供抑制攜帶靶分子的細胞的生長的方法,所述方法包括將所述細胞與嵌合分子接觸,所述嵌合分子包含

(a)特異性地結合所述靶分子的靶向部分,和

(b)假單胞菌外毒素A(“PE”),其中對應SEQ?ID?NO:1的氨基酸殘基,所述假單胞菌外毒素A中去除了殘基1-273和285-394,并且氨基酸殘基D406、R432、R467、R490、R513、E548、K590和Q592被取代為丙氨酸、甘氨酸或絲氨酸,

其中將所述細胞與所述嵌合分子接觸能抑制所述細胞的生長。

關于所述實施方案,在一些實施方案中,對應SEQ?ID?NO:1的氨基酸殘基,所述假單胞菌外毒素A中任選地至少一個選自D403、R412、R427、E431、R458、D461、R505、E522、R538、R551、R576和L597的氨基酸殘基被取代為丙氨酸、甘氨酸或絲氨酸。

在一些實施方案中,所述假單胞菌外毒素A具有SEQ?ID?NO:2的氨基酸序列。在一些實施方案中,所述假單胞菌外毒素A具有SEQ?ID?NO:3的氨基酸序列。

在一些實施方案中,所述靶向部分是抗體。在一些實施方案中,所述抗體選自scFv、dsFv、Fab、單結構域抗體和F(ab’)2。

在一些實施方案中,所述抗體針對選自以下的細胞表面抗原:CD19、CD21、CD22、CD25、CD30、CD33、CD79b、轉鐵蛋白受體、EGF受體、間皮蛋白(mesothelin)、鈣粘蛋白和Lewis?Y。

在一些實施方案中,所述抗體選自B3、RFB4、SS1、HN1、HN2、MN和HB21。

在一些實施方案中,所述抗體具有包含3個互補決定區(CDR)的可變輕鏈(VL)和包含3個CDR的可變重鏈(VH),其中

(i)所述VL?CDR1具有序列QDIXXY(SEQ?ID?NOS:4-8),其中XX選自SN、HG、GR、RG和AR;

(ii)所述VL?CDR2具有序列YTS;

(iii)所述VL?CDR3具有序列QQGNTLPWT(SEQ?ID?NO:9);

(iv)所述VH?CDR1具有序列GFAFSIYD(SEQ?ID?NO:10);

(v)所述VH?CDR2具有序列ISSGGGTT(SEQ?ID?NO:11);

(vi)所述VH?CDR3具有序列ARHSGYGXXXGVLFAY(SEQ?ID?NOS:12-16),其中XXX選自SSY、THW、YNW、TTW和STY。

在一些實施方案中,所述抗體具有包含3個互補決定區(CDR)的可變輕鏈(VL)和包含3個CDR的可變重鏈(VH),其中

(i)所述VL?CDR1具有序列QDISNY(SEQ?ID?NO:4);

(ii)所述VL?CDR2具有序列YTS;

(iii)所述VL?CDR3具有序列QQGNTLPWT(SEQ?ID?NO:9);

(iv)所述VH?CDR1具有序列GFAFSIYD(SEQ?ID?NO:10);

(v)所述VH?CDR2具有序列ISSGGGTT(SEQ?ID?NO:11);

(vi)所述VH?CDR3具有序列ARHSGYGTHWGVLFAY(SEQ?ID?NO:13)。

在一些實施方案中,所述抗體具有包含3個互補決定區(CDR)的可變輕鏈(VL)和包含3個CDR的可變重鏈(VH),其中

(i)所述VL?CDR1具有序列QDIHGY(SEQ?ID?NO:5);

(ii)所述VL?CDR2具有序列YTS;

(iii)所述VL?CDR3具有序列QQGNTLPWT(SEQ?ID?NO:9);

(iv)所述VH?CDR1具有序列GFAFSIYD(SEQ?ID?NO:10);

(v)所述VH?CDR2具有序列ISSGGGTT(SEQ?ID?NO:11);

(vi)所述VH?CDR3具有序列ARHSGYGTHWGVLFAY(SEQ?ID?NO:13)。

在一些實施方案中,所述抗體包含HA22的Fv部分。在一些實施方案中,所述抗體是人的或人源化的。

在一些實施方案中,所述靶向部分是細胞因子、淋巴因子或生長因子。

其它實施方案對于本領域技術人員是顯而易見的,并且在本文中進行了描述。

定義

按照國際單位制(SI)可接受的形式表示單位、前綴以及符號。數值范圍包括限定范圍的數值。除非另外指明,核酸按照5′至3′的方向從左至右書寫;氨基酸序列按照從氨基至羧基的方向從左至右書寫。本文提供的標題不是限制本發明的的各個方面或實施方案,應參考整個說明書理解本發明的各個方面或實施方案。因此,下文緊接著定義的術語的應當參考整個說明書進行進行更充分的定義。

假單胞菌外毒素A(“PE”)是由銅綠假單胞菌(Psedomonas?aerugmosa)分泌的活性極高的單體蛋白(分子量66kD),其抑制真核細胞中的蛋白合成。美國專利第5,602,095號中提供了天然PE序列(SEQ?ID?NO:1),通過引用將其并入本文。PE的作用方法和結構以及能導致多種PE變體的修飾在文中為此目的的節段中進行了較詳細的討論。

本文所述的PE突變參考天然PE的613個氨基酸的序列(SEQ?ID?NO:1)的具體位置處存在的氨基酸殘基,其后面為在討論的具體突變中取代了所述殘基的氨基酸。因此,例如,術語“R490A”表示參考分子中第490位的“R”(精氨酸的標準單字母代碼)被替換為“A”(丙氨酸的標準單字母代碼),而“K590Q”表示第590位上通常存在的賴氨酸被替換為谷氨酰胺。常見氨基酸的標準單字母代碼如下文所示。

“CD22”是指譜系限制性B細胞抗原,其屬于Ig超家族。60-70%的B細胞淋巴瘤和白血病中表達CD22,并且在B細胞發育早期中的細胞表面上或在干細胞上不存在CD22。參見,例如Vaickus?et?al.,Crit.Rev.Oncol/Hematol.11:267-297(1991)。

本文所用的術語“抗CD22”是指特異性地結合CD22的抗體,并且包括針對CD22產生的抗體。在優選實施方案中,CD22是靈長類CD22,例如,人CD22。在一個優選實施方案中,所述抗體是針對人CD22產生的,所述人CD22是將編碼人CD22的cDNA引入非靈長類哺乳動物后由所述動物合成的。

“CD25”或“Tac”是指IL-2受體(IL2R)的α鏈。CD25是存在于活化的T細胞、活化的B細胞、部分胸腺細胞、骨髓前體細胞以及少突細胞上的I型跨膜蛋白,其與CD122締合形成異二聚體,該異二聚體能作為IL-2的高親和力受體。大部分B細胞瘤、部分急性非淋巴細胞白血病以及成神經細胞瘤表達CD25。

本文所用的術語“抗CD25”是指特異性地結合CD25的抗體,并且包括針對CD25產生的抗體。在優選實施方案中,CD25是靈長類CD25,例如,人CD25。在一個優選實施方案中,所述抗體是針對人CD25產生的,所述人CD25是將編碼人CD25的cDNA引入非靈長類哺乳動物后由所述動物合成的。

術語“間皮蛋白”是指存在于部分人類細胞的表面上并被例如K1抗體結合的蛋白及其片段。間皮蛋白的核酸和氨基酸序列公開于,例如,PCT公開申請WO?97/25,068以及美國專利第6,083,502號和第6,153,430號。也可以參見Chang,K.&?Pastan,I.,Int.J.Cancer?57:90(1994);Chang,K.&?Pastan,I.,Proc.Nat′l?Acad.Sci?USA?93:136(1996);Brinkmann?U.,et?al,Int.J.Cancer?71:638(1997);Chowdhury,P.S.,et?al,Mol?Immunol.34:9(1997)以及美國專利第6,809,184號。間皮蛋白被表達為約69kDa的前體蛋白,然后被加工而釋放30kDa的蛋白,同時留下背景部分中所述的40kDa的甘油磷酸肌醇連接的細胞表面糖蛋白與細胞表面連接。40kDa的糖蛋白是本文中術語“間皮蛋白”所指的蛋白。數個物種的間皮蛋白的核酸和氨基酸序列已有記錄,例如,人(NM_005823.4→NP_005814.2和NM_013404.3→NP_037536.2)、小鼠(NM_018857.1→NP_061345.1)、大鼠(NM_031658.1→NP_113846.1)、牛(NM_001100374.1→NP_001093844)。

“RFB4”是指特異性地結合人CD22的小鼠IgGl單克隆抗體??梢源傭喔齬┗跎坦旱貌訪猂FB4的RFB4,例如Southern?Biotechnology?Associates,Inc.(Birmingham?AL;目錄號9360-01)、Autogen?Bioclear?UK?Ltd.(Calne,Wilts,UK;目錄號AB147)、Axxora?LLC.(San?Diego,CA)。RFB4對于B譜系細胞是高度特異性的,并且與其它正常細胞類型沒有可檢測的交叉反應(Li?et?al.,Cell.Immunol.118:85-99(1989))。RFB4的重鏈和輕鏈已被克隆出。參見,Mansfield?et?al.,Blood?90:2020-2026(1997),通過引用將其并入本文。

“BL22”(或“RFB-4(dsFv)-PE38”)是一種免疫毒素,其利用本領域稱為“RFB-4″的抗C22抗體的二硫鍵穩定的Fv區作為靶向部分。RFB-4抗體的序列是本領域公知的。BL22描述于Kreitman?et?al.,New?Eng?J?Med?345(4):241-7(2001)。BL22免疫毒素利用PE38作為免疫毒素的毒性部分。

“HA22”是一種免疫毒素,其利用RFB-4的突變形式作為靶向部分,其中,RFB4的可變重鏈CDR3的殘基SSY被突變為THW。RFB-4的這種突變及它對免疫毒素利用其作為靶向部分的影響描述于國際公布WO?03/027135和Salvatore?et?al.,Clin?Cancer?Res?8(4):995-1002(2002)。HA22免疫毒素利用PE38作為免疫毒素的毒性部分。

為了便于引用,本文所用的術語“抗體”包括全抗體(本文中有時稱為“完整抗體”)、保留抗原識別和結合能力的抗體片段(包括通過對全抗體的修飾而產生的或利用重組DNA方法重頭合成的)、單克隆抗體、多克隆抗體以及抗體模擬物,除非文中另作要求??固蹇梢允荌gM、IgG(例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4)、IgD、IgA或IgE。

IgG亞類的恒定區序列是本領域多年來已經公知的(例如,Honjo?et?al.,Cell,18:559-68(1979);Tucker?et?al.,Science,206:1303-6(1979);Yamawaki?et?al.,Nature?283:786-9(1980);Ellison?et?al.,Nucl?Acids?Res?10:4071-9(1982);Ellison?et?al.,DNA?1:11-8(1981);Ellison?and?Hood,Proc?Natl?Acad?Sci?USA?79:1984-8(1982))。因為可變區CDR決定抗體特異性,所以可以將針對靶細胞表面抗原的抗體CDR或Fv移植或工程化到選定抗體中,從而為該抗體賦予對于所述靶細胞表面抗原的特異性。例如,可以將針對靶細胞表面抗原的抗體CDR移植到已知三維結構的人抗體框架上(參見,例如,WO98/45322;WO87/02671;美國專利第5,859,205號;第5,585,089號和第4,816,567號;EP專利申請0173494;Jones,et?al.Nature?321:522(1986);Verhoeyen,et?al,Science?239:1534(1988);Riechmann,et?al.Nature?332:323(1988);以及Winter?&?Milstein,Nature?349:293(1991)),從而形成當給予人時僅會引起很小的免疫原性應答或不會引起免疫原性應答的抗體?;蛘?,可以通過將非人動物(例如小鼠)中發現的殘基替換為通常在人中發現的殘基將抗體恒定區工程化。按照此方式工程化的抗體被稱為“人源化的抗體”并且是優選的,因為它們誘導副作用的風險較低,并且可以在循環中保持更長的時間??固宓娜嗽椿椒ㄊ潛玖煊蛞閻?,并且描述于,例如,美國專利第6,180,377號、第6,407,213號、第5,693,762號、第5,585,089號和第5,530,101號。

術語“抗體片段”表示包含完整抗體的一部分的分子,通常是完整抗體的抗原結合區或可變區??固迤蔚氖道‵ab、Fab′、F(ab′)2以及Fv片段;單結構域抗體(參見,例如,Wesolowski,Med?Microbiol?Immunol.(2009)198(3):157-74;Saerens,et?al.,Curr?Opin?Pharmacol.(2008)8(5):600-8;Harmsen?and?de?Haard,Appl?Microbiol?Biotechnol.(2007)77(1):13-22);螺旋穩定抗體(參見,例如,Amdt?et?al.,J?Mol?Biol?312:221-228(2001);雙鏈抗體(參見下文);單鏈抗體分子(“scFvs”,參見,例如,美國專利第5,888,773號);二硫鍵穩定抗體(“dsFvs”,參見,例如,美國專利第5,747,654號和第6,558,672號)以及結構域抗體(“dAbs”,參見,例如,Holt?et?al.,Trends?Biotech?21(11):484-490(2003),Ghahroudi?et?al.,FEBS?Lett.414:521-526(1997),Lauwereys?et?al.,EMBO?J?17:3512-3520(1998),Reiter?et?al.,J.Mol.Biol.290:685-698(1999),Davies?and?Riechmann,Biotechnology,13:475-479(2001))。

術語“雙鏈抗體”是指具有兩個抗原結合位點的小的抗體片段,所述片段包含在同一多肽鏈中與可變輕結構域(“VL”或“VL”)連接的可變重結構域(“VH”或“VH”)(VH-VL)。通過使用由于太短而不允許同一鏈上的兩個結構域之間配對的連接物,所述結構域被迫與另一鏈的互補結構域配對,并產生兩個抗原結合位點。雙鏈抗體及其制備更詳細地描述于,例如,EP?404,097;WO?93/11161;以及Hollinger?et?al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90:6444-6448(1993)。

術語“母體抗體”表示希望進行突變或改變而獲得與母體抗體結合同一表位但具有較高親和力的抗體或其片段的任何目的抗體。

“靶向部分”是免疫偶聯物中預期使免疫偶聯物靶向于目的細胞的部分。通常,靶向部分是抗體或保留抗原識別能力的抗體片段,例如scFv、dsFv、Fab或F(ab′)2。

“毒性部分”是免疫毒素中使免疫毒素對目的細胞產生細胞毒性的部分。對于作為本發明一個主題的免疫毒素,正如下文詳細描述的,毒性部分是假單胞菌外毒素A,已對所述假單胞菌外毒素A進行突變來降低其非特異性的細胞毒性。

通常,免疫球蛋白具有重鏈和輕鏈。每條重鏈和輕鏈都含有恒定區和可變區(所述區也稱為“結構域”)。輕鏈和重鏈可變區含有″框架″區,所述框架區被3個高度可變區(也稱為“互補決定區”或“CDR”)隔開??蚣芮虲DR的范圍已被界定。不同輕鏈或重鏈的框架區序列在一個物種內是相對保守的??固宓目蚣芮?,即組成型輕鏈和重鏈的組合框架區,用于三維空間中CDR的定位和排列。

CDR主要負責與抗原的表位結合。每條鏈的CDR通常稱為CDR1、CDR2以及CDR3(從N末端開始依次編號),并且還通常由具體CDR所位于的鏈來標識。因此,VHCDR3位于其所在的抗體重鏈的可變結構域中,而VLCDR1是其所在的抗體輕鏈的可變結構域的CDR1。

“VH”或“VH”是指免疫球蛋白重鏈的可變區,包括Fv、scFv、dsFv或Fab?!癡L”或“VL”是指免疫球蛋白輕鏈的可變區,包括Fv、scFv、dsFv或Fab。

詞組“單鏈Fv”或“scFv”是指這樣的抗體:其中常規的兩條鏈的抗體的重鏈可變結構域和輕鏈可變結構域已被連接從而形成一條鏈。通常,在兩條鏈之間插入連接肽,以允許正確折疊和活性結合位點的產生。

詞組“二硫鍵”或“半胱氨酸-半胱氨酸二硫鍵”是指兩個半胱氨酸之間的共價相互作用,其中半胱氨酸的硫原子被氧化從而形成二硫鍵。二硫鍵的平均鍵能為約60kcal/mol,而氫鍵為1-2kcal/mol。

詞組“二硫鍵穩定Fv”或“dsFv”是指輕鏈和重鏈之間具有二硫鍵的免疫球蛋白可變區。在本發明的背景下,形成二硫鍵的半胱氨酸位于抗體鏈的框架區內,并且用于穩定抗體的構象。通常,將抗體進行工程化,從而在框架區中取代不會干擾抗原結合的位置處引入半胱氨酸。

術語“連接肽”包括抗體結合片段(例如,Fv片段)中的肽,其用于使重鏈可變結構域與輕鏈可變結構域間接結合。

可以通過重組方法(例如,通過噬菌體或相似載體中重組抗體文庫的選擇(參見,例如,Huse,et?al.,Science?246:1275-1281(1989);Ward,et?al.,Nature?341:544-546(1989);和Vaughan,et?al.,Nature?Biotech.14:309-314(1996)))或通過用抗原或編碼抗原的DNA免疫動物來產生與具體抗原能發生免疫反應的抗體。

術語“效應部分”表示免疫偶聯物中預期對靶向部分所靶向的細胞具有作用或預期能鑒定免疫偶聯物的存在的部分。在本發明的背景下,效應部分是突變的假單胞菌外毒素A。

術語“免疫偶聯物”包括效應分子與抗體的共價連接。

術語“有效量”或“對…有效的量”或“治療有效量”包括足以產生所需結果的治療劑劑量,所述結果例如將細胞蛋白合成抑制至少50%或殺死細胞。

術語“毒素”通常包括相思豆毒素、蓖麻毒素、假單胞菌外毒素(PE)、白喉毒素(DT)、肉毒桿菌毒素或它們的經過修飾的毒素。例如,PE和DT是高毒性化合物,它們通常通過肝毒性而導致死亡。然而,可以通過去除PE和DT的天然靶向組分(例如,PE的結構域Ia或DT的B鏈)并將其替換為不同的靶向部分(例如抗體)而將PE和DT修飾為能用作免疫毒素的形式。在本發明的背景下,毒素是突變的假單胞菌外毒素A。

術語“接觸”包括置于直接的物理關聯中。

“表達質?!卑嗦肽康姆腫擁暮塑賬嶁蛄?,其與啟動子可操作地連接。

本文所用的“多肽”、“肽”和“蛋白”可交換使用,并且包括氨基酸殘基的聚合物。上述術語適用于其中一個或多個氨基酸殘基是對應的天然存在的氨基酸的人工化學類似物的氨基酸聚合物,并且適用于天然存在的氨基酸聚合物。上述術語還適用于含有保守型氨基酸取代而使得蛋白仍具有功能的聚合物。

術語“殘基”或“氨基酸殘基”或“氨基酸”包括被合并入蛋白、多肽或肽(統稱“肽”)中的氨基酸。氨基酸可以是天然存在的氨基酸,并且除非另外限定,氨基酸可以包括以與天然存在的氨基酸相似的方式發揮作用的天然氨基酸的已知類似物。

本文涉及的氨基酸和類似物以下文表A中的縮寫名稱進行描述:

表A:氨基酸命名

當描述蛋白時,“保守型取代”是指不會顯著改變蛋白活性的蛋白氨基酸組成的改變。因此,具體氨基酸序列的“保守型修飾的變異”是指對于蛋白活性不是關鍵性的氨基酸的氨基酸取代或將氨基酸取代為具有相似性質(例如,酸性、堿性、帶正電的或帶負電的、極性的或非極性的等)的其它氨基酸,從而即使是關鍵氨基酸的取代也不會顯著改變活性。提供功能相似氨基酸的保守型取代表是本領域公知的。表B中的以下六組中的每一組都包括能彼此進行保守型取代的氨基酸:

表B

1)丙氨酸(A),絲氨酸(S),蘇氨酸(T);

2)天冬氨酸(D),谷氨酸(E);

3)天冬酰胺(N),谷氨酰胺(Q);

4)精氨酸(R),賴氨酸(K);

5)異亮氨酸(I),亮氨酸(L),蛋氨酸(M),纈氨酸(V);以及

6)苯丙氨酸(F),酪氨酸(Y),色氨酸(W)。

也可以參見Creighton,Proteins:Structures?and?Molecular?Properties,W.H.Freeman?and?Company,New?York(第二版,1992)。

對于肽而言,術語“基本上相似”表示肽包含與參考序列在10-20個氨基酸的比較窗上具有至少90%、優選至少95%的序列同一性的序列。通過在比較窗上比較兩個最佳比對的序列來確定序列同一性百分比,其中為了兩個序列的最佳比對,與參考序列(不包含插入或缺失)相比,比較窗中的多核苷酸序列部分可以包含插入或缺失(即,空位)。按照下述計算百分比:確定在兩個序列中出現相同核酸堿基或氨基酸殘基的位置數,從而得到匹配位置數,用匹配位置數除以比較窗中的總位置數并將結果乘以100,從而得到序列同一性百分比。

術語“偶聯”、“連接(joining)”、“結合”或“連接(linking)”是指使兩個多肽成為一個連續的多肽分子。在本發明的背景下,該術語包括將抗體部分與效應分子(EM)連接。所述連接可以通過化學手段或重組手段?;侄問侵縛固宀糠趾托вΨ腫又浞⑸從?,使得在兩個分子之間形成共價鍵,從而形成一個分子。

本文所用的“重組”包括涉及如下述產生的蛋白:利用在天然狀態下不具有能表達所述蛋白的內源DNA拷貝的的細胞來產生蛋白。細胞產生重組蛋白是由于已經通過引入合適的分離的核酸序列而將所述細胞進行了基因改造。該術語還包括通過引入異源核酸或將天然核酸改變為對于細胞而言是非天然的形式而進行修飾的細胞或核酸或載體,或細胞是來源于如此修飾的細胞。因此,例如,重組細胞表達在細胞的天然(非重組)形式中不存在的基因、表達天然形式中存在的基因的突變體或表達異常表達、低表達或不表達的天然基因。

本文所用的“核酸”或“核酸序列”包括涉及單鏈或雙鏈形式的脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸聚合物,并且除非另外限制,還包括以與天然存在的核苷酸相似的方式與核酸雜交的天然核苷酸的已知類似物。除非另外指明,具體的核酸序列包括其互補序列以及保守型變體(即,密碼子的擺動位置中存在的核酸和當翻譯為蛋白時產生氨基酸保守型取代的變體)。

對于指定核酸而言,本文所用的“編碼”包括涉及含有翻譯為所述指定蛋白的信息的核酸。由密碼子的使用指定所述信息。通常,氨基酸序列由核酸利用“通用”遺傳密碼所編碼。然而,通用密碼的變異存在于,例如某些植物、動物以及真菌線粒體,細菌山羊支原體(Mycoplasma?capricolum)(Proc.Nat’l?Acad.Sci.USA?82:2306-2309(1985)或纖毛蟲大核,因此當利用這些生物的翻譯機制來表達核酸時,可以使用通用密碼的變異。

詞組“框內融合”是指連接兩個或更多個編碼多肽的核酸序列,使得所連接的核酸序列能翻譯為包含原始多肽鏈的單鏈蛋白。

本文所用的“表達”包括核酸翻譯為蛋白。蛋白可以被表達,并保持在細胞內、成為細胞表面膜的組分或被分泌到細胞外基質或培養基中。

“宿主細胞”表示能支持表達載體的復制或表達的細胞。宿主細胞可以是原核細胞(例如大腸桿菌)或真核細胞(例如酵母、昆蟲、兩棲動物或哺乳動物細胞)。

對于兩個或更多個核酸或多肽序列而言,術語“同一的”或“同一性”百分比是指當為最大對應性進行比較和比對,如利用下述序列比較算法之一或通過肉眼檢查進行測定時,相同的或具有指定百分比的相同的氨基酸殘基或核苷酸的兩個或更多個序列或子序列。

對于兩個核酸或多肽而言,詞組“基本上同一的”是指當為最大對應性進行比較和比對,如利用下述序列比較算法之一或通過肉眼檢查進行測定時,具有至少60%、更優選65%、更優選70%、更優選75%、更優選80%以及最優選90-95%的核苷酸或氨基酸殘基同一性的兩個或更多個序列或子序列。優選地,基本上的同一性存在于長度為至少約50個殘基的序列的區上,更優選在至少約100個殘基的區上,并且最優選地,序列在至少約150個殘基上是基本上同一的。在最優選的實施方案中,序列在編碼區的全長上是基本上同一的。

對于序列比較,通常,一個序列作為參考序列,測試序列與其進行比較。當利用序列比較算法時,將測試序列和參考序列輸入電腦,如果需要,指定子序列坐標,并且指定序列算法程序參數。然后,序列比較算法會基于指定的程序參數而計算出測試序列相對于參考序列的序列同一性百分比。

可以通過以下進行用于比較的序列最佳比對,例如,Smith?&?Waterman,Adv.Appl.Math.2:482(1981)的局部同源性算法,Needleman?&?Wunsch,J.Mol.Biol.48:443(1970)的同源性比對算法,Pearson?&?Lipman,Proc.Nat’l.Acad.Sci.USA?85:2444(1988)的相似性方法檢索,這些算法的計算機化實施程序(Wisconsin?Genetics?Software?Package,Genetics?Computer?Group,575?Science?Dr.,Madison,WI中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA),或者肉眼檢查(可大體上參見Current?Protocols?in?Molecular?Biology,F.M.Ausubel?et?al,eds.,Current?Protocols,a?joint?venture?between?Greene?Publishing?Associates,Inc.和John?Wiley?&?Sons,Inc.,(1995增補)(Ausubel))。

適于確定序列同一性百分比和序列相似性百分比的算法的實例是BLAST和BLAST?2.0算法,它們分別描述于Altschul?et?al.(1990)J.Mol.Biol.215:403-410和Altschuel?et?al.(1977)Nucleic?Acids?Res.25:3389-3402。用于執行BLAST分析的軟件可在國家生物技術信息中心(National?Center?for?Biotechnology?Information)公開獲取(//www.ncbi.nlm.nih.gov/)。該算法涉及首先通過鑒定問詢序列中的長度W的短字符來鑒定高評分序列對(HSP),當與數據庫序列中相同長度的字符比對時,所述問詢序列中的長度W的短字符能匹配或滿足一定的正值閾值得分T。T被稱為鄰近字符得分閾值(Altschul?et?al.,同上)。這些最初的鄰近字符命中作為種子,用于起始搜索含有它們的較長HSP。然后,沿著每個序列在兩個方向延伸字符命中,直到能增加累積比對得分。對于核苷酸序列,利用參數M(匹配殘基對的獎勵得分;總是大于0)和N(錯配殘基的罰分;總是小于0)計算累積得分。對于氨基酸序列,使用評分矩陣來計算累積得分。當出現以下情形時,終止每個方向上字符命中的延伸:累積比對得分從其最大實現值掉落X的量;由于累積一個或多個負評分的殘基比對而使累積得分達到0或低于0;或者到達序列的任一末端。BLAST算法參數W、T以及X決定比對的敏感性和速度。BLASTN程序(對于核苷酸序列)默認使用:字長(W)為11、預期值(E)為10、M=5、N=-4以及兩條鏈比較。對于氨基酸序列,BLASTP程序默認使用:字長(W)為3、預期值(E)為10以及BLOSUM62評分矩陣(參見Henikoff?&?Henikoff,Proc.Nat’l.Acad.Sci.USA?89:10915(1989))。

除了計算序列同一性百分比之外,BLAST算法還執行兩個序列之間的相似性的統計學分析(參見,例如,Karlin?&?Altschul,Proc.Nat’l.Acad.Sci.USA?90:5873-5787(1993))。BLAST算法提供的相似性的一個度量是最小和概率(P(N)),其能提供兩個核苷酸或氨基酸序列之間的匹配偶然出現的概率的指示。例如,如果測試核酸與參考核酸的比較中的最小和概率小于約0.1、更優選小于約0.01以及最優選小于約0.001,則認為測試核酸與參考序列相似。

兩個核酸序列或多肽是基本上同一的另一指示是第一核酸所編碼的多肽與第二核酸所編碼的多肽能發生免疫交叉反應,如下文所述。因此,例如,當兩個肽的區別僅為保守型取代時,通常一個多肽與第二多肽是基本上同一的。兩個核酸序列是基本上同一的另一指示是兩個分子在嚴緊條件下彼此雜交,如下文所述。

術語“體內”包括位于獲取細胞的生物體的體內?!襖胩濉焙汀疤逋狻北硎疚揮諢袢∠赴納鍰宓耐獠?。

詞組“惡性細胞”或“惡性腫瘤”是指具有侵襲性的和/或能進行轉移的腫瘤或腫瘤細胞,即,癌性細胞。

本文所用的“哺乳動物細胞”包括來源于哺乳動物的細胞,所述哺乳動物包括人、大鼠、小鼠、豚鼠、猩猩或獼猴??梢栽諤迥諢蛺逋馀嘌赴?。

對于抗原,術語“選擇性反應”是指抗體的整體或一部分與攜帶該抗原的細胞或組織的優先結合,而不與缺少該抗原的細胞或組織結合。當然,已經證實在分子和非靶細胞或組織之間可以發生一定程度的非特異性相互作用。盡管如此,可以由是否通過抗原的特異性識別來區分選擇性反應。盡管選擇性反應抗體結合抗原,但它們可以以低親和力進行結合。另一方面,特異性結合導致抗體和攜帶抗原的細胞之間的結合會大大強于抗體和缺少抗原的細胞之間的結合。特異性結合通常導致抗體(每單位時間)與攜帶靶抗原的細胞或組織的結合的量比與缺少靶抗原的細胞或組織的結合的量增加大于2倍、優選大于5倍、更優選大于10倍以及最優選大于100倍。在這些條件下與蛋白的特異性結合需要針對對具體蛋白的特異性來選擇抗體。多種免疫測定形式適于選擇與具體蛋白發生特異性免疫反應的抗體。例如,固相ELISA免疫測定被常規用于選擇與蛋白發生特異性免疫反應的單克隆抗體。關于可用于測定特異性免疫反應的免疫測定形式和條件的描述,可參見Harlow?&?Lane,ANTIBODIES,A?LABORATORY?MANUAL,Cold?Spring?Harbor?Publications,New?York(1988)。

術語“免疫反應性條件”包括允許針對具體表位產生的抗體與該表位結合的程度可檢測地高于與基本上所有其它表位的結合和/或基本上不與基本上所有其它表位結合的條件。免疫反應性條件取決于抗體結合反應的形式,并且通常是免疫測定過程中所用的條件或體內遇到的那些條件。關于免疫測定形式和條件的描述,可參見Harlow?&?Lane,同上。優選地,本發明方法中所用的免疫反應性條件是“生理條件”,其包括通常處于活的哺乳動物或哺乳動物細胞中的條件(例如,溫度、同滲容摩、pH)。盡管已經認識到某些器官處于極端條件下,但是生物內和細胞內環境通常為約pH7(即,pH6.0-pH8.0,更通常為pH6.5-7.5),含有水作為主要溶劑,以及處于高于0℃且低于50℃的溫度。同滲容摩位于能支持細胞活力和增殖的范圍內。

術語“患者”、“個體(subject)”、“個體(individual)”可互換使用,是指哺乳動物,例如,人或非人靈長類,馴養哺乳動物(例如,犬或貓),農業哺乳動物(例如,牛、豬、羊、馬),實驗室哺乳動物(小鼠、大鼠、倉鼠、兔)。

術語“共同給予”是指個體血液中同時存在兩種活性劑??梢醞被蛞來蔚菟凸餐璧幕钚約?。

本文所用的術語“治療(treating)”和“治療(treatment)”是指延遲發生、阻止或逆轉該術語所應用于的疾病或疾病狀態或該疾病或疾病狀態的一種或多種癥狀的進展,或緩解或預防該術語所應用于的疾病或疾病狀態或該疾病或疾病狀態的一種或多種癥狀。

對于腫瘤或癌癥生長或進展,術語“抑制”、“降低”、“減少”是指將個體中腫瘤或癌癥的生長、擴散、轉移抑制利用本領域已知的任何方法可檢測到的量。如果腫瘤負荷比共同給予本發明的PE(例如,作為嵌合分子的一部分)之前的腫瘤負荷減少至少約10%、20%、30%、50%、80%或100%,則腫瘤或癌癥的生長、發展或擴散被抑制、降低或減少。在一些實施方案中,與給予PE之前的腫瘤負荷相比,腫瘤或癌癥的生長、發展或擴散被抑制、降低或減少至少約1倍、2倍、3倍、4倍或更多倍。

附圖簡要描述

圖1表明HA22-LR-8M對來自CLL患者的慢性淋巴性白血病(CLL)細胞具有很好的細胞殺傷活性。

圖2表明HA22-LR-8M對SCID小鼠中的CA46腫瘤具有很好的抗腫瘤活性。用HA22或HA22-LR-8M靜脈內(i.v.)注射3次治療具有CA46腫瘤的小鼠,并在23天中測量腫瘤大小。

圖3顯示了在接受免疫毒素靜脈內給藥的小鼠中,HA22-LR-8M的免疫原性低于LMB-9。

圖4顯示了在接受免疫毒素靜脈內(i.v.)給藥的小鼠中,HA22-LR-8M的免疫原性低于HA22。

圖5顯示了HA22(閉合圓圈)和HA22-LR-8M(閉合方塊)對CA46細胞的特異性細胞毒性活性(圖5A);HA22和HA22-LR-8M的抗腫瘤活性(圖5B)。

圖6顯示了對HA22、HA22-8X和HA22-LR-8M的免疫應答的比較。小鼠中針對免疫毒素的IgG抗體產生如圖6A所示。小鼠中免疫毒素所誘導的IgM應答如圖6B所示。免疫血清的滴定如圖6C所示。HA22免疫的小鼠血清中針對每種突變體分子的抗體的量如圖6D所示。對HA22或HA22-LR-8M免疫毒素的繼發性免疫應答如圖6E所示。先前存在的產抗體的B細胞對HA22或HA22-LR-8M免疫毒素的免疫應答如圖6F所示。

發明詳述

1.引言

假單胞菌外毒素A(“PE”)被研究用作嵌合分子(例如免疫毒素)的毒性部分已經超過15年。該研究體現在多種PE突變形式的開發中,這些PE突變形式保留細胞毒性活性,同時降低或去除該分子的非特異性毒性。這些突變體中的大部分是被截短的,從而提高其腫瘤透性。某些突變體在截短之外還進行了修飾,例如修飾羧基末端殘基或消除由弗林蛋白酶切割殘基279和280的需要,從而增加其細胞毒性。利用PE突變形式的免疫毒素已經在人類臨床試驗中展示出相當大的治療希望。

然而,利用基于PE的免疫毒素治療實體瘤特別受限,這是因為在首次給藥后會產生針對免疫毒素的中和抗體。對于大多數方案,在需要第二次免疫毒素給藥之前就會產生這些抗體,并因此使進一步使用免疫毒素對之前暴露過的患者中的實體瘤沒有效果。

本發明所基于的研究證實,患者對基于PE的免疫毒素的主要免疫應答是對于免疫毒素的PE部分的免疫應答。這種理解表明,降低用于免疫毒素的PE分子的抗原性會降低免疫毒素的總體抗原性并增加其效力。本發明所基于的研究還證實,PE具有7個主要表位,其可被再分為總共13個亞表位。

令人意想不到的是,我們發現,對于PE的13個亞表位中的10個,可以通過突變PE的單個氨基酸殘基來降低或消除表位或亞表位的抗原性。當然,由于PE含有多個抗原表位,所以單個突變無法消除整個PE分子的抗原性。然而,本發明的每個個體突變都能降低個體表位或亞表位的抗原性。因此,所述個體突變能降低總體PE分子和用突變的PE制備的任何免疫毒素的抗原性。

本發明所基于的研究還證實,可將不同的突變組合來降低分子的總體抗原性,同時保留PE分子的細胞毒性。在制備的PE分子中,突變了不同表位或亞表位的8個氨基酸殘基,包括殘基D406和Q592。用具有突變的PE制備免疫毒素,并測定它們的細胞毒性。為了便于比較,在用PE制備的每個免疫毒素中都使用相同的靶向部分(高親和力的抗CD22抗體)。此外,為了便于比較,PE的PE38形式被用作進行了取代的PE。根據在過去的15年中我們對于很多基于PE的免疫毒素的經驗,即,PE的所有細胞毒性形式共享相同的對靶細胞的細胞毒性機制(延長因子2的ADP核糖化)以及所用的PE其它變體僅為具有特定截短的相同氨基酸序列(或者,對于PE4E,是結構域Ia中的4處突變,而不是截短),用PE38獲得的結果預期能直接應用于PE的其它形式(例如,分別稱為PE25、PE40、PE38、PE37、PE35、PE4E、PE38QQR以及PE38KDEL的示例性形式)。

預期的是,作為免疫毒素,當用已經制備的突變的PE以及根據本發明的教導進行修飾的其它突變的PE制備免疫毒素時,會在體內引起較小的免疫應答,并且還預期的是,較低的中和抗體滴度會反映出這種減小的免疫應答。中和抗體的產生在免疫毒素的臨床前測試和免疫毒素臨床試驗過程中常規進行測定,并且可以通過這些標準測定來測量利用本發明的PE制備的免疫毒素所誘導的抗體滴度。

本領域技術人員應當理解,本發明的PE將與之前已知的已用于制備免疫毒素并在臨床試驗中測試的突變的PE一樣有用。然而,應當注意到,利用本發明的PE制備的免疫毒素預期表現出的抗原性低于利用目前已有的PE分子制備的免疫毒素,并且因此預期在患者中引起的免疫應答小于目前已有的基于PE的免疫毒素。

可以將本發明的突變方便地引入已進行過修飾的PE(例如,分別稱為PE25、PE40、PE38、PE37、PE35、PE4E、PE38QQR以及PE38KDEL的示例性形式),從而降低其抗原性以及降低患者對含有它們的免疫毒素的免疫原性應答。因此,本發明提供增加基于PE的免疫偶聯物(例如,目前處于臨床試驗中的多種基于PE的免疫毒素)的治療功效的重要的新手段。

應當注意到,本發明的改進的PE在PE分子的具體位置處包含分子突變。根據慣例,在本領域中,PE及其變體中的位置是參考天然PE分子的613個氨基酸序列(SEQ?ID?NO:1)中的對應位置進行編號。本文遵照該慣例,從而允許迅速在PE變體之間進行比較并且便于理解本發明的PE中突變了哪些殘基。例如,在大部分臨床上有用的PE形式中,分子的結構域Ia(氨基酸1-252)是缺失的,從而降低非特異性結合,這在下文中會更詳細地討論。結構域Ia缺失的PE僅具有361個殘基。盡管如此,本文中涉及的D406是指存在于天然PE序列的第406位的天冬氨酸,無論從該殘基所在的特定PE的氨基末端計數時,該殘基的編號是什么;同時,R590是指存在于天然PE的第590位的賴氨酸,以此類推。天然PE的氨基酸序列(SEQ?ID?NO:1)是本領域公知的,并且描述于,例如,美國專利第5,602,095號中。

如下文所示,在優選實施方案中,在本發明的組合物和方法中,天然PE序列中在本文所指出的位置處存在的氨基酸殘基被取代為選自丙氨酸、甘氨酸或絲氨酸的氨基酸。丙氨酸、甘氨酸和絲氨酸特別優選作為取代殘基,其中丙氨酸和絲氨酸是特別優選的。

為了發揮作用,殘基取代后的PE必須保留細胞毒性活性。為了測試進過改變來降低抗原性的PE對細胞毒性的保留,制備了多種示例性免疫毒素。在第一系列研究中,制備了19種免疫毒素。為了允許進行比較,這些免疫毒素中的每一種都使用相同的靶向部分并且以稱為PE38的相同的PE截短形式作為起點。在19種免疫毒素的每一種中,PE38中的不同殘基被替換為鑒定為能降低具體PE表位或亞表位的抗原性的突變。然后,將這19種突變的PE38的細胞毒性活性與用相同靶向部分和未改變的PE38制備的免疫毒素(為了簡便將其稱為“野生型”免疫毒素)進行比較。具有降低的抗原性的PE變體描述于,例如,PCT申請第PCT/US06/28986號(公開號為WO?2007/016150)中。

本發明所基于的研究揭示出哪些氨基酸的取代能將所指定的多于兩種單克隆抗體(“MAb”)與同一表位的結合降低至少5倍,更優選至少10倍以及最優選至少20倍。預期的是,MAb與表位結合的降低與該表位的抗原性丟失相關,并因此與含有該突變的PE分子的抗原性丟失相關。

在WO?2007/016150中,發現能將MAb與相同表位的結合降低至少5倍的突變是E282、E285、P290、R313、N314、P319、D324、E327、E331、Q332、D403、R412、R427、E431、R432、R458、D461、R467、R490、R505、R513、E522、R538、E548、R551、R576、K590以及L597。發現能將MAb與相同表位的結合降低至少10倍的PE突變位置為E282、E285、P290、R313、N314、D324、E327、E331、Q332、D403、R412、E431、R427、R432、R458、D461、R467、R490、R505、R513、E522、R538、E548、R576以及R590。發現能將MAb與相同表位的結合降低至少20倍的PE突變位置為N314、D324、E327、E331、Q332、D403、R432、R467、R490、R505、R513、R538、R551、K590以及L597。

在本發明人的實驗室之前進行的研究中(報道于PCT申請PCT/US2004/039617(國際公布號WO?2005/052006)),我們發現,將PE殘基R490突變為丙氨酸能使所獲得的PE分子作為免疫毒素的毒素部分時的細胞毒性翻倍。令人意想不到的是,本發明所基于的研究表明,PE第490位的精氨酸的突變也能消除與PE表位5的抗體結合。因此,將PE第490位的精氨酸取代為上文討論的殘基之一預期能降低PE分子的抗原性?;乖て詰氖?,將PE第490位的精氨酸的取代與能降低與PE的除表位5之外的表位或亞表位之一的結合的一個或多個殘基取代進行組合會進一步降低分子的抗原性和針對用所得PE制備的免疫毒素的PE部分的抗體的產生?;棺⒁獾?,未發現能降低與亞表位2a的結合的突變。

WO?2005/052006還證實,可以將PE第490位的精氨酸突變為甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸或異亮氨酸。增加的細胞毒性活性和降低的免疫原性是單獨的現象。因此,并非所有預期能導致細胞毒性活性增加的突變也預期能導致免疫原性降低。既能增加細胞毒性活性又能降低免疫原性的突變(例如R490突變為甘氨酸或更優選突變為丙氨酸)是特別理想的。

令人意想不到的是,我們發現,可以將某些其它殘基,即D406和Q592,進行突變,并也可以產生能用于制備具有高的細胞毒性和降低的抗原性的免疫毒素的PE。

本領域技術人員應當明白,多種類型的分子可作為將含有本發明的突變的PE靶向于本領域技術人員希望殺傷或抑制的細胞的基礎。從上文討論中可明顯看出,抗體是一種特別優選的靶向劑類型。

在另一優選實施方案中,嵌合分子的靶向部分(portion)或部分(moiety)是細胞因子,其可用于使毒素靶向于過表達該細胞因子受體的細胞。例如,已知IL-13受體在某些癌癥(例如神經膠質瘤)的細胞外部大量過表達,并且已知IL-13受體能作為某些癌癥(例如腎細胞癌、卡波濟氏肉瘤以及霍奇金病)上的自分泌生長因子。參見,例如,WO?01/34645、WO?03/039600和美國專利第6,518,061號。IL-13或IL-13的不同突變體以及環狀排列形式可用于使細胞毒素(例如含有一個或多個本發明突變的PE分子)靶向于表達IL-13受體的細胞。此外,包括環狀排列形式在內的不同IL-13形式可用于使具有突變的PE分子靶向于肺中表達IL-13受體的細胞,從而降低或消除疾病狀態(例如哮喘和過敏性鼻炎)的癥狀,以及靶向于體內其它位置的細胞,從而降低或消除特應性皮炎和血吸蟲病中肝纖維化的癥狀,正如國際公布WO?01/34645中所討論的。

除細胞因子之外,很多其它配體是本領域已知的并可用于使本發明的PE分子靶向于靶細胞。例如,轉鐵蛋白已被用作使毒素靶向于表達轉鐵蛋白受體的細胞的手段。相似地,可以靶向于疾病或疾病狀態中所涉及的細胞,只要在與疾病或疾病狀態相關的細胞中存在特異性表達或優先表達的細胞表面抗原,例如HIV感染的細胞中的gp120,參與移植物抗宿主病的T細胞上的CD25或在癌癥細胞上表達的各種表面分子,例如CEA、CD30或CD33。

2.具有降低的抗原性的改進的PE分子

天然假單胞菌外毒素A(“PE”)是由銅綠假單胞菌分泌的活性極高的單體蛋白(分子量66kD),其能抑制真核細胞中的蛋白合成。天然PE序列如美國專利第5,602,095號中的SEQ?ID?NO:1所示,通過引用將該專利并入本文。其作用機制是延長因子2(EF-2)的ADP核糖化失活。該外毒素含有3個共同作用導致細胞毒性的結構域。結構域Ia(氨基酸1-252)介導細胞結合。結構域II(氨基酸253-364)負責轉移至細胞溶質中,結構域III(氨基酸400-613)介導延長因子2的ADP核糖化。結構域Ib(氨基酸365-399)的功能仍不明確,但是結構域Ib中的一大部分(即氨基酸365-380)可以缺失而不會喪失細胞毒性。參見Siegall,et?al.,J?Biol?Chem?264:14256-61(1989)。

本文所用的術語“假單胞菌外毒素”和“PE”通常是指已從天然蛋白經過修飾從而降低或消除非特異性毒性的PE。很多這樣的修飾是本領域已知的,并且包括,但不限于,去除結構域Ia、結構域Ib、II和III中的不同氨基酸缺失,單氨基酸取代以及羧基末端處添加一個或多個序列,例如KDEL(SEQ?ID?NO:17)和REDL(SEQ?ID?NO:18)。參見,Siegall,et?al.,J.Biol.Chem.264:14256-14261(1989)。PE的細胞毒性片段包括需要或不需要靶細胞中的后續蛋白水解或其它加工而具有細胞毒性的片段(例如,作為蛋白或蛋白前體)。PE的細胞毒性片段包括PE40、PE38及其變體PE38QQR和PE38KDEL(其中在PE38的C末端添加了序列KDEL(SEQ?ID?NO:17))以及PE35,正如下文所述。在優選實施方案中,PE的細胞毒性片段保留天然PE的至少約20%、優選至少約40%、更優選約50%、更優選75%、更優選至少約90%以及更優選95%的細胞毒性。在特別優選的實施方案中,細胞毒性片段至少具有天然PE的細胞毒性,以及優選具有更高的細胞毒性。

在優選實施方案中,已對PE進行修飾來降低或消除非特異性細胞結合,通常是通過將結構域Ia缺失,正如美國專利4,892,827中的教導,但是也可以例如通過突變結構域Ia的某些殘基來實現這點。例如,美國專利5,512,658公開了表現出大大減弱的非特異性細胞毒性的突變的PE,其中結構域Ia是存在的,但結構域Ia中第57位、第246位、第247位以及第249位的堿性殘基被取代為酸性殘基(谷氨酸或“E”))。這種PE突變形式有時被稱為“PE4E”。

PE40是本領域之前已有描述的PE的截短衍生物。參見,Pai,et?al.,Proc.Nat′lAcad.Sci.USA?88:3358-62(1991);和Kondo,et?al.,Biol.Chem.263:9470-9475(1988)。PE35是PE的35kD的羧基末端片段,其中氨基酸殘基1-279是缺失的,并且分子的起始為第280位的met,然后是天然PE的氨基酸281-364和381-613。PE35和PE40公開于,例如,美國專利5,602,095和4,892,827。另一衍生物是PE25,其含有來自結構域II的11個殘基的片段和全部的結構域III。在一些實施方案中,PE的衍生物僅含有結構域III。

在一些優選的實施方案中,利用細胞毒性片段PE38。PE38含有PE的遷移和ADP核糖化結構域,但不含有細胞結合部分(Hwang,J.et?al.,Cell,48:129-136(1987))。PE38是截短的PE前體蛋白,其由氨基酸253-364和381-613組成,PE38通過細胞內的加工而被活化為細胞毒性形式(參見例如,美國專利第5,608,039號以及Pastan?et?al.,Biochim.Biophys.Acta?1333:C1-C6(1997))。因此,PE38的序列是本領域已知的,技術人員也可以通過從已知的PE序列減去所述殘基來確定PE38的序列。本領域技術人員應當明白,由于遺傳密碼的簡并性,PE38、其變體(例如PE38KDEL)以及本文討論的其它PE衍生物的氨基酸序列可以由多種核酸序列編碼,可以將所述多種核酸序列中的任意一種進行表達來得到所需的多肽。

如上文所述,可以將部分或全部的結構域Ib缺失,并將剩余部分通過連接物或直接通過肽鍵連接起來??梢越峁褂騃I的氨基部分的一部分缺失。并且,C末端可以含有天然序列的殘基609-613(REDLK;SEQ?ID?NO:19),或可以含有發現能保持構建體轉移至細胞溶質中的能力的變異,例如KDEL(SEQ?ID?NO:17)或REDL(SEQ?ID?NO:18)以及這些序列的重復。參見,例如,美國專利5,854,044、5,821,238和5,602,095以及WO?99/51643。雖然在優選實施方案中,PE是PE4E、PE40或PE38,但是在本發明的免疫毒素中可以使用非特異性細胞毒性被消除或降低至對非靶標細胞不會產生顯著毒性的水平的任何PE形式,只要其仍能在靶細胞中進行遷移和EF-2核糖化。

在優選實施方案中,將PE分子進行修飾,使通常存在于結構域III中D406和Q592位置的氨基酸殘基被取代為丙氨酸、甘氨酸、絲氨酸或谷氨酰胺。D406和Q592位置處的取代可以與結構域III中R432、R467、R490、R513、E548和K590位置處的丙氨酸、甘氨酸、絲氨酸或谷氨酰胺取代組合。在一些實施方案中,此外,至少一個選自D403、R412、R427、E431、R458、D461、R505、E522、R538、R551、R576和L597位置處的氨基酸殘基被取代為丙氨酸、甘氨酸、絲氨酸或谷氨酰胺。結構域III中的氨基酸殘基位置D406、R432、R467、R490、R513、E548、K590和Q592的取代優選與全部結構域Ia(例如,殘基1-252)的去除和大部分結構域II(例如殘基251-273和285-394)的去除組合。在一些實施方案中,PE具有SEQ?ID?NO:2的氨基酸序列。在一些實施方案中,PE具有SEQID?NO:3的氨基酸序列。

A.保守型修飾的PE變體

應當理解,天然PE和上文討論的變體的序列可以具有保守型取代并保留細胞毒性能力,以及理想地,具有低于天然PE序列的抗原性。在優選實施方案中,PE的修飾的變體或其細胞毒性片段與目的PE(例如PE38)在氨基酸水平上具有至少80%序列相似性、優選至少85%序列相似性、更優選至少90%序列相似性以及最優選至少95%序列相似性。

術語“保守型修飾的變體”適用于氨基酸和核酸序列。對于具體核酸序列,保守型修飾的變體是指編碼相同的或本質上相同的氨基酸序列的核酸序列,或如果核酸不編碼氨基酸序列,保守型修飾的變體是指本質上相同的核酸序列。由于遺傳密碼的簡并性,多種功能相同的核酸能編碼任意給定的多肽。例如,密碼子GCA、GCC、GCG和GCU都編碼丙氨酸。因此,在每個由密碼子指定為丙氨酸的位置,可以將密碼子改變為任意所述對應的密碼子,而不會改變所編碼的多肽。此類核酸變異為“沉默變異”,其是保守型修飾變異中的一類。本文中的每個編碼多肽的核酸序列也描述了所述核酸的每種可能的沉默變異。本領域技術人員應當認識到,可以改動核酸中的每個密碼子(除了AUG之外,AUG通常是蛋氨酸的唯一密碼子)而得到功能上相同的分子。因此,編碼多肽的核酸的每種沉默變異隱含在每個所述序列中。

對于氨基酸序列,本領域技術人員應當認識到,如果對核酸、肽、多肽或蛋白序列的個體取代、缺失或添加改變、添加或缺失了所編碼的序列中的單個氨基酸或少部分的氨基酸,導致一個氨基酸被化學上相似的另一個氨基酸所取代,則這種改變為“保守型修飾的變體”。

B.PE的細胞毒性或抗原性的測定

可以通過本領域技術人員公知的測定來檢測本發明所用的假單胞菌外毒素是否有所需的細胞毒性水平。因此,可以容易地測定PE的細胞毒性片段和所述片段的保守型修飾的變體的細胞毒性??梢醞ü玖煊蜆姆椒ㄍ輩舛ǘ嘀趾蜓E分子的細胞毒性。例如,可以測定候選分子亞組的細胞毒性。陽性反應的候選分子亞組可以被繼續細分,并重新測定,直至鑒定出所需的細胞毒性片段。該方法允許快速篩選大量的PE細胞毒性片段或保守型變體??梢醞ü玖煊蛞閻娜魏畏椒ú舛乖?,包括WO?2007/016150中所教導的測定。

例如,與未取代的PE(例如PE38)相比,優選的PE變體表現出等同的或更強的細胞毒性。雖然較強的細胞毒性通常比較弱的細胞毒性更優選,但是在實踐中,這些PE突變形式的降低的細胞毒性預期至少在一定程度上能被PE和用其制備的免疫毒素的降低的抗原性所彌補。因此,即使這些PE具有降低的細胞毒性,它們也是有用的。此外,與當制成免疫毒素時能表現出增加的細胞毒性的PE突變相結合時,PE的細胞毒性可以更接近于野生型PE的細胞毒性。此外,由于PE是非常強的細胞毒素,所以即使PE的突變形式具有的毒性明顯低于天然毒素,其作為毒性部分時仍保留相當強的效力。

3.嵌合分子

本發明的免疫偶聯物包括但不限于,PE分子與抗體或其它靶向劑為共價連接的分子。具體靶向劑的選擇取決于所要靶向的具體細胞。在擁有本文提供的PE分子的情況下,本領域技術人員能容易地構建多種含有功能等同核酸的克隆,例如序列不同但編碼相同PE和抗體序列的核酸。因此,本發明提供編碼抗體和PE偶聯物的核酸及其融合蛋白的核酸。

a.免疫偶聯物的制備

i.非重組方法

在本發明的非重組實施方案中,利用本領域技術人員任何已知的手段,將靶向分子(例如抗體)與本發明的PE分子連接。共價和非共價連接手段都可以用于本發明的PE分子。

連接PE分子與抗體或其它靶向分子(“TM”)的步驟會根據TM的化學結構而不同。多肽通常含有多個官能團,例如,羧酸(COOH)、自由胺基(-NH2)或巰基(-SH),這些官能團都可用于與抗體上的合適的官能團進行反應,例如,從而實現PE分子的結合。

或者,將抗體或其它TM衍生化,從而暴露或連接其它反應性官能團。衍生化可以包括連接多種連接分子中的任意一種,例如可購自Pierce?Chemical?Company,Rockford?Illinois的連接分子。

本文所用的“連接物”是用于連接TM與PE分子的分子。連接物能與抗體和效應分子都形成共價鍵。合適的連接物是本領域技術人員公知的,并且包括,但不限于,直鏈或支鏈碳連接物、雜環碳連接物或肽連接物。當抗體和效應分子是多肽時,連接物可以通過組成型氨基酸的側基與組成型氨基酸連接(例如,通過與半胱氨酸的二硫鍵)。然而,在優選實施方案中,連接物與末端氨基酸的α碳氨基和羧基連接。

在某些情況下,希望當免疫偶聯物到達其靶點時,PE分子能夠與TM分離。因此,在這些情況下,免疫偶聯物會包含能夠在靶點的附近斷裂的連接。免疫偶聯物在靶細胞內部或靶點的附近所遇到的酶促活性或條件可以促進連接物的斷裂,從而將PE分子從TM釋放出來。當靶點是腫瘤時,可以使用在腫瘤部位存在的條件下(例如當暴露于腫瘤相關的酶或酸性pH時)能斷裂的連接物。

ii.重組方法

可以通過任何合適的方法制備本發明的核酸序列,包括,例如合適的序列的克隆或直接化學合成,例如以下的方法:Narang,et?al.,Meth.Enzymol?68:90-99(1979)的磷酸三酯法;Brown,et?al.,Meth.Enzymol.68:109-151(1979)的磷酸二酯法;Beaucage,et?al.,Tetra.Lett.22:1859-1862(1981)的二乙基亞磷酰胺法;Beaucage?&?Caruthers,Tetra.Letts.22(20):1859-1862(1981)所描述的固相亞磷酰胺三酯法,例如,利用Needham-VanDevanter,et?al.,Nucl.Acids?Res.12:6159-6168(1984)中所述的自動化合成儀;以及美國專利第號4,458,066的固相載體法?;Ш銑剎チ垂押塑賬???梢醞ü牖ゲ剮蛄械腦詠換蟯ü肈NA聚合酶并使用單鏈作為模板的聚合而將單鏈轉變為雙鏈DNA。本領域技術人員應當認識到,盡管DNA的化學合成限于約100個堿基的序列,但是可以通過將較短的序列連接起來而獲得較長的序列。

在優選實施方案中,通過克隆技術制備本發明的核酸序列。合適的克隆和測序技術的實例以及能指導本領域技術人員完成多種克隆實踐的說明可見于Sambrook,et?al,MOLECULAR?CLONING:A?LABORATORY?MANUAL(分子克?。菏笛槭植?(第二版),Vols.1-3,Cold?Spring?Harbor?Laboratory(1989)),Berger?and?Kimmel(eds.),GUIDE?TO?MOLECULAR?CLONING?TECHNIQUES(分子克隆技術指南),Academic?Press,Inc.,San?Diego?CA(1987)),或Ausubel,et?al.(eds.),CURRENT?PROTOCOLS?IN?MOLECULAR?BIOLOGY(現代分子生物學技術),Greene?Publishing?and?Wiley-Interscience,NY(1987)。從生物試劑和實驗設備的制造商獲得的產品信息也能提供有用的信息。所述制造商包括SIGMA?chemical?company(Saint?Louis,MO),R&D?systems(Minneapolis,MN),Pharmacia?LKB?Biotechnology(Piscataway,NJ),CLONTECH?Laboratories,Inc.(Palo?Alto,CA),Chem?Genes?Corp.,Aldrich?Chemical?Company(Milwaukee,WI),Glen?Research,Inc.,GIBCO?BRL?Life?Technologies,Inc.(Gaithersberg,MD),Fluka?Chemica-Biochemika?Analytika(Fluka?Chemie?AG,Buchs,Switzerland),Invitrogen,San?Diego,CA,and?Applied?Biosystems(Foster?City,CA),以及本領域技術人員已知的很多其它商業來源。

也可以修飾編碼天然PE的核酸來形成本發明的免疫偶聯物。利用定點誘變的修飾是本領域公知的??梢醞ü逋夥椒ɡ┰霰嗦隤E的核酸。擴增方法包括聚合酶鏈式反應(PCR)、連接酶鏈式反應(LCR)、基于轉錄的擴增系統(TAS)、自給式序列復制系統(3SR)。多種克隆方法、宿主細胞以及體外擴增方法是本領域技術人員公知的。

在優選實施方案中,通過將編碼選定抗體或其它TM的cDNA插入包含編碼本發明的所需PE的cDNA的載體中來制備免疫偶聯物。所進行的插入使得靶向劑(為了便于討論,本文中的討論假設靶向劑是Fv,但也可以替換為其它具有相同效果的靶向劑)和PE是框內讀碼,即形成含有功能性Fv區和功能性PE區的一條連續多肽。在特別優選的實施方案中,編碼本發明的PE的cDNA與scFv連接,使得毒素位于scFv的羧基末端。在其它優選的實施方案中,編碼本發明的PE的cDNA與scFv連接,使得毒素位于scFv的氨基末端。

當編碼本發明的PE、抗體或免疫偶聯物的核酸被分離和克隆后,技術人員可以在重組工程化細胞中表達所需蛋白,所述細胞例如細菌、植物、酵母、昆蟲和哺乳動物細胞。預期的是,本領域技術人員能夠了解多種可用于表達蛋白的表達系統,包括大腸桿菌、其它細菌宿主、酵母以及各種高等真核生物細胞,例如COS、CHO、HeLa和骨髓瘤細胞系。對于已知能用于在原核細胞或真核細胞中表達蛋白的各種方法將不再詳細描述。簡而言之,通常,通過將DNA或cDNA與啟動子(可以是組成型或誘導型)可操作地連接然后合并入表達盒,能實現編碼本發明的分離的蛋白的天然核酸或合成核酸的表達。盒可以適于在原核細胞或真核細胞中復制和整合。典型的表達盒含有轉錄和翻譯終止子、起始序列以及可用于調節編碼蛋白的DNA的表達的啟動子。為了獲得克隆基因的高水平表達,構建至少含有用于指導轉錄的強啟動子、用于翻譯起始的核糖體結合位點以及轉錄/翻譯終止子的表達盒是可取的。對于大腸桿菌,表達盒包括啟動子(例如T7、trp、lac或λ啟動子)、核糖體結合位點并優選包括轉錄終止信號。對于真核細胞,控制序列可以包括啟動子并優選包括來源于免疫球蛋白基因、SV40、巨細胞病毒的增強子以及聚腺苷酸化序列,以及可以包括剪接供體和受體序列??梢醞ü椒ń痙⒚韉暮兇頻窖《ǖ乃拗饗赴?,例如對于大腸桿菌可使用氯化鈣轉化或電穿孔,對于哺乳動物細胞可使用磷酸鈣處理、電穿孔或脂質體轉染??梢醞ü兄興?例如amp、gpt、neo和hyg基因)賦予的抗生素抗性來選擇被盒轉化的細胞。

本領域技術人員應當認識到,可以對編碼本發明多肽(即,PE或用本發明的PE制備的免疫偶聯物)的核酸進行修飾,而不會降低其生物活性??梢越心承┬奘衛幢閿詘邢蚍腫涌寺?、表達或并入融合蛋白。這些修飾是本領域技術人員公知的,并且包括,例如,終止密碼子、添加于氨基末端用來提供起始位點的蛋氨酸、置于任一末端用來產生便于定位的限制性位點的其它氨基酸或有助于純化步驟的其它氨基酸(例如聚組氨酸)。

除重組方法之外,還可以利用標準肽合成法來構建全部的或部分的本發明免疫偶聯物和PE??梢醞ü韻鹿淌迪殖ざ壬儆讜?0個氨基酸的本發明多肽的固相合成:將序列的C末端氨基酸連接于不溶性載體,然后依次添加序列中剩余氨基酸。固相合成技術描述于Barany?&?Merrifield,THE?PEPTIDES:ANALYSIS,SYNTHESIS,BIOLOGY.VOL.2:SPECIAL?METHODS?IN?PEPTIDE?SYNTHESIS,PART?A.pp.3-284;Merrifield,et?al.J.Am.Chem.Soc.85:2149-2156(1963),和Stewart,et?al,SOLID?PHASE?PEPTIDE?SYNTHESIS,第二版,Pierce?Chem.Co.,Rockford,III.(1984)??梢醞ü隙唐蔚陌被汪然┒說乃鹺俠春銑山銑こざ鵲牡鞍?。通過活化羧基末端(例如,通過利用偶聯劑N,N′-二環己基碳二亞胺)來形成肽鍵的方法是本領域技術人員已知的。

iii.純化

表達后,可以按照本領域的標準方法純化本發明的重組免疫偶聯物和PE,包括硫酸銨沉淀、親和柱、柱層析等(通??剎渭?,R.Scopes,PROTEIN?PURIFICATION,Springer-Verlag,N.Y.(1982))。具有至少約90-95%同質性的基本上純的組合物是優選的,并且對于制藥用途,98-99%或更高的同質性是最優選的。當部分純化或純化至所需同質性后,如果要用于治療,多肽應當基本上不含內毒素。

從諸如大腸桿菌的細菌表達單鏈抗體和/或再折疊為合適的活性形式(包括單鏈抗體)的方法已有描述并且是公知的,并且可用于本發明的抗體。參見,Buchner,et?al.,Anal.Biochem.205:263-270(1992);Pluckthun,Biotechnology?9:545(1991);Huse,et?al.,Science?246:1275(1989)和Ward,et?al.,Nature?341:544(1989),通過引用將它們全部并入本文。

通常,將來自大腸桿菌或其它細菌的功能性異源蛋白從包含體分離,并需要利用強的變性劑進行增溶,以及需要后續的再折疊。在增溶步驟中,正如本領域所公知的,必須存在還原劑來分開二硫鍵。示例性的還原劑緩沖液是:0.1M?Tris?pH8、6M胍、2mM?EDTA、0.3M?DTE(二硫赤蘚糖醇)。二硫鍵的再氧化可以在還原和氧化形式的低分子量硫醇試劑的存在下發生,其描述于Saxena,et?al.,Biochemistry?9:5015-5021(1970)(通過引用并入本文),并且特別描述于Buchner,et?al.,同上。

通常通過將變性和還原的蛋白稀釋到(例如,100倍)再折疊緩沖液中實現復性。示例性的緩沖液是0.1M?Tris?pH8.0、0.5M?L-精氨酸、8mM氧化型谷胱甘肽以及2mM?EDTA。

作為雙鏈抗體純化過程的改動,分別溶解和還原重鏈和輕鏈區,然后在再折疊溶液中組合。按照下述摩爾比混合所述兩種蛋白可獲得優選的產率:一種蛋白超過另一種蛋白不大于5倍摩爾數。氧化還原往返完成后,向再折疊溶液中添加過量的氧化型谷胱甘肽或其它氧化低分子量化合物是可取的。

b.靶向部分

i.靶細胞表面標志物

嵌合分子的靶向組分可以針對細胞表面標志物。細胞表面標志物可以是蛋白或糖類。細胞表面抗原可以是腫瘤相關抗原。優選地,細胞表面標志物是在癌癥細胞或其它異常增殖細胞上專有表達、優先表達或以較高的臨床相關水平表達。作為嵌合分子靶標的細胞表面抗原是本領域公知的,并且總結于,例如Mufson,Front?Biosci(2006)11:337-43;Frankel,Clin?Cancer?Res(2000)6:326-334和Kreitman,AAPS?Journal(2006)8(3):E532-E551。

示例性細胞表面標志物靶標包括細胞表面受體??衫帽痙⒚韉畝舅匕邢虻南赴礱媸芴灝?,但不限于,轉鐵蛋白受體、EGF受體、CD19、CD22、CD25、CD21、CD79、間皮蛋白和鈣粘蛋白??山邪邢蠣庖叨舅刂瘟頻鈉淥赴礱嬋乖?,但不限于,MUC1、MAGE、PRAME、CEA、PSA、PSMA、GM-CSFR、CD56、HER2/neu、erbB-2、CD5、CD7。其它細胞表面腫瘤相關抗原是已知的,并且可用作靶標。

在多種不同類型的癌癥細胞上可見的抗原靶標,包括,但不限于,成神經細胞瘤、腸癌、直腸癌、結腸癌、家族性腺瘤性息肉病癌、遺傳性非息肉性結直腸癌、食道癌、唇癌、喉癌、下咽癌、舌癌、唾液腺癌、胃癌、腺癌、甲狀腺髓樣癌、甲狀腺乳頭狀癌、甲狀腺濾泡癌、甲狀腺未分化癌、腎癌、腎實質癌、卵巢癌、宮頸癌、子宮體癌、子宮內膜癌、絨毛膜癌、胰腺癌、前列腺癌、睪丸癌、乳腺癌、膀胱癌、黑色素瘤、腦瘤、成膠質細胞瘤、星形細胞瘤、腦膜瘤、成神經管細胞瘤、外周神經外胚層腫瘤、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、急性淋巴性白血病(ALL)、慢性淋巴性白血病(CLL)、急性骨髓性白血病(AML)、慢性骨髓性白血病(CML)、成體T細胞白血病淋巴瘤、肝細胞癌、膽囊癌、支氣管癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、多發性骨髓瘤、基底細胞癌、畸胎瘤、成視網膜細胞瘤、脈絡膜黑色素瘤、精原細胞瘤、橫紋肌肉瘤、顱咽管瘤、骨肉瘤、軟骨肉瘤、肌肉瘤、脂肪肉瘤、纖維肉瘤、尤文肉瘤以及漿細胞瘤。

在一些實施方案中,細胞表面標志物是間皮蛋白??梢醞ü邢蚣淦さ鞍桌唇檔突蛞種粕?、擴散和/或進展的示例性癌癥包括卵巢癌、間皮瘤、非小細胞肺癌、肺腺癌、輸卵管癌、頭頸癌、宮頸癌和胰腺癌。

在一些實施方案中,細胞表面標志物是CD22??梢醞ü邢駽D22來降低或抑制生長、擴散和/或進展的示例性癌癥包括毛細胞白血病、慢性淋巴性白血病(CLL)、前淋巴細胞白血病(PLL)、非霍奇金淋巴瘤、小淋巴細胞淋巴瘤(SLL)和急性淋巴性白血病(ALL)。

在一些實施方案中,細胞表面標志物是CD25??梢醞ü邢駽D25來降低或抑制生長、擴散和/或進展的示例性癌癥包括白血病和淋巴瘤、包括毛細胞白血病以及霍奇金淋巴瘤。

在一些實施方案中,細胞表面標志物是糖類,例如Lewis?Y抗原??梢醞ü邢騆ewis?Y抗原來降低或抑制生長、擴散和/或進展的示例性癌癥包括膀胱癌、乳腺癌、卵巢癌、結直腸癌、食道癌、胃癌、肺癌和胰腺癌。

在一些實施方案中,細胞表面標志物是CD33??梢醞ü邢駽D33來降低或抑制生長、擴散和/或進展的示例性癌癥包括急性骨髓性白血病(AML)、慢性骨髓單核細胞性白血病(CML)以及骨髓增生性疾病。

ii.抗體靶向部分

在優選實施方案中,靶向部分是抗體,優選特異性地結合細胞上的表面標志物的抗體。因此,在一些實施方案中,嵌合分子是免疫毒素。

在另一優選實施方案中,靶向部分是抗體片段,優選特異性地結合細胞上的表面標志物的抗體片段。優選抗體片段是單鏈Fv。在本文中,描述了基于細胞毒素的免疫毒素的構建和表征,其中細胞毒素與scFv融合。毒素或細胞毒性片段可以融合的其它優選抗體片段包括Fab、Fab′、F(ab′)2、Fv片段、螺旋穩定抗體、雙鏈抗體、二硫鍵穩定抗體以及單結構域抗體(例如,駱駝抗體)。

細胞毒素與抗體或抗體片段的融合可以是與抗體或抗體片段的N末端或C末端的融合。通常利用重組DNA技術完成所述融合。

可用于免疫毒素的多種抗體是本領域已知的,并且可用于本發明的組合物和方法。針對腫瘤抗原的示例性抗體包括,但不限于,針對轉鐵蛋白受體的抗體(例如,HB21及其變體)、針對CD22的抗體(例如,RFB4及其變體)、針對CD25的抗體(例如,抗Tac及其變體)、針對間皮蛋白的抗體(例如,SS1、SSP1、HN1、HN2、MN及它們的變體)和針對Lewis?Y抗原的抗體(例如,B3及其變體)。

可包含在免疫毒素中以及可用于本發明的抗體描述于,例如,美國專利第5,242,824號(抗轉鐵蛋白受體)、第5,846,535號(抗CD25)、第5,889,157號(抗Lewis?Y)、第5,981,726號(抗Lewis?Y)、第5,990,296號(抗Lewis?Y)、第7,081,518號(抗間皮蛋白)、第7,355,012號(抗CD22和抗CD25)、第7,368,110號(抗間皮蛋白)、第7,470,775號(抗CD30)、第7,521,054號(抗CD25)、第7,541,034號(抗CD22)、美國專利公布第2007/0189962號(抗CD22),并且總結于,例如Frankel,Clin?Cancer?Res(2000)6:326-334和Kreitman,AAPS?Journal(2006)8(3):E532-E551。

可成功用于對抗癌癥和急性移植物抗宿主病的多種免疫毒素也是本領域已知的,并且可用于本發明的組合物和方法,即,通過將細胞毒素替換為本發明的改進的PE。示例性的免疫毒素可見于,例如,www.clinicaltrials.gov,并且包括,但不限于,LMB-2(抗Tac(Fv)-PE38)、BL22和HA22(RFB4(dsFv)-PE38)、SS1P(SS1(dsFv)-PE38)、HB21-PE40??捎玫鈉淥庖叨舅孛枋鲇諫銜牧諧齙淖ɡ捅疚鬧?,并且總結于,例如,Frankel,Clin?Cancer?Res(2000)6:326-334和Kreitman,AAPS?Journal(2006)8(3):E532-E551。

在一些實施方案中,抗體是HA22的Fv部分。HA22是最近開發的改進形式的BL22。在HA22中,抗體可變區重鏈(“VH”)的CDR3中的殘基SSY被突變為THW。與其母體抗體RFB4相比,HA22對不同CD22陽性細胞系的細胞毒性活性增加5-10倍,并且對來自CLL和HCL患者的細胞的細胞毒性強于其母體抗體RFB4高達50倍(Salvatore,G.,et?al.,Clin?Cancer?Res,8(4):995-1002(2002);也可以參見共有申請PCT/US02/30316(國際公布WO?03/027135)。

SS1P已被證實能特異性地殺傷表達間皮蛋白的細胞系,并且能使小鼠中表達間皮蛋白的腫瘤消退(Hassan,R.et?al.,Clin?Cancer?Res?8:3520-6(2002);Onda.,et?al.,Cancer?Res?61:5070-7(2001))?;謖廡┭芯亢褪識鵲陌踩允?,2個針對SS1P的I期試驗正在國家癌癥研究院在表達間皮蛋白的癌癥患者中進行(Chowdhury,P.S.et?al.,Proc?Natl?Acad?Sci?USA?95:669-74(1998);Hassan,R.et?al.,Proc?Am?Soc?Clin?Oncol?21:29a(2002))。此外,靶向于間皮蛋白的其它治療處于臨床前開發中(Thomas,A.M.et?al.,J?Exp?Med?200:297-306(2004))。HN1和HN2是人抗間皮蛋白抗體,其描述于,例如,Feng,et?al.,Mol?Cancer?Ther(2009)8(5):1113-8。

HA22-LR和SS1P-LR是HA22和SS1P免疫毒素的溶酶體抗性變體,其中去除了溶酶體蛋白酶的斷裂簇。這些變體描述于,例如,Weldon,et?al.,Blood,(2009)113(16):3792-800和WO?2009/032954。

iii.非抗體靶向部分

在另一優選實施方案中,靶向部分是特異性地結合細胞表面上的受體的配體。所述配體可以是能結合細胞表面標志物的任何配體。優選配體是VEGF、Fas、TRAIL、細胞因子(例如,IL-2、IL-15、IL-4、IL-13)、淋巴因子、激素、生長因子(例如,TGFa、神經生長因子、表皮生長因子)。

4.藥物組合物和給藥

一方面,本發明提供藥物組合物或藥物,其包含至少一種本發明的嵌合蛋白,優選靶向毒素,以及任選地包含藥學可接受的載體??梢越鲆┪鎰楹銜锘蛞┪鋦杌頰呃粗瘟萍膊∽刺?,包括,但不限于,惡性疾病或癌癥。

a.制劑

可通過標準技術、利用一種或多種生理學可接受的載體或賦形劑來配制可用于本發明的藥物組合物或藥物。合適的藥物載體在本文中描述,并且描述于Remington:The?Science?and?Practice?of?Pharmacy(雷明頓:制藥科學和實踐),第21版,University?of?the?Sciences?in?Philadelphia,Lippencott?Williams?&?Wilkins(2005)。本發明的嵌合蛋白可配制用于任何合適的途徑的給藥,包括吸入給藥、局部給藥、經鼻給藥、口服給藥、胃腸外給藥或直腸給藥。因此,可以通過下述方式給予藥物組合物:利用注射器或其它裝置進行皮內、皮下(subdermal)、靜脈內、肌肉內、鼻內、吸入、腦內、氣管內、動脈內、腹膜內、膀胱內、胸膜內、冠脈內、皮下(subcutaneously)或腫瘤內注射。也可考慮經皮給藥,如吸入或氣溶膠給藥。片劑和膠囊可以口服給藥、直腸給藥或陰道給藥。

用于給藥的組合物通常包含溶解于藥學可接受的載體、優選水性載體中的嵌合蛋白、優選靶向毒素的溶液??梢允褂枚嘀炙栽靨?,例如,緩沖鹽溶液等。這些溶液是無菌的,并通常不含不希望的物質??梢醞ü9婀拿鵓際踅廡┳楹銜錈鵓?。組合物可以含有接近生理條件所需的藥學可接受的輔助物質,例如pH調節和緩沖劑、毒性調節劑等,例如,乙酸鈉、氯化鈉、氯化鉀、氯化鈣、乳酸鈉等。這些制劑中融合蛋白的濃度可以變化很大,并且可以主要基于液體量、粘性、體重等、根據選定的具體給藥模式和患者需要進行選擇。

本發明的靶向毒素組合物適于胃腸外給藥,包括靜脈內給藥或體腔內給藥。

本發明的嵌合蛋白、優選靶向毒素可以配制用于通過注射的胃腸外給藥,例如通過彈丸注射或連續輸注??梢砸緣ノ患亮啃問教峁┳⑸溆彌萍?,例如,提供在安瓿或多劑量容器中,并添加防腐劑。注射用組合物優選為水性等滲溶液或懸液,并且優選用脂肪乳劑或懸液制備的栓劑。組合物可以是經過滅菌的和/或含有佐劑,例如防腐劑、穩定劑、潤濕劑或乳化劑、溶解促進劑、用于調節滲透壓的鹽和/或緩沖液?;蛘?,活性成分可以是粉末形式,用于在使用前用合適的介質(例如,無菌、無熱原的水)復原。此外,它們還可以含有其它有治療價值的物質。按照分別的常規混合、制?;虬環椒ㄖ票缸楹銜?,并且含有約0.1-75%、優選約1-50%的活性成分。

可以將本發明的靶向毒素組合物的控釋胃腸外制劑制為植入物、油性注射液或顆粒體系。關于蛋白遞送體系的廣泛總結,可參見,Banga,A.J.,THERAPEUTIC?PEPTIDES?AND?PROTEINS:FORMULATION,PROCESSING,AND?DELIVERY?SYSTEMS,Technomic?Publishing?Company,Inc.,Lancaster,PA,(1995),通過引用將其并入本文??帕L逑蛋ㄎ⑶?、微粒、微膠囊、納米膠囊、納米球以及納米顆粒。微膠囊含有治療性蛋白作為中央核。在微球中,治療劑分散于整個顆粒。小于約1μm的顆粒、微球以及微膠囊通常分別稱為納米顆粒,納米球以及納米膠囊。毛細血管的直徑為約5μm,因此只有納米顆粒能進行靜脈內給藥。微粒的直徑通常為約100μm,并用于皮下或肌肉內給藥。參見,例如,Kreuter?J.,COLLOIDAL?DRUG?DELIVERY?SYSTEMS,J.Kreuter,ed.,Marcel?Dekker,Inc.,New?York,NY,pp.219-342(1994);和Tice?&?Tabibi,TREATISE?ON?CONTROLLED?DRUG?DELIVERY,A.Kydonieus,ed.,Marcel?Dekker,Inc.New?York,NY,pp.315-339(1992),通過引用將它們并入本文。

聚合物可用于本發明靶向毒素組合物的離子控釋。各種用于受控藥物遞送的可降解的和不可降解的聚合基質是本領域已知的(Langer?R.,Accounts?Chem.Res.,26:537-542(1993))。例如,嵌段共聚物泊洛沙姆407在低溫下為粘性但可流動的液體,但是在體溫下形成半固體凝膠。已經證實其可作為重組白介素-2和脲酶的配制和持續遞送的有效介質(Johnston?et?al.,Pharm.Res.,9:425-434(1992);和Pec?et?al.,J.Parent.Sci.Tech.,44(2):58-65(1990))?;蛘?,羥磷灰石已被用作蛋白控釋的微載體(Ijntema?et?al.,Iht.J.Pharm.,112:215-224(1994))。另一方面,脂質體用于脂質封裝藥物的控釋和藥物靶向(Betageri?et?al.,LIPOSOME?DRUG?DELIVERY?SYSTEMS,Technomic?Publishing?Co.,Inc.,Lancaster,PA(1993))。用于治療性蛋白的受控遞送的多種其它體系是已知的。參見,例如,美國專利第5,055,303號、第5,188,837號、第4,235,871號、第4,501,728號、第4,837,028號、第4,957,735號、第5,019,369號、第5,055,303號、第5,514,670號、第5,413,797號、第5,268,164號、第5,004,697號、第4,902,505號、第5,506,206號、第5,271,961號、第5,254,342號、第5,534,496號,通過引用將每篇專利文獻并入本文。

適于經皮施用的制劑包括有效量的本發明組合物以及載體。優選的載體包括可吸收的藥理學可接受的溶劑,以輔助透過宿主皮膚。例如,經皮裝置為繃帶的形式,其包括背襯元件、容納組合物并任選地容納載體的貯器、任選地用于將組合物以受控的和預定的速率在長的時間段遞送至宿主皮膚的速率控制屏障、以及將裝置固定于皮膚的結構。也可以使用基質經皮制劑。

適于局部施用于例如皮膚和眼部的制劑優選為本領域公知的水性溶液、軟膏、霜或凝膠。這些制劑可以含有增溶劑、穩定劑、張力增強劑、緩沖液和防腐劑。

對于口服給藥,藥物組合物或藥物可以采取的形式,例如,通過常規手段用藥學可接受的賦形劑制備的片劑或膠囊。優選為片劑和明膠膠囊,其包含活性成分(即,本發明組合物),以及(a)稀釋劑或填充劑,例如乳糖、葡萄糖、蔗糖、甘露醇、山梨醇、纖維素(例如乙基纖維素、微晶纖維素)、甘氨酸、果膠、聚丙烯酸酯和/或磷酸氫鈣、硫酸鈣;(b)潤滑劑,例如二氧化硅、滑石、硬脂酸、硬脂酸的鎂鹽或鈣鹽、金屬硬脂酸鹽、膠體二氧化硅、氫化植物油、玉米淀粉、苯甲酸鈉、乙酸鈉和/或聚乙二醇;對于片劑還可以包含(c)粘合劑,例如硅酸鎂鋁、淀粉糊、明膠、黃蓍膠、甲基纖維素、羧甲基纖維素鈉、聚乙烯吡咯烷酮和/或羥丙基甲基纖維素;如果需要還可以包含(d)崩解劑,例如淀粉(例如馬鈴薯淀粉或淀粉鈉)、乙醇酸鹽、瓊脂、藻酸或其鈉鹽、或泡騰混合物;(e)潤濕劑,例如月桂基硫酸鈉;和/或(f)吸收劑、著色劑、調味劑和甜味劑。

可以按照本領域已知的方法將片劑包薄膜衣或腸溶衣。用于口服給藥的液體制劑可以采取的形式,例如溶液、糖漿或懸液,或可以將它們制為干燥產品,用于在使用前用水或其它合適的介質復原??梢醞ü9媸侄斡靡┭Э山郵艿奶砑蛹林票剛廡┮禾逯萍?,所述添加劑,例如,懸浮劑,例如山梨醇糖漿、纖維素衍生物或氫化食用脂肪;乳化劑,例如卵磷脂或阿拉伯膠;非水性介質,例如杏仁油、油性酯、乙醇或分餾植物油;以及防腐劑,例如,對羥苯甲酸甲酯或對羥苯甲酸丙酯或山梨酸。所述制劑還可以視情況含有緩沖鹽、調味劑、著色劑和/或甜味劑。如果需要,可以合適地配制用于口服給藥的制劑,用來提供活性組合物的控釋。

對于吸入給藥,可以以氣溶膠噴霧呈現形式、利用合適的推進劑從加壓包或霧化器方便地遞送嵌合蛋白、優選抗體和/或靶向毒素,所述推進劑例如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、1,1,1,2-四氟乙烷、二氧化碳或其它合適的氣體。對于加壓氣溶膠,可以提供閥來遞送規定量從而確定劑量單位。例如,用于吸入器或吹入器的明膠膠囊和芯可以配制為含有嵌合蛋白、優選抗體和/或靶向毒素和合適的粉末基料(例如,乳糖或淀粉)的粉末混合物。

還可以將組合物配制于直腸組合物中(例如,栓劑或保留灌腸劑),所述直腸組合物例如含有常規栓劑基料,例如,可可油或其它甘油酯。

此外,可以將組合物配制為貯存制劑。此類長效制劑可以通過植入進行給藥(例如,皮下或肌肉內)或通過肌肉內注射進行給藥。因此,例如,組合物可以用合適的聚合材料或疏水材料(例如,作為可接受的油中的乳劑)或離子交換樹脂配制或作為微溶衍生物,例如,作為微溶性鹽。

如果需要,可以將組合物提供在包裝或分配裝置中,所述包裝或分配裝置可以含有一個或多個含有活性成分的單位劑量形式。例如,所述包裝可以包括金屬或塑料薄膜,例如,泡罩包裝。所述包裝或分配裝置可以配有給藥說明。

b.劑量

在本發明一個實施方案中,將藥物組合物或藥物以治療有效劑量給予患者,用來預防、治療或控制疾病或惡性疾病狀態,例如癌癥。給予患者的藥物組合物或藥物的量足以在患者中引起有效的治療或診斷反應。有效的治療或診斷反應是至少部分地阻止或延緩疾病或惡性疾病狀態的癥狀或并發癥的反應。足夠實現這一點的量被定義為“治療有效劑量”。

所給予的嵌合蛋白、優選靶向毒素或組合物的劑量取決于溫血動物(哺乳動物)的種類、體重、年齡、個體狀態、待治療的區域的表面積和給藥形式。劑量的大小也由具體化合物在具體個體中的給藥所伴隨的任何副反應的存在、性質以及程度來決定。用于給予約50-70kg的哺乳動物的單位劑量可以含有約5-500mg的活性成分。通常,本發明化合物的劑量是足以實現所需效應的劑量。

可以從測量嵌合蛋白、優選靶向毒素在個體機體中的積累計算出最佳給藥安排。通常,劑量為1ng-1000mg/公斤體重,并且可以每天、每周、每月或每年給藥一次或多次。本領域技術人員能容易地確定最佳劑量、給藥方法和重復率。根據本領域已知的制定方案和本文的公開內容,本領域技術人員能確定將嵌合蛋白、優選靶向毒素給予人類的最佳給藥方案。

組合物的最佳劑量、毒性以及治療功效可以根據個體組合物的相對效力而不同,并且可以通過細胞培養物或實驗動物中的標準藥物程序來確定,例如,通過測定LD50(致50%的群體死亡的劑量)和ED50(在50%的群體中治療有效的劑量)。毒性和治療效果的劑量比為治療指數,并且可以表示為LD50/ED50的比值。表現出大的治療指數的組合物是優選的。雖然可以使用表現出毒性副作用的組合物,但是應當注意設計出能將這些組合物靶向于受累組織部位的遞送系統,從而將對正常細胞的可能損傷最小化,并從而降低副作用。

從例如動物研究(例如嚙齒動物和猴)獲得的數據可用于建立用于人的劑量范圍。本發明化合物的劑量優選位于包括ED50同時具有很小毒性或沒有毒性的循環濃度的范圍內。劑量可以根據所用劑量形式和給藥途徑在該范圍內變化。對于在本發明方法中使用的任何組合物,可以最初從細胞培養物測定估計治療有效劑量??梢栽詼錟P橢薪⒛艽锏槳ㄔ諳赴嘌鎦脅舛ǖ腎C50(能實現癥狀的最大抑制的50%的受試化合物濃度)的血漿循環濃度范圍的劑量。這些信息可用于更準確地確定人中的可用劑量??梢岳繽ü咝б合嗌?HPLC)來測量血漿水平。通常,對于一般個體來說,嵌合蛋白、優選靶向毒素的劑量當量為約1ng/kg-100mg/kg。

用于靜脈內給藥的本發明的典型靶向毒素組合物為約0.1-10mg/患者/天??梢允褂么?.1直至約100mg/患者/天的劑量。制備可給予的組合物的實際方法對于本領域技術人員是已知的或顯而易見的,并且詳細描述于出版物中,例如Remington:The?Science?and?Practice?of?Pharmacy(雷明頓:制藥科學與實踐),第21版,University?of?the?Sciences?in?Philadelphia,Lippencott?Williams?&?Wilkins(2005)。

本文所述的組合物的示例性劑量,包括每千克個體或樣品重量為毫克或微克級別量的組合物,例如,約1微克/千克-約500毫克/千克、約100微克/千克-約5毫克/千克或約1微克/千克-約50微克/千克?;褂Φ崩斫?,組合物的合適劑量取決于組合物在待實現的所需效應中的功效。當需要將這些組合物中的一種或多種給予哺乳動物時,醫師、獸醫或研究人員可以,例如,首先開立相對低的劑量,然后增加劑量直至獲得合適的反應。此外,應當理解,任何具體哺乳動物個體的具體劑量水平取決于很多因素,包括所用具體組合物的活性,個體的年齡、體重、一般健康狀況、性別以及飲食,給藥時間,給藥途徑,排泄率,任何藥物聯用以及待調節的表達或活性的程度。

在本發明的一個實施方案中,包含本發明嵌合蛋白、優選靶向毒素的藥物組合物或藥物的給藥為,例如,日劑量為約1mg化合物/kg個體體重(1mg/kg)至約1g/kg。在另一實施方案中,劑量為約5mg/kg-約500mg/kg。在另一實施方案中,劑量為約10mg/kg-約250mg/kg。在另一實施方案中,劑量為約25mg/kg-約150mg/kg。優選劑量為約10mg/kg。日劑量可以每天給藥一次或分成亞劑量并分多次給藥,例如,每天2次、3次或4次。然而,本領域技術人員應當理解,可以以不同量和以不同次數給予本文所述的組合物。本領域技術人員還應當理解,某些因素可以影響有效治療個體所需的劑量和時間安排,包括但不限于疾病或惡性疾病狀態的嚴重程度、先前的治療、個體的一般健康狀況和/或年齡以及所存在的其它疾病。此外,用治療有效量的組合物治療個體可以包括單次治療,或優選地,可以包括一系列治療。

ABT-263的示例性劑量為按照需要每天劑量100-500mg。ABT-263可以給予的濃度為約25mg/mL-約50mg/mL。ABT-737的示例性劑量為每天劑量約50-200mg/kg,例如,約100mg/kg。

在成功治療后,使個體進行保持性治療來防止所治療的疾病或惡性疾病狀態的復發是可取的。

c.給藥

可以給予本發明的組合物用于治療性處理。在治療性應用中,給予疾病或惡性疾病狀態(例如癌癥)患者的組合物的量足以治愈或至少部分地阻止疾病及其并發癥。足以實現這一點的量被定義為“治療有效劑量”。該用途的有效量取決于疾病的嚴重程度和患者健康的一般狀態?;銜锏撓行Я渴悄芴峁┲⒆吹鬧鞴芻航饣蛺峁┯梢絞蚱淥兇手實墓鄄煸憊鄄斕降目凸劭杉ǖ母納頻牧?。

有效量的確定是本領域技術人員容易做到的,特別是借鑒了本文提供的詳細公開內容。通常,通過以下方式確定免疫偶聯物的有效量(efficacious?amount)或有效量(effective?amount):首先給予低劑量或少量的免疫偶聯物,然后逐步增加給藥劑量(dose)或劑量(dosage),并且視需要添加第二藥物或第三藥物直至在所治療的個體中觀察到理想的效果,同時毒性副作用最小或沒有毒性副作用。

組合物的單次或多次給藥取決于所需的以及患者能耐受的劑量和頻率。在任何情況下,組合物應當能提供足夠量的本發明蛋白,從而有效治療患者。優選地,一次給予劑量,但是也可以周期性施用,直至達到治療效果或副作用警告需要中斷治療。通常,劑量能足以治療或改善疾病的癥狀或指征,而不會對患者產生不可接受的毒性。

為了達到理想的治療效果,可以以治療有效的日劑量在多天中給予組合物。因此,為了治療個體中本文所述的疾病或惡性疾病狀態,組合物的治療有效給藥可能需要周期性給藥(例如,每天),持續3天至兩周或更長。通常,至少連續3天給予組合物,通常至少5天連續給藥,更通常至少10天連續給藥,并且有時20、30、40或更多天連續給藥。盡管連續日劑量是達到治療有效劑量的優選途徑,但是,即使化合物或組合物不是每天給藥,也能實現治療有益效果,只要給藥的重復足夠頻繁而能在個體中保持組合物的治療有效濃度。例如,可以隔一天、每三天給予組合物,或者如果采用更高的劑量范圍并且能被個體耐受,可以每周給予組合物。

在本發明靶向毒素的各種使用中,包括可以通過融合蛋白的毒性作來消除由特定人類細胞引起的多種疾病狀態。例如,目標細胞可能表達細胞表面標志物,例如間皮蛋白、CD22或CD25。

5.抑制腫瘤生長的方法

本發明組合物可以以多種方式發揮作用。例如,本發明的PE分子(例如,作為嵌合分子的一部分)可用于(i)在攜帶一種或多種表面標志物的細胞中誘導凋亡;(ii)抑制攜帶一種或多種細胞表面標志物的細胞的不希望的生長、過度增殖或存活;(iii)治療疾病狀態,例如癌癥;以及(iv)為患有由存在的攜帶一種或多種細胞表面標志物的細胞引起的疾病的哺乳動物提供治療。

表達一種或多種細胞表面標志物、優選細胞表面受體(例如,本文所述的)的任何細胞或腫瘤細胞可用于實施本發明的方法。表達表面標志物的優選的細胞或腫瘤細胞選自成神經細胞瘤、腸癌、直腸癌、結腸癌、家族性腺瘤性息肉病癌、遺傳性非息肉性結直腸癌、食道癌、唇癌、喉癌、下咽癌、舌癌、唾液腺癌、胃癌、腺癌、甲狀腺髓樣癌、甲狀腺乳頭狀癌、甲狀腺濾泡癌、甲狀腺未分化癌、腎癌、腎實質癌、卵巢癌、宮頸癌、子宮體癌、子宮內膜癌、絨毛膜癌、胰腺癌、前列腺癌、睪丸癌、乳腺癌、膀胱癌、黑色素瘤、腦瘤、成膠質細胞瘤、星形細胞瘤、腦膜瘤、成神經管細胞瘤、外周神經外胚層腫瘤、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、急性淋巴性白血病(ALL)、慢性淋巴性白血病(CLL)、急性骨髓性白血病(AML)、慢性骨髓性白血病(CML)、成體T細胞白血病淋巴瘤、肝細胞癌、膽囊癌、支氣管癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、多發性骨髓瘤、基底細胞癌、畸胎瘤、成視網膜細胞瘤、脈絡膜黑色素瘤、精原細胞瘤、橫紋肌肉瘤、顱咽管瘤、骨肉瘤、軟骨肉瘤、肌肉瘤、脂肪肉瘤、纖維肉瘤、尤文肉瘤以及漿細胞瘤。

可以體外或體內實施本發明的方法。當涉及細胞時,應當理解,該術語還包括細胞群體,即,多于一個細胞。

利用組合物在攜帶一種或多種細胞表面標志物的細胞中誘導凋亡

凋亡在多細胞器官的發育和平衡中起到關鍵作用?!暗蟯觥筆侵賦絳蛐韻赴勞?,并且其表現為某些細胞學特征,例如膜起泡、染色質濃縮和片段化、凋亡小體形成和陽性“TUNEL”(末端脫氧核糖核酸轉移酶介導的UTP缺口末端標記法)染色模式。凋亡過程中的后續步驟是質膜降解,從而使凋亡細胞能暴露于各種染料(例如,碘化丙啶)。

凋亡可以由多個獨立信號通路誘導,所述多個獨立信號通路匯聚于由數個死亡受體及其配體之間的多種相互作用組成的最終效應機制,所述死亡受體及其配體屬于腫瘤壞死因子(TNF)受體/配體超家族。表征最清楚的死亡受體是CD95(“Fas”)、TNFR1(p55)、死亡受體3(DR3或Apo3/TRAMO)、DR4和DR5(apo2-TRAIL-R2)。凋亡的最終效應機制是一系列指定為半胱天冬酶的蛋白酶的活化。這些半胱天冬酶的活化導致一系列重要細胞蛋白的切割和細胞死亡。

本發明提供在表達一種或多種細胞表面標志物的細胞中誘導凋亡的方法。一方面,在細胞中誘導凋亡的方法包括以下步驟:使表達一種或多種細胞表面標志物(例如細胞表面受體)的細胞暴露于本發明的PE(例如,作為本文所述的嵌合分子的一部分)或與本發明的PE接觸。通常,將細胞暴露于有效量的免疫偶聯物或使細胞與有效量的免疫偶聯物接觸,其中所述接觸導致誘導凋亡。

在本發明的另一方面中,提供了誘導表達一種或多種細胞表面標志物的腫瘤細胞經歷凋亡的方法,其包括以下步驟:給予個體本發明的PE(例如,作為嵌合分子的一部分)。

利用組合物來抑制攜帶一種或多種細胞表面標志物的細胞的生長、過度 增殖或存活

本發明的一個目的是提供利用本發明組合物治療癌癥的改進的治療策略。在本發明的一方面中,提供抑制細胞的不希望的生長、過度增殖或存活中至少之一的方法。該方法包括以下步驟:使表達表面標志物的細胞與有效量的本發明的PE(例如,作為本文所述的嵌合分子的一部分)接觸,其中接觸步驟導致抑制細胞的不希望的生長、過度增殖或存活中的至少一種。在一個實施方案中,該方法包括以下步驟:確定細胞是否表達一種或多種細胞表面標志物,例如,細胞表面受體。通常,使細胞暴露于有效量的免疫偶聯物或使細胞與有效量的免疫偶聯物接觸,其中所述接觸導致抑制細胞的不希望的生長、過度增殖或存活中的至少一種。

因此,在本發明的一方面中,提供抑制攜帶一種或多種細胞表面標志物的細胞群體的生長的方法。在優選實施方案中,該方法包括以下步驟:(a)使細胞群體與嵌合蛋白接觸,所述嵌合蛋白包含(i)特異性地結合至少一種細胞表面標志物的靶向部分和(ii)本發明的PE,例如,D406和Q592被取代為Gly、Ala或Ser。從而使細胞群體的生長受到抑制。

很多腫瘤形成轉移。因此,在本發明的另一方面中,本發明組合物被用于預防轉移形成。該方法包括以下步驟:將本發明組合物給予腫瘤細胞,其中所述給藥實現轉移的預防。在優選實施方案中,所述組合物包含靶向毒素,所述靶向毒素包含針對細胞表面抗原的抗體和本發明的PE。通常,使細胞暴露于有效量的免疫偶聯物或使細胞與有效量的免疫偶聯物接觸,其中所述接觸實現轉移的預防。

利用組合物治療癌癥

可以在體外和體內實施本發明的方法。因此,在本發明的另一方面中,提供治療患有癌癥的個體的方法。該方法包括以下步驟:給予被診斷患有癌癥的個體治療有效量的本文所述的改進的PE分子,其中癌癥的特征為表達一種或多種細胞表面標志物的細胞的不希望的生長或增殖,并且其中所述給藥步驟實現對個體的治療。

在優選實施方案中,組合物包含具有本發明的改進的PE或其變體的免疫毒素。通常,使細胞暴露于有效量的免疫毒素或使細胞與有效量的免疫毒素接觸,其中所述接觸實現對個體的治療。

本發明組合物可用于治療本文所述的任何癌癥,例如,進行免疫毒素治療的那些癌癥。在本發明的一個實施方案中,包含本發明的PE的免疫毒素被用于治療患有表達一種或多種細胞表面標志物的肺惡性腫瘤的個體。肺惡性腫瘤包括,但不限于,支氣管癌[鱗狀細胞癌、未分化小細胞癌、未分化大細胞癌、腺癌]、肺泡[細支氣管]癌、支氣管腺癌、肉瘤、淋巴瘤、軟骨錯構瘤、間皮瘤、SCLC以及NSCLC。

在本發明的另一實施方案中,本發明組合物被用于治療患有表達一種或多種細胞表面標志物的肉瘤的個體。肉瘤包括,但不限于,惡性腫瘤,例如血管肉瘤、纖維肉瘤、橫紋肌肉瘤、脂肪肉瘤、粘液瘤、橫紋肌瘤、纖維瘤、脂肪瘤和畸胎瘤。

在本發明的另一實施方案中,包含本發明的PE的免疫毒素被用于治療患有表達一種或多種細胞表面標志物的胃腸惡性腫瘤的個體。胃腸惡性腫瘤包括,但不限于,食道的惡性腫瘤[鱗狀細胞癌、腺癌、平滑肌肉瘤、淋巴瘤]、胃的惡性腫瘤[癌、淋巴瘤、平滑肌肉瘤]、胰腺的惡性腫瘤[胰管腺癌、胰島瘤、胰高血糖素瘤、促胃液素瘤、類癌瘤、血管活性腸肽瘤]、小腸的惡性腫瘤[腺癌、淋巴瘤、類癌瘤、卡波濟氏肉瘤、平滑肌瘤、血管瘤、脂肪瘤、纖維神經瘤、纖維瘤]以及大腸的惡性腫瘤[腺癌、管狀腺瘤、絨毛狀腺瘤、錯構瘤、平滑肌瘤]。

在本發明的一個實施方案中,包含本發明的PE的免疫毒素被用于治療患有表達一種或多種細胞表面標志物的泌尿生殖道惡性腫瘤的個體。泌尿生殖道惡性腫瘤包括,但不限于,腎的惡性腫瘤[腺癌、維耳姆斯氏瘤(腎母細胞瘤)、淋巴瘤、白血病、腎細胞癌]、膀胱和尿道的惡性腫瘤[鱗狀細胞癌、移行細胞癌、腺癌]、前列腺的惡性腫瘤[腺癌、肉瘤]以及睪丸的惡性腫瘤[精原細胞瘤、畸胎瘤、胚胎性癌、畸胎癌、絨毛膜癌、肉瘤、萊氏細胞瘤、纖維瘤、纖維腺瘤、腺瘤樣瘤、脂肪瘤]。

在本發明的另一實施方案中,包含本發明的PE的免疫毒素被用于治療患有表達一種或多種細胞表面標志物的肝惡性腫瘤的個體。肝惡性腫瘤包括,但不限于,肝細胞癌、膽管細胞型肝癌、肝母細胞癌、血管肉瘤、肝細胞腺瘤以及血管瘤。

在本發明的一個實施方案中,包含本發明的PE的免疫毒素被用于治療患有表達一種或多種細胞表面標志物的皮膚惡性腫瘤的個體。皮膚惡性腫瘤包括,但不限于,惡性黑色素瘤、基底細胞癌、鱗狀細胞癌、卡波濟氏肉瘤、痣、發育不良的痣、脂肪瘤、血管瘤、皮膚纖維瘤、瘢痕瘤以及銀屑病。

在本發明的一個實施方案中,包含本發明的PE的免疫毒素被用于治療患有表達一種或多種細胞表面標志物的婦科惡性腫瘤的個體。婦科惡性腫瘤包括,但不限于,子宮的惡性腫瘤[子宮內膜癌]、宮頸的惡性腫瘤[宮頸癌、侵入前宮頸非典型增生]、卵巢的惡性腫瘤[卵巢癌(漿液性囊腺癌、粘液性囊腺癌、子宮內膜樣癌、透明細胞腺癌、未分類癌)、卵泡膜細胞瘤、支持間質細胞瘤、無性細胞瘤、惡性畸胎瘤和其它生殖細胞腫瘤]、外陰的惡性腫瘤[鱗狀細胞癌、上皮內癌、腺癌、纖維肉瘤、黑色素瘤]、陰道的惡性腫瘤[透明細胞腺癌、鱗狀細胞癌、葡萄狀肉瘤(胚胎性橫紋肌肉瘤肉瘤)以及輸卵管的惡性腫瘤[癌]。

在本發明的另一實施方案中,包含本發明的PE的免疫毒素被用于治療患有表達一種或多種細胞表面標志物的骨惡性腫瘤的個體。骨惡性腫瘤包括,但不限于,成骨肉瘤[骨肉瘤]、纖維肉瘤、惡性纖維組織細胞瘤、軟骨肉瘤、尤文肉瘤、惡性淋巴瘤[網狀細胞肉瘤]、多發性骨髓瘤、惡性巨細胞瘤、脊索瘤、骨軟骨瘤[骨軟骨性外生骨疣]、良性軟骨瘤、成軟骨細胞瘤、軟骨粘液樣纖維瘤、骨樣骨瘤以及巨細胞瘤。

在本發明的一個實施方案中,包含本發明的PE的免疫毒素被用于治療患有表達一種或多種細胞表面標志物的神經系統惡性腫瘤的個體。神經系統惡性腫瘤包括、但不限于,顱骨的惡性腫瘤[骨瘤、血管瘤、肉芽腫瘤、黃瘤、骨佩吉特病]、腦膜的惡性腫瘤[腦膜瘤、腦膜肉瘤、神經膠質瘤病]、腦的惡性腫瘤[星形細胞瘤、成神經管細胞瘤、神經膠質瘤、室管膜瘤、胚組織瘤(松果體瘤)、多形性成膠質細胞瘤、少突神經膠質瘤、許旺氏細胞瘤、成視網膜細胞瘤、先天性腫瘤]以及脊髓的惡性腫瘤[纖維神經瘤、腦膜瘤、神經膠質瘤、肉瘤]。

在本發明的一個實施方案中,包含本發明的PE的免疫毒素被用于治療患有表達一種或多種細胞表面標志物的血液學惡性腫瘤的個體。血液學惡性腫瘤包括,但不限于,血液惡性腫瘤[骨髓性白血病(急性和慢性)、毛細胞白血病、急性淋巴細胞白血病、慢性淋巴細胞白血病、骨髓增生性疾病、多發性骨髓瘤、骨髓化生不良綜合癥]、霍奇金病以及非霍奇金淋巴瘤(惡性淋巴瘤)。

在本發明的一個實施方案中,包含本發明的PE的免疫毒素被用于治療患有間皮蛋白-CA125結合相互作用所介導的惡性腫瘤的個體。生長、擴散和/或發展至少部分地由CA125/間皮蛋白結合介導的示例性惡性腫瘤包括卵巢癌、間皮瘤、非小細胞肺癌、肺腺癌和胰腺癌。

在本發明的一個實施方案中,包含本發明的PE的免疫毒素被用于治療患有表達一種或多種細胞表面標志物的腎上腺的惡性腫瘤的個體。腎上腺的惡性腫瘤包括,但不限于,成神經細胞瘤。

治療惡性腫瘤的方法可以任選地包括以下步驟中的一個或多個:從個體獲得組織或液體的生物樣品;篩選生物樣品是否表達一種或多種細胞表面標志物、優選細胞表面受體,例如通過使生物樣品與針對表面標志物、優選細胞表面受體的抗體接觸;或者篩選生物樣品是否表達表面標志物多核苷酸、優選細胞表面受體多核苷酸,例如通過檢測表面標志物mRNA、優選細胞表面受體mRNA??梢允褂帽玖煊蛞閻謀曜技際趵詞迪終獾?,例如,Western印跡、Northern印?;騊CR。

利用組合物來治療發展出由攜帶一種或多種細胞表面標志物的細胞引起 的疾病的個體

還提供了發展出由優先攜帶或過表達一種或多種細胞表面標志物的細胞的存在或異常增殖引起的疾病的哺乳動物的治療方法。在優選實施方案中,該方法包括以下步驟:將嵌合蛋白給予所述哺乳動物,所述嵌合蛋白包含(i)特異性地結合所述細胞上的至少一種表面標志物的靶向部分和(ii)本發明的PE,例如,D406和Q592A取代為Gly、Ala或Ser。

在優選實施方案中,嵌合蛋白包含具有本發明的PE或其變體的免疫毒素。通常,將細胞暴露于有效量的免疫毒素或使細胞與有效量的免疫毒素接觸,其中所述接觸實現對個體的治療。

在另一實施方案中,本發明提供利用本發明PE分子來體外或離體清除靶細胞。例如,包含本發明PE分子的嵌合分子可被用于從培養物的細胞群體中清除目標細胞。因此,例如,可以通過使培養物與本文所述的針對目的細胞表面標志物的嵌合分子接觸來從患有表達目標細胞表面標志物(例如,CD22、CD25、間皮蛋白、Lewis?Y)的癌癥的患者培養的細胞中清除癌癥細胞。

在某些情況下,靶細胞可以包含在生物樣品中。本文所用的“生物樣品”是含有靶細胞和非靶細胞的生物組織或液體的樣品。所述樣品包括,但不限于,來自活組織檢查、血液以及血細胞(例如,白細胞)的組織。生物樣品通?;褡遠嘞赴婧松?,優選哺乳動物,例如大鼠、小鼠、牛、狗、豚鼠或兔,以及更優選靈長類,例如獼猴、黑猩猩或人。最優選地,樣品來自于人。

6.監測疾病的方法

本發明提供檢測患有或易患可用靶向毒素治療的癌癥(例如,具有細胞表面標志物的癌癥)的患者中腫瘤生長的抑制的方法。所述方法尤其可用于監測利用本發明的PE分子(例如,作為本文所述的嵌合分子的一部分)給予患者治療的過程。所述方法可用于監測對有癥狀患者的治療性處理和對無癥狀患者的預防性處理。

所述監測方法需要在給予本發明PE分子(例如,作為嵌合分子的一部分)的劑量之前確定患者中腫瘤負荷的基線值,以及將其與治療后的腫瘤負荷的值或未接受治療的患者中的腫瘤負荷的值進行比較。

腫瘤負荷值的顯著降低(即,大于相同樣品的重復測量中實驗誤差的通常界限(表示為這些測量的平均值的一倍標準差))指示陽性治療結果(即,本發明PE分子的給藥(例如,作為嵌合分子的一部分)阻斷腫瘤生長和/或轉移的發展)。

在其它方法中,測定對照群體或正常群體的腫瘤負荷的對照值(即,平均值和標準差)(例如,負荷=0)。通常,對照群體的個體未接受事先治療。然后,將給予本發明PE分子(例如,作為嵌合分子的一部分)之后的患者中腫瘤負荷的測量值與對照值進行比較。相對于對照值,腫瘤負荷的顯著降低(例如,大于平均值的一倍標準差)指示陽性治療結果。缺乏顯著降低或增加增加指示陰性治療結果。

在其它方法中,測定已經歷接受本發明PE分子(例如,作為本文所述的嵌合分子的一部分)的方案治療的個體的對照群體中腫瘤負荷的對照值(例如,平均值和標準差)。將患者中腫瘤負荷的測量值與對照值進行比較。如果患者的測量值與對照值不是顯著不同(例如,大于一倍標準差),則可以中斷治療。如果患者的腫瘤負荷水平顯著高于對照值,則試劑的繼續給藥是合理的。

在其它方法中,監測目前未接受治療、但已經歷事先治療過程的患者的腫瘤負荷來確定是否需要恢復治療??梢越頰咧兄琢齦漢傻牟飭恐滌脛盎竦玫氖孿戎瘟乒毯蟮幕頰咧械鬧琢齦漢芍到斜冉?。相對于之前的測量,腫瘤負荷的顯著增加(即,大于相同樣品的重復測量中誤差的通常界限)指示可以恢復治療?;蛘?,可以將患者中的測量值與經歷治療過程后的患者群體中測定的對照值(平均值+標準差)進行比較?;蛘?,可以將患者中的測量值與仍無疾病癥狀的預防性處理的患者群體或表現出疾病特征減輕的治療性處理的患者群體中的對照值進行比較。在所有這些情況下,相對于對照水平,腫瘤負荷的增加(即,大于一倍標準差)指示患者應當恢復治療。

用于分析的組織樣品通常為來自患者的血液、血漿、血清、粘液、生物活檢組織、腫瘤、腹水或腦脊液??梢苑治鲅返牧魴緯杉O???梢岳帽玖煊蛞閻娜魏畏椒ɡ醇觳飭魴緯苫蛑琢齦漢?,例如,由有資質的病理學專家對生物活檢進行肉眼觀察或通過其它可視化技術,例如放射線照相術、超聲、磁共振成象(MRI)。

7.試劑盒、容器、裝置以及系統

為了在上文所述的診斷、研究和治療應用中使用,本發明還提供了試劑盒和系統。本發明的試劑盒包含嵌合分子,所述嵌合分子包含本發明的PE(例如,作為嵌合分子的一部分)。本發明的PE和嵌合分子的實施方案如本文所述。

此外,試劑盒和系統可以包括說明性材料,其包括實施本發明方法的指導(即,操作流程)。說明可以以多種形式提供在主題試劑盒中,其中的一種或多種可以提供在試劑盒中。盡管說明性材料通常包括書寫材料或印刷材料,但是它們不限于此。本發明考慮到能存儲這些說明和能將它們傳遞給最終使用者的任何媒介。所述媒介包括,但不限于電子存儲媒介(例如,磁盤、錄音帶、磁片盒、芯片)、光學媒介(例如,CDROM)等。所述媒介可以包括提供該說明書材料的網址。

可以根據本發明制備多種試劑盒、系統以及組合物,這取決于試劑盒和系統的預期使用者以及使用者的具體需求。

提供了具有單位劑量的活性組合物(例如口服、陰道、直腸、經皮或注射用劑量(例如,用于肌肉內、靜脈內或皮下注射))的試劑盒。在所述試劑盒中,除了裝有所述單位劑量的容器之外,還有描述組合物在治療疾病或惡性疾病狀態中的用途和伴隨益處的信息說明書。合適的活性組合物和單位劑量如本文上文所述。

盡管已經通過為了清楚和理解而進行說明和舉例的方式較詳細地描述了前述本發明,但對本領域技術人員顯而易見的是,在本發明的教導下,可以在不必脫離本發明實質和范圍的情況下對其進行某些等同的變化、改變、修改和取代。因此,本文所述的實施方案可進行各種改動、改變等,而本發明的范圍僅可參照后附權利要求來確定。本領域技術人員能容易地意識到,可以改變、變化或改動多種非關鍵參數而得到本質上相似的結果?;褂Φ崩斫?,本文所用的術語僅是為了描述具體實施方案,而不是意圖進行限制,因為本發明的范圍僅受后附權利要求的限定。

盡管本發明的每個元件在本文中描述為含有多個實施方案,但應當理解,除非另外指出,本發明給定元件的每個實施方案能用于本發明其它元件的每個實施方案,并且每種所述應用意圖形成本發明的不同實施方案。

在此,將本文引用的參考專利、專利申請和科學文獻(包括GenBank數據庫序列的登錄號)通過引用的方式整體并入本文,如同每個單獨的出版物、專利或專利申請被具體地和單獨地指出通過引用并入本文一樣。本文引用的任何參考文獻和本說明書中的具體教導之間的任何矛盾應當以利于后者的方式解釋。同樣,詞語或短語的本領域理解的定義和本說明書中具體教導的該詞語或短語的定義之間的任何矛盾應當以利于后者的方式解釋。

從上文的公開內容中可以理解,本發明具有多種應用。

通過下述實施例進一步說明本發明,所述實施例僅是說明性的而不是意圖以任何方式限制本發明的定義和范圍。

實施例

提供以下實施例是為了說明本發明,而不是限制本發明。

實施例1:現有PE分子中移除的表位:PE-LR-8M

表1

??移除的表位 ??突變 ??1 ??LR(Δ251-273/Δ285-394) ??2 ??LR,R467A ??3 ??LR ??4 ??R432G,D406A ??5 ??R490A ??6 ??E548A,R513A ??7 ??K590S,Q592A

*表位描述于,例如,Onda,et?al.,Proc?Natl?Acad?Sci?USA.2008?105(32):11311-6和WO?2007/016150中。

實施例2:HA22-LR-8M對細胞的細胞毒性活性

HA22-LR-8M對Raji和CA46細胞具有與HA22和HA22-LR-6X相當的細胞毒性。將細胞與不同免疫毒素(例如,HA22、HA22-LR、HA22-LR-6X、HA22-LR-8M)孵育2天或3天,并且通過WST測定評估細胞活力(即,利用四唑鹽WST-1(試劑和試劑盒可獲自Roche?Applied?Sciences)測定細胞增殖)。結果總結在表2中。

表2

HA22-非突變形式的PE38

HA22?LR-(Δ251-273/Δ285-394)

HA22?LR?6X-(Δ251-273/Δ285-394/R432G,R467A,R490A,R513A,E548S,K590S)

HA22?LR?8X-(Δ251-273/Δ285-394/D406A,R432G,R467A,R490A,R513A,E548S,K590S,Q592A)

測試HA22-LR-8M對來自CLL患者的慢性淋巴性白血病(CLL)細胞的細胞殺傷活性。將來自CLL患者的細胞與HA22(非突變形式的PE38)、HA22-LR或HA22-LR-8M孵育,并測定細胞活力降低50%時的濃度(IC50)。HA22-LR-8M的IC50與HA22-LR相當,并且比HA22有大幅提高。結果顯示在圖1中。

實施例3:HA22-LR-8M的抗腫瘤活性和降低的免疫原性

在SCID小鼠中測試HA22-LR-8M對CA46腫瘤的抗腫瘤活性。用HA22或HA22-LR-8M的3次靜脈內(i.v.)注射來治療具有CA46腫瘤的小鼠,并且在23天中測量腫瘤的大小。結果顯示在圖2中。

按照標準技術,在接受免疫毒素靜脈內給藥的小鼠中測試HA22-LR-8M相比于LMB-9的免疫原性。用非突變形式的PE38的免疫毒素LMB9或HA22-LR-8M對小鼠靜脈內注射4次,間隔7天。每次注射后6天,從動物取血,并通過ELISA測定其與LMB9或HA22-LR-8M的反應性。收集血液樣品,并將其保存在-80℃,直至測定。即使在28天中4次HA22-LR-8M靜脈內給藥后測定時,也未引起免疫原性應答(圖3)。

按照標準技術,在接受免疫毒素靜脈內(i.v.)給藥的小鼠中測試HA22-LR-8M相比于HA22的免疫原性。每2周用5μg免疫毒素對小鼠進行靜脈內注射,并在10天后取血。通過ELISA分析血清中與注射的免疫毒素發生反應的抗體。即使在66天中5次HA22-LR-8M靜脈內給藥后測定時,也未引起免疫原性應答(圖4)。

實施例4:HA22-LR-8M的生物活性的其它研究

按照上文所述測試HA22和HA22-LR-8M對CA46細胞的特異性細胞毒性活性。結果提供在圖5A中,HA22(閉合圓圈)和HA22-LR-8M(閉合方塊)。

HA22和HA22-LR-8M對SCID小鼠的抗腫瘤活性(圖5B)。用PBS/0.2%MSA(黑方塊)或0.4mg/kg(三角)、2.5mg/kg(圓圈)或5.0mg/kg(灰色方塊)這3個劑量的HA22-LR-8M對8只攜帶CA46腫瘤的SCID小鼠的各個組進行每隔一天、共三次(如箭頭所示)的治療。每隔一天測量腫瘤大小,并使用公式(0.4×a?b^2)來計算。數據被表示為平均值+標準差。第24天和第27天的抗腫瘤活化存在顯著差異(p<0.05)。

比較對HA22、HA22-8X和HA22-LR-8M的免疫應答。小鼠中針對免疫毒素的IgG抗體產生顯示于圖6A中。Balb/c小鼠(n=9)的各組每14天(箭頭)靜脈內接受HA22(250μg/kg,圓圈)、HA22-8X(250μg/kg,方塊)或HA22-LR-8M(500μg/kg,三角),并在每次注射后10天取血。按照標準技術,利用ICC-ELISA測定分別的免疫毒素的抗體水平。

還測試了小鼠中由免疫毒素誘導的IgM應答(圖6B)。用配制于PBS/0.2%MSA中的HA22(250μg/kg,圓圈)、HA22-LR-8M(500μg/kg,方塊)或作為對照的單獨的PBS/0.2%MSA(三角)對Balb/c小鼠(10只/組)每14天進行靜脈內注射。每次注射后10天從小鼠取血,并且利用ICC-ELISA測定稀釋50倍的血清中針對分別的免疫毒素的IgM。免疫后的血清滴定顯示在圖6C中。也將來自用HA22(圓圈)免疫的小鼠的第38天的血清連續稀釋,并與用單獨的PBS/0.2%MSA(三角)免疫的對照血清比較針對HA22的IgM。利用ICC-ELISA和每種免疫毒素測定IgM水平。

測試HA22免疫的小鼠血清中針對每種突變分子的抗體的量(圖6D)。10只Balb/c小鼠每14天(共4次注射)靜脈內接受HA22(250μg/kg),并在第4次注射后10天取血。利用ICC-ELISA和HA22測定針對HA22的抗體水平?;估肐CC-ELISA和分別的免疫毒素測定HA處理的血清對突變免疫毒素的交叉反應。

研究了對HA22或HA22-LR-8M免疫毒素的次級免疫應答(圖6E)。在用HA22初次免疫(5μg,2次免疫,間隔2周)后的4周,用HA22(方塊)或HA22-LR-8M(圓圈)將小鼠再次免疫。顯示了每種免疫毒素的特異性IgG水平。

先前存在的產抗體B細胞對HA22或HA22-LR-8M免疫毒素的免疫應答(圖6F)。在用HA22(5μg/小鼠)3次或4次靜脈內免疫后15周,選擇了具有低滴度(約103)的抗HA22特異性IgG的8只小鼠用于進一步的再免疫研究。用HA22(方塊)或HA22-LR-8M(圓圈)將小鼠再次免疫。顯示了每種免疫毒素的特異性IgG滴度。相對于針對PE38的mAb(IP30)表示抗體的量。數據表示為平均值+標準差。HA,HA22;LR,HA22-LR;LR8M,HA22-LR-8M;ns,不顯著;*,p<0.05

應當理解,本文所述的實施例和實施方案僅用于說明性目的,并且根據所述實施例和實施方案進行的各種改動或變化對于本領域技術人員是顯而易見的,并且將包括在本申請的實質和范圍以及后附權利要求的范圍內。通過引用的方式將本文引用的所有登錄號、出版物、專利以及專利申請出于所有目的整體并入本文。

關 鍵 詞:
具有 降低 免疫原性 改進 假單胞菌外 毒素
  專利查詢網所有資源均是用戶自行上傳分享,僅供網友學習交流,未經上傳用戶書面授權,請勿作他用。
關于本文
本文標題:具有降低的免疫原性的改進的假單胞菌外毒素A.pdf
鏈接地址://www.vmyqew.com.cn/p-6872846.html
關于我們 - 網站聲明 - 網站地圖 - 資源地圖 - 友情鏈接 - 網站客服客服 - 聯系我們

[email protected] 2017-2018 www.vmyqew.com.cn網站版權所有
經營許可證編號:粵ICP備17046363號-1 
 


收起
展開