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皇家马德里对阵维戈塞尔塔: 乙酰肝素酶活性抑制劑.pdf

摘要
申請專利號:

维戈塞尔塔vs皇家社会 www.vmyqew.com.cn CN201080043864.1

申請日:

20100929

公開號:

CN102655863A

公開日:

20120905

當前法律狀態:

有效性:

有效

法律詳情:
IPC分類號: A61K31/4015,A61K8/49,A61K31/4166,A61P43/00,A61Q19/08 主分類號: A61K31/4015,A61K8/49,A61K31/4166,A61P43/00,A61Q19/08
申請人: 株式會社資生堂
發明人: 入山俊介,福西宏忠,末繼勝,天野聰
地址: 日本東京都
優先權: 228406/2009
專利代理機構: 北京市中咨律師事務所 代理人: 段承恩;田欣
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法律狀態
申請(專利)號:

CN201080043864.1

授權公告號:

法律狀態公告日:

法律狀態類型:

摘要

本發明提供一種乙酰肝素酶活性抑制劑,其含有下述通式(I)所示的環狀羧酰胺衍生物或其鹽作為活性成分。(通式(I)中,n為1~3的整數,R1為氫原子或可以被羥基取代的碳數1~6的烴基,X為-CH2-或-N(R2)-所示的基團,R2是指氫原子或可以被羥基取代的碳數1~6的烴基。)

權利要求書

1.一種乙酰肝素酶活性抑制劑,其包含下述通式(I)所示的環狀羧酰胺衍生物或其鹽作為活性成分,通式(I)中,n為1~3的整數,R為氫原子或可以被羥基取代的碳數1~6的烴基,X為-CH-或用-N(R)-表示的基團,R表示氫原子或可以被羥基取代的碳數1~6的烴基。2.如權利要求1所述的乙酰肝素酶活性抑制劑,在通式(I)中,n=1。3.如權利要求1所述的乙酰肝素酶活性抑制劑,其中,所述環狀羧酰胺衍生物為選自2-咪唑啉酮、1-(2-羥乙基)-2-咪唑啉酮及1-(2-羥乙基)-2-吡咯烷酮中的1種或多種。4.一種皺紋改善劑,其含有權利要求1~3中任一項所述的乙酰肝素酶活性抑制劑作為有效成分。5.一種深皺紋改善劑,其含有權利要求1~3中任一項所述的乙酰肝素酶活性抑制劑作為有效成分。6.一種美白劑,其含有權利要求1~3中任一項所述的乙酰肝素酶活性抑制劑作為有效成分。

說明書

技術領域

本發明涉及以通式(I)的環狀羧酰胺衍生物為活性成分的皮膚外用劑,特別涉及一種乙酰肝素酶抑制劑,所述乙酰肝素酶抑制劑通過用作化妝品能夠抑制皮膚中的乙酰肝素酶的活化,并通過?;ち蛩嵋陰8嗡?,能夠抑制隨著增殖因子的控制失敗產生的皮膚變化,從而可以維持年青皮膚的狀態,進而也具有美白效果。

背景技術

近年來,正在開展涉及抗老化的研究。關于皮膚老化的原因,微觀上來看,年齡增加是重要的要素,但除此之外,氧化、干燥、太陽光(紫外線)等要素也被列舉為參與皮膚老化的直接因子。作為皮膚老化的具體現象,已知以透明質酸為代表的粘多糖類的減少、骨膠原的交聯反應、紫外線引起的細胞損害等。

另外,以抑制、改善由皮膚傷害造成或由紫外線暴露引起的皮膚老化造成的肌膚的皺紋、細紋、松弛等為目的進行了各種研究。其結果闡明:例如,促進透明質酸的產生(日本特開2001-163794號公報:專利文獻1)、抑制基質金屬蛋白酶(MMP)的產生和/或活性(日本特表2000-503660號公報:專利文獻2)、促進骨膠原的產生、抑制酯酶的活性(日本特開平11-335235號公報:專利文獻3)、抑制血管新生(WO03/84302:專利文獻4)、抑制淋巴管擴張(參照K.Kajiya?et?al.,Am.J.Pathol.,2006,169(4):1496-1503.:非專利文獻1)等是有效的。

這樣的研究大致分為2種類型:關注表皮或表皮細胞而謀求細紋等的抑制、改善;和關注包含血管、淋巴管的真皮變化的抑制而謀求深皺紋等的抑制、改善。雖然通過表皮的變化傳遞到真皮而誘導包含血管、淋巴管的真皮發生變化,但乙酰肝素酶與該過程密切相關。實際上已經明確,通過在細紋模型上涂布乙酰肝素酶抑制劑,具有顯著的抗皺紋效果(PCT?JP2009/056717)。

現有技術文獻

專利文獻

專利文獻1:日本特開2001-163794

專利文獻2:日本特表2000-503660

專利文獻3:日本特開平11-335235號公報

專利文獻4:WO?03/84302

專利文獻5:DE?2746550

專利文獻6:日本專利第2901297號

專利文獻7:日本特開2008-303186

專利文獻8:日本特表2004-526758

非專利文獻

非專利文獻1:K.Kajiya?et?al.,Am.J.Pathol.,2006,169(4):1496-1503

非專利文獻2:Vlodavsky?I.,et.al.,Semin?Cancer?Biol.,2002;12(2):121-129

發明內容

本發明的課題在于,從乙酰肝素酶和皮膚老化的關系的觀點考慮,發現新的對皮膚老化的預防、抑制有效的藥劑,和/或對斑、雀斑、暗沉等色素沉著的預防、抑制有效的美白劑。

本發明者進行了潛心研究,結果發現,規定的環狀羧酰胺衍生物抑制乙酰肝素酶活性,其結果是有效地預防或抑制老化和/或色素沉著。

因此,本申請提供以下的發明。

(1)一種乙酰肝素酶活性抑制劑,其含有下述通式(I)所示的環狀羧酰胺衍生物或其鹽作為活性成分,

(通式(I)中,n為1~3的整數,R1為氫原子或可以被羥基取代的碳數1~6的烴基,X為-CH2-或用-N(R2)-表示的基團,R2表示氫原子或可以被羥基取代的碳數1~6的烴基。)

對上述“烴基”沒有特別限定,可以為烷基、環烷基、鏈烯基、炔基、環烷基烷基、鹵代烷基、烷氧基烷基、烷氧基羰基烷基等,特別優選為烷基。

(2)如(1)所述的乙酰肝素酶活性抑制劑,在通式(I)中,n=1。

(3)如(1)所述的乙酰肝素酶活性抑制劑,其中,所述環狀羧酰胺衍生物為選自2-咪唑啉酮、1-(2-羥乙基)-2-咪唑啉酮及1-(2-羥乙基)-2-吡咯烷酮中的1種或多種。

(4)一種皺紋改善劑,其含有(1)~(3)中任一項所述的乙酰肝素酶活性抑制劑作為有效成分。

(5)一種深皺紋改善劑,其含有(1)~(3)中任一項所述的乙酰肝素酶活性抑制劑作為有效成分。

(6)一種美白劑,其含有(1)~(3)中任一項所述的乙酰肝素酶活性抑制劑作為有效成分。

本發明的乙酰肝素酶活性抑制劑可有效地抑制乙酰肝素酶活性,因此,例如,可優選作為皺紋改善劑的有效成分用于預防或抑制皺紋(特別是深皺紋)的形成,進而可用作對預防或抑制斑、雀斑、暗沉等色素沉著有效的美白劑。

附圖說明

圖1是表示正常人角質形成細胞的紫外線照射及未照射條件下的乙酰肝素酶活性的差異的圖。

圖2是表示正常人臀部組織的紫外線照射部位及未照射部位中的乙酰肝素酶及硫酸乙酰肝素的免疫染色圖像。

圖3(a)、(b)均為表示模擬皮膚模型的示意圖。(a)表示基底膜片不含有硫酸乙酰肝素的“硫酸乙酰肝素分解模型”(硫酸乙酰肝素(-)),(b)表示基底膜片不含有硫酸乙酰肝素的“正常模型”(硫酸乙酰肝素(+))。

圖4是表示使用圖3(a)、(b)的模擬皮膚模型的VEGF的透過性的評價結果的圖。

圖5是表示使用圖3(a)、(b)的模擬皮膚模型的血管新生的評價結果的照片。

圖6是表示圖5的照片中的血管面積的分析結果的圖。

圖7表示包含黑色素細胞的皮膚模型(MEL-FT、MatTeK社制、USA)的外觀照片。

圖8表示各皮膚模型的表皮中的黑色素量的比較結果。

圖9表示老年性色素斑和其附近部位的正常組織的基底膜蛋白聚糖(perlecan)、硫酸乙酰肝素的免疫染色結果。

圖10表示利用作為血管標記物的抗CD31抗體的免疫染色的結果和圖像分析結果。

圖11表示利用作為淋巴管標記物的抗LYVE-1抗體的免疫染色的結果和圖像分析結果。

圖12表示老年性色素斑組織中的原位bFGF結合試驗的結果。

圖13表示脂溢性色素斑組織中的原位bFGF結合試驗的結果。

具體實施方式

乙酰肝素酶存在于各種細胞中,是特異性地分解各種硫酸乙酰肝素蛋白聚糖的硫酸乙酰肝素鏈的酶。在皮膚中,由構成表皮的表皮角質形成細胞及真皮的成纖維細胞、血管內皮細胞等產生。已知在各種癌細胞中產生也升高,還啟示與癌的惡性度相關。已知在癌細胞中如果乙酰肝素酶的產生高,則轉移性高,誘導血管新生的能力也高(Vlodavsky?I.,et.al.,Semin?Cancer?Biol.,2002;12(2):121-129(參照非專利文獻2))。

硫酸乙酰肝素蛋白聚糖起到使硫酸乙酰肝素結合性增殖因子(bFGF,HGF,VEGF,HB-EGF等)蓄積在細胞外的作用。作為硫酸乙酰肝素蛋白聚糖的1種的基底膜蛋白聚糖(perlecan)也在位于表皮和真皮的邊界部的表皮基底膜中存在,在皮膚中,使硫酸乙酰肝素結合性增殖因子與表皮基底膜結合,從而控制表皮、真皮間的增殖因子的移動。另外已明確,存在于表皮基底膜的基底膜蛋白聚糖也控制增殖因子對與基底膜結合的表皮基底細胞的作用,是表皮良好地增殖、分化所必須的。

因此,由乙酰肝素酶的活化或表達增強引起的基底膜蛋白聚糖的硫酸乙酰肝素鏈的分解,破壞蓄積的增殖因子的釋放以及表皮、真皮間的增殖因子的控制,產生表皮的分化、增殖控制失敗及真皮肥厚,促進皺紋形成?;謊災?,抑制所述乙酰肝素酶活性,對于抑制由硫酸乙酰肝素的分解引起的增殖因子的游離,抑制表皮、真皮間的增殖因子的移動是有用的。

因此,以乙酰肝素酶活性為指標進行篩選,結果發現了能夠顯著地抑制乙酰肝素酶活性的某種環狀羧酰胺衍生物。作為環狀羧酰胺衍生物已知各種化合物,并已知例如作為皮膚保濕劑的用途(DE?2746550:專利文獻5)、作為浸透促進化合物的用途(日本專利第2901297:專利文獻6)、作為角化包膜形成和/或成熟化促進劑的用途(日本特開2008-303186:專利文獻7)。但是,在現有技術中還完全未知環狀羧酰胺衍生物顯示乙酰肝素酶活性抑制作用。

如在實施例欄中詳細敘述那樣,本發明者這次還弄清楚了,如果對培養正常角質形成細胞照射紫外線,則正常角質形成細胞的乙酰肝素酶活化(參照圖1)。另外明確了,通過對人的皮膚照射紫外線,從而表皮中乙酰肝素酶的量增加,基底膜的硫酸乙酰肝素降低(參照圖2)。由此明確了,不僅在細紋模型中乙酰肝素酶活化,而且紫外線也使乙酰肝素酶活化。

進而,如果乙酰肝素酶活化,則基底膜硫酸乙酰肝素被分解,因此,本發明者等作為模擬皮膚模型,制作了基底膜含有硫酸乙酰肝素的正常模型和基底膜不含有硫酸乙酰肝素的硫酸乙酰肝素分解模型,進行VEGF的透過性及血管新生的評價。其結果明確了,與正常模型相比,在硫酸乙酰肝素分解模型中,VEGF的透過性增大,血管新生被誘導(參照圖3~6)。

迄今為止,矢野等發現,由于顯示通過紫外線而在真皮中血管新生被誘導、引起真皮的變化對深皺紋形成是重要的(日本特表2004-526758:專利文獻8),因此,乙酰肝素酶是不僅與細紋形成密切相關,而且與深皺紋形成也密切相關的酶。即,抑制乙酰肝素酶活性,不僅對干燥引起的細紋的預防是有效地,而且對長期日光暴露等引起的深皺紋的預防也是有效的。在此,“深皺紋”是指在外眼角或鼻唇溝等上形成的相對于肌肉面為垂直方向的大且深的皺紋,是指形成不僅在表皮上、而且在真皮上也發生變化的結果的皺紋。

在以乙酰肝素酶的活性為指標的第一次評價中,如在下述實施例中詳細記載的那樣,將進行了生物素化的硫酸乙酰肝素固定在96孔板上,然后在藥劑存在下使乙酰肝素酶作用,通過使過氧化物酶標記的抗生物素蛋白作用并顯色,來評價生物素化硫酸乙酰肝素的減少量,從而評價乙酰肝素酶活性。對在第一次評價中具有乙酰肝素酶活性抑制效果的藥劑通過第二次評價體系來進行再現性及濃度依賴性的評價。其結果發現,環狀羧酰胺衍生物抑制乙酰肝素酶活性。

在本說明書中,“抗老化”是指,通過抑制伴隨由年齡增加或光老化引起的基底膜蛋白聚糖的硫酸乙酰肝素的分解所產生的硫酸乙酰肝素結合性增殖因子的皮膚變化,具體而言,通過抑制表皮分化異常、真皮血管新生、淋巴管擴張、彈性蛋白分解來防止、改善皮膚的皺紋、松弛、硬化等,維持有彈性的年青健康的肌膚的狀態。

進而,本發明者弄清楚了,如在實施例欄中詳細敘述的那樣,老年性色素斑組織與曝光部皮膚相比,基底膜的硫酸乙酰肝素分解。隨著硫酸乙酰肝素的分解,在表皮表達的血管內皮細胞增殖因子-A(VEGF-A)的控制失敗,由此,因真皮的血管和/或淋巴管的變化而產生炎癥,使黑色素細胞活化,促進向黑素體的黑色素貯藏。另外,在真皮表達的成纖維細胞增殖因子-7(FGF-7)的控制失敗,由此,促進黑素體從黑色素細胞轉移至表皮細胞。即,一般認為,伴隨乙酰肝素酶活化的硫酸乙酰肝素的分解,通過由炎癥引起的黑色素細胞的活化和由FGF-7控制失敗引起的黑素體轉移促進,從而協同地使得黑素體蓄積于角質形成細胞中。因此,乙酰肝素酶活性抑制劑不僅對于預防和/或抑制皺紋是有用的,而且作為用于預防、抑制斑、暗沉、雀斑等色素沉著的美白劑也是有用的。

在本說明書中,“美白”是指抑制由伴隨基底膜的硫酸乙酰肝素的分解的黑色素細胞的活化的結果而生成的角質形成細胞內的黑素體的蓄積所引起的皮膚的黑色化,改善斑、雀斑、暗沉等。只要沒有特殊說明,本發明中所謂的“美白方法”是指美容目的,根據情況,有時也為醫療目的。

本發明的乙酰肝素酶活性抑制劑也可用于與乙酰肝素酶活性相關的其它各種狀態或癥狀的治療、改善或預防。在此,作為“與乙酰肝素酶活性相關的狀態或癥狀”,可以舉出癌細胞的增殖或轉移、血管新生等。因此,含有本發明的乙酰肝素酶活性抑制劑的醫藥組成物也用于癌細胞的增殖或轉移的抑制、血管新生的抑制等。

在本發明的通式(I)的環狀羧酰胺衍生物為公知物質的情況下,可以利用公知的方法容易地合成,或可容易地購入市售品,另外,即使為新化合物,只要是本領域技術人員,就可以利用公知的方法容易地合成。

另外,本發明的通式(I)的環狀羧酰胺衍生物可以利用公知的方法制成無機鹽或有機鹽。作為在本發明中所使用的鹽,沒有特別限定,例如,作為無機鹽,可以舉出:鹽酸鹽、硫酸鹽、磷酸鹽、氫溴酸鹽、鈉鹽、鉀鹽、鎂鹽、鈣鹽、銨鹽等。作為有機鹽,可以舉出:乙酸鹽、乳酸鹽、馬來酸鹽、富馬酸鹽、酒石酸鹽、檸檬酸鹽、甲磺酸鹽、對甲苯磺酸鹽、三乙醇胺鹽、二乙醇胺鹽、氨基酸鹽等。

本發明的乙酰肝素酶活性抑制劑可以單獨含有僅一種式(I)的環狀羧酰胺衍生物或其鹽,也可以以任意的組合及比率含有2種以上的式(I)的環狀羧酰胺衍生物或其鹽。

本發明的乙酰肝素酶活性抑制劑中的式(I)的環狀羧酰胺衍生物或其鹽的含量只要是對于有效發揮乙酰肝素酶活性的抑制作用充分的量,就沒有特別限定,根據乙酰肝素酶活性抑制劑的用途適宜選擇即可。但一般相對于乙酰肝素酶活性抑制劑整體,式(I)的環狀羧酰胺衍生物或其鹽的比率通常為0.0001質量%以上,尤其優選為0.0001質量%以上,并且通常為1質量%以下,尤其優選為0.2質量%以下。在使用2種以上的式(I)的環狀羧酰胺衍生物或其鹽的情況下,使它們的總計量滿足上述范圍即可。

另外,本發明的乙酰肝素酶活性抑制劑,在不實質上損害式(I)的環狀羧酰胺衍生物或其鹽的乙酰肝素酶活性的抑制作用的限度內,除式(I)的環狀羧酰胺衍生物或其鹽之外,可以含有其它任意的成分。作為其它成分,可舉出具有乙酰肝素酶活性的抑制作用的其它化合物(其它活性成分)和/或可藥用的載體和/或輔助劑。該其它成分可以單獨使用1種,也可以2種以上以任意的組合及比率使用。

本發明的乙酰肝素酶活性抑制劑可以按照常規方法制造,另外,作為構成皮膚外用劑的成分,可單獨制備通式(1)的環狀羧酰胺衍生物或其鹽的1種或2種以上,通常根據需要適宜配合可用于包含準藥品的化妝品和/或藥品等的皮膚外用劑等中的成分,例如油分、表面活性劑、粉末、色料、水、醇類、增稠劑、螯合劑、硅酮類、抗氧化劑、紫外線吸收劑、保濕劑、香料、各種藥效成分、防腐劑、pH值調節劑、中和劑等。

對本發明的乙酰肝素酶活性抑制劑的給藥途徑及劑型均沒有限定,根據其用途適宜選擇即可。作為給藥途徑的例子,可以舉出局部給藥(皮膚外用等)、經口給藥、非經口給藥(靜脈給藥、腹腔內給藥等)等,在用作抗老化劑的情況下,優選作為皮膚外用劑使用。作為劑型,在局部給藥(皮膚外用劑)的情況下,可以舉出將溶液系、增溶系、乳化系、粉末分散系、水-油二層系、水-油-粉末三層系等制成貼劑、軟膏、霜、乳液、化妝水、凝膠、氣溶膠等形態。在經口給藥的情況下,可以舉出片劑、包衣片、糖衣片、顆粒劑、散劑、膠囊劑(例如硬膠囊劑或軟膠囊劑)等固體制劑或內服液劑、糖漿劑等液體制劑(溶液、懸浮液)等形態。在非經口給藥的情況下,可以舉出注射液等形態。

另外,在本發明的乙酰肝素酶活性抑制劑中,在不實質上損害通式(1)的環狀羧酰胺衍生物或其鹽的乙酰肝素酶活性的抑制作用的限度內,除本發明的通式(1)的環狀羧酰胺衍生物或其鹽之外,還可以配合其它1種或2種以上的任意成分。對其它成分沒有特別限定,根據醫藥組成物的用途、劑型、給藥形態等適當選擇即可,作為例子,可以舉出可藥用的載體和/或輔助劑。作為輔助劑,可以舉出例如,稀釋劑、粘合劑、崩解劑、增稠劑、分散劑、再吸收促進劑、矯味劑、緩沖液、表面活性劑、溶解助劑、保存劑、乳化劑、等滲劑、穩定劑、pH值調節劑等。

作為具體例,在將本發明的乙酰肝素酶活性抑制劑設為皮膚外用劑的情況下,可根據需要適宜配合通常用于外用劑的成分、例如美白劑、保濕劑、抗氧化劑、油性成分、紫外線吸收劑、表面活性劑、增稠劑、醇類、粉末成分、色料、水性成分、水、各種皮膚營養劑等。進而,也可適宜配合乙二胺四乙酸二鈉、乙二胺四乙酸三鈉、檸檬酸鈉、多磷酸鈉、偏磷酸鈉、葡萄糖酸等金屬離子封端劑、對羥基苯甲酸甲酯、對羥基苯甲酸乙酯、對羥基苯甲酸丁酯等防腐劑、咖啡因、單寧、維拉帕米、凝血酸及其衍生物、甘草提取物、光甘草定、木瓜果實的熱水提取物、各種生藥、乙酸生育酚、甘草酸及其衍生物或其鹽等藥劑、維生素C、抗壞血酸磷酸鎂、抗壞血酸葡糖苷、熊果苷、曲酸等美白劑、葡萄糖、果糖、甘露糖、蔗糖、海藻糖等糖類、視黃酸、視黃醇、乙酸視黃醇、棕櫚酸視黃醇等維生素A衍生物類等。

上述成分是例示,并不限定于這些。另外,這些成分可以按照根據所期望的形態的配方適宜組合來進行配合。

對本發明的皮膚外用劑的劑型沒有特別限定,例如可采用溶液系、增溶系、乳化系、粉末分散系、水-油二層系、水-油-粉末三層系、軟膏、凝膠、氣溶膠等任意劑型。另外,對使用形態也沒有特別限定,例如可采用化妝水、乳液、霜、精華、膠凍劑、凝膠、軟膏、面膜(pack)、面膜(mask)、粉底等任意形態。

本發明的乙酰肝素酶抑制劑可以通過應用于肌膚,從而在用于謀求深皺紋形成的預防和/或所形成的皺紋的減少和/或消失的美容方法中利用。對上述美容方法中的本發明的皮膚外用劑的用法、用量也沒有特別限定,可根據劑型和/或所處置的肌膚的皺紋的狀態來適宜確定,典型地,可以以每1天數次適量地直接擦在肌膚上,所述數次例如1次~5次,所述適量例如每1cm2為0.1ml~1ml;或者將其適量浸透到薄紗等中之后貼合于肌膚。

以上,舉出具體例對本發明進行了說明,但以上的具體例終究是例示,本發明可以在不脫離權利要求書的范圍內進行任意的變更來實施。

以下,舉出實施例對本發明進行更具體的說明,但本發明并不限定于下述實施例。

實施例

1.以乙酰肝素酶活性的抑制率為指標的評價

用加入有10%血清的DMEM(達爾伯克改良伊格爾培養基)培養A431細胞(浸潤性人上皮癌細胞)。將培養細胞用溶解緩沖液(Lysis?Buffer)(50mM?Tris、0.5%?TritonX-100、0.15M氯化鈉、pH值4.5)進行溶解,用刮刀回收,然后進行吸液,在冰上靜置30分鐘。然后,以10,000轉/分鐘離心10分鐘除去不溶解物,回收上清液作為細胞提取液。用BCA蛋白質定量試劑盒(BCA?Protein?Assay?Kit、PIERCE、CA46141)測定該細胞提取液中的蛋白質量。

接著,將上述A431細胞提取液用試驗緩沖液(50mM?HEPES、50mM乙酸鈉、150mM氯化鈉、9mM氯化鈣、0.1%BSA)稀釋為500μg/mL。接著,使試驗對象化合物溶解于DMSO,以相對于該稀釋細胞提取液為0.0005質量%、0.005質量%及0.05質量%的比率的方式添加、混合來制作試樣溶液(DMSO的終濃度5%)。對照溶液以相對于稀釋細胞提取液使DMSO的終濃度為5%的方式混合,將這些試樣溶液及對照溶液在生物素化硫酸乙酰肝素固定化板上以100μL/孔的比例接種。在37℃下反應2小時,用PBS-T清洗3次,然后以100μL/孔的比例加入10,000倍稀釋HRP-抗生物素蛋白(Vector、A-2004)/PBS-T,在37℃下反應1小時。再次用PBS-T清洗3次,以100μL/孔的比例加入TMB試劑(BIO-RAD、172-1066)使其反應,用1N硫酸停止反應,然后,測定475nm下的吸光度(OD475)。

另外,在上述A431細胞提取液的利用試驗緩沖液的連續稀釋液(細胞提取液濃度500μg/mL、50μg/mL、5μg/mL、0.5μg/mL)中不添加試驗對象的化合物,添加并混合DMSO使終濃度為5%(標準曲線用溶液)。對該標準曲線用溶液,用與上述同樣的步驟進行在向生物素化硫酸乙酰肝素固定化板上接種以后的處理,測定OD475。

接著,基于標準曲線用溶液的OD475的值制作蛋白質濃度的標準曲線,使用該標準曲線,由以各添加濃度添加有試驗對象化合物的試樣溶液的OD475的值算出各試樣溶液的蛋白質濃度。進而,對于對照用溶液也同樣地算出蛋白質濃度。由各試樣溶液的蛋白質濃度和對照用溶液的蛋白質濃度的比率(%)求得各試樣溶液的乙酰肝素酶活性的抑制率。

此外,關于以上的步驟請參照日本特表2003-502054號公報。

通過以上的步驟對各種環狀羧酰胺衍生物的乙酰肝素酶活性抑制作用進行試驗。將結果示于表1。由表1明確,各種環狀羧酰胺衍生物即使添加濃度為0.0005%也顯示37.64%的抑制率,在添加濃度為0.05%時顯示94.74%的抑制率,有效地抑制乙酰肝素酶活性。2-咪唑啉酮、1-(2-羥乙基)-2-咪唑啉酮和1-(2-羥乙基)-2-吡咯烷酮

表1?乙酰肝素酶活性的抑制率

2.利用紫外線的乙酰肝素酶的活性變化的評價

用正常角質形成細胞用培養基EpiLife培養正常人角質形成細胞。將培養基暫時置換為PBS后,照射50mJ的UVB,在培養1小時、2小時、4小時后,將細胞用溶解緩沖液(Lysis?Buffer)進行溶解,將所得的溶液用作紫外線照射組的試樣溶液。另外,將培養基暫時置換為PBS、不照射紫外線而得的溶液用作對照用溶液。使用這些試樣溶液及對照用溶液,與實施例1同樣地進行處理,測定OD475?;謁玫腛D475的值,與實施例1同樣地評價乙酰肝素酶活性。將其結果示于圖1。明確:與不照射紫外線的對照相比,在紫外線照射組中,乙酰肝素酶顯著活化。

紫外線照射人皮膚中的乙酰肝素酶及硫酸乙酰肝素的免疫染色

對20多歲的人臀部照射2MED的紫外線,在2天后用活組織檢查法采取照射部位和附近的未照射紫外線的臀部皮膚,用AMeX法制作石蠟塊。制作3μm的組織切片,實施乙酰肝素酶及硫酸乙酰肝素的免疫染色。將所得的免疫染色圖像示于圖2。明確了在紫外線照射部位中,與未照射部位相比,乙酰肝素酶的量增加,另外,硫酸乙酰肝素的量降低。

按照硫酸乙酰肝素的有無的VEGF的透過性及血管新生的評價

將硫酸乙酰肝素2mg及瓊脂糖10mg加熱溶解于PBS?1ml(1%瓊脂糖溶液)中,然后涂布于插入板(コ一ニング社制24孔用Transwell),由此形成包含硫酸乙酰肝素的片。另外,作為對照,不使用硫酸乙酰肝素而僅使用瓊脂糖,除此之外,利用同樣的步驟形成不包含硫酸乙酰肝素的片。這樣,制作將插入板內看作表皮側、將片看作基底膜、將孔看作真皮側的模擬皮膚模型(圖3a,b)。

如上得到的模擬皮膚模型,可以用作按照看作基底膜的片(以下,稱為“基底膜片”)中的硫酸乙酰肝素的有無來評價VEGF的透過性及血管新生的評價體系。此外,在以下的記載中,將基底膜片含有硫酸乙酰肝素的模擬皮膚模型作為“正常模型”,將基底膜片不含有硫酸乙酰肝素的模擬皮膚模型設為“硫酸乙酰肝素分解模型”。

首先,為了評價VEGF的透過性,在各模型的表皮側(插入板內)添加10μg/mL的VEGF水溶液,在室溫下靜置3小時,用VEGF?ELISA試劑盒(R&D?systems)檢測真皮側的孔內的VEGF濃度。將其結果示于圖4。在正常模型中,與硫酸乙酰肝素分解模型相比,VEGF的透過量顯著減少。

然后,為了評價血管新生,在各模型的表皮側(插入板內)添加100μg/mL的VEGF水溶液,放置在血管新生試劑盒(クラボウ社)中培養11天,然后拍攝培養物的光學顯微鏡照片。將所得的圖像示于圖5。在硫酸乙酰肝素分解模型中,確認了濃度依賴性顯著的血管新生,但在正常模型中,未發現血管新生。

進而,使用血管新生試劑盒用分析軟件(クラボウ社)分析圖5的圖像的血管面積。將其結果示于圖6。明確了,在硫酸乙酰肝素分解模型中,與正常模型相比,確認了顯著的血管面積的增加,血管新生顯著發生。

3.乙酰肝素酶抑制劑的美白效果的評價

使用包含黑色素細胞的皮膚模型,對于作為乙酰肝素酶抑制劑的1-[4-(1H-苯并咪唑-2-基)-苯基]-3-[4-(1H-苯并咪唑-2-基)-苯基]-脲的美白效果進行研究。

將包含黑色素細胞的皮膚模型(MEL-FT、MatTeK社制、USA)用專用培養基(MEL-FT-NMM-113、MatTeK社制、USA)開始培養。從培養第2天開始,對照組加入DMSO進行培養,乙酰肝素酶抑制劑組以終濃度為50μM添加1-[4-(1H-苯并咪唑-2-基)-苯基]-3-[4-(1H-苯并咪唑-2-基)-苯基]-脲進行培養,每隔2天或3天更換培養基。在培養第10天、第14天采取皮膚模型并拍攝外觀照片,結果可知,在乙酰肝素酶抑制劑組中,與對照組相比,外觀的顏色更淡更白。

進而,僅采取該皮膚模型的表皮,添加0.2N氫氧化鈉溶液300μL并攪拌后,在室溫下靜置24小時,在95℃下加熱30分鐘,由此使表皮完全溶解。通過測定溶解后的溶液的475nm吸光度來研究表皮中所含的黑色素量,明確了乙酰肝素酶抑制劑組與對照組相比,OD475nm的值顯著低,即黑色素量少。

圖7顯示MEL-FT皮膚模型的外觀照片??芍涸諗嘌?0天、第14天,在乙酰肝素酶抑制劑組中明顯較白。圖8現實各皮膚模型的表皮中的黑色素量的比較結果??芍涸諗嘌?0天、第14天,在乙酰肝素酶抑制劑組中作為黑色素的指標的OD475nm的吸光度值顯著低。由此證明,乙酰肝素酶抑制劑具有美白效果。

4.凍結人組織的免疫染色

將老年性色素斑及附近的正常部位皮膚的凍結組織塊重新進行切片,制成8μm的切片。將剝切成8μm的組織切片用冷丙酮固定并干燥后,用PBS進行脫OCT。通過3%過氧化氫水處理使組織內源性過氧化物酶鈍化,然后用10%正常山羊血清封閉,按表1的1次抗體、2次抗體的步驟進行反應。HRP標記后的組織用PBS清洗5次后,用AEC進行顯色。顯色后的組織用流水充分清洗后,使用水溶性封片劑密封。

表2?使用的1次抗體和2次抗體

5.原位bFGF試驗

使25μg的bFGF與200μL的膨潤肝素-Sepharose(CL-6B;Pharmacia?Biotech)結合,使其與溶解于DMSO的NH2-反應性-生物素(Dojindo?molecular?tech.)在室溫下反應5分鐘,用800μL的清洗緩沖液(20mmol/L?HEPES,pH值7.4,400mmol/L?NaCl)清洗,用200μL的溶出緩沖液(20mmol/L?HEPES,pH值7.4,0.2%BSA,3mol/L?NaCl)溶出2次,由此回收高鹽濃度生物素化bFGF。然后,放入到Ultra?free?C3LGC柱(アミコン)中,用PBS清洗3次,由此得到(0.25g/L)生物素化bFGF。

將剝切成5μm的石蠟組織切片(老年性、脂溢性角化癥部位和其附近正常部位)用二甲苯脫蠟后,用乙醇(100%→70%)置換,用3%過氧化氫水處理使組織內源性過氧化物酶鈍化。然后,用pH值5的緩沖液(含0.5M?NaCl)、pH值10的緩沖液(含0.5M?NaCl)清洗,由此使內源性的硫酸乙酰肝素結合因子游離。用10%血清封閉,使生物素化bFGF(10nmol/L)在室溫下反應1小時,用PBS清洗3次。然后,使其與過氧化物酶標記鏈霉菌抗生物素蛋白(Nichirei,Japan)在室溫下作用15分鐘,用PBS清洗3次,用DAB進行顯色。顯色后的組織用流水充分清洗后,用蘇木精使核染色,進行乙醇(70%→100%)置換、二甲苯置換后密封。

6.血管、淋巴管圖像分析

CD31染色、LYVE1染色組織每1切片拍攝3張照片,使用win?roof(Mitani?Corporation)并通過圖像分析算出染色后的血管、淋巴管的數量、面積。進而,也通過圖像解析算出真皮乳頭層區域的真皮總面積,由此算出血管或淋巴管的密度、大小。

圖9顯示老年性色素斑和其附近部位的正常組織的基底膜蛋白聚糖、硫酸乙酰肝素的免疫染色結果。在正常組織中,基底膜與基底膜蛋白聚糖、硫酸乙酰肝素同時被染色,但在老年性色素斑組織中,僅基底膜蛋白聚糖被染色,硫酸乙酰肝素的染色顯著降低。由該結果可知,在老年性色素斑部位,硫酸乙酰肝素特異性地被分解。

圖10顯示利用作為血管標記的抗CD31抗體的免疫染色的結果和圖像分析結果。通過用圖像分析軟件win?roof對各染色組織計算出被cd31染色的血管的數量、粗細、面積,由此對老年性色素斑部位和其附近正常部位的血管的變化進行分析。明確了,在老年性色素斑部位,血管的尺寸、血管區域顯著較高。由該結果明確了,在老年性色素斑部位發生了血管擴張。

圖11顯示利用作為淋巴管標記的抗LYVE-1抗體的免疫染色的結果和圖像分析結果。通過用分析軟件win?roof對各染色圖像計算出被LYVE-1染色的淋巴管的數量、粗細、面積,由此對老年性色素斑部位和其附近正常部位的淋巴管的變化進行分析。明確了,在老年性色素斑部位,淋巴管的尺寸、淋巴管面積顯著較高。由該結果明確了,在老年性色素斑部位發生了淋巴管擴張。

圖12顯示老年性色素斑組織中的原位bFGF結合試驗的結果。在老年性色素斑附近的正常組織中,基底膜被染色成棕色,由此顯示bFGF結合,但在老年性色素斑部位,沒有發現基底膜的染色,即顯示bFGF不能結合,認為由于硫酸乙酰肝素的分解而bFGF不能結合。

圖13表示脂溢性色素斑組織中的原位bFGF結合試驗的結果。在脂溢性色素斑附近的正常組織中,基底膜被染色成棕色,由此顯示bFGF結合,但在脂溢性色素斑部位,沒有發現基底膜的染色,即顯示bFGF不能結合,認為由于硫酸乙酰肝素的分解而bFGF不能結合。

產業可利用性

本發明的乙酰肝素酶活性抑制劑可有效地抑制乙酰肝素酶活性,因此,例如作為皺紋改善劑的有效成分,用于皺紋(特別是深皺紋)的形成的預防、抑制或斑、雀斑、暗沉等色素沉著的預防、抑制等。

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乙酰 肝素 活性 抑制劑
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