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皇家马德里对维戈塞尔塔直播: 用于降低的或增強的藥效學作用的致耐受性合成納米載體和治療性大分子.pdf

摘要
申請專利號:

维戈塞尔塔vs皇家社会 www.vmyqew.com.cn CN201480032251.6

申請日:

20140502

公開號:

CN105283175A

公開日:

20160127

當前法律狀態:

有效性:

審查中

法律詳情:
IPC分類號: A61K9/16,A61K47/30,A61K39/395 主分類號: A61K9/16,A61K47/30,A61K39/395
申請人: 西萊克塔生物科技公司
發明人: 羅伯托·A·馬爾多納多,岸本·隆·慧
地址: 美國馬薩諸塞州
優先權: 61/819,517,61/881,921,61/881,851,61/881,913,61/907,177,61/948,313,61/948,384
專利代理機構: 北京集佳知識產權代理有限公司 代理人: 彭鯤鵬;鄭斌
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法律狀態
申請(專利)號:

CN201480032251.6

授權公告號:

法律狀態公告日:

法律狀態類型:

摘要

公開了提供治療性大分子特異性的藥效學作用的組合物和方法。所述作用可由與免疫抑制劑劑量相組合的治療性大分子的降低的劑量產生。所述作用還可用這樣的組合物來增強。

權利要求書

1.一種方法,其包括:提供免疫抑制劑劑量,其中所述免疫抑制劑劑量與合成納米載體連接;以及將治療性大分子的降低的藥效學有效劑量與所述免疫抑制劑劑量伴隨施用于其中預期發生抗治療性大分子抗體應答的對象;其中所述伴隨施用根據方案進行,所述方案已被證明,與當不與所述免疫抑制劑劑量伴隨施用并且存在抗治療性大分子抗體應答時施用所述治療性大分子相比,在與所述免疫抑制劑劑量伴隨施用后以所述治療性大分子的所述降低的藥效學有效劑量產生藥效學作用。2.權利要求1所述的方法,其中所述方法還包括確定所述方案。3.權利要求1或2所述的方法,其中所述方法還包括確定所述降低的藥效學有效劑量。4.權利要求1至3中任一項所述的方法,其中所述方法還包括在所述施用之前和/或之后在所述對象中評估所述藥效學作用。5.權利要求1至4中任一項所述的方法,其中所述施用通過靜脈內、腹膜內或皮下施用進行。6.一種方法,其包括:提供免疫抑制劑劑量,其中所述免疫抑制劑劑量與合成納米載體連接;以及將治療性大分子的降低的藥效學有效劑量與所述免疫抑制劑劑量伴隨施用;其中所述治療性大分子的所述降低的藥效學有效劑量低于治療性大分子的以下藥效學有效劑量:(A)在抗治療性大分子抗體應答存在下施用所述治療性大分子,和(B)不與所述免疫抑制劑劑量伴隨施用所述治療性大分子。7.權利要求6所述的方法,其中所述方法還包括確定所述降低的藥效學有效劑量。8.權利要求6或7所述的方法,其中所述方法還包括在所述施用之前和/或之后在對象中評估藥效學作用。9.權利要求6至8中任一項所述的方法,其中所述施用通過靜脈內、腹膜內或皮下施用進行。10.一種方法,其包括:提供免疫抑制劑劑量,其中所述免疫抑制劑劑量與合成納米載體連接;以及將治療性大分子的藥效學有效劑量與免疫抑制劑劑量伴隨施用于其中預期發生抗治療性大分子抗體應答的對象;其中所述伴隨施用根據方案進行,所述方案已被證明,與當不與所述免疫抑制劑劑量伴隨施用且各自存在抗治療性大分子抗體應答時施用所述治療性大分子相比,在與所述免疫抑制劑劑量伴隨施用后增強所述治療性大分子的藥效學作用。11.權利要求10所述的方法,其中所述方法還包括確定所述方案。12.權利要求10或11所述的方法,其中所述方法還包括確定所述藥效學有效劑量。13.權利要求10至12中任一項所述的方法,其中所述方法還包括在所述施用之前和/或之后在所述對象中評估所述藥效學作用。14.權利要求10至13中任一項所述的方法,其中所述施用通過靜脈內、腹膜內或皮下施用進行。15.一種方法,其包括:提供免疫抑制劑劑量,其中所述免疫抑制劑劑量與合成納米載體連接;將治療性大分子的藥效學有效劑量與所述免疫抑制劑劑量伴隨施用于其中預期發生抗治療性大分子抗體應答的對象;以及在所述伴隨施用之后記錄增強的藥效學作用。16.權利要求15所述的方法,其中所述方法還包括確定所述藥效學有效劑量。17.權利要求15或16所述的方法,其中所述方法還包括在所述施用之前和/或之后在所述對象中評估所述藥效學作用。18.權利要求15至17中任一項所述的方法,其中所述施用通過靜脈內、腹膜內或皮下施用進行。19.一種方法,其包括:提供在一個或更多個對象中重復給藥后導致或預期導致抗治療性大分子抗體的治療性大分子;提供免疫抑制劑劑量,其中所述免疫抑制劑劑量與合成納米載體連接;以及以相同或較低的劑量將所述治療性大分子與所述免疫抑制劑劑量向對象伴隨地重復給藥。20.權利要求19所述的方法,其中伴隨施用根據方案進行,所述方案已被證明,使得在將兩個或更多個治療性大分子劑量給予對象期間維持所述治療性大分子的藥效學作用。21.權利要求20所述的方法,其中所述方法還包括確定所述方案。22.權利要求19至21中任一項所述的方法,其中所述方法還包括在施用所述兩個或更多個劑量之前和/或之后在所述對象中評估藥效學作用。23.權利要求19至22中任一項所述的方法,其中所述施用通過靜脈內、腹膜內或皮下施用進行。24.一種組合物或藥盒,其包含:免疫抑制劑劑量,其中所述免疫抑制劑與合成納米載體連接;和治療性大分子的降低的藥效學有效劑量。25.權利要求24所述的組合物或藥盒,其中所述組合物或藥盒用于本文中提供的任一種方法。26.權利要求24或25所述的組合物或藥盒,其中所述組合物或藥盒還包含可藥用載體。27.一種組合物或藥盒,其包含:治療性大分子的降低的藥效學有效劑量,其用于與免疫抑制劑劑量相組合的本文中提供之任一種方法,其中免疫抑制劑與合成納米載體連接。28.權利要求27所述的組合物或藥盒,其還包含可藥用載體。29.前述權利要求中任一項所述的方法或組合物或藥盒,其中所述治療性大分子未與所述合成納米載體連接。30.前述權利要求中任一項所述的方法或組合物或藥盒,其中所述治療性大分子與所述合成納米載體連接。31.前述權利要求中任一項所述的方法或組合物或藥盒,其中所述合成納米載體不包含治療性大分子APC可呈遞抗原。32.權利要求24至31中任一項所述的組合物或藥盒,其中所述免疫抑制劑劑量和所述治療性大分子包含在分離的容器中。33.權利要求24至31中任一項所述的組合物或藥盒,其中所述免疫抑制劑劑量和所述治療性大分子包含在同一容器中。34.權利要求1至9中任一項所述的方法或者前述權利要求中任一項所述的組合物或藥盒,其中所述治療性大分子的所述降低的藥效學有效劑量比治療性大分子的以下藥效學有效劑量低至少30%:(A)在抗治療性大分子抗體應答存在下施用所述治療性大分子,和(B)不與所述免疫抑制劑劑量伴隨施用所述治療性大分子。35.權利要求34所述的方法或組合物或藥盒,其中所述降低的藥效學有效劑量降低至少40%。36.權利要求35所述的方法或組合物或藥盒,其中所述降低的藥效學有效劑量降低至少50%。37.前述權利要求中任一項所述的方法或組合物或藥盒,其中所述免疫抑制劑劑量包含:他汀類、mTOR抑制劑、TGF-β信號傳導劑、皮質類固醇、線粒體功能的抑制劑、P38抑制劑、NF-κβ抑制劑、腺苷受體激動劑、前列腺素E2激動劑、磷酸二酯酶4抑制劑、HDAC抑制劑或蛋白酶體抑制劑。38.權利要求37所述的方法或組合物或藥盒,其中所述mTOR抑制劑是雷帕霉素。39.前述權利要求中任一項所述的方法或組合物或藥盒,其中所述治療性大分子包含治療性蛋白質。40.權利要求39所述的方法或組合物或藥盒,其中所述治療性蛋白質用于蛋白質替代或蛋白質補充治療。41.前述權利要求中任一項所述的方法或組合物或藥盒,其中所述治療性大分子包含:可輸注或可注射的治療性蛋白質、酶、酶輔因子、激素、血液因子或凝血因子、細胞因子、干擾素、生長因子、單克隆抗體、多克隆抗體或與龐皮病相關的蛋白質。42.權利要求41所述的方法或組合物或藥盒,其中所述可輸注或可注射的治療性蛋白質包含:托珠單抗、α-1抗胰蛋白酶、Hematide、白蛋白干擾素α-2b、Rhucin、替莫瑞林、奧瑞珠單抗、貝利木單抗、聚乙二醇化重組尿酸酶、他利苷酶α、阿加糖酶α或葡糖腦苷脂酶α。43.權利要求41所述的方法或組合物或藥盒,其中所述酶包含:氧化還原酶、轉移酶、水解酶、裂合酶、異構酶或連接酶。44.權利要求41所述的方法或組合物或藥盒,其中所述酶包含用于溶酶體貯積癥的酶替代治療的酶。45.權利要求44所述的方法或組合物或藥盒,其中所述用于溶酶體貯積癥的酶替代治療的酶包含:伊米苷酶、a-半乳糖苷酶A(a-galA)、阿加糖酶β、酸性α-葡糖苷酶(GAA)、阿葡糖苷酶α、LUMIZYME、MYOZYME、芳基硫酸酯酶B、拉羅尼酶、ALDURAZYME、艾杜硫酶、ELAPRASE、芳基硫酸酯酶B或NAGLAZYME。46.權利要求41所述的方法或組合物或藥盒,其中所述酶包含KRYSTEXXA(聚乙二醇化重組尿酸酶)。47.權利要求41所述的方法或組合物或藥盒,其中所述單克隆抗體包含HUMIRA(阿達木單抗)。48.權利要求41所述的方法或組合物或藥盒,其中所述細胞因子包含:淋巴因子、白介素、趨化因子、1型細胞因子或2型細胞因子。49.權利要求41所述的方法或組合物或藥盒,其中所述血液因子或凝血因子包含:因子I、因子II、組織因子、因子V、因子VII、因子VIII、因子IX、因子X、因子Xa、因子XII、因子XIII、馮·維勒布蘭德因子、前激肽釋放酶、高分子量激肽原、纖連蛋白、抗凝血酶III、肝素輔因子II、蛋白C、蛋白S、蛋白Z、蛋白Z相關蛋白酶抑制劑(ZPI)、纖溶酶原、α2-抗纖溶酶、組織纖溶酶原激活物(tPA)、尿激酶、纖溶酶原激活物抑制劑-1(PAIl)、纖溶酶原激活物抑制劑-2(PAI2)、癌促凝物質或阿法依伯汀。50.權利要求49所述的方法或組合物或藥盒,其中所述血液因子或凝血因子是因子VIII。51.前述權利要求中任一項所述的方法或組合物或藥盒,其中基于所述合成納米載體的平均值,與所述合成納米載體連接的免疫抑制劑的載量為0.1%至50%。52.權利要求51所述的方法或組合物或藥盒,其中所述載量為0.1%至20%。53.前述權利要求中任一項所述的方法或組合物或藥盒,其中所述合成納米載體包含:脂質納米顆粒、聚合物納米顆粒、金屬納米顆粒、基于表面活性劑的乳劑、樹狀聚體、巴基球、納米線、病毒樣顆?;蛘嘮幕虻鞍字士帕?。54.權利要求53所述的方法或組合物或藥盒,其中所述合成納米載體包含脂質納米顆粒。55.權利要求53所述的方法或組合物或藥盒,其中所述合成納米載體包含脂質體。56.權利要求53所述的方法或組合物或藥盒,其中所述合成納米載體包含金屬納米顆粒。57.權利要求56所述的方法或組合物或藥盒,其中所述金屬納米顆粒包含金納米顆粒。58.權利要求53所述的方法或組合物或藥盒,其中所述合成納米載體包含聚合物納米顆粒。59.權利要求58所述的方法或組合物或藥盒,其中所述聚合物納米顆粒包含聚合物,所述聚合物為非甲氧基封端的普朗尼克聚合物。60.權利要求58或59所述的方法或組合物或藥盒,其中所述聚合物納米顆粒包含:聚酯、與聚醚連接的聚酯、聚氨基酸、聚碳酸酯、聚縮醛、聚縮酮、多糖、聚乙基唑啉或聚乙烯亞胺。61.權利要求60所述的方法或組合物或藥盒,其中所述聚酯包含:聚(乳酸)、聚(乙醇酸)、聚乳酸-乙醇酸共聚物或聚己內酯。62.權利要求60或61所述的方法或組合物或藥盒,其中所述聚合物納米顆粒包含聚酯和與聚醚連接的聚酯。63.權利要求60至62中任一項所述的方法或組合物或藥盒,其中所述聚醚包含聚乙二醇或聚丙二醇。64.前述權利要求中任一項所述的方法或組合物或藥盒,其中使用所述合成納米載體的動態光散射獲得的顆粒大小分布的平均值為大于100nm的直徑。65.權利要求64所述的方法或組合物或藥盒,其中所述直徑大于150nm。66.權利要求65所述的方法或組合物或藥盒,其中所述直徑大于200nm。67.權利要求66所述的方法或組合物或藥盒,其中所述直徑大于250nm。68.權利要求67所述的方法或組合物或藥盒,其中所述直徑大于300nm。69.前述權利要求中任一項所述的方法或組合物或藥盒,其中所述合成納米載體的縱橫比大于1∶1、1∶1.2、1∶1.5、1∶2、1∶3、1∶5、1∶7或1∶10。

說明書

相關申請

本申請依據35U.S.C.§119要求于2013年5月3日提交的美國臨時申請61/819517、于2013年9月24日提交的美國臨時申請61/881851、于2013年9月24日提交的美國臨時申請61/881913、于2013年9月24日提交的美國臨時申請61/881921、于2013年11月21日提交的美國臨時申請61/907177、于2014年3月5日提交的美國臨時申請61/948313、以及于2014年3月5日提交的美國臨時申請61/948384的權益,其每一個的全部內容均通過引用并入本文。

技術領域

本發明涉及與治療性大分子伴隨施用的免疫抑制劑劑量(在一些實施方案中,與合成納米載體連接)及相關方法。該組合物和方法允許治療性大分子特異性的高效藥效學作用。因此,所提供的組合物和方法可用于甚至在治療性大分子的降低的劑量下在對象中產生藥效學響應?;箍砂樗嫻刂馗詞┯帽疚鬧刑峁┑淖楹銜錆頭椒ㄒ圓諭囊┬аё饔煤兔庖哐ё饔?。

背景技術

治療性治療(例如蛋白質或酶替代治療)通常導致針對具體治療劑的不期望免疫應答。在這些情況下,免疫系統中的細胞將該治療劑識別為外來的并試圖將其中和或破壞,正如它們試圖破壞感染性生物,例如細菌和病毒。此類不期望的免疫應答可中和治療性治療的效力或者引起針對該治療劑的超敏反應??賞ü褂妹庖咭種埔┪錮唇檔駝廡┎黃諭Υ?。然而,常規的免疫抑制藥物作用廣泛,并且作用廣泛的免疫抑制劑的使用與嚴重副作用的風險相關,所述副作用例如腫瘤、感染、腎毒性和代謝紊亂。因此,新的治療將是有益的。

發明概述

在一個方面,提供了一種方法,其包括提供免疫抑制劑劑量,其中在一些實施方案中,所述免疫抑制劑劑量與合成納米載體連接;以及將治療性大分子的降低的藥效學有效劑量與免疫抑制劑劑量伴隨施用于對象。在一個實施方案中,所述伴隨施用根據已被證明與當不與免疫抑制劑劑量伴隨施用且各自存在抗治療性大分子抗體應答時施用治療性大分子相比,在與免疫抑制劑劑量伴隨施用后以治療性大分子的降低的藥效學有效劑量產生藥效學作用的方案進行。在所提供之任一種方法的另一個實施方案中,治療性大分子的降低的藥效學有效劑量低于(A)在抗治療性大分子抗體應答存在下施用的、和(B)不與免疫抑制劑劑量伴隨施用的治療性大分子的藥效學有效劑量。

在另一個方面,提供了一種方法,其包括提供免疫抑制劑劑量,其中在一些實施方案中,所述免疫抑制劑劑量與合成納米載體連接;以及將治療性大分子的藥效學有效劑量與免疫抑制劑劑量伴隨施用。在一個實施方案中,伴隨施用根據已被證明與當不與免疫抑制劑劑量伴隨施用且各自存在抗治療性大分子抗體應答時施用治療性大分子相比,在與免疫抑制劑劑量伴隨施用后增強治療性大分子的藥效學作用的方案進行。

在另一個方面,提供了一種方法,其包括提供免疫抑制劑劑量,其中在一些實施方案中,所述免疫抑制劑劑量與合成納米載體連接;將治療性大分子的藥效學有效劑量與免疫抑制劑劑量伴隨施用;以及在伴隨施用之后記錄增強的藥效學作用。

在另一個方面,提供了一種方法,其包括提供在一個或更多個對象中重復給藥后產生或預期產生抗治療性大分子抗體的治療性大分子;以及提供免疫抑制劑劑量,其中所述免疫抑制劑劑量與合成納米載體連接。在一些實施方案中,所述方法包括以相同或較低的劑量將治療性大分子與所述免疫抑制劑劑量向對象伴隨地重復給藥。在一些實施方案中,伴隨施用根據已被證明使得在給對象的兩個或更多個治療性大分子劑量期間維持所述治療性大分子的藥效學作用的方案進行。

在所提供之任一種方法的一個實施方案中,所述方法還包括確定所述方案。在所提供之任一種方法的另一個實施方案中,所述方法還包括確定藥效學有效劑量,例如降低的或提高的藥效學有效劑量。在所提供之任一種方法的另一個實施方案中,所述方法還包括在施用之前和/或之后在對象中評估藥效學作用。在所提供之任一種方法的另一個實施方案中,重復伴隨施用一次或更多次。在所提供之任一種方法的另一個實施方案中,所述施用通過靜脈內、腹膜內或皮下施用進行。在所提供之任一種方法的另一個實施方案中,所述對象處于抗治療性大分子抗體應答的風險之中。在所提供之任一種方法的另一個實施方案中,所述對象為其中預期發生抗治療性大分子應答的對象。

在另一個方面,提供了一種組合物或藥盒(kit),其包含免疫抑制劑劑量,其中在一些實施方案中,所述免疫抑制劑與合成納米載體連接;和治療性大分子的降低的藥效學有效劑量。

在另一個方面,提供了一種組合物或藥盒,其包含與免疫抑制劑劑量相組合的用于本文中提供之任一種方法的治療性大分子的降低的藥效學有效劑量,其中在一些實施方案中,所述免疫抑制劑與合成納米載體連接。

在所提供之任一種組合物或藥盒的一個實施方案中,所述組合物或藥盒用于本文中提供的任一種方法。在所提供之任一種組合物或藥盒的一個實施方案中,所述組合物或藥盒還包含可藥用載體。

在所提供之任一種方法或組合物或藥盒的一個實施方案中,所述治療性大分子未與合成納米載體連接。在所提供之任一種方法或組合物或藥盒的另一個實施方案中,所述治療性大分子與合成納米載體連接。在所提供之任一種方法或組合物或藥盒的另一個實施方案中,所述合成納米載體不包含治療性大分子APC可呈遞抗原。

在所提供之任一種組合物或藥盒的一個實施方案中,所述免疫抑制劑劑量和治療性大分子分別包含在容器中。在所提供之任一種組合物或藥盒的另一個實施方案中,所述免疫抑制劑劑量和治療性大分子包含在獨立容器中。在所提供之任一種組合物或藥盒的另一個實施方案中,所述免疫抑制劑劑量和治療性大分子包含在同一容器中。

在所提供之任一種方法或組合物或藥盒的一個實施方案中,所述治療性大分子的降低的藥效學有效劑量比(A)在抗治療性大分子抗體應答存在下施用的、和(B)不與免疫抑制劑劑量伴隨施用的治療性大分子的藥效學有效劑量低至少30%。在所提供之任一種方法或組合物或藥盒的另一個實施方案中,所述降低的藥效學有效劑量降低至少40%。在所提供之任一種方法或組合物或藥盒的另一個實施方案中,所述降低的藥效學有效劑量降低至少50%。

在所提供之任一種方法或組合物或藥盒的一個實施方案中,所述免疫抑制劑劑量包含:他汀類、mTOR抑制劑、TGF-β信號傳導劑、皮質類固醇、線粒體功能的抑制劑、P38抑制劑、NF-κβ抑制劑、腺苷受體激動劑、前列腺素E2激動劑、磷酸二酯酶4抑制劑、HDAC抑制劑或蛋白酶體抑制劑。在所提供之任一種方法或組合物或藥盒的另一個實施方案中,mTOR抑制劑是雷帕霉素。

在所提供之任一種方法或組合物或藥盒的一個實施方案中,所述治療性大分子包含治療性蛋白質。在所提供之任一種方法或組合物或藥盒的另一個實施方案中,所述治療性大分子包含治療性多核苷酸。在所提供之任一種方法或組合物或藥盒的另一個實施方案中,所述治療性蛋白質用于蛋白質替代或蛋白質補充治療。在所提供之任一種方法或組合物或藥盒的另一個實施方案中,所述治療性蛋白質包含可輸注或可注射的治療性蛋白質、酶、酶輔因子、激素、血液因子或凝血因子、細胞因子、干擾素、生長因子、單克隆抗體、多克隆抗體或與龐皮病(Pompe’sdisease)相關的蛋白質。在所提供之任一種方法或組合物或藥盒的另一個實施方案中,所述可輸注或可注射的治療性蛋白質包含:托珠單抗(Tocilizumab)、α-1抗胰蛋白酶、Hematide、白蛋白干擾素α-2b(albinterferonalfa-2b)、Rhucin、替莫瑞林(tesamorelin)、奧瑞珠單抗(ocrelizumab)、貝利木單抗(belimumab)、聚乙二醇化重組尿酸酶(pegloticase)、聚乙二醇化重組假絲酵母尿酸酶(pegsiticase)、他利苷酶α(taliglucerasealfa)、阿加糖酶α(agalsidasealfa)或葡糖腦苷脂酶α(velaglucerasealfa)。在所提供之任一種方法或組合物或藥盒的另一個實施方案中,所述酶包含:氧化還原酶、轉移酶、水解酶、裂合酶、異構酶或連接酶。在所提供之任一種方法或組合物或藥盒的另一個實施方案中,所述酶包含用于溶酶體貯積癥的酶替代治療的酶。在所提供之任一種方法或組合物或藥盒的另一個實施方案中,所述用于溶酶體貯積癥的酶替代治療的酶包含:伊米苷酶(imiglucerase)、a-半乳糖苷酶A(a-galA)、阿加糖酶β(agalsidasebeta)、酸性α-葡糖苷酶(acidα-glucosidase,GAA)、阿葡糖苷酶α(alglucosidasealfa)、LUMIZYME、MYOZYME、芳基硫酸酯酶B、拉羅尼酶(laronidase)、ALDURAZYME、艾杜硫酶(idursulfase)、ELAPRASE、芳基硫酸酯酶B或NAGLAZYME。在所提供之任一種方法或組合物或藥盒的另一個實施方案中,所述酶包含KRYSTEXXA(聚乙二醇化重組尿酸酶)。在所提供之任一種方法或組合物或藥盒的另一個實施方案中,所述單克隆抗體包含HUMIRA(阿達木單抗)。在所提供之任一種方法或組合物或藥盒的另一個實施方案中,所述細胞因子包含:淋巴因子、白介素、趨化因子、1型細胞因子或2型細胞因子。在所提供之任一種方法或組合物或藥盒的另一個實施方案中,所述血液因子或凝血因子包含:因子I、因子II、組織因子、因子V、因子VII、因子VIII、因子IX、因子X、因子Xa、因子XII、因子XIII、馮·維勒布蘭德因子(vonWillebrandfactor)、前激肽釋放酶(prekallikrein)、高分子量激肽原、纖連蛋白、抗凝血酶III、肝素輔因子II、蛋白C、蛋白S、蛋白Z、蛋白Z相關蛋白酶抑制劑(proteinZ-relatedproteaseinhibitor,ZPI)、纖溶酶原、α2-抗纖溶酶、組織纖溶酶原激活物(tissueplasminogenactivator,tPA)、尿激酶、纖溶酶原激活物抑制劑-1(plasminogenactivatorinhibitor-1,PAI1)、纖溶酶原激活物抑制劑-2(plasminogenactivatorinhibitor-2,PAI2)、癌促凝物質或阿法依伯汀(epoetinalfa)。在所提供之任一種方法或組合物或藥盒的另一個實施方案中,所述血液因子或凝血因子是因子VIII。

在所提供之任一種方法或組合物或藥盒的一個實施方案中,基于所有合成納米載體的平均值,與合成納米載體連接的免疫抑制劑的載量為0.1%至50%。在所提供之任一種方法或組合物或藥盒的另一個實施方案中,所述載量為0.1%至20%。

在所提供之任一種方法或組合物或藥盒的一個實施方案中,所述合成納米載體包含脂質納米顆粒、聚合物納米顆粒、金屬納米顆粒、基于表面活性劑的乳劑(surfactant-basedemulsion)、樹狀聚體(dendrimer)、巴基球(buckyball)、納米線(nanowire)、病毒樣顆?;蛘嘮幕虻鞍字士帕?。在所提供之任一種方法或組合物或藥盒的另一個實施方案中,所述合成納米載體包含脂質納米顆粒。在所提供之任一種方法或組合物或藥盒的另一個實施方案中,所述合成納米載體包含脂質體。在所提供之任一種方法或組合物或藥盒的另一個實施方案中,所述合成納米載體包含金屬納米顆粒。在所提供之任一種方法或組合物或藥盒的另一個實施方案中,所述金屬納米顆粒包含金納米顆粒。在所提供之任一種方法或組合物或藥盒的另一個實施方案中,所述合成納米載體包含聚合物納米顆粒。在所提供之任一種方法或組合物或藥盒的另一個實施方案中,所述聚合物納米顆粒包含聚合物,其為非甲氧基封端的普朗尼克(pluronic)聚合物。在所提供之任一種方法或組合物或藥盒的另一個實施方案中,所述聚合物納米顆粒包含聚酯、與聚醚連接的聚酯、聚氨基酸、聚碳酸酯、聚縮醛、聚縮酮、多糖、聚乙基唑啉或聚乙烯亞胺。在所提供之任一種方法或組合物或藥盒的另一個實施方案中,所述聚酯包含:聚(乳酸)、聚(乙醇酸)、聚乳酸-乙醇酸共聚物或聚己內酯。在所提供之任一種方法或組合物或藥盒的另一個實施方案中,所述聚合物納米顆粒包含聚酯和與聚醚連接的聚酯。在所提供之任一種方法或組合物或藥盒的另一個實施方案中,所述聚醚包含聚乙二醇或聚丙二醇。

在所提供之任一種方法或組合物或藥盒的一個實施方案中,使用合成納米載體的動態光散射獲得的顆粒大小分布的平均值為大于100nm的直徑。在所提供之任一種方法或組合物或藥盒的另一個實施方案中,所述直徑大于150nm。在所提供之任一種方法或組合物或藥盒的另一個實施方案中,所述直徑大于200nm。在所提供之任一種方法或組合物或藥盒的另一個實施方案中,所述直徑大于250nm。在所提供之任一種方法或組合物或藥盒的另一個實施方案中,所述直徑大于300nm。

在所提供之任一種方法或組合物或藥盒的一個實施方案中,所述合成納米載體的縱橫比(aspectratio)大于1∶1、1∶1.2、1∶1.5、1∶2、1∶3、1∶5、1∶7或1∶10。

在另一個方面,提供了制備本文中提供的任一種組合物或藥盒的方法。在一個實施方案中,所述制備方法包括產生治療性大分子的劑量或劑型和產生免疫抑制劑的劑量或劑型。在一些實施方案中,治療性大分子的劑量或劑型為治療性大分子的降低的藥效學有效劑量。在所提供之任一種制備方法的另一個實施方案中,產生免疫抑制劑的劑量或劑型的步驟包括使免疫抑制劑與合成納米載體連接。在所提供之任一種制備方法的另一個實施方案中,所述方法還包括將免疫抑制劑的劑量或劑型與治療性大分子的劑量或劑型在藥盒中組合。

在另一個方面,提供了本文中提供的任一種組合物或藥盒用于制備用于在對象中降低抗治療性大分子抗體應答的藥物的用途。在一個實施方案中,所述組合物或藥盒包含免疫抑制劑和治療性大分子,其中可以以治療性大分子的降低的藥效學有效劑量提供治療性大分子。在本文中提供的任一種用途的另一個實施方案中,免疫抑制劑與合成納米載體連接。在本文中提供的任一種用途的另一個實施方案中,所述用途用于實現本文中提供的任一種方法。

在另一個方面,本文中提供的任一種組合物或藥盒可用于本文中提供的任一種方法。在一個實施方案中,所述組合物或藥盒包含治療性大分子的一種或更多種劑量或劑型和/或免疫抑制劑的一種或更多種劑量或劑型。在一個實施方案中,治療性大分子的劑量為降低的藥效學有效劑量。在另一個實施方案中,免疫抑制劑與合成納米載體連接。

在另一個方面,提供了制備意圖用于降低抗治療性大分子抗體應答的藥物的方法。在一個實施方案中,所述藥物包含免疫抑制劑和/或治療性大分子,其中治療性大分子可以在降低的藥效學有效劑量下。在本文中提供的任一種制備方法的另一個實施方案中,免疫抑制劑與合成納米載體連接。

附圖簡述

圖1示出了在本文中提供的伴隨施用下循環抗原特異性抗體產生的水平。

圖2示出了在本文中提供的伴隨施用下循環抗原特異性抗體產生的水平。

圖3提供了在本文中提供的伴隨施用下的抗OVA抗體效價。

圖4提供了在本文中提供的伴隨施用下的抗KLH抗體效價。

圖5示出了在最后的納米載體和FVIII給藥后1個月針對FVIII的抗體回憶應答。

圖6A和6B示出了血友病A小鼠中納米載體和FVIII給藥的效力。

圖7A和7B示出了在用有或無與雷帕霉素連接之納米載體的HUMIRA/阿達木單抗處理的小鼠中針對HUMIRA的免疫應答。

圖8示出了在用有或無與雷帕霉素連接之納米載體的鑰孔林普貝血藍蛋白(KeyholeLimpetHemocyanin,KLH)處理的小鼠中的抗KLH抗體效價。

圖9示出了在用有或無與雷帕霉素連接之納米載體的卵清蛋白(ovalbumin,OVA)處理的小鼠中的抗OVA抗體效價。

圖10示出了在用有或無與雷帕霉素連接之納米載體的KRYSTEXXA處理的小鼠中的抗KRYSTEXXA抗體效價。

圖11示出了在存在或不存在與雷帕霉素連接之納米載體的情況下,用OVA和KLH處理的小鼠中的抗體效價。

圖12A和12B示出了在用有或無與雷帕霉素連接之納米載體的KLH處理的小鼠中針對KLH的免疫應答。

圖13A和13B示出了在用有或無與雷帕霉素連接之納米載體的HUMIRA/阿達木單抗處理的小鼠中針對HUMIRA/阿達木單抗的免疫應答。

圖14提供了用于實施本文中提供的方法的一個示例性方案。

圖15示出了關于用HUMIRA治療的實施本文中提供的方法的有益效果。

圖16提供了用于實施本文中提供的方法的一個示例性方案。

圖17示出了關于用HUMIRA治療的實施本文中提供的方法的有益效果。

圖18證明了作為與合成納米載體連接的兩種不同免疫抑制劑的結果,抗蛋白質抗體應答降低。

圖19示出了關于用HUMIRA治療的實施本文中提供的方法的另一個示例性方案和有益效果。

發明詳述

在對本發明進行詳細描述之前,應當理解,本發明不限于具體舉例說明的材料或工藝參數,因為其當然可以變化?;褂斫獾氖?,本文中使用的術語僅是為了描述本發明的一些具體實施方案,并非旨在對描述本發明的替代術語的用途進行限制。

出于所有目的,本文中引用的所有出版物、專利和專利申請(無論上文或下文)均在此通過引用整體并入。

除非所述內容另有明確指出,否則本說明書及所附權利要求書中使用的沒有數量詞修飾的名詞表示一個/種或更多個/種。例如,提及的“聚合物”包括兩種或更多種此類分子的混合物或不同分子量的單一聚合物種類的混合物,提及的“合成納米載體”包括兩種或更多種此類合成納米載體的混合物或多種這樣的合成納米載體,提及的“RNA分子”包括兩種或更多種此類RNA分子的混合物或多種這樣的RNA分子,提及的“免疫抑制劑”包括兩種或更多種此類材料的混合物或多種這樣的免疫抑制劑分子等。

本文中使用的術語“包含/包括”或其變化形式應理解為指包括引用的任何整體(例如特點、要素、特征、特性、方法/處理步驟或限制)或整體(例如特點、要素、特征、特性、方法/處理步驟或限制)的組,但不排除任何其他整體或整體的組。因此,本文中使用的術語“包含/包括”是包括性的并且不排除另外的未引用整體或方法/處理步驟。

在本文中提供任一種組合物和方法的一些實施方案中,可用“基本由…組成”或“由…組成”來替代“包含/包括”。本文中使用的短語“基本由…組成”要求指定的整體或步驟以及不顯著影響所要求?;ぶ⒚韉奶卣骰蜆δ艿哪切?。本文中使用的術語“由…組成”僅用于指所引用的整體(例如特點、要素、特征、特性、方法/處理步驟或限制)或整體(例如特點、要素、特征、特性、方法/處理步驟或限制)的組的存在。

A.引言

本文中提供的方法、組合物或藥盒可用于在已發生針對治療性大分子的抗體應答的對象中提高該治療性大分子的藥效學作用。因此,本文中提供的方法或組合物或藥盒可用于提高治療性大分子的藥效學作用(其否則由于抗治療性大分子抗體應答而減弱)。不受特定理論的限制,認為可使用所提供的方法、組合物或藥盒來降低針對治療性大分子的不期望體液免疫應答。在一些實施方案中,所述方法、組合物或藥盒可用于使對象對治療性大分子產生耐受性,降低當在不伴隨施用所提供的免疫抑制劑劑量的情況下施用治療性大分子時將否則產生的不期望免疫應答,所述劑量可重復地伴隨施用。此類不期望免疫應答可導致對治療性大分子的清除增強或對治療性大分子之治療活性的其他干擾。因此,作為不期望免疫應答降低的結果,用本文所提供的方法、組合物或藥盒可增強治療性大分子的藥效學作用和/或可使用治療性大分子的降低的劑量來實現相同作用水平。因此,作為不期望免疫應答降低的另一結果,可向對象施用治療性大分子的重復給藥。

已出乎意料且令人驚訝地發現,在抗治療性大分子抗體應答存在下將免疫抑制劑(優選地,在一些實施方案中,當與合成納米載體連接時)與治療性大分子伴隨施用可產生增強的藥效學作用。例如,上述組合可有助于中和干擾治療性大分子的期望治療效果的抗治療性大分子特異性抗體。在一些實施方案中,本文中提供的方法、組合物或藥盒不僅降低針對治療性大分子的不期望免疫應答,而且使得增強當單獨施用治療性大分子時否則減弱的治療性大分子的期望治療效果(作為針對該治療性大分子的不期望免疫應答的結果)。因此,本文中提供的方法、組合物或藥盒可使對象獲得治療性大分子的治療益處而無需提高治療性大分子的劑量,而當在無本文中提供之本發明的益處的情況下施用時,為了補償針對治療性大分子的不期望免疫應答一般將提高治療性大分子的劑量。令人驚訝的是,本文中提供的方法、組合物或藥盒甚至允許向對象施用降低的治療性大分子劑量以實現相同的治療益處。

由于可用所提供的方法、組合物或藥盒來抵消在用治療性大分子進行治療性治療期間產生的不期望免疫應答,本發明可用于實現增強的藥效學作用或者用于在其中產生或預期產生針對治療性大分子之不期望免疫應答的對象中使用降低的藥效學有效劑量。在本文中提供的任一種方法的一個實施方案中,所述對象可以是處于這樣的不期望免疫應答的風險之中的對象。

現在,將在下文中對本發明進行更詳細的描述。

B.定義

“施用”意指以在藥理學上可用的方式向對象提供物質。在一些實施方案中,該術語旨在包括“引起施用”?!耙鶚┯謾幣庵鋼苯踴蚣浣擁匾?、促使、鼓勵、幫助、誘導或指導另一方施用物質。

在用于向對象施用之組合物或劑量的情況下,“有效量”指該組合物或劑量在對象中產生一種或更多種期望應答的量,所述期望應答例如產生致耐受性免疫應答(例如,治療性大分子特異性B細胞之增殖、活化、誘導、存活、募集的降低或者治療性大分子特異性抗體之產生的降低)。在一些實施方案中,有效量為藥效學有效量。因此,在一些實施方案中,有效量為本文中提供的組合物或劑量(或本文中提供的多個組合物或劑量)之產生本文中提供的一種或更多種期望藥效學作用、治療效果和/或免疫應答的任意量。該量可用于體外或體內目的。對于體內目的,所述量可以是臨床醫生認為可對需要治療性大分子施用和/或針對它的抗原特異性免疫耐受的對象具有臨床益處的量。

有效量可涉及降低不期望免疫應答的水平,但是在一些實施方案中,其涉及完全阻止不期望的免疫應答。有效量還可涉及延遲不期望免疫應答的發生。有效量還可以是產生期望治療終點或期望治療結果的量。在另一些實施方案中,有效量可涉及增強期望應答(例如治療終點或結果)的水平。優選地,有效量在對象中引起針對抗原(例如治療性大分子)的致耐受性免疫應答??賞ü9娣椒ɡ醇嗖饃鮮鋈我幌畹氖迪?。

在所提供之任一種方法的一些實施方案中,有效量為其中期望應答在對象中持續至少1周、至少2周、至少1個月、至少2個月、至少3個月、至少4個月、至少5個月或更久的量。在所提供之任一種組合物或方法的另一些實施方案中,有效量為在至少1周、至少2周、至少1個月、至少2個月、至少3個月、至少4個月、至少5個月或更久內產生可測量的期望應答的量。

當然,有效量將取決于所治療的具體對象;病癥、疾病或紊亂的嚴重程度;個體患者的參數,包括年齡、身體狀況、身材和體重;治療的持續時間;同時治療(如果有的話)的性質;具體的施用途徑以及在健康從業者的知識和經驗范圍內的類似因素。這些因素是本領域普通技術人員所公知的并且可僅用常規實驗就可解決。一般優選使用最大劑量,即根據合理醫療判斷的最高安全劑量。然而,本領域普通技術人員將理解,患者可由于醫學原因、心理原因或實際上任何其他原因而堅持使用較低劑量或可耐受劑量。

一般來說,本發明組合物中免疫抑制劑和/或治療性大分子的劑量指免疫抑制劑和/或治療性大分子的量?;蛘?,可基于提供期望量的免疫抑制劑和/或治療性大分子的合成納米載體的數量來施用所述劑量。

“抗治療性大分子抗體應答”或“抗治療性大分子特異性抗體應答”為作為施用治療性大分子之結果的抗治療性大分子特異性抗體的產生或用于產生此類抗體的過程的誘導。在一些實施方案中,這樣的應答抵消治療性大分子的治療作用。

“抗原”意指B細胞抗原或T細胞抗原?!翱乖睦嘈汀幣庵腹燦邢嗤蚧鞠嗤目乖蘊卣韉姆腫?。在一些實施方案中,抗原可以是蛋白質、多肽、肽、脂蛋白、糖脂、多核苷酸、多糖或者包含在細胞中或在細胞內表達。在一些實施方案中,例如當抗原未經充分定義或表征時,抗原可包含在細胞或組織制備物、細胞碎片、細胞外來體、條件化培養基等中。

“抗原特異性的”指由于該抗原或其一部分的存在而產生的任何免疫應答或產生特異性地識別或結合該抗原之分子的任何免疫應答。在一些實施方案中,當抗原包含治療性大分子時,抗原特異性的可意指治療性大分子特異性的。例如,當免疫應答是抗原特異性抗體產生(例如治療性大分子特異性抗體產生)時,產生特異性地結合該抗原(例如治療性大分子)的抗體。作為另一個實例,當免疫應答是抗原特異性B細胞或CD4+T細胞增殖和/或活性時,增殖和/或活性由識別單獨或在與MHC分子、B細胞等的復合物中的抗原或其一部分引起。

“評估藥效學作用”指對體外或體內藥效學作用的水平、存在或不存在、降低、提高等的任何測量或確定??啥源傭韻蠡竦玫囊環莼蚋嚳菅方姓庋牟飭炕蛉范???梢砸員疚鬧刑峁┑幕蟣玖煊蛑辛磽庖閻娜我恢址椒ɡ唇姓庋鈉攔?。

“處于風險之中”的對象為健康從業者認為具有患疾病、紊亂或病癥的可能性的對象,或者為健康從業者認為具有經歷本文中所提供的不期望抗治療性大分子抗體應答的可能性并且將受益于本文中提供的組合物和方法的對象。在本文中提供的任一種方法、組合物或藥盒的一個實施方案中,所述對象為處于具有針對治療性大分子之抗治療性大分子抗體應答的風險之中的對象。在本文中提供的任一種方法、組合物或藥盒的另一個實施方案中,所述對象為預期具有針對治療性大分子的抗治療性大分子抗體應答的對象。

“連接”或“連接的”或者“偶聯”或“偶聯的”(等)意指使一個實體(例如一個部分)與另一個實體化學結合。在一些實施方案中,連接是共價的,意指連接發生在兩個實體之間存在共價鍵的情況下。在一些非共價實施方案中,非共價連接由非共價相互作用介導,所述非共價相互作用包括但不限于:電荷相互作用、親和性相互作用、金屬配位、物理吸附、主體-客體相互作用、疏水性相互作用、TT堆積相互作用、氫鍵合相互作用、范德華相互作用、磁性相互作用、靜電相互作用、偶極-偶極相互作用和/或其組合。在一些實施方案中,包封是連接的一種形式。

在一些實施方案中,治療性大分子與免疫抑制劑彼此未連接,意指治療性大分子和免疫抑制劑未經歷特異性地意圖使彼此化學締合的過程。在一些實施方案中,治療性大分子和/或免疫抑制劑未與合成納米載體連接,意指治療性大分子(和/或免疫抑制劑)和合成納米載體未經歷特異性地使彼此化學締合的過程。

除非另有指出,否則本文中使用的術語“平均值”指算術平均值。

當應用于兩種或更多種材料和/或藥劑(在本文中也稱為組分)時,“組合”旨在對其中兩種或更多種材料/藥劑相締合的材料進行定義??山櫸值ザ辣曄?,例如第一組分、第二組分、第三組分等。在該情況下的術語“組合的”和“組合”可作相應解釋。

兩種或更多種材料/藥劑以組合相締合可以是物理的或非物理的。物理締合的組合材料/藥劑的實例包括:

·包含混合的兩種或更多種材料/藥劑(例如在同一單位劑量內)的組合物(例如單一制劑);

·包含其中兩種或更多種材料/藥劑經化學/物理化學連接(例如通過交聯、分子聚集或與常見的載劑部分結合)的材料的組合物;

·包含其中兩種或更多種材料/藥劑經化學/物理化學共包裝(例如,布置在脂囊泡、顆粒(例如微米顆?;蚰擅卓帕?或乳劑微滴之上或之中)的材料的組合物;

·其中兩種或更多種材料/藥劑經共包裝或共存在(例如作為一組單位劑量的一部分)的藥盒、藥物包裝或患者包裝;

經非物理締合的組合材料/藥劑的實例包括:

·包含兩種或更多種材料/藥劑中的至少一種的材料(例如非單一制劑),附帶有用于使該至少一種化合物/藥劑臨時締合以形成這兩種或更多種材料/藥劑的物理締合的說明書;

·包含兩種或更多種材料/藥劑中的至少一種的材料(例如非單一制劑),附帶有用于使用這兩種或更多種材料/藥劑進行聯合治療的說明書;

·包含兩種或更多種材料/藥劑中的至少一種的材料,附帶有用于向已施用(或正在施用)該兩種或更多種材料/藥劑中的其他材料/藥劑的患者群施用的說明書;

·以特異性地適合與兩種或更多種材料/藥劑中的其他材料/藥劑組合使用的量或形式包含這兩種或更多種材料/藥劑中的至少一種的材料。

本文中使用的術語“聯合治療”旨在對治療進行定義,其包括使用兩種或更多種材料/藥劑的組合(如下文所定義的)。因此,本申請中提及的材料/藥劑的“聯合治療”、“組合”和“組合”使用可指作為同一總治療方案的一部分施用的材料/藥劑。因此,兩種或更多種材料/藥劑各自的劑量學可有所不同:每一種可在相同時間或不同時間施用。因此,應當理解,可依次(例如之前或之后)或同時(在同一藥物制劑(即一起)中或者在不同藥物制劑(即獨立地)中)施用組合中的材料/藥劑。在同一制劑中時,同時是作為單一制劑;而在不同藥物制劑中時,同時為非單一的。兩種或更多種材料/藥劑各自在聯合治療中的劑量學在施用途徑方面也可有所不同。

“伴隨”意指將兩種或更多種材料/藥劑以時間上相關、優選時間上足夠相關以提供對生理學或免疫學應答之調節的方式施用于對象,并且甚至更優選地將兩種或更多種材料/藥劑組合施用。在一些實施方案中,伴隨施用可包括在指定時間內,優選在1個月內,更優選在1周內,仍更優選在1天內并且甚至更優選在1小時內施用兩種或更多種材料/藥劑。在一些實施方案中,可重復地伴隨施用所述材料/藥劑;即不止一次進行伴隨施用,例如實施例中可提供的。

“確定”意指確知實際關系。確定可以以多種方式實現,包括但不限于進行實驗或者作出預測。例如,可如下確定免疫抑制劑或治療性大分子的劑量:以測試劑量開始并使用已知的縮放(scaling)技術(例如異速縮放或等速縮放)來確定施用劑量。這還可用于確定如本文中提供的方案。在另一個實施方案中,可通過在對象中測試多種劑量來確定所述劑量,即通過基于經驗和指導數據進行直接試驗。在一些實施方案中,“確定”包括“引起確定”?!耙鶉范ā幣庵敢?、促使、鼓勵、幫助、誘導或指導實體確知實際關系或者與實體協同作用以使其確知實際關系;包括直接或間接地,或者明確或隱含地。

“劑型”意指在適合向對象施用的介質、載體、載劑或裝置中的藥理學和/或免疫學活性材料。本文中提供的任一種組合物或劑量均可以是劑型形式。

“劑量”指在給定時間內向對象施用的藥理學和/或免疫學活性材料的具體量。

“包封”意指將至少一部分物質封裝在合成納米載體內。在一些實施方案中,將物質全部封裝在合成納米載體內。在另一些實施方案中,大部分或全部的經包封物質不暴露于合成載體外部的局部環境。在另一些實施方案中,不超過50%、40%、30%、20%、10%或5%(重量/重量)暴露于局部環境。包封與吸附不同,吸附將大部分或全部的物質置于合成載體的表面上并使物質暴露于合成納米載體外部的局部環境。

“產生”意指自身直接或間接地引起作用例如發生生理學或免疫學應答(例如,致耐受性免疫應答)。

“鑒定對象”為這樣的任何活動或活動集合,其允許臨床醫生將對象識別為可受益于本文中提供的方法、組合物或藥盒的對象。優選地,經鑒定的對象為需要來自如本文中提供的治療性大分子的治療益處和其中已發生或預期發生抗治療性大分子特異性抗體應答的對象。所述活動或活動集合可以本身直接采取或者間接采取。在本文中提供的任一種方法的一個實施方案中,所述方法還包括鑒定需要本文中提供的方法、組合物或藥盒的對象。

“免疫抑制劑”意指這樣的化合物,其導致APC具有免疫抑制作用或者T細胞或B細胞被抑制(例如,致耐受性作用)。免疫抑制作用一般指APC產生或表達降低、抑制或預防不期望的免疫應答或促進期望免疫應答(例如,調節性免疫應答)的細胞因子或其他因子。當APC在識別由該APC呈遞之抗原的免疫細胞上獲取免疫抑制功能(屬于免疫抑制作用)時,認為該免疫抑制作用對所呈遞的抗原具有特異性。不受任何特定理論的限制,認為:免疫抑制作用是免疫抑制劑被遞送至APC的結果,優選在抗原存在下。在一個實施方案中,免疫抑制劑致使APC促進一個或更多個免疫效應細胞中的調節性表型。例如,調節性表型的特征可在于:抑制抗原特異性CD4+T細胞或B細胞的產生、誘導、刺激或募集,抑制抗原特異性抗體的產生,Treg細胞(例如CD4+CD25高FoxP3+Treg細胞)的產生、誘導、刺激或募集等。這可以是CD4+T細胞或B細胞轉化成調節性表型的結果。這也可以是其他免疫細胞(CD8+T細胞、巨噬細胞和iNKT細胞)中誘導FoxP3的結果。在一個實施方案中,免疫抑制劑在其對抗原進行加工之后影響APC的應答。在另一個實施方案中,免疫抑制劑不干涉對抗原的加工。在另一個實施方案中,免疫抑制劑不是凋亡信號傳導分子。在另一個實施方案中,免疫抑制劑不是磷脂。

免疫抑制劑包括但不限于:他汀類;mTOR抑制劑,例如雷帕霉素或雷帕霉素類似物;TGF-β信號傳導劑;TGF-β受體激動劑;組蛋白去乙?;敢種萍?,例如曲古抑菌素A;皮質類固醇;線粒體功能的抑制劑,例如魚藤酮;P38抑制劑;NF-κβ抑制劑,例如6Bio、地塞米松、TCPA-1、IKKVII;腺苷受體激動劑;前列腺素E2激動劑(prostaglandinE2agonist,PGE2),例如米索前列醇;磷酸二酯酶抑制劑,例如磷酸二酯酶4抑制劑(phosphodiesterase4inhibitor,PDE4),例如咯利普蘭;蛋白酶體抑制劑;激酶抑制劑;G蛋白偶聯受體激動劑;G蛋白偶聯受體拮抗劑;糖皮質激素;類視黃醇;細胞因子抑制劑;細胞因子受體抑制劑;細胞因子受體激活劑;過氧化物酶體增殖物激活受體拮抗劑;過氧化物酶體增殖物激活受體激動劑;組蛋白去乙?;敢種萍?;鈣調神經磷酸酶抑制劑;磷酸酶抑制劑;P13KB抑制劑,例如TGX-221;自噬抑制劑,例如3-甲基腺嘌呤;芳基烴受體抑制劑;蛋白酶體抑制劑I(proteasomeinhibitorI,PSI);以及氧化的ATP,例如P2X受體阻斷劑。免疫抑制劑還包括:IDO、維生素D3、環孢素(例如環孢素A)、芳基烴受體抑制劑、白藜蘆醇、硫唑嘌呤(azathiopurine,Aza)、6-巰基嘌呤(6-mercaptopurine,6-MP)、6-硫鳥嘌呤(6-thioguanine,6-TG)、FK506、薩菲菌素A(sanglifehrinA)、沙美特羅、嗎替麥考酚酯(mycophenolatemofetil,MMF)、阿司匹林以及其他COX抑制劑、尼氟滅酸、雌三醇、甲氨喋呤和雷公藤內酯(triptolide)。在一些實施方案中,免疫抑制劑可包含本文中提供的藥劑中的任一種。

免疫抑制劑可以是直接提供對APC的免疫抑制作用或者其可以是間接提供免疫抑制作用的化合物(即,在施用后以某種方式進行加工)。因此,免疫抑制劑包括本文中提供的任何化合物的前藥形式。

在本文中提供之任一種方法、組合物或藥盒的一些實施方案中,本文中提供的免疫抑制劑與合成納米載體連接。在一些優選實施方案中,免疫抑制劑是除構成合成納米載體之結構的材料之外的組分。例如,在一個實施方案中,當合成納米載體由一種或更多種聚合物構成時,免疫抑制劑為除所述一種或更多種聚合物之外并與其連接的化合物。作為另一個實例,在一個實施方案中,當合成納米載體由一種或更多種脂質構成時,免疫抑制劑仍為除所述一種或更多種脂質之外并與其連接。在一些實施方案中,例如當合成納米載體的材料也引起免疫抑制作用時,免疫抑制劑為除合成納米載體的材料之外存在的引起免疫抑制作用的組分。

其他示例性的免疫抑制劑包括但不限于:小分子藥物、天然產物、抗體(例如針對CD20、CD3、CD4的抗體)、基于生物制品的藥物、基于碳水化合物的藥物、納米顆粒、脂質體、RNAi、反義核酸、適配體、甲氨蝶呤、NSAID;芬戈莫德;那他珠單抗;阿侖單抗;抗-CD3;他克莫司(FK506);細胞因子和生長因子,例如TGF-β和IL-10;等。另一些免疫抑制劑是本領域技術人員已知的并且本發明在此方面不受限制。

在本文中提供之任一種方法、組合物或藥盒的一些實施方案中,免疫抑制劑是如納米結晶形式的形式,由此免疫抑制劑的形式本身是顆?;蚩帕Q?。在一些實施方案中,這樣的形式模擬病毒或其他外來病原體。很多藥物是已被納米化的并且本領域普通技術人員知曉用于產生這樣的藥物形式的合適方法。藥物納米晶體(例如納米結晶雷帕霉素)是本領域普通技術人員已知的(Katteboinaa,等2009,InternationalJournalofPharmTechResesarch;第1卷,第3期;第682-694頁)。本文中使用的“藥物納米晶體”指不包含載體或基質材料的藥物(例如,免疫抑制劑)的形式。在一些實施方案中,藥物納米晶體包含90%、95%、98%或99%或更多藥物。用于產生藥物納米晶體的方法包括但不限于:研磨、高壓均質化、沉淀、噴霧干燥、超臨界溶液的迅速膨脹(rapidexpansionofsupercriticalsolution,RESS)、技術(BaxterHealthcare)和NanocrystalTechnologyTM(ElanCorporation)。在一些實施方案中,表面活性劑或穩定劑可用于藥物納米晶體的空間或靜電穩定性。在一些實施方案中,免疫抑制劑的納米晶體或納米結晶形式可用于提高免疫抑制劑(特別是不溶性或不穩定的免疫抑制劑)的溶解度、穩定性和/或生物利用度。在一些實施方案中,將降低的藥效學有效劑量的治療性大分子與納米結晶形式的免疫抑制劑伴隨施用產生降低的抗治療性大分子抗體應答。

當與合成納米載體連接時,“載量”為基于整個合成納米載體中材料的總干配方重量之與合成納米載體連接的免疫抑制劑和/或治療性大分子的量(重量/重量)。一般來說,將這樣的載量計算為整個合成納米載體群的平均值。在一個實施方案中,基于所有合成納米載體的平均值,所述載量為0.1%至99%。在另一個實施方案中,所述載量為0.1%至50%。在另一個實施方案中,免疫抑制劑/或治療性大分子的載量為0.1%至20%。在另一個實施方案中,免疫抑制劑/或治療性大分子的載量為0.1%至10%。在又一個實施方案中,免疫抑制劑/或治療性大分子的載量為1%至10%。在又一個實施方案中,免疫抑制劑的載量為7%至20%。在又一個實施方案中,基于整個合成納米載體群的平均值,免疫抑制劑/或治療性大分子的載量為至少0.1%、至少0.2%、至少0.3%、至少0.4%、至少0.5%、至少0.6%、至少0.7%、至少0.8%、至少0.9%、至少1%、至少2%、至少3%、至少4%、至少5%、至少6%、至少至少7%、至少8%、至少9%、至少10%、至少11%、至少12%、至少13%、至少14%、至少15%、至少16%、至少17%、至少18%、至少19%至少20%、至少25%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%。在又一個實施方案中,基于整個合成納米載體群的平均值,免疫抑制劑/或治療性大分子的載量為0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%、0.7%、0.8%、0.9%、1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%或20%。在上述實施方案的一些實施方案中,基于整個合成納米載體群的平均值,免疫抑制劑/或治療性大分子的載量為不超過25%。在一些實施方案中,可如實施例中所述或者如本領域中另外已知的計算載量。

在一些實施方案中,當免疫抑制劑的形式本身是顆?;蚩帕Q?例如納米結晶免疫抑制劑)時,免疫抑制劑的載量為顆粒等中免疫抑制劑的量(重量/重量)。在這樣的一些實施方案中,載量可接近97%、98%、99%或更多。

“合成納米載體的最大尺寸”意指沿合成納米載體之任意軸測量的該納米載體的最大尺寸?!昂銑贍擅自靨宓淖钚〕嘰紜幣庵稈睪銑贍擅自靨逯我庵岵飭康母煤銑贍擅自靨宓淖钚〕嘰?。例如,對于球形合成納米載體,合成納米載體的最大尺寸和最小尺寸基本相同并且是其直徑的尺寸。類似地,對于立方形合成納米載體,合成納米載體的最小尺寸是其高度、寬度或長度中的最小者,而合成納米載體的最大尺寸是其高度、寬度或長度中的最大者。在一個實施方案中,基于樣品中合成納米載體的總數,該樣品中至少75%,優選至少80%,更優選至少90%的合成納米載體的最小尺寸等于或大于100nm。在一個實施方案中,基于樣品中合成納米載體的總數,該樣品中至少75%,優選至少80%,更優選至少90%的合成納米載體的最大尺寸等于或小于5μm。優選地,基于樣品中合成納米載體的總數,該樣品中至少75%,優選至少80%,更優選至少90%的合成納米載體的最小尺寸大于110nm,更優選大于120nm,更優選大于130nm,并且更優選還大于150nm。合成納米載體的最大尺寸和最小尺寸的縱橫比可根據實施方案而不同。例如,合成納米載體的最大尺寸:最小尺寸的縱橫比可以是1∶1至1,000,000∶1,優選1∶1至100,000∶1,更優選1∶1至10,000∶1,更優選1∶1至1000∶1,仍更優選1∶1至100∶1并且還更優選1∶1至10∶1。優選地,基于樣品中合成納米載體的總數,該樣品中至少75%,優選至少80%,更優選至少90%的合成納米載體的最大尺寸等于或小于3μm,更優選等于或小于2μm,更優選等于或小于1μm,更優選等于或小于800nm,更優選等于或小于600nm,并且更優選還等于或小于500nm。在一些優選實施方案中,基于樣品中合成納米載體的總數,該樣品中至少75%,優選至少80%,更優選至少90%的合成納米載體的最小尺寸等于或大于100nm,更優選地等于或大于120nm,更優選等于或大于130nm,更優選等于或大于140nm,并且更優選還等于或大于150nm。在一些實施方案中,可如下獲得合成納米載體尺寸(例如,有效直徑)的測量:使合成納米載體混懸于液體介質(通常為水性介質)中并使用動態光散射(dynamiclightscattering,DLS)(例如使用BrookhavenZetaPALS儀器)。例如,可將合成納米載體的混懸液從水性緩沖液稀釋到純水中以獲得約0.01mg/mL至0.1mg/mL的最終合成納米載體混懸液濃度??稍謨糜贒LS分析的合適比色皿內直接制備經稀釋的混懸液或者可將經稀釋的混懸液轉移至用于DLS分析的合適比色皿。然后,可將比色皿放置在DLS中,允許平衡至受控溫度,隨后基于針對介質之黏度和樣品之折射指數的合適輸入,掃描足夠的時間以獲取穩定且可重現的分布。然后,報道有效直徑或分布的平均值。確定高縱橫比或非球形合成納米載體的有效尺寸可需要放大技術(例如電子顯微術)以獲得更準確的測量。合成納米載體的“尺寸”或“大小”或“直徑”意指例如使用動態光散射獲得的顆粒大小分布的平均值。

“非甲氧基封端的聚合物”意指至少一個末端以不同于甲氧基的部分結尾的聚合物。在一些實施方案中,所述聚合物具有至少兩個以不同于甲氧基的部分結尾的末端。在另一些實施方案中,所述聚合物沒有以甲氧基結尾的末端?!胺羌籽躉舛說鈉綻誓崢司酆銜鎩幣庵覆煌諏蕉碩季哂屑籽躉南咝云綻誓崢司酆銜锏木酆銜?。本文中提供的聚合物納米顆??砂羌籽躉舛說木酆銜锘蚍羌籽躉舛說鈉綻誓崢司酆銜?。

“可藥用賦形劑”或“可藥用載體”意指與藥理學活性材料一起使用以配制組合物的藥理學惰性材料??梢┯酶承渭漣ū玖煊蛑幸閻畝嘀植牧?,包括但不限于:糖類(例如葡萄糖、乳糖等)、防腐劑(例如抗微生物劑)、重構助劑(reconstitutionaid)、著色劑、鹽水(例如磷酸緩沖鹽水)和緩沖劑。

“藥效學響應”的“藥效學作用”意指由施用治療性大分子引起的任何生理學或免疫學應答。這樣的應答可以是期望的應答,例如與治療效果相關的應答。在一些實施方案中,已發現當在抗治療性大分子抗體應答存在下施用時,本文中提供的方法、組合物或藥盒產生增強的藥效學作用,例如增強的治療效果。在一些情況下,可使用與在抗治療性大分子抗體應答存在下不與本文中提供的免疫抑制劑劑量伴隨施用時施用的治療性大分子劑量相同或低于它的治療性大分子劑量獲得增強的藥效學作用??賞ü曜擠椒ɡ雌蘭鄄牧匣?藥劑是否是藥效學上有效的。在一些實施方案中,將在抗治療性大分子抗體應答存在下使用所提供的方法、組合物或藥盒的藥效學作用與不按此但仍在抗治療性大分子抗體應答存在下施用治療性大分子時的藥效學作用進行比較。在一些實施方案中,當在抗治療性大分子抗體應答存在下單獨施用治療性大分子時,比較針對藥效學作用。一般來說,在于抗治療性大分子抗體應答存在下施用時評估藥效學作用,因為期望方法、組合物或藥盒有效地克服這樣的應答。因此,在正發生這樣的應答時確定藥效學作用。

“方案”意指向對象施用的模式并且包括針對對象之一種或更多種物質的任何給藥方案。方案由要素(或變量)構成,因此方案包含一個或更多個要素。方案的所述要素可包括給藥量、給藥頻率、施用途徑、給藥持續時間、給藥速率、給藥間隔、上述任一項的組合等。在一些實施方案中,這樣的方案可用于向一個或更多個測試對象施用本發明的一種或更多種組合物。然后,可對這些測試對象中的免疫應答進行評估以確定該方案是否有效地產生期望的藥效學作用或者期望的藥效學作用水平。作為前述免疫應答的替代或除前述免疫應答之外,還可對任何其他治療和/或免疫學效果進行評估??上惹霸誆饈遠韻?例如非人對象)中證明過方案的一個或更多個要素,隨后將其轉化成人方案。例如,可使用已有技術例如異速縮放或其他縮放方法將在非人對象中證明的給藥劑量縮放為人方案的要素。不管方案是否具有期望的效果,其均可使用本領域中提供的或本領域中另外已知的任何方法確定。例如,樣品可獲自已經根據特定方案向其施用本文中提供的組合物的對象以確定特定的免疫細胞、細胞因子、抗體等是否得以降低、產生、激活等??捎糜詡觳餉庖呦赴拇嬖諍?或數量的方法包括但不限于:流式細胞術法(例如,FACS)、ELISpot、增殖應答、細胞因子產生和免疫組織化學法。用于對免疫細胞標志物進行特異性染色的抗體及其他結合劑均是市售可得的。這樣的藥盒通常包含針對抗原的染色試劑,其允許從異質細胞群對期望的細胞群進行基于FACS的檢測、分離和/或量化。在一些實施方案中,使用所述方案包含的一個或更多個要素或者全部或基本全部要素向另一對象施用本文中提供的多種組合物。在一些實施方案中,已證明所述方案導致針對治療性大分子的抗體應答降低和/或產生提高的藥效學作用。

“提供”意指個體進行的供給用于實施本發明的所需項目或項目組或方法的活動或活動集合。所述活動或活動集合可本身直接采取或者間接采取。

“提供對象”為這樣的任何活動或活動集合,其引起臨床醫生與對象接觸并向其施用本文中提供的組合物或者對其進行本文中提供的方法。優選地,所述對象是需要治療性大分子施用和針對它的抗原特異性免疫耐受的對象。所述活動或活動集合可本身直接采取或者間接采取。在本文中提供的任一種方法的一個實施方案中,所述方法還包括提供對象。

“記錄增強的藥效學作用”意指以任何書寫或電子形式記錄治療性大分子劑量在實際的、預期的或懷疑的抗治療性大分子抗體應答存在下實現增強的藥效學作用,或者在期待這樣的記錄發生時直接或間接導致這些活動。一般來說,在這些情況下,基于在本文中提供的伴隨施用時獲得的信息,已預期如果不與本文中提供的免疫抑制劑劑量一起施用(例如,單獨施用),治療性大分子劑量在抗治療性大分子抗體應答存在下不會實現增強的藥效學作用。例如,在這些情況下,預期如果不與免疫抑制劑劑量一起施用治療性大分子的有效性將被減弱,但是在本文中提供的伴隨施用下卻觀察到增強的藥效學作用。在一些情況下,記錄發生在將免疫抑制劑劑量與治療性大分子劑量組合施用于對象時或此后的某點。在這些實施方案中的一些中,與在抗治療性大分子抗體應答存在下不與免疫抑制劑劑量一起施用時的治療性大分子劑量相比,治療性大分子劑量有所降低(或者不超過該劑量)。本文中使用的“手寫形式”指在介質例如紙上的任何記錄。本文中使用的“電子形式”指在電子介質上的任何記錄。本文中提供的任一種方法還可包括記錄根據本文中提供的方法接受治療的對象中的治療和/或免疫應答的步驟。

“降低的藥效學有效劑量”指這樣的降低的治療性大分子量,與當不與免疫抑制劑劑量一起施用時(例如,當單獨施用治療性大分子時)的治療性大分子量相比,當如本文中提供的與免疫抑制劑劑量伴隨施用時其可實現類似的藥效學作用。如本文中所使用的,類似的藥效學作用為在以相同方式測量的另一水平的一個log內的作用水平。優選地,類似藥效學作用的差異不超過5倍。仍更優選地,類似藥效學作用的差異不超過2倍。

“對象”意指動物,包括溫血哺乳動物,例如人和靈長類動物;禽類;馴養的家養或農場動物,例如貓、狗、綿羊、山羊、牛、馬和豬;實驗室動物,例如小鼠、大鼠和豚鼠;魚;爬行動物;動物園動物和野生動物;等。

“合成納米載體”意指不存在于自然界中并且至少一個維度的尺寸小于或等于5微米的離散物體。白蛋白納米顆粒一般作為合成納米載體包括在內,然而在某些實施方案中,合成納米載體不包括白蛋白納米顆粒。在一些實施方案中,合成納米載體不包含殼聚糖。在另一些實施方案中,合成納米載體不是基于脂質的納米顆粒。在另一些實施方案中,合成納米載體不包含磷脂。

合成納米載體可以是,但不限于以下中的一種或多種:基于脂質的納米顆粒(在本文中也稱為脂質納米顆粒,即構成其結構的大部分材料為脂質的納米顆粒)、聚合物納米顆粒、金屬納米顆粒、基于表面活性劑的乳劑、樹狀聚體、巴基球、納米線、病毒樣顆粒(即,主要由非感染性或具有低感染性的病毒結構蛋白構成的顆粒)、基于肽或蛋白質的顆粒(在本文中也稱為蛋白質顆粒,即,構成其結構的大部分材料是肽或蛋白質的顆粒)(例如白蛋白納米顆粒)和/或使用納米材料之組合開發的納米顆粒(例如脂質-聚合物納米顆粒)。合成納米載體可以是多種不同的形狀,包括但不限于:球形、立方形、棱錐形、長方形、圓柱形、環形等。根據本發明的合成納米載體包括一個或更多個表面??墑視糜謔凳┍痙⒚韉氖糾院銑贍擅自靨灝ǎ?1)Gref等的美國專利5,543,158中公開的生物可降解納米顆粒,(2)Saltzman等的公開的美國專利申請20060002852中的聚合物納米顆粒,(3)DeSimone等的公開的美國專利申請20090028910中以平版印刷方式構建的納米顆粒,(4)vonAndrian等的WO2009/051837的公開內容,(5)Penades等的公開的美國專利申請2008/0145441中公開的納米顆粒,(6)delosRios等的公開的美國專利申請20090226525中公開的蛋白質納米顆粒,(7)Sebbel等的公開的美國專利申請20060222652中公開的病毒樣顆粒,(8)Bachmann等的公開的美國專利申請20060251677中公開的核酸連接的病毒樣顆粒,(9)WO2010047839A1或WO2009106999A2中公開的病毒樣顆粒,(10)P.Paolicelli等,“Surface-modifiedPLGA-basedNanoparticlesthatcanEfficientlyAssociateandDeliverVirus-likeParticles”Nanomedicine.5(6):843-853(2010)中公開的經納米沉淀的納米顆粒,(11)美國公開2002/0086049中公開的凋亡細胞、凋亡體或者合成或半合成模擬物,或者(12)Look等,Nanogel-baseddeliveryofmycophenolicacidamelioratessystemiclupuserythematosusinmice”J.ClinicalInvestigation123(4):1741-1749(2013)中的那些。在一些實施方案中,合成納米載體的縱橫比可以大于1∶1、1∶1.2、1∶1.5、1∶2、1∶3、1∶5、1∶7,或大于1∶10。

最小尺寸等于或小于約100nm、優選等于或小于100nm之根據本發明的合成納米載體不包含具有激活補體的羥基的表面,或者作為替代地包含基本由不是激活補體之羥基的部分組成的表面。在一個優選實施方案中,最小尺寸等于或小于約100nm、優選等于或小于100nm之根據本發明的合成納米載體不包含顯著激活補體的表面,或者作為替代地包含基本由不顯著激活補體的部分組成的表面。在一個更優選的實施方案中,最小尺寸等于或小于約100nm、優選等于或小于100nm之根據本發明的合成納米載體不包含激活補體的表面,或者作為替代地包含基本由不激活補體的部分組成的表面。在一些實施方案中,合成納米載體不包括病毒樣顆粒。在一些實施方案中,合成納米載體的縱橫比可以大于1∶1、1∶1.2、1∶1.5、1∶2、1∶3、1∶5、1∶7,或大于1∶10。

“治療性大分子”指可向對象施用并且具有治療效果的任何蛋白質、碳水化合物、脂質或核酸。在一些實施方案中,向對象施用治療性大分子可引起不期望的免疫應答,包括抗治療性大分子特異性抗體的產生。如本文中所述的,將治療性大分子與免疫抑制劑劑量伴隨施用可增強該治療性大分子的治療有效性,例如通過降低針對它的不期望免疫應答。在一些實施方案中,治療性大分子可以是治療性多核苷酸或治療性蛋白質。

“治療性多核苷酸”意指可向對象施用并且具有治療效果的任何多核苷酸或基于多核苷酸的治療。這樣的治療包括基因沉默。這樣的治療的實例在本領域中是已知的并且包括但不限于:裸RNA(包括信使RNA、經修飾的信使RNA以及RNAi的形式)。本文中的其他部分還提供了其他治療性多核苷酸的實例。治療性多核苷酸可在細胞中產生、在細胞上產生或者由細胞產生,并且還可使用無細胞體外方法獲得或者由完全體外合成方法獲得。因此,對象包括需要前述任何治療性多核苷酸進行治療的任何對象。這樣的對象包括將接受前述任何治療性多核苷酸的那些。

“治療性蛋白質”意指可向對象施用并且具有治療效果的任何蛋白質或基于蛋白質的治療。這樣的治療包括蛋白質替代或蛋白質補充治療。這樣的治療還包括施用外源或外來蛋白質、抗體治療和細胞治療或基于細胞的治療。治療性蛋白質包括但不限于:酶、酶輔因子、激素、凝血因子、細胞因子、生長因子、單克隆抗體、抗體-藥物綴合物和多克隆抗體。本文中的其他部分還提供了其他治療性蛋白質的實例。治療性蛋白質可在細胞中產生、在細胞上產生或者由細胞產生,并且可從這樣的細胞獲得或者以這樣的細胞的形式施用。在一些實施方案中,治療性蛋白質在哺乳動物細胞、昆蟲細胞、酵母細胞、細菌細胞、植物細胞、轉基因動物細胞、轉基因植物細胞等中產生、在其上產生或者由其產生。治療性蛋白質可在這樣的細胞中重組產生。治療性蛋白質可在經病毒轉化的細胞中產生、在其上產生或者由其產生。因此,對象可包括需要前述任何治療性蛋白質進行治療的任何對象。這樣的對象包括將接受前述任何治療性蛋白質的那些。

“治療性大分子APC可呈遞抗原”意指與治療性大分子相關的抗原(即,治療性大分子或其可產生針對該治療性大分子的免疫應答(例如,抗治療性大分子特異性抗體的產生)的片段)。一般來說,治療性大分子抗原呈遞細胞(APC)可呈遞抗原可被呈遞為被免疫系統(例如,免疫系統中的細胞,例如通過抗原呈遞細胞呈遞的細胞,包括但不限于樹突細胞、B細胞或巨噬細胞)識別。治療性大分子APC可呈遞抗原可被呈遞為被例如T細胞識別。這樣的抗原可通過呈遞與I類或II類主要組織相容性復合物分子(maiorhistocompatabilitycomplexmolecule,MHC)結合之抗原的表位而被T細胞識別并觸發T細胞中的免疫應答。治療性大分子APC可呈遞抗原一般包括蛋白質、多肽、肽、多核苷酸、脂蛋白或者包含在細胞中或者在細胞內表達、細胞上表達或由細胞表達。在一些實施方案中,治療性大分子抗原與合成納米載體連接,并且包含MHCI類限制性表位和/或MHCII類限制性表位和/或B細胞表位。優選地,用本文中提供的方法、組合物或藥盒引起治療性大分子特異性的一種或更多種致耐受性免疫應答。在一些實施方案中,合成納米載體群不包含添加的治療性大分子APC可呈遞抗原,意指在合成納米載體制備期間未有意地向其中添加顯著量的治療性大分子APC可呈遞抗原。

“不期望的免疫應答”指這樣的任何不期望免疫應答,其是由暴露于抗原引起的、促進或加重本文中提供疾病、紊亂或病癥(或其癥狀),或者其為本文中提供的疾病、紊亂或病癥的癥狀。這樣的免疫應答一般對對象的健康具有不良影響或者為對對象之健康的不良影響的癥狀。不期望的免疫應答包括抗原特異性抗體產生、抗原特異性B細胞增殖和/或活性或抗原特異性CD4+T細胞增殖和/或活性。一般來說,這些不期望的免疫應答可以是治療性大分子特異性的并且抵消施用所述治療性大分子所期望的有益效果。因此,在一些實施方案中,不期望的免疫應答為抗治療性大分子抗體應答。

C.組合物及相關方法

本文中提供了包含免疫抑制劑和治療性大分子的組合物以及相關的方法或藥盒。這樣的方法、組合物或藥盒可用于在抗治療性大分子抗體應答存在下增強治療性大分子的藥效學作用,例如通過降低或抑制減弱治療性大分子之治療益處的治療性大分子特異性的不期望免疫應答。這樣的方法、組合物或藥盒還可用于允許治療性大分子的重復給藥。因此,本文中提供的方法、組合物或藥盒可用于實現或增強治療性大分子的期望治療效果。在一些實施方案中,可在降低的藥效學有效劑量下實現或增強這樣的治療效果。所提供的方法、組合物或藥盒可用于需要治療性大分子的治療益處的任何對象。

如上所述,發現在抗治療性大分子抗體應答存在下將免疫抑制劑(優選地,在一些實施方案中,當與合成納米載體連接時)與治療性大分子伴隨遞送可產生增強的藥效學作用,包括甚至在降低的治療性大分子劑量下所述作用的增強。例如,所述方法、組合物或藥盒可有助于中和干擾治療性大分子的期望治療效果的抗治療性大分子特異性抗體。因此,本文中提供的方法、組合物或藥盒可使得增強治療性大分子之當不將治療性大分子與免疫抑制劑劑量一起施用時(例如,當單獨施用治療性大分子時)否則減弱的期望治療效果。因此,在一些實施方案中,本文中提供的方法、組合物或藥盒允許對象獲得治療性大分子的治療益處而無需提高治療性大分子的劑量,而當在無本文中提供之本發明的益處的情況下施用時,為了補償針對治療性大分子的不期望免疫應答一般將提高治療性大分子的劑量。令人驚訝的是,本文中提供的方法、組合物或藥盒甚至允許向對象施用降低的治療性大分子劑量就可在抗治療性大分子抗體應答存在下獲得相同或更佳的治療益處。

多種免疫抑制劑可用于實施本發明,優選地,免疫抑制劑與合成納米載體連接。根據本發明,可使用多種合成納米載體。在一些實施方案中,合成納米載體為球體或球狀體。在一些實施方案中,合成納米載體是平的或板狀的。在一些實施方案中,合成納米載體為立方體物或者是立方體的。在一些實施方案中,合成納米載體為卵形或橢圓形。在一些實施方案中,合成納米載體為圓柱體、圓錐體或棱錐體。

在一些實施方案中,期望使用在尺寸或形狀方面相對均一的合成納米載體群使得每個合成納米載體具有類似的特性。例如,基于合成納米載體的總數,至少80%、至少90%或至少95%的合成納米載體的最大尺寸或最小尺寸可落入合成納米載體之平均直徑或平均尺寸的5%、10%或20%內。

合成納米載體可以是實心的或中空的并且可包含一個或更多個層。在一些實施方案中,相對于其他層,每個層均具有獨特的組成和獨特的特性。僅為了給出一個實例,合成納米載體可具有芯/殼結構,其中芯為一個層(例如聚合物芯)而殼為第二層(例如脂質雙層或單層)。合成納米載體可包含多個不同的層。

在一些實施方案中,合成納米載體可任選地包含一種或更多種脂質。在一些實施方案中,合成納米載體可包含脂質體。在一些實施方案中,合成納米載體可包含脂質雙層。在一些實施方案中,合成納米載體可包含脂質單層。在一些實施方案中,合成納米載體可包含膠束。在一些實施方案中,合成納米載體可包含由脂質層(例如,脂質雙層、脂質單層等)包圍的包含聚合物基質的芯。在一些實施方案中,合成納米載體可包含由脂質層(例如,脂質雙層、脂質單層等)包圍的非聚合物芯(例如,金屬顆粒、量子點、陶瓷顆粒、骨顆粒、病毒顆粒、蛋白質、核酸、碳水化合物等)。

在另一些實施方案中,合成納米載體可包含金屬顆粒、量子點、陶瓷顆粒等。在一些實施方案中,非聚合物合成納米載體是非聚合物組分的聚集體,例如金屬原子(例如,金原子)的聚集體。

在一些實施方案中,合成納米載體可任選地包含一種或更多種兩親性實體。在一些實施方案中,兩親性實體可促進產生穩定性提高、均勻性提高或黏度提高的合成納米載體。在一些實施方案中,兩親性實體可與脂質膜(例如,脂質雙層、脂質單層等)的內表面相締合。本領域中已知的很多兩親性實體均適用于制備根據本發明的合成納米載體。這樣的兩親性實體包括但不限于:磷酸甘油酯;磷脂酰膽堿;二棕櫚酰磷脂酰膽堿(DPPC);二油烯基磷脂酰乙醇胺(DOPE);二油烯氧基丙基三乙銨(DOTMA);二油酰磷脂酰膽堿;膽固醇;膽固醇酯;二酰甘油;琥珀酸二酰甘油酯;二磷脂酰甘油(DPPG);十六烷醇(hexanedecanol);脂肪醇,例如聚乙二醇(PEG);聚氧乙烯-9-月桂基醚;表面活性脂肪酸,例如棕櫚酸或油酸;脂肪酸;脂肪酸單甘油酯;脂肪酸二甘油酯;脂肪酸酰胺;去水山梨糖醇三油酸酯(85)甘氨膽酸鹽;去水山梨糖醇單月桂酸酯(20);聚山梨醇酯20(20);聚山梨醇酯60(60);聚山梨醇酯65(65);聚山梨醇酯80(80);聚山梨醇酯85(85);聚氧乙烯單硬脂酸酯;表面活性素;泊洛沙姆;去水山梨糖醇脂肪酸酯,例如去水山梨糖醇三油酸酯;卵磷脂;溶血卵磷脂;磷脂酰絲氨酸;磷脂酰肌醇;鞘磷脂;磷脂酰乙醇胺(腦磷脂);心磷脂;磷脂酸;腦苷脂;磷酸二鯨蠟酯;二棕櫚酰磷脂酰甘油;硬脂酰胺;十二烷胺;十六烷胺;乙酰棕櫚酸酯;蓖麻醇酸甘油酯;硬脂酸十六烷酯;肉豆蔻酸異丙酯;泰洛沙泊;聚(乙二醇)5000-磷脂酰乙醇胺;聚(乙二醇)400-單硬脂酸酯;磷脂;具有高表面活性劑特性的合成和/或天然洗滌劑;脫氧膽酸鹽;環糊精;離液鹽;離子配對劑;及其組合。兩親性實體組分可以是不同兩親性實體的混合物。本領域技術人員將認識到:這是具有表面活性劑活性之物質的示例性的非全面性列表。任何兩親性實體均可用于產生根據本發明使用的合成納米載體。

在一些實施方案中,合成納米載體可任選地包含一種或更多種碳水化合物。碳水化合物可以是天然的或合成的。碳水化合物可以是衍生化的天然碳水化合物。在某些實施方案中,碳水化合物包含單糖或二糖,包括但不限于:葡萄糖、果糖、半乳糖、核糖、乳糖、蔗糖、麥芽糖、海藻糖、纖維二糖、甘露糖、木糖、阿拉伯糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、甘露糖醛酸、葡糖胺、半乳糖胺和神經氨酸。在某些實施方案中,碳水化合物為多糖,包括但不限于:普魯蘭多糖、纖維素、微晶纖維素、羥丙基甲基纖維素(HPMC)、羥基纖維素(HC)、甲基纖維素(MC)、葡聚糖、環葡聚糖、糖原、羥乙基淀粉、角叉菜膠、糖苷配糖基(glycon)、直鏈淀粉、殼聚糖、N,O-羧甲基殼聚糖、藻膠和藻酸、淀粉、甲殼質、菊粉、魔芋、葡甘露聚糖、石耳素(pustulan)、肝素、透明質酸、凝膠多糖(curdlan)和黃原膠。在一些實施方案中,合成納米載體不包含(或者特別排除)碳水化合物,例如多糖。在某些實施方案中,碳水化合物可包含碳水化合物衍生物,例如糖醇,包括但不限于:甘露糖醇、山梨糖醇、木糖醇、赤蘚糖醇、麥芽糖醇和乳糖醇。

在一些實施方案中,合成納米載體可包含一種或更多種聚合物。在一些實施方案中,合成納米載體包含一種或更多種這樣的聚合物,其為非甲氧基封端的普朗尼克聚合物。在一些實施方案中,構成合成納米載體的至少1%、2%、3%、4%、5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%或99%(重量/重量)聚合物為非甲氧基封端的普朗尼克聚合物。在一些實施方案中,構成合成納米載體的所有聚合物均為非甲氧基封端的普朗尼克聚合物。在一些實施方案中,合成納米載體包含一種或更多種這樣的聚合物,其為非甲氧基封端的聚合物。在一些實施方案中,構成合成納米載體的至少1%、2%、3%、4%、5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%或99%(重量/重量)聚合物為非甲氧基封端的聚合物。在一些實施方案中,構成合成納米載體的所有聚合物均為非甲氧基封端的聚合物。在一些實施方案中,合成納米載體包含一種或更多種不含普朗尼克聚合物的聚合物。在一些實施方案中,構成合成納米載體的至少1%、2%、3%、4%、5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%或99%(重量/重量)聚合物不包含普朗尼克聚合物。在一些實施方案中,構成合成納米載體的所有聚合物均不包含普朗尼克聚合物。在一些實施方案中,這樣的聚合物可由包被層(例如,脂質體、脂質單層、膠束等)包圍。在一些實施方案中,合成納米載體中的多種組分可與聚合物連接。

可通過多種方法中的任一種來使免疫抑制劑和/或治療性大分子與合成納米載體連接。一般來說,連接可以是免疫抑制劑和/或治療性大分子與合成納米載體之間鍵合的結果。這種鍵合可導致免疫抑制劑和/或治療性大分子與合成納米載體的表面連接和/或包含(包封)在合成納米載體中。然而,在一些實施方案中,由于合成納米載體的結構的原因,免疫抑制劑和/或治療性大分子被合成納米載體包封而不是與合成納米載體鍵合。在一些優選實施方案中,合成納米載體包含本文中提供的聚合物,并且免疫抑制劑和/或治療性大分子與聚合物連接。

當由于免疫抑制劑和/或治療性大分子與合成納米載體之間的鍵合而發生連接時,所述連接可經由偶聯部分發生。偶聯部分可以是免疫抑制劑和/或治療性大分子通過它與合成納米載體鍵合的任何部分。這樣的部分包含共價鍵(例如酰胺鍵或酯鍵)以及使免疫抑制劑和/或治療性大分子與合成納米載體(共價或非共價)鍵合的獨立分子。這樣的分子包含接頭或聚合物或其單元。例如,偶聯部分可包含與免疫抑制劑和/或治療性大分子靜電結合的帶電聚合物。作為另一個實例,偶聯部分可包含與免疫抑制劑和/或治療性大分子共價鍵合的聚合物或其單元。

在一些優選實施方案中,合成納米載體包含本文中提供的聚合物。這些合成納米載體可以是完全聚合物的或者其可以是聚合物與其他材料的混合物。

在一些實施方案中,合成納米載體中的聚合物締合以形成聚合物基質。在這些實施方案中的一些中,組分(例如免疫抑制劑或治療性大分子)可與聚合物基質中的一種或更多種聚合物共價締合。在一些實施方案中,共價締合由接頭介導。在一些實施方案中,組分可與聚合物基質中的一種或更多種聚合物非共價締合。例如,在一些實施方案中,組分可包封在聚合物基質內、被聚合物基質包圍和/或分散在聚合物基質中。作為替代或補充,組分與聚合物基質中的一種或更多種聚合物可通過疏水性相互作用、電荷相互作用、范德華力等締合。多種聚合物以及用于由其形成聚合物基質的方法均是常規已知的。

聚合物可以是天然聚合物或非天然(合成)聚合物。聚合物可以是含有兩個或更多個單體的均聚物或共聚物。就序列而言,共聚物可以是隨機的、嵌段的,或者包含隨機序列和嵌段序列的組合。通常來說,根據本發明的聚合物是有機聚合物。

在一些實施方案中,聚合物包含聚酯、聚碳酸酯、聚酰胺或聚醚或其單元。在另一些實施方案中,聚合物包含聚(乙二醇)(PEG)、聚丙二醇、聚(乳酸)、聚(乙醇酸)、聚乳酸-乙醇酸共聚物或聚己內酯或其單元。在一些實施方案中,優選地,聚合物是生物可降解的。因此,在這些實施方案中,優選地,如果聚合物包含聚醚(例如聚(乙二醇)、聚丙二醇或其單元),則該聚合物包含聚醚和生物可降解聚合物的嵌段共聚物,使得該聚合物是生物可降解的。在另一些實施方案中,聚合物不僅包含聚醚或其單元,例如聚(乙二醇)或聚丙二醇或其單元。

適用于本發明中的聚合物的其他實例包括但不限于:聚乙烯、聚碳酸酯(例如聚(1,3-二烷-2酮))、聚酐(例如聚(癸二酐))、聚丙基富馬酸酯、聚酰胺(例如聚己內酰胺)、聚縮醛、聚醚、聚酯(例如,聚丙交酯、聚乙交酯、聚丙交酯-乙交酯共聚物、聚己內酯、聚羥基酸(例如聚(β-羥基烷酸酯)))、聚(原酸酯)、聚氰基丙烯酸酯、聚乙烯醇、聚氨酯、聚磷腈、聚丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸酯、聚脲、聚苯乙烯以及聚胺、聚賴氨酸、聚賴氨酸-PEG共聚物和聚(乙烯亞胺)、聚(乙烯亞胺)-PEG共聚物。

在一些實施方案中,根據本發明的聚合物包括已由美國食品藥品管理局(U.S.FoodandDrugAdministration,FDA)根據21C.F.R.§177.2600批準用于人的聚合物,包括但不限于:聚酯(例如,聚乳酸、聚乳酸-乙醇酸共聚物、聚己內酯、聚戊內酯、聚(1,3-二烷-2酮));聚酐(例如,聚(癸二酐));聚醚(例如,聚乙二醇);聚氨酯;聚甲基丙烯酸酯;聚丙烯酸酯;和聚氰基丙烯酸酯。

在一些實施方案中,聚合物可以是親水性的。例如,聚合物可包含陰離子基團(例如,磷酸根基團、硫酸根基團、羧酸根基團);陽離子基團(例如,季胺基團);或極性基團(例如,羥基、巰基、胺基)。在一些實施方案中,包含親水性聚合物基質的合成納米載體在合成納米載體內產生親水性環境。在一些實施方案中,聚合物可以是疏水性的。在一些實施方案中,包含疏水性聚合物基質的合成納米載體在合成納米載體內產生疏水性環境。對聚合物之親水性或疏水性的選擇可影響合成納米載體中摻入(例如連接)的材料的性質。

在一些實施方案中,可用一個或更多個部分和/或官能團對聚合物進行修飾。根據本發明可使用多種部分或官能團。在一些實施方案中,可用聚乙二醇(PEG)、碳水化合物和/或由多糖衍生的無環聚縮醛對聚合物進行修飾(Papisov,2001,ACSSymposiumSeries,786:301)。某些實施方案可使用Gref等的美國專利No.5543158或VonAndrian等的WO公開WO2009/051837的一般性教導來進行。

在一些實施方案中,可用脂質或脂肪酸基團來對聚合物進行修飾。在一些實施方案中,脂肪酸基團可以是以下中的一種或更多種:丁酸、己酸、辛酸、癸酸、月桂酸、肉豆蔻酸、棕櫚酸、硬脂酸、花生酸、山崳酸或二十四烷酸。在一些實施方案中,脂肪酸基團可以是以下中的一種或更多種:棕櫚油酸、油酸、異油酸、亞油酸、α-亞油酸、γ-亞油酸、花生四烯酸、鱈油酸、花生四烯酸、二十碳五烯酸、二十二碳六烯酸或芥酸。

在一些實施方案中,聚合物可以是聚酯,包含含有乳酸和乙醇酸單元的共聚物,例如聚乳酸-乙醇酸共聚物和聚丙交酯-乙交酯共聚物,在本文中將其統稱為“PLGA”;以及含有乙醇酸單元的均聚物(在本文中稱為“PGA”)和含有乳酸單元的均聚物,例如聚-L-乳酸、聚-D-乳酸、聚-D,L-乳酸、聚-L-丙交酯、聚-D-丙交酯和聚-D,L-丙交酯(在本文中統稱為“PLA”)。在一些實施方案中,示例性的聚酯包括例如:聚羥基酸;PEG共聚物及丙交酯和乙交酯的共聚物(例如,PLA-PEG共聚物、PGA-PEG共聚物、PLGA-PEG共聚物,及其衍生物。在一些實施方案中,聚酯包括例如:聚(己內酯)、聚(己內酯)-PEG共聚物、聚L-丙交酯-L-賴氨酸共聚物、聚(絲氨酸酯)、聚(4-羥基-L-脯氨酸酯)、聚[α-(4-氨基丁基)-L-乙醇酸],及其衍生物。

在一些實施方案中,聚合物可以是PLGA。PLGA是乳酸和乙醇酸的生物相容性的生物可降解共聚物,并且多種PLGA形式通過乳酸:乙醇酸之比來表征。乳酸可以是L-乳酸、D-乳酸或D,L-乳酸??賞ü謀淙樗幔閡掖妓嶂壤吹鶻赑LGA的降解速率。在一些實施方案中,根據本發明使用的PLGA的特征在于:乳酸∶乙醇酸比例為約85∶15、約75∶25、約60∶40、約50∶50、約40∶60、約25∶75或約15∶85。

在一些實施方案中,聚合物可以是一種或更多種丙烯酸類聚合物。在某些實施方案中,丙烯酸類聚合物包括例如:丙烯酸和甲基丙烯酸共聚物、甲基丙烯酸甲酯共聚物、甲基丙烯酸乙氧基乙酯、甲基丙烯酸氰基乙酯、甲基丙烯酸氨基烷酯共聚物、聚(丙烯酸)、聚(甲基丙烯酸)、甲基丙烯酸烷基酰胺共聚物、聚(甲基丙烯酸甲酯)、聚(甲基丙烯酸酐)、甲基丙烯酸甲酯、聚甲基丙烯酸酯、聚(甲基丙烯酸甲酯)共聚物、聚丙烯酰胺、甲基丙烯酸氨基烷酯共聚物、甲基丙烯酸縮水甘油酯共聚物、聚氰基丙烯酸酯以及包含前述聚合物中一種或更多種的組合。丙烯酸類聚合物可包括丙烯酸酯和甲基丙烯酸酯的具有低含量季銨基團的完全聚合的共聚物。

在一些實施方案中,聚合物可以是陽離子聚合物。一般來說,陽離子聚合物能夠縮合和/或?;ず慫岬拇旱緦?。含胺聚合物例如聚(賴氨酸)(Zauner等,1998,Adv.DrugDel.Rev.,30:97;和Kabanov等,1995,BioconjugateChem.,6:7)、聚(乙烯亞胺)(PEI;Boussif等,1995,Proc.Natl.Acad.Sci.,USA,1995,92:7297)和聚(酰胺胺)樹狀聚體(Kukowska-Latallo等,1996,Proc.Natl.Acad.Sci.,USA,93:4897;Tang等,1996,BioconjugateChem.,7:703;和Haensler等,1993,BioconjugateChem.,4:372)在生理pH下帶正電并且與核酸形成離子對。在一些實施方案中,合成納米載體可不包含(或者可排除)陽離子聚合物。

在一些實施方案中,聚合物可以是攜帶陽離子側鏈的可降解聚酯(Putnam等,1999,Macromolecules,32:3658;Barrera等,1993,J.Am.Chem.Soc.,115:11010;Kwon等,1989,Macromolecules,22:3250;Lim等,1999,J.Am.Chem.Soc.,121:5633;和Zhou等,1990,Macromolecnles,23:3399)。這些聚酯的實例包括聚L-丙交酯-L-賴氨酸共聚物(Barrera等,1993,J.Am.Chem.Soc.,115:11010)、聚(絲氨酸酯)(Zhou等,1990,Macromolecules,23:3399)、聚(4-羥基-L-脯氨酸酯)(Putnam等,1999,Macromolecules,32:3658;和Lim等,1999,J.Am.Chem.Soc.,121:5633)和聚(4-羥基-L-脯氨酸酯)(Putnam等,1999,Macromolecules,32:3658;和Lim等,1999,J.Am.Chem.Soc.,121:5633)。

這些和其他聚合物的特性及其制備方法在本領域中是公知的(參見,例如,美國專利6,123,727;5,804,178;5,770,417;5,736,372;5,716,404;6,095,148;5,837,752;5,902,599;5,696,175;5,514,378;5,512,600;5,399,665;5,019,379;5,010,167;4,806,621;4,638,045;和4,946,929;Wang等,2001,J.Am.Chem.Soc.,123:9480;Lim等.,2001,J.Am.Chem.Soc.,123:2460;Langer,2000,Acc.Chem.Res.,33:94;Langer,1999,J.Control.Release,62:7;和Uhrich等,1999,Chem.Rev.,99:3181)。更一般地,用于合成某些合適聚合物的多種方法在以下中進行了描述:ConciseEncyclopediaofPolymerScienceandPolymericAminesandAmmoniumSalts,由Goethals編輯,PergamonPress,1980;PrinciplesofPolymerization,Odian,JohnWiley&Sons,第四版,2004;ContemporaryPolymerChemistry,Allcock等,Prentice-Hall,1981;Deming等,1997,Nature,390:386;以及美國專利6,506,577、6,632,922、6,686,446和6,818,732。

在一些實施方案中,聚合物可以是直鏈聚合物或支鏈聚合物。在一些實施方案中,聚合物可以是樹狀聚體。在一些實施方案中,聚合物可彼此基本交聯。在一些實施方案中,聚合物可基本無交聯。在一些實施方案中,可根據本發明在不經歷交聯步驟的情況下使用聚合物?;褂Φ崩斫獾氖?,合成納米載體可包含前述及其他聚合物的嵌段共聚物、接枝共聚物、共混物、混合物和/或加合物。本領域技術人員將認識到,本文中所列舉的聚合物代表可根據本發明使用之聚合物的示例性的非全面性列表。

在一些實施方案中,合成納米載體不包含聚合物組分。在一些實施方案中,合成納米載體可包含金屬顆粒、量子點、陶瓷顆粒等。在一些實施方案中,非聚合物合成納米載體為非聚合物組分的聚集體,例如金屬原子(例如,金原子)的聚集體。

根據本發明的組合物可包含與可藥用賦形劑(例如防腐劑、緩沖劑、鹽水和磷酸緩沖鹽水)組合的組分。所述組合物可使用常規的藥物制備和配合技術制成以實現可用的劑型。在一個實施方案中,將組合物(例如包含合成納米載體的那些)與防腐劑一起混懸于無菌鹽水溶液中以用于注射。

在一些實施方案中,當制備合成納米載體作為載體時,用于使組分與合成納米載體連接方法是可用的。如果組分是小分子,有利地可在組裝合成納米載體之前使該組分與聚合物連接。在一些實施方案中,還有利的是,可制備具有表面基團的合成納米載體,其可用于通過使用這些表面基團來使組分與合成納米載體連接,而非使組分與聚合物連接并然后在構建合成納米載體中使用該聚合物綴合物。

在某些實施方案中,連接可以是共價接頭。在一些實施方案中,根據本發明的組分可與外表面經由1,2,3-三唑接頭共價連接,所述接頭通過納米載體之表面上的疊氮基與含有炔基之組分的1,3-偶極環加成反應形成或者通過納米載體之表面上的炔與含有疊氮基之組分的1,3-偶極環加成反應形成。優選在Cu(I)催化劑以及合適Cu(I)配體和還原劑存在下進行這樣的環加成反應以將Cu(II)化合物還原成催化活性的Cu(I)化合物?;箍山庵諧u(I)催化的疊氮化物-炔環加成(CuAAC)稱為點擊反應。

另外,共價連接可包含共價接頭,其包括酰胺接頭、二硫接頭、硫醚接頭、腙接頭、酰肼接頭、亞胺或肟接頭、脲或硫脲接頭、脒接頭、胺接頭和磺酰胺接頭。

酰胺接頭通過一種組分上的胺與第二組分(例如納米載體)的羧酸基團之間的酰胺鍵形成。接頭中的酰胺鍵可使用經適當?;さ陌被岷突罨人?例如N-羥基琥珀酰亞胺活化的酯)利用任何常規的酰胺鍵形成反應形成。

二硫接頭通過在形式為例如R1-S-S-R2的兩個硫原子之間形成二硫(S-S)鍵構成。二硫鍵可通過使含有巰基/硫醇基(-SH)的組分與聚合物或納米載體上的另一個活化巰基進行巰基交換形成,或者通過使含有巰基/硫醇基的納米載體與含有活化巰基的組分進行巰基交換形成。

三唑接頭,特別是其中R1和R2可以是任何化學實體之形式的1,2,3-三唑,通過與第一組分(例如納米載體)連接之疊氮化物和與第二組分(例如免疫抑制劑或治療性大分子)連接之末端炔的1,3-偶極環加成反應形成。在存在或無催化劑,優選Cu(I)催化劑的情況下進行1,3-偶極環加成反應,其通過1,2,3-三唑功能將兩種組分連接。Sharpless等,Angew.Chem.Int.第41(14)版,2596,(2002)和Meldal,等,Chem.Rev.,2008,108(8),2952-3015對這一化學進行了詳細描述,并且通常將其稱為“點擊”反應或CuAAC。

在一些實施方案中,制備聚合物鏈末端包含疊氮化合物或炔基團的聚合物。然后,使用這種聚合物以使得多個炔或疊氮化物基團位于合成納米載體之表面的方式制備合成納米載體?;蛘?,可通過另一途徑制備合成納米載體并隨后用炔或疊氮化物進行官能化。在炔(如果聚合物包含疊氮化物)基團或疊氮化物(如果聚合物包含炔)基團存在下制備該組分。然后,在催化劑存在或不存在下使該組分與納米載體經由1,3-偶極環加成反應而反應,所述催化劑使該組分與顆粒通過1,4-二取代的1,2,3-三唑接頭連接。

硫醚接頭通過以例如R1-S-R2的形式形成硫-碳(硫醚)鍵構成。硫醚可通過一種組分上的巰基/硫醇基(-SH)與第二組分上的烷基化基團(例如鹵化物或環氧化物)的烷基化形成。硫醚接頭還可通過將一種組分上的巰基/硫醇基Michael加成到含有馬來酰亞胺基團或乙烯砜基團作為Michael接受體之第二組分上的缺電子烯基團形成。在另一種方式中,硫醚接頭可通過一種組分上的巰基/硫醇基與第二組分上的烯基團的自由基巰基-烯反應制備。

腙接頭通過使一種組分上的酰肼基團與第二組分上的醛/酮基團反應形成。

酰肼接頭通過使一種組分上的肼基團與第二組分上的羧酸基團反應形成。這樣的反應一般使用與其中羧酸經活化試劑激活的酰胺鍵形成類似的化學來進行。

亞胺接頭或肟接頭通過使一種組分上的胺或N-烷氧基胺(或氨基氧基)基團與第二組分上的醛或酮基團反應形成。

脲或硫脲接頭通過使一種組分上的胺基團與第二組分上的異腈酸酯或硫代異腈酸酯基團反應制備。

脒接頭通過使一種組分上的胺基團與第二組分上的亞氨酸酯基團反應制備。

胺接頭通過一種組分上的胺基團與第二組分上的烷基化基團(例如鹵化物、環氧化物或磺酸酯基團)的烷基化反應形成?;蛘?,胺接頭還可通過使一種組分上的胺基團與第二組分上的醛或酮基團在合適還原劑(例如氰基硼氫化鈉或三乙酰氧基硼氫化鈉)存在下進行還原胺化形成。

磺酰胺接頭通過使一種組分上的胺基團與第二組分上的磺酰鹵(例如磺酰氯)基團反應形成。

砜接頭通過將親核體Michael加成到乙烯砜形成。乙烯砜或親核體可以在納米載體的表面上或者與組分連接。

組分與納米載體綴合還可通過非共價綴合方法綴合。例如,帶負電的治療性大分子或免疫抑制劑可與帶正電的納米載體通過靜電吸附綴合。含有金屬配體的組分可與含有金屬復合物的納米載體經由金屬-配體復合物綴合。

在一些實施方案中,可在組裝合成納米載體之前使組分與聚合物(例如聚乳酸-乙二醇嵌段共聚物)連接,或者合成納米載體可形成為在其表面上具有反應性或可活化基團。在后一種情況下,組分可使用與通過合成納米載體之表面呈現的連接化學相容的基團制備。在另一些實施方案中,可使用合適的接頭使肽組分與VLP或脂質體連接。接頭為能夠將兩個分子連接在一起的化合物或試劑。在一個實施方案中,接頭可以是Hermanson2008中所述的同雙功能試劑或異雙功能試劑。例如,可在EDC存在下用同雙功能接頭己二酸二酰肼(adipicdihydrazide,ADH)處理表面上包含羧基的VLP或脂質體合成納米載體以形成具有ADH接頭的相應合成納米載體。然后,使所得ADH連接的合成納米載體經由該納米載體上ADH接頭的另一端與含有酸基團的肽組分綴合以產生相應的VLP或脂質體肽綴合物。

有關可用綴合方法的詳細描述,參見HermansonGT“BioconiugateTechniques”,第2版,由AcademicPress出版,Inc.,2008。除共價連接之外,組分可與預先形成的合成納米載體通過吸附連接或者其可在形成合成納米載體期間通過包封連接。

本文中提供的任何免疫抑制劑均可用于所提供的方法或組合物,并且在一些實施方案中,可與合成納米載體連接。免疫抑制劑包括但不限于:他汀類;mTOR抑制劑,例如雷帕霉素或雷帕霉素類似物;TGF-β信號傳導劑;TGF-β受體激動劑;組蛋白去乙?;?HDAC)抑制劑;皮質類固醇;線粒體功能的抑制劑,例如魚藤酮;P38抑制劑;NF-κβ抑制劑;腺苷受體激動劑;前列腺素E2激動劑;磷酸二酯酶抑制劑,例如磷酸二酯酶4抑制劑;蛋白酶體抑制劑;激酶抑制劑;G蛋白偶聯受體激動劑;G蛋白偶聯受體拮抗劑;糖皮質激素;類視黃醇;細胞因子抑制劑;細胞因子受體抑制劑;細胞因子受體激活劑;過氧化物酶體增殖物激活受體拮抗劑;過氧化物酶體增殖物激活受體激動劑;組蛋白去乙?;敢種萍?;鈣調神經磷酸酶抑制劑;磷酸酶抑制劑和氧化的ATP。免疫抑制劑還包括IDO、維生素D3、環孢素A、芳基烴受體抑制劑、白藜蘆醇、硫唑嘌呤、6-巰基嘌呤、阿司匹林、尼氟滅酸、雌三醇、雷公藤內酯、白介素(例如,IL-1、IL-10)、環孢素A、靶向細胞因子或細胞因子受體的siRNA等。

他汀類的實例包括:阿托伐他汀西立伐他汀、氟伐他汀洛伐他汀美伐他汀匹伐他汀瑞舒伐他汀瑞舒伐他汀和辛伐他汀

mTOR抑制劑的實例包括:雷帕霉素及其類似物(例如,CCL-779、RAD001、AP23573、C20-甲基烯丙基雷帕霉素(C20-Marap)、C16-(S)-丁基磺酰氨基雷帕霉素(C16-Bsrap)、C16-(S)-3-甲基吲哚雷帕霉素(C16-iRap)(Bayle等Chemistry&Biology2006,13:99-107))、AZD8055、BEZ235(NVP-BEZ235)、大黃根酸(大黃酚)、地磷莫司(deforolimus,MK-8669)、依維莫司(RAD0001)、KU-0063794、PI-103、PP242、坦羅莫司和WYE-354(可獲自Selleck,Houston,TX,USA)。

TGF-β信號傳導劑的實例包括TGF-β配體(例如,活化素A、GDF1、GDF11、骨形態生成蛋白、nodal、TGF-β)及其受體(例如,ACVR1B、ACVR1C、ACVR2A、ACVR2B、BMPR2、BMPR1A、BMPR1B、TGFβRI、TGFβRII)、R-SMADS/co-SMADS(例如,SMAD1、SMAD2、SMAD3、SMAD4、SMAD5、SMAD8)和配體抑制劑(例如,卵泡抑素、頭蛋白(noggin)、脊索蛋白(chordin)、DAN、lefty、LTBP1、THBS1、Decorin)。

線粒體功能的抑制劑的實例包括蒼術苷(二鉀鹽)、米醇菌酸(三銨鹽)、羰基氰化物間氯苯腙、羧基蒼術苷(例如,來自歐蒼術(4tractylisgummifera))、CGP-37157、(-)-魚藤素(例如,來自絹毛萌豆(Munduleasericea))、F16、己糖激酶IIVDAC結合結構域肽、寡霉素、魚藤酮、Ru360、SFK1和纈氨霉素(例如,來自極暗黃鏈霉菌(Streptomycesfulvissimus)(EMD4Biosciences,USA)。

P38抑制劑的實例包括SB-203580(4-(4-氟苯基)-2-(4-甲基亞磺?;交?-5-(4-吡啶基)1H-咪唑)、SB-239063(反式-1-(4羥基環己基)-4-(氟苯基)-5-(2-甲氧基-嘧啶-4-基)咪唑)、SB-220025(5-(2氨基-4-嘧啶基)-4-(4-氟苯基)-1-(4-哌啶基)咪唑))和ARRY-797。

NF(例如,NK-κβ)抑制劑的實例包括IFRD1、2-(1,8-萘啶-2-基)苯酚、5-氨基水楊酸、BAY11-7082、BAY11-7085、CAPE(咖啡酸苯乙酯)、馬來酸二乙酯、IKK-2抑制劑IV、IMD0354、乳胞素、MG-132[Z-Leu-Leu-Leu-CHO]、NFκB激活抑制劑III、NF-κB激活抑制劑II、JSH-23、小白菊內酯、氧化苯胂(PAO)、PPM-18、吡咯烷二硫代氨基甲酸銨鹽、QNZ、RO106-9920、楝酰胺、楝酰胺AL、楝酰胺C、楝酰胺I、楝酰胺J、洛克米蘭醇(rocaglaol)、(R)-MG-132、水楊酸鈉、雷公藤內酯(PG490)和蟛蜞菊內酯(wedelolactone)。

腺苷受體激動劑的實例包括CGS-21680和ATL-146e。

前列腺素E2激動劑的實例包括E-Prostanoid2和E-Prostanoid4。

磷酸二酯酶抑制劑(非選擇性和選擇性抑制劑)的實例包括咖啡因、氨茶堿、IBMX(3-異丁基-1-甲基黃嘌呤)、副黃嘌呤、己酮可可堿、可可堿、茶堿、甲基化黃嘌呤、長春西汀、EHNA(赤型-9-(2-羥基-3-壬基)腺嘌呤)、阿那格雷、依諾昔酮(PERFANTM)、米立農、左西孟旦、日中花堿(mesembrine)、異丁司特、吡拉米司特、木犀草素、屈他維林、羅氟司特(DAXASTM、DALIRESPTM)、西地那非他達拉非伐地那非烏地那非、阿伐那非、淫羊藿苷(icariin)、4-甲基哌嗪和吡唑并嘧啶-7-1。

蛋白酶體抑制劑的實例包括:硼替佐米、雙硫侖、表沒食子兒茶素-3-沒食子酸酯和salinosporamideA。

激酶抑制劑的實例包括貝伐單抗、BIBW2992、西妥昔單抗伊馬替尼曲妥珠單抗吉非替尼雷珠單抗哌加他尼、索拉非尼、達沙替尼、舒尼替尼、埃羅替尼、尼洛替尼、拉帕替尼、帕尼單抗、凡德他尼、E7080、帕唑帕尼(pazopanib)和木利替尼(mubritinib)。

糖皮質激素的實例包括氫化可的松(皮質醇)、醋酸可的松、潑尼松、潑尼松龍、甲潑尼龍、地塞米松、倍他米松、曲安西龍、倍氯米松、醋酸氟氫可的松、醋酸脫氧皮質酮(DOCA)和醛固酮。

類視黃醇的實例包括視黃醇、視黃醛、維A酸(視黃酸、異維A酸阿利維A酸依曲替酯(TEGISONTM)、及其代謝物阿維A他扎羅汀貝沙羅汀和阿達帕林

細胞因子抑制劑的實例包括IL1ra、IL1受體拮抗劑、IGFBP、TNF-BF、尿調節素、α-2-巨球蛋白、環孢素A、噴他瞇和己酮可可豆堿

過氧化物酶體增殖物激活受體拮抗劑的實例包括GW9662、PPARγ拮抗劑III、G335和T0070907(EMD4Biosciences,USA)。

過氧化物酶體增殖物激活受體激動劑的實例包括吡格列酮、環格列酮、氯貝丁酯、GW1929、GW7647、L-165,041、LY171883、PPARγ激活劑、Fmoc-Leu、曲格列酮和WY-14643(EMD4Biosciences,USA)。

組蛋白去乙?;敢種萍戀氖道ㄒ祠請克?或氧肟酸鹽)例如曲古抑菌素A、環四肽(例如trapoxinB)和縮酚酸肽、苯甲酰胺、親電性酮、脂族酸化合物(例如苯丁酸和丙戊酸)、異羥肟酸(例如伏立諾他(SAHA)、貝利司他(PXD101)、LAQ824和帕比司他(LBH589))、苯甲酰胺例如恩替諾特(MS-275)、CI994和mocetinostat(MGCD0103)、煙酰胺、NAD的衍生物、二氫香豆素類、萘并吡喃酮類、以及2-羥基萘醛。

鈣調神經磷酸酶抑制劑的實例包括環孢素、吡美莫司、伏環孢素(voclosporin)和他克莫司。

磷酸酶抑制劑的實例包括BN82002鹽酸鹽、CP-91149、花萼海綿誘癌素A(calyculinA)、斑蝥酸、斑蝥素、氯氰菊酯、乙基-3,4-迪磷他汀、福司曲星鈉鹽、MAZ51、甲基-3,4-迪磷他汀、NSC95397、去甲斑蝥素、來自凹形原甲藻(prorocentrumconcavum)的岡田酸銨鹽、岡田酸、岡田酸鉀鹽、岡田酸鈉鹽、氧化苯胂、多種磷酸酶抑制劑混合物、蛋白質磷酸酶1C、蛋白質磷酸酶2A抑制劑蛋白、蛋白質磷酸酶2A1、蛋白質磷酸酶2A2和正釩酸鈉。

在所提供之任一種方法、組合物或藥盒的一些實施方案中,本文中所述的治療性大分子也與合成納米載體連接。在另一些實施方案中,治療性大分子未與任何合成納米載體連接。在這些情況中任一種的一些實施方案中,治療性大分子可以以治療性大分子自身的形式遞送或者以其片段或衍生物的形式遞送。

治療性大分子可包括治療性蛋白質或治療性多核苷酸。治療性蛋白質包括但不限于:可輸注的治療性蛋白質、酶、酶輔因子、激素、凝血因子、細胞因子和干擾素、生長因子、單克隆抗體和多克隆抗體(例如作為替代治療施用于對象)以及與龐皮病相關的蛋白質(例如,酸性葡糖苷酶α,rhGAA)(例如,Myozyme和Lumizyme(Genzyme))。治療性蛋白質還包括參與凝血級聯的蛋白質。治療性蛋白質包括但不限于:因子VIII、因子VII、因子IX、因子V、馮·維勒布蘭德因子、vonHeldebrant因子、組織纖溶酶原激活物、胰島素、生長激素、紅細胞生成素α、VEGF、血小板生成素、溶菌酶、抗凝血酶等。治療性蛋白質還包括脂肪素(adipokine),例如瘦素和脂聯素。治療性蛋白質的其他實例如下文及本文中的其他部分所述。

用于患有溶酶體貯積癥之對象的酶替代治療中的治療性蛋白質的實例包括但不限于:用于治療戈謝病(Gaucher’sdisease)的伊米苷酶(例如,CEREZYMETM),用于治療法布里病(Fabrydisease)的a-半乳糖苷酶A(a-galA)(例如,阿加糖酶β、FABRYZYMETM),用于治療龐皮病的酸性α-葡糖苷酶GAA(例如,酸葡糖苷酶α、LUMIZYMETM、MYOZYMETM),用于治療黏多醣貯積癥(Mucopolysaccharidose)的芳基硫酸酯酶B(例如,拉羅尼酶、ALDURAZYMETM、艾杜硫酶、ELAPRASETM、芳基硫酸酯酶B、NAGLAZYMETM),聚乙二醇化重組尿酸酶(KRYSTEXXA)和聚乙二醇化重組假絲酵母尿酸酶。

酶的實例包括:氧化還原酶、轉移酶、水解酶、裂合酶、異構酶、天冬酰胺酶、尿酸酶、糖苷酶、天冬酰胺酶、尿酸酶、蛋白酶、核酸酶、膠原酶、透明質酸酶、肝素酶、類肝素酶、細胞溶素(lysin)和連接酶。

治療性蛋白質還可包括分離自或來源于細菌、真菌或病毒來源的任何酶、毒素或其他蛋白質或肽。

激素的實例包括:褪黑激素(N-乙?;?5-甲氧基色胺)、血清素、甲狀腺素(或四碘甲腺原氨酸)(甲狀腺激素)、三碘甲腺原氨酸(甲狀腺激素)、腎上腺素(或腎上腺激素)、去甲腎上腺素(或去甲腎上腺激素)、多巴胺(或催乳素抑制激素)、抗米勒管激素(或米勒管抑制因子或激素)、脂連蛋白、促腎上腺皮質激素(或促皮質素)、血管緊張素原和血管緊張素、抗利尿激素(或加壓素、精氨酸加壓素)、心房鈉尿肽(或心鈉素)、降鈣素、膽囊收縮素、促皮質素釋放激素、紅細胞生成素、促卵泡激素、胃泌素、生長素釋放肽、胰高血糖素、胰高血糖素樣肽(GLP-1)、GIP、促性腺素釋放激素、生長激素釋放激素、人絨毛膜促性腺素、人胎盤催乳素、生長激素、抑制素、胰島素、胰島素樣生長因子(或生長調節素)、瘦素、黃體化激素、黑素細胞刺激激素、食欲素、催產素、甲狀旁腺激素、催乳素、松弛素、分泌素、生長激素抑制素、血小板生成素、甲狀腺刺激激素(或促甲狀腺素)、促甲狀腺素釋放激素、皮質醇、醛固酮、睪酮、去氫表雄酮、雄烯二酮、二氫睪酮、雌二醇、雌酮、雌三醇、黃體酮、骨化三醇(1,25-一羥基維生素D3)、骨化二醇(25-羥基維生素D3)、前列腺素類、白三烯類、前列環素、血栓烷類、催乳素釋放激素、促脂解素、腦鈉尿肽、神經肽Y、組胺、內皮素、胰多肽、腎素和腦啡肽。

血液因子或凝血因子的實例包括:因子I(纖維蛋白原)、因子II(凝血酶原)、組織因子、因子V(前加速素,不穩定因子)、因子VII(穩定因子、前轉化素)、因子VIII(抗血友病球蛋白)、因子IX(克雷司馬斯因子(Christmasfactor)或血漿促凝血酶原激酶組分)、因子X(斯圖爾特因子(Stuart-Prowerfactor))、因子Xa、因子XI、因子XII(哈格曼因子(Hagemanfactor))、因子XIII(纖維蛋白穩定因子)、馮·維勒布蘭德因子、前激肽釋放酶(弗萊徹因子(Fletcherfactor))、高分子量激肽原(HMWK)(菲茲杰拉爾德因子(Fitzgeraldfactor))、纖連蛋白、纖維蛋白、凝血酶、抗凝血酶III、肝素輔因子II、蛋白C、蛋白S、蛋白Z、蛋白Z相關蛋白酶抑制劑(ZPI)、纖溶酶原、α2-抗纖溶酶、組織纖溶酶原激活物(tPA)、尿激酶、纖溶酶原激活物抑制劑-1(PAI1)、纖溶酶原激活物抑制劑-2(PAI2)、癌促凝物質或阿法依伯汀(Epogen,Procrit)。

細胞因子的實例包括淋巴因子、白介素以及趨化因子、1型細胞因子(例如IFN-γ、TGF-β)和2型細胞因子(例如IL-4、IL-10和IL-13)。

生長因子的實例包括腎上腺髓質素(AM)、血管生成素(Ang)、自分泌運動因子、骨形態生成蛋白(Bonemorphogeneticprotein,BMP)、腦源性神經營養因子(Brain-derivedneurotrophicfactor,BDNF)、表皮生長因子(Epidermalgrowthfactor,EGF)、紅細胞生成素(EPO)、成纖維細胞生長因子(Fibroblastgrowthfactor,FGF)、神經膠質細胞系源性神經營養因子(Glialcellline-derivedneurotrophicfactor,GDNF)、粒細胞集落刺激因子(Granulocytecolony-stimulatingfactor,G-CSF)、粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(Granulocytemacrophagecolony-stimulatingfactor,GM-CSF)、生長分化因子-9(Growthdifferentiationfactor-9,GDF9)、肝細胞生長因子(Hepatocytegrowthfactor,HGF)、肝癌源性生長因子(Hepatoma-derivedgrowthfactor,HDGF)、胰島素樣生長因子(Insulin-likegrowthfactor,IGF)、促移行因子、肌生長抑制素(GDF-8)、神經生長因子(Nervegrowthfactor,NGF)及其他神經營養因子、血小板源性生長因子(Platelet-derivedgrowthfactor,PDGF)、血小板生成素(TPO)、轉化生長因子α(Transforminggrowthfactoralpha,TGF-α)、轉化生長因子β(Transforminggrowthfactorbeta,TGF-β)、腫瘤壞死因子α(Tumour_necrosis_factor-alpha,TNF-α)、血管內皮生長因子(Vascularendothelialgrowthfactor,VEGF)、Wnt信號傳導途徑、胎盤生長因子(placentalgrowthfactor,P1GF)、(胎牛促生長素,FoetalBovineSomatotrophin)(FBS)、IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6和IL-7。

單克隆抗體的實例包括:阿巴伏單抗、阿昔單抗、阿達木單抗、阿德木單抗、阿非莫單抗、阿夫土珠單抗(Afutuzumab)、培化阿珠單抗、ALD、阿侖單抗、阿妥莫單抗噴替酸鹽、麻安莫單抗、安蘆珠單抗、抗胸腺細胞珠蛋白、阿泊珠單抗、阿西莫單抗、阿塞珠單抗、Atlizumab(托珠單抗)、阿托木單抗、Bapineuzumab、巴利昔單抗、巴維昔單抗、貝妥莫單抗、貝利木單抗、Benralizumab、柏替木單抗、貝索單抗、貝伐單抗、比西單抗、莫比伐珠單抗、Blinatumomab、Brentuximabvedotin、Briakinumab、卡那單抗、莫坎妥珠單抗、卡羅單抗噴地肽、卡妥索單抗、西利珠單抗、賽妥珠單抗、西妥昔單抗、泊西他珠單抗、Cixutumumab、克立昔單抗、Clivatuzumabtetraxetan、Conatumumab、Dacetuzumab、達珠單抗、Daratumumab、狄迪諾塞麥、地莫單抗、阿托度單抗、Dorlixizumab、依美昔單抗、依庫珠單抗、埃巴單抗、依決可單抗、依法利珠單抗、依芬古單抗、埃羅妥珠單抗、艾西莫單抗、培戈賴莫單抗、西依匹莫單抗、依帕珠單抗、Erlizumab、厄妥索單抗、Etaracizumab、艾韋單抗、Fanolesomab、法拉莫單抗、Farletuzumab、非維珠單抗、非扎奴單抗、Figitumumab、芳妥珠單抗、Foravirumab、Fresolimumab、Galiximab、Gantenerumab、加維莫單抗、吉妥單抗、GC1008、Girentuximab、Glembatumumabvedotin、戈利木單抗、Gomiliximab、Ibalizumab、替伊莫單抗、伊戈伏單抗、英西單抗、英夫利昔單抗、Intetumumab、伊諾莫單抗、奧英妥珠單抗、依匹木單抗、Iratumumab、凱利昔單抗、拉貝珠單抗、Lebrikizumab、來馬索單抗、樂地單抗、來沙木單抗、利韋單抗、林妥珠單抗、Lorvotuzumabmertansine、Lucatumumab、魯昔單抗、馬帕木單抗、馬司莫單抗、馬妥珠單抗、美泊利單抗、美替木單抗、Milatuzumab、明瑞莫單抗、米妥莫單抗、莫羅木單抗、Motavizumab、鼠單克隆抗體-CD3、他那可單抗、Naptumomabestafenatox、那他珠單抗、奈巴庫單抗、Necitumumab、奈瑞莫單抗、尼妥珠單抗、巰諾莫單抗、Ocrelizumab、奧度莫單抗、奧法木單抗、Olaratumab、奧馬珠單抗、莫奧珠單抗、奧戈伏單抗、Otelixizumab、Pagibaximab、帕利珠單抗、帕尼單抗、Panobacumab、帕考珠單抗、Pemtumomab、帕妥珠單抗、Pexelizumab、平妥莫單抗、普立昔單抗、Pritumumab、雷韋單抗、雷莫蘆單抗、雷珠單抗、Raxibacumab、瑞加韋單抗、瑞利珠單抗、Rilotumumab、利妥昔單抗、Robatumumab、Rontalizumab、羅維珠單抗、魯利單抗、沙妥莫單抗噴地肽、司韋單抗、西羅珠單抗、西法木單抗、Siltuximab、西利珠單抗、Solanezumab、Sonepcizumab、Sontuzumab、Stamulumab、硫索單抗、Tacatuzumabtetraxetan、他度珠單抗、Talizumab、尼珠單抗、帕他普莫單抗、替非珠單抗、阿替莫單抗、Tenatumomab、替奈昔單抗、Teplizumab、Ticilimumab(替西木單抗)、替加珠單抗、托珠單抗(atlizumab)、托利珠單抗、托西莫單抗、曲妥珠單抗、替西木單抗、Tucotuzumabcelmoleukin、妥韋單抗、烏珠單抗、Ustekinumab、伐利昔單抗、維多珠單抗、維妥珠單抗、維帕莫單抗、Visilizumab、伏洛昔單抗、伏妥莫單抗、Zalutumumab、扎木單抗、齊拉木單抗和阿佐莫單抗。單克隆抗體還包括抗-TNF-α抗體。

輸注治療或可注射的治療性蛋白質的實例包括例如:托珠單抗(Roche/)、α-1抗胰蛋白酶(Kamada/AAT)、(Affymax和Takeda,合成肽)、白蛋白干擾素α-2b(albinterferonalfa-2b)(Novartis/ZalbinTM)、(PharmingGroup,C1抑制劑替代治療)、替莫瑞林(Theratechnologies/Egrifta,合成生長激素釋放因子)、奧瑞珠單抗(Genentech、Roche和Biogen)、貝利木單抗(GlaxoSmithKline/)、聚乙二醇化重組尿酸酶(pegloticase)(SavientPharmaceuticals/KrystexxaTM)、聚乙二醇化重組假絲酵母尿酸酶、他利苷酶α(Protalix/Uplyso)、阿加糖酶α(Shire/)、葡糖腦苷脂酶α(Shire)和鑰孔林普貝血藍蛋白(KLH)。

另外的治療性蛋白質包括例如:工程化蛋白質,例如Fc融合蛋白、雙特異性抗體、多特異性抗體、納米體、抗原結合蛋白、抗體片段和蛋白質綴合物,例如抗體藥物綴合物。

治療性多核苷酸包括但不限于:核酸適配體例如哌加他尼(Macugen,一種聚乙二醇化抗VEGF適配體)、反義治療性多核苷酸例如反義多核苷酸或反義寡核苷酸(例如,抗病毒藥福米韋生,或米泊美生,靶向載脂蛋白B的信使RNA以降低膽固醇水平的反義治療劑);小干擾RNA(siRNA)(例如,dicer底物siRNA分子(DsiRNA),其為以極高效力介導RNAi的25-30個堿基對的不對稱雙鏈RNA);或經修飾的信使RNA(mmRNA)例如Fougerolles等的美國專利申請2013/0115272和Schrum等的公開的美國專利申請2012/0251618中所公開的那些。

可根據本發明的一些方面使用的其他治療性大分子對本領域技術人員是顯而易見的,并且本發明在此方面不受限制。

在一些實施方案中,組分(例如治療性大分子或免疫抑制劑)可以是經分離的?!熬擲氳摹敝缸櫸鐘肫涮烊換肪撤擲氬⑶乙宰愎渙看嬖諞栽市砥浼ɑ蚴褂?。這意味著,例如,組分可(i)通過表達克隆選擇性地產生或者(ii)通過色譜或電泳進行純化。經分離的組分可以但不需要是基本純的。由于可將經分離的組分與可藥用賦形劑一起混合在藥物制劑中,所述組分可僅占制劑的小重量百分比。組分仍是經分離的,只要其已與在活系統中與其相關的物質分離,即與其他脂質或蛋白質分離。本文中提供的任一種組分均可以是經分離的并且以經分離形式包含在組合物中或者用于方法中。

D.制備和使用所述組合物的方法及相關方法

本發明的一些方面涉及確定用于本文中提供的伴隨施用的方法的方案??扇縵氯范ǚ槳福焊謀涫┯彌瘟菩源蠓腫雍兔庖咭種萍戀鈉德?、劑量及其他方面并隨后基于這些變化評估藥效學作用。各種施用均發生在抗治療性大分子抗體應答存在下。用于實施本發明的一個優選方案誘導期望的藥效學作用但誘導很少至無抗治療性大分子抗體應答。

在本發明的一些方面,治療性大分子的期望藥效學作用包括刺激或抑制特定應答。在一些實施方案中,藥效學作用涉及,但不限于:細胞因子、趨化因子、信號傳導分子或其他分子的產生或降解;誘導特定細胞類型的增殖或死亡;特定細胞類型的成熟或定位;與酶、結構蛋白、載體蛋白或受體蛋白的相互作用;調節酶、結構蛋白或受體蛋白的活性,等。在一些實施方案中,藥效學作用為降低細胞因子例如炎癥相關的細胞因子(例如TNF、IL-1)的產生。在一些實施方案中,藥效學作用為降低細胞因子的活性。在一些實施方案中,藥效學作用為降低不期望分子的產生。在一些實施方案中,藥效學作用為提高不期望分子(例如尿酸晶體)的降解。在一些實施方案中,藥效學作用為酶的活性。

可通過標準方法來評估治療性大分子的藥效學作用。在本發明的一些方面,藥效學作用為炎癥的降低??賞ü韻率糾苑椒ɡ雌攔姥字⒌乃?,所述方法不限于對炎性癥狀(例如發紅或腫脹)進行評分;對關節炎癥狀(例如運動性、疼痛或關節損壞)進行評分;對過敏反應癥狀(例如腫脹、血壓、氣短)進行評分;通過組織學、免疫組織化學、流式細胞術檢測和/或量化細胞浸潤;通過ELISA測量蛋白質或炎癥相關細胞因子(TNF、IL-1)的濃度,通過轉錄分析評估基因或炎癥相關基因的表達;測量炎癥相關細胞因子的活性,等。

在本發明的一些方面,藥效學作用為不期望分子的降低或降解。在一些實施方案中,可通過但不限于借助例如ELISA的方法量化組織或血液樣品中的不期望分子來評估藥效學作用。在一些實施方案中,可通過借助例如ELISA的方法量化由不期望分子的降解所產生的分子來評估藥效學作用。在本發明的一些方面,藥效學作用為先前不存在或不充分存在的酶的活性。在這樣的一些實施方案中,可通過檢測具有該酶活性之產物的存在或濃度來評估酶的活性。

在本發明的一些方面,施用降低的治療性大分子劑量以產生藥效學作用。出于此目的的降低的治療性大分子劑量包括在免疫抑制劑劑量的伴隨施用下在抗治療性大分子抗體應答存在下實現藥效學作用的任意治療性大分子劑量,其低于在抗治療性大分子抗體應答存在下當不與免疫抑制劑劑量伴隨施用時用治療性大分子實現類似的藥效學作用所需的劑量??扇縵氯范ń檔偷募亮浚涸誑怪瘟菩源蠓腫涌固逵Υ鶇嬖諳亂閱騁患亮渴┯彌瘟菩源蠓腫硬樗媸┯妹庖咭種萍良亮?,并且評估藥效學作用。然后,可將藥效學作用與通過在抗治療性大分子抗體應答存在下在無伴隨施用免疫抑制劑劑量下施用治療性大分子獲得的藥效學作用進行比較。通過這樣的比較確定之實現類似藥效學作用的較低劑量即為降低的劑量。

如前所述,免疫抑制劑可與合成納米載體連接??墑褂帽玖煊蛑幸閻畝嘀址椒ɡ粗票負銑贍擅自靨?。例如,可通過以下方法及本領域普通技術人員公知的其他方法來形成合成納米載體:例如,納米沉淀、使用流體通道的流動聚焦、噴霧干燥、單乳化溶劑蒸發和雙乳化溶劑蒸發、溶劑萃取、相分離、研磨、微乳化法、微制造、納米制造、犧牲層、簡單凝聚和復合凝聚。作為替代或補充,用于單分散半導體納米材料、電導性納米材料、磁性納米材料、有機納米材料及其他納米材料的水性溶劑和有機溶劑合成已有描述(Pellegrino等,2005,Small,1:48;Murray等,2000,Ann.Rev.Mat.Sci.,30:545;和Trindade等,2001,Chem.Mat.,13:3843)。另外的方法已在以下文獻中進行了描述(參見,例如,Doubrow,編輯,“MicrocapsulesandNanoparticlesinMedicineandPharmacy,”CRCPress,BocaRaton,1992;Mathiowitz等,1987,J.Control.Release,5:13;Mathiowitz等,1987,ReactivePolymers,6:275;和Mathiowitz等,1988,J.Appl.PolymerSci.,35:755;美國專利5578325和6007845;P.Paolicelli等,“Surface-modifiedPLGA-basedNanoparticlesthatcanEfficientlyAssociateandDeliverVirus-likeParticles”Nanomedicine.5(6):843-853(2010))。

如果期望的話,可使用多種方法將多種材料包封在合成納米載體內,所述方法包括但不限于C.Astete等,“SynthesisandcharacterizationofPLGAnanoparticles”J.Biomater.Sci.PolymerEdn,第17卷,第3期,第247-289頁(2006);K.Avgoustakis“PegylatedPoly(Lactide)andPoly(Lactide-Co-Glycolide)Nanoparticles:Preparation,PropertiesandPossibleApplicationsinDrugDelivery”CurrentDrugDelivery1:321-333(2004);C.Reis等,“NanoencapsulationI.Methodsforpreparationofdrug-loadedpolymericnanoparticles”Nanomedicine2:8-21(2006);P.Paolicelli等,“Surface-modifiedPLGA-basedNanoparticlesthatcanEfficientlyAssociateandDeliverVirus-likeParticles”Nanomedicine.5(6):843-853(2010)。也可使用適合將材料包封在合成納米載體內的其他方法,包括但不限于于2003年10月14日授權的Unger的美國專利6,632,671中公開的方法。

在某些實施方案中,通過納米沉淀法或噴霧干燥來制備合成納米載體??啥雜糜謚票負銑贍擅自靨宓奶跫懈謀湟圓哂釁諭嘰緇蛺匭?例如,疏水性、親水性、外部形態、“黏性”、形狀等)的顆粒。制備合成納米載體的方法及所使用的條件(例如,溶劑、溫度、濃度、空氣流速等)可取決于待與合成納米載體連接的材料和/或聚合物基質的組成。

如果通過上述任一種方法制備的合成納米載體的尺寸范圍在期望范圍之外,則可例如使用篩對此類合成納米載體進行尺寸選擇。

合成納米載體的成分(即,組分)(例如抗原、免疫抑制劑等)可與整個合成納米載體例如通過一個或更多個共價鍵連接,或者可借助一個或更多個接頭連接。官能化合成納米載體的另外方法可修改自Saltzman等的公開的美國專利申請2006/0002852、DeSimone等的公開的美國專利申請2009/0028910或Murthy等的公開的國際專利申請WO/2008/127532A1。

作為替代或補充,合成納米載體與組分可直接地或間接地經由非共價相互作用連接。在一些非共價實施方案中,非共價連接由非共價相互作用介導,所述非共價相互作用包括但不限于:電荷相互作用、親和性相互作用、金屬配位、物理吸附、主體-客體相互作用、疏水性相互作用、TT堆積相互作用、氫鍵合相互作用、范德華相互作用、磁性相互作用、靜電相互作用、偶極-偶極相互作用和/或其組合。這樣的偶聯可布置成在合成納米載體的外表面或內表面上。在一些實施方案中,包封和/或吸附是連接的形式。在一些實施方案中,可將合成納米載體與治療性大分子或其他組成通過混合在同一載劑或遞送系統中而組合。

本文中提供的組合物可包含無機或有機緩沖劑(例如,磷酸、碳酸、醋酸或檸檬酸的鈉鹽或鉀鹽)和pH調節劑(例如,鹽酸、氫氧化鈉或氫氧化鉀、檸檬酸或醋酸的鹽、氨基酸及其鹽)、抗氧化劑(例如,抗壞血酸、α-生育酚)、表面活性劑(例如,聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯80、聚氧乙烯9-10壬基苯酚、去氧膽酸鈉)、溶液劑和/或冷凍/凍干穩定劑(例如,蔗糖、乳糖、甘露醇、海藻糖)、滲透調節劑(例如,鹽或糖)、抗菌劑(例如,苯甲酸、苯酚、慶大霉素)、消泡劑(例如,聚二甲基硅氧烷)、防腐劑(例如,硫柳汞、2-苯氧基乙醇、EDTA)、聚合物穩定劑和黏度調節劑(例如,聚乙烯吡咯烷酮、泊洛沙姆488、羧甲基纖維素)和潛溶劑(例如甘油、聚乙二醇、乙醇)。

根據本發明的組合物可包含可藥用賦形劑。所述組合物可使用常規的藥物制備和配合技術制成以實現可用的劑型。適用于實施本發明的技術可見于HandbookofIndustrialMixing:ScienceandPractice,由EdwardL.Paul,VictorA.Atiemo-Obeng和SuzanneM.Kresta編輯,2004JohnWiley&Sons,Inc.;和Pharmaceutics:TheScienceofDosageFormDesign,第2版.由M.E.Auten編輯,2001,ChurchillLivingstone中。在一個實施方案中,將組合物與防腐劑一起混懸于無菌鹽水溶液中以用于注射。

應當理解,本發明的組合物可以以任何合適的方式制備,并且本發明不以任何方式局限于可使用本文中所述的方法制備的組合物。對合適制備方法的選擇可需要注意所締合的具體部分的特性。

在一些實施方案中,組合物是在無菌條件下制備的,或者是經最終滅菌的。這可確保,所得組合物是無菌的和非感染性的,從而當與非無菌組合物相比時,安全性提高。這提供了有價值的安全措施,尤其是當接受組合物的對象具有免疫缺陷、患有感染和/或易受感染時。在一些實施方案中,可將組合物冷凍干燥并懸浮儲存或者作為凍干粉末儲存,這取決于不喪失活性的長期配制策略。

根據本發明的施用可通過多種途徑,包括但不限于:皮下、靜脈內、腹膜內、肌內、經粘膜、經皮、經皮膚或皮內途徑。在一個優選實施方案中,施用經由皮下施用途徑??墑褂貿9娣椒ń疚鬧刑峒暗淖楹銜錙渲坪橢票賦捎糜謔┯?,優選用于伴隨施用。

可以以有效量(例如本文中其他部分所述的有效量)施用本發明的組合物。根據本發明,劑型的劑量可包含不同量的免疫抑制劑和/或治療性大分子。本發明劑型中存在的免疫抑制劑和/或治療性大分子的量可根據以下方面而不同:治療性大分子和/或免疫抑制劑的性質、需達到的治療益處以及其他這樣的參數。在一些實施方案中,可進行劑量范圍研究以建立劑型中存在之免疫抑制劑和/或治療性大分子的最佳治療量。在一些實施方案中,免疫抑制劑和/或治療性大分子以在施用于對象后有效產生期望的藥效學作用和/或針對所述治療性大分子的降低免疫應答的量存在于劑型中??衫迷詼韻籩薪諧9嫻募亮糠段а芯亢圖際趵慈范ㄓ行Р諭峁拿庖咭種萍梁?或治療性大分子的量。本發明的劑型可以以多種頻率施用。在一個優選實施方案中,本文中提供的組合物的至少一次施用就足以產生藥理學上相關的響應。在一些更優選的實施方案中,利用至少兩次施用或至少三次施用以確保藥理學上相關的響應。在一些實施方案中,利用重復施用以確保藥理學上相關的響應。

本公開內容的另一個方面涉及藥盒。在一些實施方案中,所述藥盒包含治療性大分子的一個藥效學有效劑量或多于一個劑量,例如降低的藥效學有效劑量。在這樣的一些實施方案中,所述藥盒還可包含一個免疫抑制劑劑量或多于一個免疫抑制劑劑量。免疫抑制劑劑量和藥效學有效劑量可包含在藥盒中的獨立容器中或者包含在藥盒中的同一容器中。在一些實施方案中,所述容器為小瓶或安瓿。在一些實施方案中,治療性大分子的藥效學有效劑量和/或免疫抑制劑劑量包含在與容器分開的溶液中,使得可隨后將治療性大分子的藥效學有效劑量和/或免疫抑制劑劑量添加至容器。在一些實施方案中,治療性大分子的藥效學有效劑量和/或免疫抑制劑劑量以凍干形式各自存在于獨立容器中或同一容器中,使得它們可隨后重構。在一些實施方案中,所述藥盒還包含用于重構、混合、施用等的說明書。在一些實施方案中,所述說明書包含對本文中所述的方法的說明。說明書可以是任何合適的形式,例如,作為印刷插入物或標簽。在一些實施方案中,所述藥盒還包含一個或更多個注射器。

實施例

實施例1:用包含免疫抑制劑和APC可呈遞抗原的合成納米載體體內評 價免疫應答

材料

卵清蛋白肽323-339(OVA323-339),即已知為卵清蛋白蛋白質的T細胞和B細胞表位的一種17氨基酸肽,購自BachemAmericasInc.(3132KashiwaStreet,TorranceCA90505;Part#4065609)。雷帕霉素購自TSZCHEM(185WilsonStreet,Framingham,MA01702;產品目錄#R1017)。丙交酯∶乙交酯比例為3∶1并且特性黏度為0.75dL/g的PLGA購自SurModicsPharmaceuticals(756TomMartinDrive,Birmingham,AL35211;產品代碼7525DLG7A)。聚乙烯醇(85%至89%水解的)購自EMDChemicals(產品號1.41350.1001)。

用于制備包含雷帕霉素和卵清蛋白(323-339)的合成納米載體的方法

如下制備溶液:

溶液l:稀鹽酸水溶液中的20mg/mLOVA323-339。該溶液通過在室溫下將卵清蛋白肽溶解于0.13M鹽酸溶液中制備。

溶液2:二氯甲烷中的100mg/mLPLGA。該溶液通過將PLGA溶解于純二氯甲烷中制備。

溶液3:二氯甲烷中的100mg/mLPLA-PEG。該溶液通過將PLA-PEG溶解于純二氯甲烷中制備。

溶液4:二氯甲烷中的50mg/mL雷帕霉素。該溶液通過將雷帕霉素溶解于純二氯甲烷中制備。

溶液5:100mMpH8磷酸鹽緩沖液中的50mg/mL聚乙烯醇。

首先制備初級的油包水型乳劑。如下制備W1/O1:將溶液1(0.2mL)、溶液2(0.75mL)、溶液3(0.25mL)和溶液4(0.2mL)合并在小壓力管中并使用BransonDigitalSonifier250以50%振幅進行超聲處理40秒。然后,如下制備次級乳劑(W1/O1/W2):將溶液5(3.0mL)與初級W1/O1乳劑組合,渦旋10秒并使用BransonDigitalSonifier250以30%振幅進行超聲處理60秒。

將W1/O1/W2乳劑添加至含有70mMpH8磷酸鹽緩沖溶液(30mL)的燒杯并在室溫下攪拌2小時以使二氯甲烷蒸發并形成合成納米載體。將一部分的合成納米載體經如下洗滌:將合成納米載體混懸液轉移至離心管并在75,600×g和4℃下離心35分鐘,除去上清液并將沉淀物重懸于磷酸緩沖鹽水中。重復洗滌操作并將沉淀物重懸于磷酸緩沖鹽水中以獲得約10mg/mL的最終合成納米載體分散體。

通過HPLC分析確定合成納米載體中肽和雷帕霉素的量。通過重量法確定總干合成納米載體質量/mL混懸液。

用于包含雷帕霉素的合成納米載體的方法

首先制備初級油包水型乳劑。如下制備W1/O1:將0.13M鹽酸溶液(0.2mL)、溶液2(0.75mL)、溶液3(0.25mL)和溶液4(0.2mL)合并在小壓力管中并使用BransonDigitalSonifier250以50%振幅進行超聲處理40秒。然后,如下制備次級乳劑(W1/O1/W2):將溶液5(3.0mL)與初級W1/O1乳劑組合,渦旋10秒并使用BransonDigitalSonifier250以30%振幅進行超聲處理60秒。

將W1/O1/W2乳劑添加至含有70mMpH8磷酸鹽緩沖溶液(30mL)的燒杯并在室溫下攪拌2小時以使二氯甲烷蒸發并形成合成納米載體。將一部分的合成納米載體經如下洗滌:將合成納米載體混懸液轉移至離心管并在21,000×g和4℃下離心1小時,除去上清液并將沉淀物重懸于磷酸緩沖鹽水中。重復洗滌操作并將沉淀物重懸于磷酸緩沖鹽水中以獲得約10mg/mL的最終合成納米載體分散體。

通過HPLC分析確定合成納米載體中雷帕霉素的量。通過重量法確定總干合成納米載體質量/mL混懸液。

用于測量雷帕霉素載量的方法

收集約3mg的合成納米載體并離心以使上清液與合成納米載體沉淀物分離。向沉淀物添加乙腈,將樣品超聲處理并離心以除去任何不溶性材料。將上清液和沉淀物注射在RP-HPLC上并在278nm下讀取吸光度。使用見于沉淀物中的μg計算捕獲的%(載量),并使用上清液和沉淀物中的μg計算回收的總μg。

用于測量卵清蛋白(323-339)載量的方法

收集約3mg的合成納米載體并離心以使上清液與合成納米載體沉淀物分離。向沉淀物添加三氟乙醇并對樣品進行超聲處理以使聚合物溶解,添加0.2%三氟乙酸,將樣品進行超聲處理并離心以除去任何不溶性材料。將上清液和沉淀物注射在RP-HPLC上并在215nm下讀取吸光度。使用見于沉淀物中的μg計算捕獲的%(載量),使用上清液和沉淀物中的μg計算回收的總μg。

免疫

本實驗的目的是為了通過測量抗原特異性免疫球蛋白來評估經包封的免疫抑制劑對正發生的抗體應答的影響。使一組動物保持未免疫作為對照。使用雞卵清蛋白(Ovalbumin,OVA)和CpG通過在足墊內進行3次注射(d0、d14和d28)來對兩組動物進行免疫,之后評估抗體效價。對于免疫,使動物在兩后肢內皮下接受20μl/肢的OVA+CpG(12.5μgOVA+10μgCpG)。在相同天施用的處理包括靜脈內(200μl)或皮下(20μl)施用。以使得在處理組中注射相同量OVA323-339的方式對納米載體進行稀釋。

IgG的測量

對IgG抗體的水平進行測量。使用PBS中的封閉劑酪蛋白(ThermoFisher,目錄#37528)作為稀釋劑。使用PBS中的0.05%Tween-20作為洗滌緩沖液,其通過將10mlTween-20(Sigma,目錄#P9416-100mL)添加至2升10xPBS貯存液(PBS:10XPBS液體濃縮物,4L,EMDChemicals,目錄#6505)和18升去離子水制備。

使用貯存液濃度為5mg/ml的OVA蛋白質作為包被材料。使用5μg/ml的1∶1000稀釋度作為工作濃度。用100μl經稀釋OVA/孔包被測定板的每個孔,將板用密封膜(VWR目錄#60941-120)密封并在4℃下孵育過夜。使用Costar901796孔平底板作為測定板(Costar9017)。

使用低結合聚丙烯96孔板或管作為在轉移至測定板之前在其中制備樣品的制備板(set-upplate)。制備板不含任何抗原,因此在制備樣品期間血清抗體不與該板結合。如果使用經抗原包被的板來制備樣品,使用制備板進行樣品制備以最小化在制備或用移液管吸移樣品期間可發生的結合。在于制備板中制備樣品之前,將孔用稀釋劑覆蓋以封閉任何非特異性結合,將板密封并在4℃下孵育過夜。

將測定板用洗滌緩沖液洗滌三次,并在最后一次洗滌之后完全吸出孔中的洗滌緩沖液。在洗滌之后,向測定板的每個孔添加300μl稀釋劑以封閉非特異性結合并將板在室溫下孵育至少2小時。以合適的起始稀釋度在制備板中制備血清樣品。有時也使用稀釋劑在1.5ml管中制備起始稀釋度并隨后將其轉移至制備板。在可用時,基于先前的數據來確定合適的起始稀釋度。當先前的數據不可用時,最低起始稀釋度為1∶40。一旦被稀釋,將200μl起始稀釋度的血清樣品從管轉移至制備板中的合適孔。

一種示例性制備板的布局描述如下:列2和3包含稀釋至0.25μg/mL(1∶4000稀釋度)的抗卵清蛋白單克隆IgG2b同種型(AbCam,ab17291)標準物。列3至11包含血清樣品(適當稀釋度)。列1和12不用于樣品或標準物以避免由于邊緣效應而引起的任何測量偏差。作為替代,列1和12包含200μl稀釋劑。使用經1∶40稀釋的正常小鼠血清作為陰性對照。使用由0.5mg/mL貯存液(BDBioscience)經1∶500稀釋的抗小鼠IgG2a作為同種型對照。

一旦在制備板中制備完所有的樣品,將板密封并儲存在4℃下,直至測定板的封閉完成。將測定板用洗滌緩沖液洗滌三次,并在最后一次洗滌之后完全吸出洗滌緩沖液。在洗滌之后,向測定板的B至H排中的所有孔中添加100μL稀釋劑。使用12-道移液器將樣品從制備板轉移至測定板。在轉移之前通過將150μl經稀釋的血清用移液管上下吸移3次來混合樣品。在混合之后,將每份樣品中的150μl從制備板轉移并添加至各測定板的A排。

一旦將起始稀釋度的每份樣品從制備板轉移至測定板的A排,如下在測定板上用移液管吸移連續稀釋液:使用12-道移液器從A排取出每份血清樣品中的50μl并將其與之前添加至B排每孔中的100μl稀釋劑混合。在整個板中向下重復該步驟。在用移液管吸移最后一排的稀釋物之后,從最后一排的孔中取出50μl流體并棄掉以在測定板的每個孔中產生100μl的終體積。一旦在測定板中制備完樣品稀釋物,將板在室溫下孵育至少2小時。

在孵育之后,將板用洗滌緩沖液洗滌三次。在稀釋劑中以1∶1500(0.33μg/mL)稀釋檢測抗體(山羊抗小鼠抗-IgG、HRP綴合的、AbCamab98717)并向每個孔添加100μl經稀釋的抗體。將板在室溫下孵育1小時并隨后用洗滌緩沖液洗滌三次,其中每個洗滌步驟包括至少30秒的浸泡時間。

在洗滌之后,向孔中添加檢測底物。在臨添加至測定板之前,將等份的底物A和底物B(BDBiosciencesTMBSubstrateReagentSet,目錄#555214)合并,向每個孔添加100μl的經混合底物溶液并在暗處孵育10分鐘。10分鐘后,通過向每個孔添加50μl終止溶液(2NH2SO4)使反應終止。在添加終止溶液之后,立即通過450nm下的板讀數與570nm下的板讀數相減評估孔的光密度(OD)。使用MolecularDevice軟件SoftMaxProv5.4進行數據分析。以稀釋度為x軸(log刻度)并以OD值為y軸(線性刻度)制作四參數邏輯曲線擬合圖(four-parameterlogisticcurve-fitgraph),并確定每份樣品的半最大值(EC50)。調整布局頂部的板模板以反映每份樣品的稀釋度(1/列)。

結果

結果證明了使用與抗原的組合的免疫抑制劑劑量能夠降低抗原特異性抗體應答,免疫抑制劑和抗原兩者均與納米載體連接。圖1示出了當靜脈內施用時,在包含肽抗原和免疫抑制劑的納米載體下循環中抗原特異性抗體產生的降低。進行2個獨立實驗,每個實驗中使用5只動物。圖2示出了當皮下施用時,在包含肽抗原和免疫抑制劑的納米載體下循環中抗原特異性抗體產生的降低。進行3個獨立實驗,每個實驗中使用5只動物。使用常規的單因素ANOVA檢驗的事后Bonferroni檢驗計算p值(*=p<0.05、**=p<0.01和***=p<0.001)。

這些結果證明:當在一般地產生顯著抗卵清蛋白抗體應答的條件下施用時,使用相同量的卵清蛋白蛋白質可獲得增強的作用。此外,如結果所提示的,已可在降低的藥效學有效劑量下獲得這種藥效學作用。最后,結果的重現支持建立證明當與免疫抑制劑劑量伴隨施用后在治療性大分子的降低的藥效學有效劑量下產生藥效學作用的方案。

實施例2:在包含免疫抑制劑和治療性蛋白質的合成納米載體的伴隨施用 之后評價免疫應答

材料

雷帕霉素購自TSZCHEM(185WilsonStreet,Framingham,MA01702;產品目錄#R1017)。具有76%丙交酯和24%乙交酯含量并且特性黏度為0.69dL/g的PLGA購自SurModicsPharmaceuticals(756TomMartinDrive,Birmingham,AL35211.產品代碼7525DLG7A.)。PEG嵌段為約5,000Da并且PLA嵌段為約40,000Da的PLA-PEG嵌段共聚物購自SurModicsPharmaceuticals(756TomMartinDrive,Birmingham,AL35211;產品代碼100DLmPEG50005CE)。聚乙烯醇(85%至89%水解的)購自EMDChemicals(產品號1.41350.1001)。

用于制備合成納米載體的方法

如下制備溶液:

溶液1:二氯甲烷中的75mg/mLPLGA和25mg/mLPLA-PEG。該溶液通過將PLGA和PLA-PEG溶解于純二氯甲烷中制備。

溶液2:二氯甲烷中的100mg/mL雷帕霉素。該溶液通過將雷帕霉素溶解于純二氯甲烷中制備。

溶液3:100mMpH8磷酸鹽緩沖液中的50mg/mL聚乙烯醇。

使用水包油型乳劑制備納米載體。如下制備O/W乳劑:將溶液1(1mL)、溶液2(0.1mL)和溶液3(3mL)合并在小壓力管中并使用BransonDigitalSonifier250以30%振幅進行超聲處理60秒。將O/W乳劑添加至含有70mMpH8磷酸鹽緩沖溶液(30mL)的燒杯并在室溫下攪拌2小時以使二氯甲烷蒸發并形成納米載體。將一部分的納米載體經如下洗滌:將納米載體混懸液轉移至離心管并在75,000×g和4℃下離心35分鐘,除去上清液并將沉淀物重懸于磷酸緩沖鹽水中。重復洗滌操作并將沉淀物重懸于磷酸緩沖鹽水中以獲得約10mg/mL的最終納米載體分散體。

通過動態光散射確定納米載體的尺寸。通過HPLC分析確定納米載體中的雷帕霉素量。通過重量法確定總干納米載體質量/mL混懸液。

針對卵清蛋白的應答

對C57BL/6年齡匹配(5周至6周)的雌性小鼠(5只/組,3組:原初對照、未經處理的對照和用具有雷帕霉素的合成納米載體進行處理)靜脈內注射25μg使用高剪切以形成聚集體從而提高其免疫原性誘導的雞卵清蛋白(aggOVA)。在引發和加強免疫應答的這些靜脈內注射(在第0、14和28天施用)之后,腹膜內進行25μg卵清蛋白的后續加強(i.p.,第42和57天)并在左后肢內皮下進行12.5μgpOVA攻擊(s.c.d62),之后是使用與CpG組合的相同aggOVA的攻擊(s.c.,第90、105和135天)。圖3示出了此免疫方案的結果。在第25和40天,使用ELISA(一般如實施例1中所述的技術)在這些動物中可檢測到顯著的抗OVA抗體(Ab)應答。觀察到,后續的aggOVA注射維持這些效價或者甚至加強該應答。相比之下,當僅在d0、14和28之與抗原的前三次接觸期間使用與aggOVA靜脈內伴隨施用的合成納米載體(計算劑量以提供100μg的雷帕霉素)處理小鼠時,甚至在4次包含aggOVA之免疫原性混合物注射后的隨后60天內仍不能檢測到IgG應答。參見圖3。僅在aggOVA/KLH和CpG(極其具有免疫原性的組合)的3次s.c.注射(s.c.第90、105和135天)后,可在經處理的動物中檢測到非常溫和的抗aggOVAIgG應答。

針對第二抗原鑰孔林普貝血藍蛋白的應答

也向上述同一小鼠注射0.05μg第二Ag鑰孔林普貝血藍蛋白(KLH),其中KLH與aggOVA混合并根據aggOVA的上述方案施用。使用與實施例1中所述的抗OVAIgG效價方法類似的方法確定抗KLHIgG抗體效價。

圖4中的結果表明,不同于aggOVA,KLH在的與Ag接觸的第一階段(d0-40)無免疫原性。然而,在于CpGs.c.存在下進行3次KLH免疫(s.c.,第90、105和135天)后,在未經合成納米載體處理的動物中KLH具有免疫原性。在這些對照小鼠中可觀察到強抗KIH應答,而在該方案開始時接受3次具有與抗原組合的免疫抑制劑的合成納米載體處理的小鼠甚至在KLH/CpG攻擊后仍沒有可檢測的應答。

這些結果證明,當在一般產生顯著抗體應答的條件下施用時,使用本文中提供的組合物和方法可獲得增強的作用。此外,結果支持建立了證明產生藥效學作用的方案。

實施例3:用于制備與雷帕霉素連接的納米載體的方法

材料

雷帕霉素購自TSZCHEM(185WilsonStreet,Framingham,MA01702;產品代碼R1017)。丙交酯∶乙交酯比例為3∶1并且特性黏度為0.75dL/g的PLGA購自SurModicsPharmaceuticals(756TomMartinDrive,Birmingham,AL35211;產品代碼7525DLG7A)。甲基醚封端的PEG嵌段為約5,000Da并且整體特性黏度為0.5DL/g的PLA-PEG-OMe嵌段共聚物購自LakeshoreBiochemicals(756TomMartinDrive,Birmingham,AL35211;產品代碼100DLmPEG50005CE)。聚乙烯醇4-88,USP(85%至89%水解的,黏度為3.4mPa·s至4.6mPa·s)購自EMDChemicalsInc.(480SouthDemocratRoadGibbstown,NJ08027.產品代碼1.41350)。

方法

如下制備溶液:

溶液1:二氯甲烷中的75mg/mLPLGA、25mg/mLPLA-PEG-OMe和12.5mg/mL雷帕霉素。該溶液通過將PLGA、PLA-PEG-OMe和雷帕霉素溶解于純二氯甲烷中制備。

溶液2:100mMpH8磷酸鹽緩沖液中的50mg/mL聚乙烯醇。

使用水包油型(O/W)乳劑制備納米載體。如下制備O/W乳劑:將溶液1(1.0mL)和溶液2(3.0mL)合并在小壓力管中并使用BransonDigitalSonifier250以30%振幅進行超聲處理60秒。將O/W乳劑添加至含有70mMpH8磷酸鹽緩沖溶液的燒杯并在室溫下攪拌2小時以使二氯甲烷蒸發并形成納米載體。將一部分的納米載體經如下洗滌:將納米載體混懸液轉移至離心管并在75,600×g和4℃下離心50分鐘,除去上清液并將沉淀物重懸于磷酸緩沖鹽水中。重復洗滌操作并將沉淀物重懸于磷酸緩沖鹽水中以獲得約10mg/mL的最終合成納米載體分散體。

通過動態光散射確定納米載體的尺寸并示于表1中。通過HPLC分析確定納米載體中雷帕霉素的量(表1)。通過重量法確定總干納米載體質量/mL混懸液。

與雷帕霉素連接的納米載體的有效直徑和雷帕霉素含量

材料

雷帕霉素購自TSZCHEM(185WilsonStreet,Framingham,MA01702;產品代碼R1017)。丙交酯∶乙交酯比例為1∶1并且特性黏度為0.24dL/g的PLGA購自SurModicsPharmaceuticals(756TomMartinDrive,Birmingham,AL35211;產品代碼5050DLG2.5A)。甲基醚封端的PEG嵌段為約5,000Da并且整體特性黏度為0.5DL/g的PLA-PEG-OMe嵌段共聚物購自LakeshoreBiochemicals(756TomMartinDrive,Birmingham,AL35211;產品代碼100DLmPEG50005CE)。聚乙烯醇4-88,USP(85%至89%水解的,黏度為3.4mPa·s至4.6mPa·s)購自EMDChemicalsInc.(480SouthDemocratRoadGibbstown,NJ08027.產品代碼1.41350)。

方法

如下制備溶液:

溶液1:二氯甲烷中的75mg/mLPLGA、25mg/mLPLA-PEG-OMe和12.5mg/mL的雷帕霉素。該溶液通過將PLGA、PLA-PEG-OMe和雷帕霉素溶解于純二氯甲烷中制備。

溶液2:100mMpH8磷酸鹽緩沖液中的50mg/mL聚乙烯醇。

溶液3:70mM磷酸鹽緩沖液,pH8。

如下制備水包油型乳劑:將溶液1(1.0mL)和溶液2(3.0mL)混合在小壓力管中并使用BransonDigitalSonifier250以30%振幅進行超聲處理60秒。將乳劑添加至含有溶液3(30mL)的50mL敞口燒杯并在室溫下攪拌2小時以使二氯甲烷蒸發并混懸形成納米載體。然后,將一部分的混懸納米載體經如下洗滌:將納米載體混懸液轉移至離心管并在75,600rcf旋轉40分鐘,除去上清液并將沉淀物重懸于磷酸緩沖鹽水中。重復該洗滌操作并隨后將沉淀物重懸于PBS1X中以獲得基于聚合物的標稱濃度為10mg/mL的納米載體混懸液。將混懸液冷凍儲存在-20℃下直至使用。

通過動態光散射確定納米載體的尺寸。通過HPLC分析確定納米載體中的雷帕霉素量。通過重量法確定總干納米載體質量/mL混懸液。

與雷帕霉素連接的納米載體的有效直徑和雷帕霉素含量

材料

雷帕霉素購自TSZCHEM(185WilsonStreet,Framingham,MA01702;產品代碼R1017)。丙交酯∶乙交酯比例為1∶1并且特性黏度為0.24dL/g的PLGA購自SurModicsPharmaceuticals(756TomMartinDrive,Birmingham,AL35211;產品代碼5050DLG2.5A)。甲基醚封端的PEG嵌段為約5,000Da并且整體特性黏度為0.5DL/g的PLA-PEG-OMe嵌段共聚物購自LakeshoreBiochemicals(756TomMartinDrive,Birmingham,AL35211;產品代碼100DLmPEG50005CE)。F8II.1723肽購自AnaSpec(34801CampusDrive,Fremont,CA94555)。聚乙烯醇4-88,USP(85%至89%水解的,黏度為3.4mPa·s至4.6mPa·s)購自EMDChemicalsInc.(480SouthDemocratRoadGibbstown,NJ08027.產品代碼1.41350)。

方法

如下制備溶液:

溶液1:二氯甲烷中的75mg/mLPLGA、25mg/mLPLA-PEG-OMe和12.5mg/mL雷帕霉素。該溶液通過將PLGA、PLA-PEG-OMe和雷帕霉素溶解于純二氯甲烷中制備。

溶液2:50mMpH11.5磷酸鹽緩沖液中的10mg/mLF8II.1723(ERLWDYGMSSSPHVL)和100mg/mL蔗糖。該溶液通過將蔗糖溶解于50mMpH11.5磷酸鹽緩沖液中并隨后添加作為干粉的F8II.1723肽制備。

溶液3:100mMpH8磷酸鹽緩沖液中的50mg/mL聚乙烯醇。

溶液4:70mMpH8磷酸鹽緩沖液。

首先如下制備初級(W1/O)乳劑:將溶液1(1.0mL)和溶液2(0.2mL)混合在小玻璃壓力管中并使用BransonDigitalSonifier250以50%振幅進行超聲處理40秒。

然后,如下形成次級(W1/01/W2)乳劑:向初級W1/01乳劑添加溶液3(3.0mL),渦旋以產生粗分散體,然后使用BransonDigitalSonifier250以30%振幅進行超聲處理60秒。

將次級乳劑添加至含有溶液4(30mL)的50mL敞口燒杯并在室溫下攪拌2小時以使二氯甲烷蒸發并混懸形成納米載體。然后將一部分的混懸的納米載體經如下洗滌:將納米載體混懸液轉移至離心管并在75,600rcf下旋轉35分鐘,除去上清液并將沉淀物重懸于磷酸緩沖鹽水中。重復洗滌操作并將沉淀物重懸于PBS1X中以獲得基于聚合物的標稱濃度為10mg/mL的納米載體混懸液。將混懸液冷凍儲存在-20℃下直至使用。

通過動態光散射確定納米載體的尺寸。通過HPLC分析確定納米載體中的雷帕霉素量。使用基于熒光胺的測定確定納米載體中F8II.1723的量。通過重量法確定總干納米載體質量/mL混懸液。

與雷帕霉素連接的納米載體的有效直徑和雷帕霉素含量

材料

雷帕霉素購自TSZCHEM(185WilsonStreet,Framingham,MA01702;產品代碼R1017)。丙交酯∶乙交酯比例為1∶1并且特性黏度為0.24dL/g的PLGA購自SurModicsPharmaceuticals(756TomMartinDrive,Birmingham,AL35211;產品代碼5050DLG2.5A)。甲基醚封端的PEG嵌段為約5,000Da并且整體特性黏度為0.5DL/g的PLA-PEG-OMe嵌段共聚物購自LakeshoreBiochemicals(756TomMartinDrive,Birmingham,AL35211;產品代碼100DLmPEG50005CE)。F8II.75肽購自AnaSpec(34801CampusDrive,Fremont,CA94555)。聚乙烯醇4-88,USP(85%至89%水解的,黏度為3.4mPa·s至4.6mPa·s)購自EMDChemicalsInc.(480SouthDemocratRoadGibbstown,NJ08027.產品代碼1.41350)。

方法

如下制備溶液:

溶液1:二氯甲烷中的75mg/mLPLGA、25mg/mLPLA-PEG-OMe和12.5mg/mL雷帕霉素。該溶液通過將PLGA、PLA-PEG-OMe和雷帕霉素溶解于純二氯甲烷中制備。

溶液2:50mMpH2磷酸鹽緩沖液中的10mg/mLF811.75(VHLFNIAKPRPPWMG)和100mg/mL蔗糖。該溶液通過將蔗糖溶解于50mMpH2磷酸鹽緩沖液中并隨后添加作為干粉的F8II.75肽制備。

溶液3:100mMpH8磷酸鹽緩沖液中的50mg/mL聚乙烯醇。

溶液4:70mMpH8磷酸鹽緩沖液。

首先如下形成初級(W1/O)乳劑:將溶液1(1.0mL)和溶液2(0.2mL)混合在小玻璃壓力管中并使用BransonDigitalSonifier250以50%振幅進行超聲處理40秒。

然后,如下形成次級(W1/O1/W2)乳劑:向初級W1/O1乳劑添加溶液3(3.0mL),渦旋以產生粗分散體并使用BransonDigitalSonifier250以30%振幅進行超聲處理60秒。

將次級乳劑添加至含有溶液4(30mL)的50mL敞口燒杯并在室溫下攪拌2小時以使二氯甲烷蒸發并混懸形成納米載體。然后將一部分的混懸納米載體經如下洗滌:將納米載體混懸液轉移至離心管并在75,600rcf下旋轉35分鐘,除去上清液并將沉淀物重懸于磷酸緩沖鹽水中。重復該洗滌操作并隨后將沉淀物重懸于PBS1X中以獲得基于聚合物的標稱濃度為10mg/mL的納米載體混懸液。將混懸液冷凍儲存在-20℃下直至使用。

通過動態光散射確定納米載體的尺寸。通過HPLC分析確定納米載體中的雷帕霉素量。使用基于熒光胺的測定確定納米載體中F8II.75的量。通過重量法確定總干納米載體質量/mL混懸液。

與雷帕霉素連接的納米載體的有效直徑和雷帕霉素含量

材料

雷帕霉素購自TSZCHEM(185WilsonStreet,Framingham,MA01702;產品代碼R1017)。丙交酯∶乙交酯比例為1∶1并且特性黏度為0.24dL/g的PLGA購自SurModicsPharmaceuticals(756TomMartinDrive,Birmingham,AL35211;產品代碼5050DLG2.5A)。甲基醚封端的PEG嵌段為約5,000Da并且整體特性黏度為0.5DL/g的PLA-PEG-OMe嵌段共聚物購自LakeshoreBiochemicals(756TomMartinDrive,Birmingham,AL35211;產品代碼100DLmPEG50005CE)。F8II.2210肽購自AnaSpec(34801CampusDrive,Fremont,CA94555)。聚乙烯醇4-88,USP(85%至89%水解的,黏度為3.4mPa·s至4.6mPa·s)購自EMDChemicalsInc.(480SouthDemocratRoadGibbstown,NJ08027.產品代碼1.41350)。

方法

如下制備溶液:

溶液1:二氯甲烷中的75mg/mLPLGA、25mg/mLPLA-PEG-OMe和12.5mg/mL雷帕霉素。該溶液通過將PLGA、PLA-PEG-OMe和雷帕霉素溶解于純二氯甲烷中制備。

溶液2:50mMpH2磷酸鹽緩沖液中的10mg/mLF8II.2210(TASSYFTNMFATWSPSKAR)和100mg/mL蔗糖。該溶液通過將蔗糖溶解于50mMpH2磷酸鹽緩沖液中并隨后添加作為干粉的F8II.2210肽制備。

溶液3:100mMpH8磷酸鹽緩沖液中的50mg/mL聚乙烯醇。

溶液4:70mMpH8磷酸鹽緩沖液。

首先如下制備初級(W1/O)乳劑:將溶液1(1.0mL)和溶液2(0.2mL)混合在小玻璃壓力管中并使用BransonDigitalSonifier250以50%振幅進行超聲處理40秒。

然后,如下形成次級(W1/O1/W2)乳劑:向初級乳劑添加將溶液3(3.0mL),渦旋以產生粗分散體并使用BransonDigitalSonifier250以30%振幅進行超聲處理60秒。

將次級乳劑添加至含有溶液4(30mL)的50mL敞口燒杯并在室溫下攪拌2小時以使二氯甲烷蒸發并混懸形成納米載體。然后將一部分的混懸納米載體經如下洗滌:將納米載體混懸液轉移至離心管并在75,600rcf下旋轉35分鐘,除去上清液并將沉淀物重懸于磷酸緩沖鹽水中。重復該洗滌操作并隨后將沉淀物重懸于PBS1X中以獲得基于聚合物的標稱濃度為10mg/mL的納米載體混懸液。將混懸液冷凍儲存在-20℃下直至使用。

通過動態光散射確定納米載體的尺寸。通過HPLC分析確定納米載體中的雷帕霉素量。使用基于熒光胺的測定確定納米載體中F8II.2210的量。通過重量法確定總干納米載體質量/mL混懸液。

與雷帕霉素連接的納米載體的有效直徑和雷帕霉素含量

材料

丙交酯∶乙交酯比例為1∶1并且特性黏度為0.24dL/g的PLGA購自SurModicsPharmaceuticals(756TomMartinDrive,Birmingham,AL35211;產品代碼5050DLG2.5A)。甲基醚封端的PEG嵌段為約5,000Da并且整體特性黏度為0.5DL/g的PLA-PEG-OMe嵌段共聚物購自LakeshoreBiochemicals(756TomMartinDrive,Birmingham,AL35211;產品代碼100DLmPEG50005CE)。聚乙烯醇4-88,USP(85%至89%水解的,黏度為3.4mPa·s至4.6mPa·s)購自EMDChemicalsInc.(480SouthDemocratRoadGibbstown,NJ08027.產品代碼1.41350)。

方法

如下制備溶液:

溶液1:二氯甲烷中的75mg/mLPLGA和25mg/mLPLA-PEG-OMe。該溶液通過將PLGA和PLA-PEG-OMe溶解于純二氯甲烷中制備。

溶液2:100mMpH8磷酸鹽緩沖液中的50mg/mL聚乙烯醇。

溶液3:70mM磷酸鹽緩沖液,pH8。

如下制備水包油型乳劑:將溶液1(1.0mL)和溶液2(3.0mL)混合在小玻璃壓力管中并使用BransonDigitalSonifier250以30%振幅進行超聲處理60秒。將乳劑添加至含有溶液3(30mL)的50mL敞口燒杯并在室溫下攪拌2小時以使二氯甲烷蒸發并混懸形成納米載體。然后將一部分的混懸納米載體經如下洗滌:將納米載體混懸液轉移至離心管并在75,600rcf下旋轉40分鐘,除去上清液并將沉淀物重懸于磷酸緩沖鹽水中。重復該洗滌操作并隨后將沉淀物重懸于PBS1X中以獲得基于聚合物的標稱濃度為10mg/mL的納米載體混懸液。將混懸液冷凍儲存在-20℃下直至使用。

通過動態光散射確定納米載體的尺寸。通過重量法確定總干納米載體質量/mL混懸液。

納米載體ID 有效直徑(nm) 8 183

實施例4:評價針對FVIII的免疫應答

使血友病A小鼠(E16小鼠)(第0天,n=8)每周接受以下的伴隨靜脈內(i.v.)注射:凝血蛋白質(因子VIII(FVIII))和與雷帕霉素連接的合成納米載體(納米載體ID4),或者空納米載體(NP)(納米載體ID8)和FVIII或者IVIG(靜脈內免疫球蛋白)和FVIII,持續連續5周。為了在最后的FVIII和與雷帕霉素連接之納米載體的劑量后1個月評價針對FVIII的抗體回憶應答,使用顯色FVIII活性測定藥盒(CoatestSP4FVIII)通過畢提斯達測定(Bethesdaassay)確定抑制劑效價,如5中所示。

為了進一步評估由FVIII和與雷帕霉素連接之納米載體的處理引起的持久耐受性,使血友病A小鼠(E16小鼠)(第0天,n=8)每周接受以下的伴隨靜脈內注射:合成納米載體和FVIII肽(將納米載體ID5、6和7混合以獲得1∶1∶1的肽質量比并一起注射),或者與雷帕霉素連接的合成納米載體(納米載體ID4)和FVIII蛋白,或者空NP(納米載體lD8)和FVIII,或者IVIG(靜脈內免疫球蛋白)和FVIH,持續5周,如圖6A中示意性所示的。第57、81和125天,在不存在進一步處理的情況下用FVIII(i.v.或i.p.)攻擊小鼠。通過ELISA確定抗FVIII抗體的水平。在選定時間點的結果示于圖6B中。將每個時間點的數據表示為平均值±SEM。對于統計學分析,使用具有雙尾分布的t-檢驗(studentt-test)將納米載體組(具有蛋白質或肽)與空納米顆粒對照組進行比較。*p<0.05和**p<0.01,在具有蛋白質的納米載體ID4和空NP組之間;#p<0.05和##p<0.01,在納米載體和肽(納米載體ID5、6和7)與空NP組之間。FVIII的所有注射均為1μg/注射。納米載體ID4的所有注射均為100μg/注射。

數據表明將與合成納米載體連接之免疫抑制劑和FVIII或其肽一起施用可降低抗因子FVIII抗體應答。與未連接的因子FVIII蛋白以及也與合成納米載體連接的因子FVIII肽組合使用免疫抑制劑合成納米載體也是如此。數據還表明,這樣的施用可使因子VIII的活性提高。這證明,當伴隨施用與合成納米載體連接的免疫抑制劑時降低針對蛋白質的不期望免疫應答并且提高效力。最后,結果支持建立了如本文中提供的方案。

實施例5:評價針對HUMIRA/阿達木單抗的應答

一周一次地,在前肢內向年齡匹配(5周至6周)的雌性對照C57BL/6皮下(s.c.)注射60μgHUMIRA,直至第29天(d0、7、14、22、29,在所有組和條件下)。使另一組接受類似的注射,但在開始第0天,將0.9mg與雷帕霉素連接的合成納米載體(納米載體ID1、2或3)與HUMIRA的溶液混合。圖7A中所示的結果示出了在第21天所有動物的血液中的抗體效價。對照動物發生針對HUMIRA的穩健抗體應答,而經處理的動物甚至在20天和在無處理情況下進行兩次HUMIRA注射后保持完全陰性。在第29天,在一個后肢內使動物接受再一次攻擊,而使另一后肢接受鹽水以測試局部抗體介導的I型超敏反應。為此,在注射后1小時借助卡尺測量后肢的厚度。兩個肢體間的厚度差異示于圖7B中。與抗體結果類似,納米載體處理消除了通過局部施用HUMIRA引起的炎性應答。

這些結果表明,將與合成納米載體連接的免疫抑制劑與HUMIRA一起施用可降低不期望的抗HUMIRA抗體應答以及消除由在無免疫抑制劑納米載體組合物下施用HUMIRA引起的不期望炎性反應。這證明,當伴隨施用與合成納米載體連接的免疫抑制劑時降低針對蛋白質的不期望免疫應答。最后,結果支持建立了如本文中提供的方案。

實施例6:評價針對鑰孔林普貝血藍蛋白(KLH)的應答

從第0天或第21天開始,一周一次地在尾靜脈內向年齡匹配的(5周至6周)雌性C57BL/6靜脈內(i.v.)注射200μg鑰孔林普貝血藍蛋白(KLH),直至第34天(d0、7、14、21、28、34)。在第0天至第34天,使另一組接受類似的注射,但在第0、14和21天,將0.47mg與雷帕霉素連接的合成納米載體(納米載體ID1、2或3)與KLH的溶液混合,之后在第21天至第34天每周進行單獨KLH注射(d21、28、34)。圖8中所示的結果示出了在指定時間點所有動物的血液中的KIH抗體效價。在使用相同量的KLH進行三次注射后(分別在第26天和第40天),在第0天或第21天開始免疫的對照動物發生非常類似的應答(EC50=3×103至5×103)。相比之下,在進行三次單獨KIH的注射后,接受三次合成納米載體注射的動物保持完全陰性。

數據表明,將與合成納米載體連接的免疫抑制劑與KLH一起施用可降低抗KLH抗體應答,并且甚至在納米載體處理之后施用KLH后仍可保持這樣的降低。這證明,與合成納米載體連接之免疫抑制劑的伴隨施用降低針對蛋白質的不期望免疫應答。最后,結果支持建立了如本文中提供的方案。

實施例7:評價針對卵清蛋白的應答

在第-21天和第-13天,在尾靜脈內對年齡匹配的(5周至6周)雌性C57BL/6靜脈內注射1.2mg未連接納米顆粒(NP[空])(納米載體ID8)、游離雷帕霉素(fRapa)(100μg)、22μg游離雞卵清蛋白(fOVA)、fRapa與fOVA的組合、單獨或與22μgfOVA組合之1.2mg與雷帕霉素連接的納米載體(NP[Rapa],100μg雷帕霉素內容物)(納米載體ID1、2或3)。在第0天,在后肢內,對所有動物皮下注射與2μgCpG混合的2.5μg顆粒OVA(pOVA),之后在第7天和第14天注射2.5μgpOVA。在不存在任何處理的情況下(NP[空]),動物發生針對OVA的穩健免疫應答,這可通過抗OVAIgG抗體效價測量。圖9中所示的第22天抗體效價證明在相同溶液(fOVA+NP[Rapa])中與OVA伴隨施用之合成納米載體的兩個劑量甚至在1次OVA+CpG注射和2次單獨OVA注射之后有效地預防針對OVA的抗體形成。

數據表明,將與合成納米載體連接的免疫抑制劑與OVA一起施用可降低抗OVA抗體應答,并且甚至在將OVA與強佐劑組合施用后仍可保持這樣的降低。這證明,與合成納米載體連接之免疫抑制劑的伴隨施用降低針對蛋白質的不期望免疫應答。最后,結果支持建立了如本文中提供的方案。

實施例8:評價針對KRYSTEXXA的應答

在第-21天和第-14天,在尾靜脈內,向對照組年齡匹配的(5周至6周)雌性C57BL/6靜脈內注射PBS,而向處理組注射0.9mg與雷帕霉素連接的納米載體(納米載體ID1、2或3)和40μgKRYSTEXXA的組合。在第0天至第28天,在后肢內使所有動物每周接受與20μgCpGs.c.組合的100μgKRYSTEXXA的注射(d0、7、12、28)。對照動物發生針對KRYSTEXXA的免疫應答,這可通過抗KRYSTEXXAIgM抗體效價測量。圖10中的結果表明,在同一溶液中用與KRYSTEXXA伴隨施用之合成納米載體處理動物有效地在長時間內預防針對KRYSTEXXA的抗體形成。經處理的動物甚至在無納米載體的情況下進行5次KRYSTEXXA+CpG注射后未發生抗KRYSTEXXA應答。

數據表明,將與合成納米載體連接的免疫抑制劑與KRYSTEXXA一起施用可降低抗KRYSTEXXA抗體應答,并且甚至在納米載體處理之后將KRYSTEXXA與強佐劑組合施用后仍可保持這樣的降低。這證明,與合成納米載體連接之免疫抑制劑的伴隨施用降低針對蛋白質的不期望免疫應答。最后,結果支持建立了如本文中提供的方案。

實施例9:評價針對卵清蛋白和KLH的應答

一周一次地,在尾靜脈內向對照組年齡匹配的(5周至6周)雌性C57BL/6靜脈內注射2.5μg顆粒卵清蛋白(pOVA)的免疫原性形式并在后肢內皮下注射2μg鑰孔林普貝血藍蛋白(KIH),持續49天(d0、7、14、20、28、35、42、49)。以相同的途徑和量使其他動物組接受pOVA和KLH,但在第0、7和14天與0.2mg連接有雷帕霉素的納米載體(納米載體ID1、2或3)混合,之后在第20天至第42天進行pOVA注射(與之前相同的量)。對照動物發生針對OVA和KLH的穩健免疫應答,這可通過抗OVA或抗KLHIgG抗體效價測量。圖11中所示的第54天抗體效價證明,在同一溶液中與pOVA伴隨施用之合成納米載體的3個劑量有效地在長時間內降低和預防針對OVA的抗體形成,而非KLH(注射在另一位置s.c.)。經處理的動物甚至在5次單獨的pOVA注射后仍未發生抗OVA應答。

數據表明,將與合成納米載體連接的免疫抑制劑與蛋白質伴隨施用可降低抗蛋白質抗體應答,但這樣的應答是對通過相同途徑施用的蛋白質有特異性的。這證明,與合成納米載體連接之免疫抑制劑的伴隨施用降低針對蛋白質的不期望免疫應答。最后,結果支持建立了如本文中提供的方案。

實施例10:評價針對KLH的應答

一周一次地,在尾靜脈內向年齡匹配(5周至6周)的雌性對照C57BL/6靜脈內(i.v.)注射200μg鑰孔林普貝血藍蛋白(KLH),持續63天(d0、7、14、21、28、35、42、49、56、63)。使另一組接受類似的注射但在第0、7、14和21天,將0.9mg與雷帕霉素連接的合成納米載體(納米載體ID1、2或3)與KLH的溶液混合,之后在第28天至第63天進行6次KLH注射(相同量)。對照動物發生針對KLH的穩健應答,這可通過抗KLHIgG抗體效價以及由注射引起的過敏反應測量。圖12A中的結果示出了在指定時間點所有動物的血液中的抗體效價,并且由注射抗原導致的過敏反應評分示于圖12B中。與KLH伴隨施用之合成納米載體的4個劑量有效地在長時間內降低和預防抗體形成和過敏反應。事實上,經處理的動物甚至在4次單獨KLH的注射后仍未發生抗KLH應答,在對照動物中,4次單獨KLH的注射在很大程度上足以產生應答(第26天)。

這些結果表明,本文中提供的組合物當在一段時間內與蛋白質伴隨施用時可在長時間內降低或預防抗體形成和過敏反應。由三個獨立的觀察者確定過敏反應評分,如下:0=無癥狀,1=嗜睡,2=嗜睡和不能直立,3=垂死。

這些結果表明,將與合成納米載體連接的免疫抑制劑與KLH伴隨施用可降低不期望的抗KLH抗體應答,以及消除由在無免疫抑制劑納米載體組合物的情況下施用KLH所引起的不期望過敏反應。這證明,與合成納米載體連接之免疫抑制劑的伴隨施用降低針對蛋白質不期望免疫應答。最后,結果支持建立了如本文中提供的方案。

實施例11:評價關節炎動物中的抗HUMIRA免疫應答

過表達人腫瘤壞死因子α的轉基因動物(transgenicanimalsoverexpressinghumantumornecrosisfactoralpha,huTNFaTg)在出生后20周內發生進行性類風濕性關節炎。這一過程可通過使用全人抗人TNFα抗體HUMIRA/阿達木單抗來預防。然而,重復施用初始治療劑量的HUMIRA(60μg)導致中和治療益處的抗藥物抗體(anti-drugantibody,ADA)形成。再者,只有非常高的劑量才可維持治療益處和克服中和的免疫應答。例如,認為,在這樣的小鼠模型的一個實例中產生炎癥的最大抑制需要約200μg(Binder等,Arthritis&Rheumatism,第65卷(第3期),2013年3月,第608-617頁)。

對于前7次注射,在肩胛下區域內,向年齡匹配的huTNFaTg5周齡雌性動物皮下注射鹽水(PBS)或60μgHUMIRA(每周),或者HUMIRA和0.87mg與雷帕霉素連接的納米載體(納米載體ID1、2或3)的混合物(第0、7、14、21、28、35、42天,5周至12周齡),之后進行3次單獨HUMIRA的注射(相同量)(第49天至第63天,13周至15周齡)。圖13A中的結果示出了在第21天所有動物的血液中的抗體效價。如所預期的,未接受HUMIRA的對照動物無抗HUMIRA效價;而在僅接受HUMIRA的對照中可觀察到穩健的抗體應答。相比之下,經納米載體處理的動物甚至在無處理的情況下進行三次HUMIRA注射后保持完全陰性。對這些動物之肢體的監測揭示了在對照動物中在10周齡就已顯現的進行性疾病。經單獨HUMIRA處理的動物顯著阻斷疾病進程,而向該方案添加納米載體極大地阻斷關節炎癥狀的出現。在此的評分為4個獨立評分員的總分,如下:1)表示滑膜炎、關節積液和軟組織腫脹,2)包括增殖性發炎滑液組織,其生長進入關節腔并破壞軟骨,3)表示軟骨的廣泛損失、關節邊緣的腐蝕和畸形,4)幾乎為具有關節的纖維性或骨性硬化的疾病的末期,其結束其功能壽命。

這些結果表明,將與合成納米載體連接的免疫抑制劑與HUMIRA施用可降低抗HUMIRA抗體應答。證明HUMIRA效力提高的進一步降低的關節炎評分也證明了伴隨施用的益處。這證明,與合成納米載體連接之免疫抑制劑的伴隨施用不僅降低針對治療性蛋白質的不期望免疫應答而且提高效力。這還證明,在本文中提供的本發明伴隨施用下不需要較高劑量的治療劑。此外,基于在相同HUMIRA劑量下關節炎評分的降低水平,與在無本文中提供之免疫抑制劑劑量的伴隨施用下所需的HUMIRA量相比,還可使用降低的HUMIRA量,并且其可實現提高的效力。重點指出的是,本實施例中使用的HUMIRA量為60μg,與本領域中為了通過HUMIRA實現炎癥的最大抑制而使用的約200μg量相比,這遠遠降低(Binder等,Arthritis&Rheumatism,第65卷(第3期),2013年3月,第608-617頁)。最后,結果支持建立了如本文中提供的方案。

實施例12:具有連接的布洛芬的介孔二氧化硅納米顆粒(預示性的)

通過溶膠-凝膠法制備介孔SiO2納米顆粒芯。將十六烷基三甲基溴化銨(Hexadecyltrimethyl-ammoniumbromide,CTAB)(0.5g)溶解于去離子水(500mL)中,然后向CTAB溶液添加2MNaOH水溶液(3.5mL)。將溶液攪拌30分鐘,然后向溶液添加四乙氧基硅烷(Tetraethoxysilane,TEOS)(2.5mL)。將所得凝膠在80℃的溫度下攪拌3小時。通過過濾捕獲形成的白色沉淀物,之后用去離子水洗滌并在室溫下干燥。然后,將剩余的表面活性劑通過混懸于HCl的乙醇溶液中過夜來從顆粒中萃取。將顆粒用乙醇洗滌,離心并在超聲處理下重分散。再重復該洗滌操作兩次。

然后,使用(3-氨基丙基)-三乙氧基硅烷((3-aminopropyl)-triethoxysilane,APTMS)用氨基官能化SiO2納米顆粒。為了實現這一點,將顆?;煨諞掖?30mL)中,并向混懸液添加APTMS(50μL)。使混懸液在室溫下靜置2小時,然后煮沸4小時,通過定期添加乙醇使體積保持不變。如下除去剩余的反應物:通過離心進行5個循環的洗滌并重分散于純乙醇中。

在獨立反應中,產生直徑為1nm至4nm的金籽晶(goldseed)。首先,對該反應中使用的所有水進行去離子并隨后從玻璃蒸餾。向100mL的圓底瓶添加水(45.5mL)。在攪拌的同時,添加0.2MNaOH水溶液(1.5mL),之后添加四(羥甲基)氯化(tetrakis(hydroxymethyl)phosphoniumchloride,THPC)的1%水溶液(1.0mL)。在添加THPC溶液后2分鐘,添加已陳化至少15分鐘的氯金酸的10mg/mL水溶液(2mL)。通過用水透析純化金籽晶。

為了形成芯-殼納米載體,首先,將上述形成的氨基官能化SiO2納米顆粒與金籽晶在室溫下混合2小時。通過離心收集經金裝飾的SiO2顆粒并將其與氯金酸和碳酸氫鉀的水溶液混合以形成金殼。然后,通過離心并重分散于水中對顆粒進行洗滌。通過將顆?;煨誆悸宸夷頻娜芤?1mg/L)中72小時裝載布洛芬。然后,通過離心并重分散于水中從顆粒中洗去游離的布洛芬。

實施例13:包含環孢素A的脂質體(預示性的)

使用薄膜水合形成脂質體。將1,2-二棕櫚?;?sn-甘油基-3-磷酸膽堿(1,2-Dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine,DPPC)(32μmol)、膽固醇(32μmol)和環孢素A(6.4μmol)溶解于純氯仿(3mL)中。將該脂質溶液添加至50mL的圓底瓶,并在60℃的溫度下在旋轉蒸發器上使溶劑蒸發。然后,用氮氣吹洗該瓶以除去剩余的溶劑。向該瓶添加磷酸緩沖鹽水(2mL)和5個玻璃珠,通過在60℃下搖動1小時以形成混懸液來對脂質膜進行水合。將混懸液轉移至小壓力管并在60℃下超聲處理4個30秒脈沖的循環,其中每個脈沖之間具有30秒延遲。然后,使混懸液在室溫下靜置2小時以允許完全水合。通過離心并隨后重懸于新鮮的磷酸緩沖鹽水中對脂質體進行洗滌。

實施例14:制備包含雷帕霉素的金納米載體(AuNC)(預示性的)

制備HS-PEG-雷帕霉素:

將PEG酸二硫化物(1.0當量)、雷帕霉素(2.0當量至2.5當量)、DCC(2.5當量)和DMAP(3.0當量)在無水DMF中的溶液在室溫下攪拌過夜。通過過濾除去不溶性二環己基脲并將濾液添加至異丙醇(IPA)以沉淀出PEG-二硫化物-二-雷帕霉素酯,用IPA洗滌并干燥。然后,用DMF中的三(2-羧基乙基)膦鹽酸鹽處理聚合物以將PEG二硫化物還原成巰基PEG雷帕霉素酯(HS-PEG-雷帕霉素)。通過從IPA中沉淀出回收所得聚合物,如前所述進行干燥并通過HNMR和GPC分析。

金NC(AuNC)的形成:

在劇烈攪拌下,將500mL1mMHAuCl4的水溶液在裝備有冷凝器的1L圓底瓶中加熱回流10分鐘。然后,向攪拌中的溶液迅速添加50mL40mM檸檬酸三鈉的溶液。將所得的深酒紅色溶液在回流下保持25分鐘至30分鐘并撤出熱量,將溶液冷卻至室溫。然后,通過0.8μm膜過濾器過濾溶液以得到AuNC溶液。使用可見光譜和透射電子顯微術對AuNC進行表征。經檸檬酸鹽包被的AuNC的直徑為約20nm,并且在520nm下具有峰吸收。

具有HS-PEG-雷帕霉素的AuNC綴合物:

向1mL直徑為20nm的經檸檬酸鹽包被金納米載體(1.16nM)添加150μlHS-PEG-雷帕霉素(10mMpH9.0碳酸鹽緩沖液中10μM)的溶液以產生巰基∶金為2500∶1的摩爾比。將混合物在氬氣下在室溫下攪拌1小時以使巰基與金納米載體上的檸檬酸鹽完全交換。然后,通過在12,000g下離心30分鐘純化表面上具有PEG-雷帕霉素的AuNC。將上清液倒出并隨后用1xPBS緩沖液洗滌含有AuNC-S-PEG-雷帕霉素的沉淀物。然后,將經純化的金-PEG-雷帕霉素納米載體重懸于合適的緩沖液中以進行進一步的分析和生物測定。

實施例15.包含雷帕霉素和卵清蛋白的脂質體(預示性的)

通過薄膜水合形成脂質體。將1,2-二棕櫚?;?sn-甘油基-3-磷酸膽堿(DPPC)(32μmol)、膽固醇(32μmol)和雷帕霉素(6.4μmol)溶解于純氯仿(3mL)中。將該脂質溶液添加至10mL玻璃管,在氮氣流下除去溶劑并真空干燥6小時。通過用2.0ml包含過量卵清蛋白的25mMMOPS緩沖液pH8.5水合膜得到多層囊泡。使管渦旋直至脂質膜從管表面剝離。為了將多層囊泡分解成單層囊泡,應用了10個冷凍(液氮)和解凍(30℃水浴)的循環。然后,在25mMMOPS緩沖液pH8.5中將樣品稀釋至1ml。通過使10倍的樣品通過200nm孔聚碳酸酯過濾器擠出來均化所得脂質體的尺寸。然后將所得的脂質體用于進一步的分析和生物測定。

實施例16.在關節炎動物中,針對HUMIRA的致耐受性應答預防中和抗 HUMIRA應答的形成

材料

雷帕霉素購自TSZCHEM(185WilsonStreet,Framingham,MA01702;產品代碼R1017)。丙交酯∶乙交酯比例為3∶1并且特性黏度為0.75dL/g的PLGA購自SurModicsPharmaceuticals(756TomMartinDrive,Birmingham,AL35211;產品代碼7525DLG7A)。甲基醚封端的PEG嵌段為約5,000Da并且整體特性黏度為0.5DL/g的PLA-PEG-OMe嵌段共聚物購自LakeshoreBiochemicals(756TomMartinDrive,Birmingham,AL35211;產品代碼100DLmPEG50005CE)。聚乙烯醇4-88,USP(85%至89%水解的,黏度為3.4mPa·s至4.6mPa·s)購自EMDChemicalsInc.(480SouthDemocratRoadGibbstown,NJ08027.產品代碼1.41350)。

方法

如下制備溶液:

溶液1:二氯甲烷中的75mg/mLPLGA、25mg/mLPLA-PEG-OMe和12.5mg/mL雷帕霉素。該溶液通過將PLGA、PLA-PEG-OMe和雷帕霉素溶解于純二氯甲烷中制備。溶液2:100mMpH8磷酸鹽緩沖液中的50mg/mL聚乙烯醇。

使用水包油型乳劑制備納米載體。如下制備O/W乳劑:將溶液1(1.0mL)和溶液2(3.0mL)合并在小壓力管中并使用BransonDigitalSonifier250以30%振幅進行超聲處理60秒。將O/W乳劑添加至含有70mMpH8磷酸鹽緩沖溶液的燒杯并在室溫下攪拌2小時以使二氯甲烷蒸發并形成納米載體。將一部分的納米載體經如下洗滌:將納米載體混懸液轉移至離心管并在75,600×g和4℃下離心50分鐘,除去上清液并將沉淀物重懸于磷酸緩沖鹽水中。重復洗滌操作并將沉淀物重懸于磷酸緩沖鹽水中以獲得約10mg/mL的最終合成納米載體分散體

通過動態光散射確定納米載體的尺寸。通過HPLC分析確定納米載體中雷帕霉素的量。通過重量法確定總干納米載體質量/mL混懸液。

過表達人腫瘤壞死因子α的轉基因動物(huTNFaTg)在出生后20周內發生進行性類風濕性關節炎。這一過程可通過使用全人抗人TNFα抗體阿達木單抗或HUMIRA來預防。然而,重復施用初始治療劑量的HUMIRA(60μg)導致中和治療益處的抗藥物抗體形成(ADA)。

對于前7次注射(第0至42天,第5周至第11周齡),在肩胛下區域內,向年齡匹配的huTNFaTg5周齡雌性動物皮下注射鹽水(PBS)或60μgHUMIRA(每周),或者HUMIRA與0.87mg致耐受性納米顆粒的混合物,之后進行10次單獨HUMIRA的周注射(相同量)(第49天至第107天,第12周至第20周齡)。該方案示于圖14中。

圖15(左圖)中的結果示出了在不同時間點所有動物的血液中的抗體效價。如所預期的,經對照模擬物處理的動物無效價;而在僅接受HUMIRA的動物中可觀察到穩健的抗HUMIRA抗體應答。在第5周至11周齡的致耐受性納米顆粒處理甚至在無致耐受性處理的情況下進行10次HUMIRA注射(第12周至第20周)后導致完全抵抗發生抗HUMIRA效價。對這些動物之肢體的監測揭示了在10周齡就已顯現的進行性疾病。單獨HUMIRA顯著阻斷疾病進程,而向該方案添加致耐受性納米載體極大地阻斷關節炎癥狀的出現。在此的評分為4個獨立評分員的平均總分,如下:1)表示滑膜炎、關節積液和軟組織腫脹,2)包括增殖性發炎滑液組織,其生長進入關節腔并破壞軟骨,3)表示軟骨的廣泛損失、關節邊緣的腐蝕和畸形,4)幾乎為具有關節的纖維性或骨性硬化的疾病的末期,其結束其功能壽命。

這些結果表明,本文中提供的組合物當在一段時間內與蛋白質伴隨施用時可在長時間內降低或預防針對生物治療劑的抗體形成,并由此提高其效力和治療窗。這些結果還表明,將與合成納米載體連接之免疫抑制劑與HUMIRA一起施用可降低不期望的抗HUMIRA抗體應答。證明HUMIRA效力提高的進一步降低的關節炎評分也證明了伴隨施用的益處。這證明,與合成納米載體連接之免疫抑制劑的伴隨施用不僅降低針對治療性蛋白質的不期望免疫應答而且提高效力。這還證明,在本文中提供的本發明伴隨施用下不需要較高劑量的治療劑。此外,基于在相同HUMIRA劑量下關節炎評分的降低水平,與在無本文中提供之免疫抑制劑劑量的伴隨施用下所需的HUMIRA量相比,還可使用降低的HUMIRA量,并且其可實現提高的效力。重點指出的是,本實施例中使用的HUMIRA量為60μg,與本領域中為了通過HUMIRA實現炎癥的最大抑制而使用的約200μg量相比,這遠遠降低(Binder等,Arthritis&Rheumatism,第65卷(第3期),2013年3月,第608-617頁)。最后,結果支持建立了如本文中提供的方案。

實施例17:評價抗HUMIRA免疫應答

材料

雷帕霉素購自TSZCHEM(185WilsonStreet,Framingham,MA01702;產品代碼R1017)。丙交酯∶乙交酯比例為3∶1并且特性黏度為0.75dL/g的PLGA購自SurModicsPharmaceuticals(756TomMartinDrive,Birmingham,AL35211;產品代碼7525DLG7A)。甲基醚封端的PEG嵌段為約5,000Da并且整體特性黏度為0.5DL/g的PLA-PEG-OMe嵌段共聚物購自LakeshoreBiochemicals(756TomMartinDrive,Birmingham,AL35211;產品代碼100DLmPEG50005CE)。聚乙烯醇4-88,USP(85%至89%水解的,黏度為3.4mPa·s至4.6mPa·s)購自EMDChemicalsInc.(480SouthDemocratRoadGibbstown,NJ08027.產品代碼1.41350)。

方法

如下制備溶液:

溶液1:二氯甲烷中的75mg/mLPLGA、25mg/mLPLA-PEG-OMe和12.5mg/mL雷帕霉素。該溶液通過將PLGA、PLA-PEG-OMe和雷帕霉素溶解于純二氯甲烷中制備。溶液2:100mMpH8磷酸鹽緩沖液中的50mg/mL聚乙烯醇。

使用水包油型乳劑制備納米載體。如下制備O/W乳劑:將溶液1(1.0mL)和溶液2(3.0mL)合并在小壓力管中并使用BransonDigitalSonifier250以30%振幅進行超聲處理60秒。將O/W乳劑添加至含有70mMpH8磷酸鹽緩沖溶液的燒杯并在室溫下攪拌2小時以使二氯甲烷蒸發并形成納米載體。將一部分的納米載體經如下洗滌:將納米載體混懸液轉移至離心管并在75,600×g和4℃下離心50分鐘,除去上清液并將沉淀物重懸于磷酸緩沖鹽水中。重復洗滌操作并將沉淀物重懸于磷酸緩沖鹽水中以獲得約10mg/mL的最終納米載體分散體。

通過動態光散射確定納米載體的尺寸。通過HPLC分析確定納米載體中雷帕霉素的量。通過重量法確定總干納米載體質量/mL混懸液。

使用上述材料和方法產生含雷帕霉素的納米載體。通過動態光散射確定納米載體的尺寸。通過HPLC分析確定納米載體中雷帕霉素的量。通過重量法確定總干納米載體質量/mL混懸液。

對關節炎動物中的抗HUMIRA免疫應答和中和應答進行評價。過表達人腫瘤壞死因子α的轉基因動物(huTNFaTg)在出生后20周內發生進行性類風濕性關節炎。這一過程可通過使用全人抗人TNFα抗體阿達木單抗或HUMIRA來預防。然而,重復施用初始治療劑量的HUMIRA(60μg)導致中和治療益處的抗藥物抗體形成(ADA)??悸塹紿umira的治療效果,可注射較高量的Humira(200μg)以克服該對抗性免疫應答。

對于前3次注射(第5周至7周齡),在肩胛下區域內,向年齡匹配的huTNFαTg5周齡雌性動物皮下注射鹽水(PBS)或者60μg或200μgHUMIRA(每周)(第5周至第10周),或者60μgHUMIRA和0.87mg致耐受性納米顆粒的混合物,之后進行3次單獨HUMIRA的周注射(相同量)(第8周至第10周齡)。圖17(左圖)中的結果示出了在不同時間點所有動物的血液中的抗體效價。如所預期的,經對照模擬物處理的動物無抗效價;而在僅接受HUMIRA的動物中可觀察到穩健的抗HUMIRA抗體應答。在第5周至7周齡的納米載體處理甚至在無處理的情況下進行3次HUMIRA注射(第8周至第10周)后導致完全抵抗發生抗HUMIRA效價。值得注意的是,三次HUMIRA注射導致對照動物具有非常高的效價(第7周效價),而經納米載體處理動物中的三次類似注射(總共6次注射)則完全抵抗發生效價(第10周)。圖16示出了給藥方案。

對這些動物之肢體的監測揭示了在6周齡就已顯現的進行性疾病。單獨HUMIRA顯著阻斷疾病進程,而向該方案添加納米載體極大地阻斷關節炎癥狀的出現。評分(圖17(右圖))為4個獨立評分員的平均總分,如下:1)表示滑膜炎、關節積液和軟組織腫脹,2)包括增殖性發炎滑液組織,其生長進入關節腔并破壞軟骨,3)表示軟骨的廣泛損失、關節邊緣的腐蝕和畸形,4)幾乎為具有關節的纖維性或骨性硬化的疾病的末期,其結束其功能壽命。

這些結果表明,本文中提供的方法和組合物可降低或預防針對治療性蛋白質的抗體形成并且提高其效力。特別地,如上所述,這些結果表明:將與合成納米載體連接之免疫抑制劑與HUMIRA一起施用可降低不期望的抗HUMIRA抗體應答。證明HUMIRA效力提高的進一步降低的關節炎評分也證明了伴隨施用的益處。這證明,與合成納米載體連接之免疫抑制劑的伴隨施用不僅降低針對治療性蛋白質的不期望免疫應答而且提高效力。這還證明,在本文中提供的本發明伴隨施用下不需要較高劑量的治療劑。此外,基于在相同HUMIRA劑量下關節炎評分的降低水平,與在無本文中提供之免疫抑制劑劑量的伴隨施用下所需的HUMIRA量相比,還可使用降低的HUMIRA量,并且其可實現提高的效力。重點指出的是,本實施例中使用的HUMIRA量為60μg,與本領域中為了通過HUMIRA實現炎癥的最大抑制而使用的約200μg量相比,這遠遠降低(Binder等,Arthritis&Rheumatism,第65卷(第3期),2013年3月,第608-617頁)。最后,結果支持建立了如本文中提供的方案。

實施例18:針對具有經包封雷帕霉素的雞卵清蛋白的抗體特異性致耐受 性應答

NP[Rapa]材料和方法

材料

雷帕霉素購自TSZCHEM(185wilsonStreet,Framingham,MA01702),產品代碼R1017。丙交酯∶乙交酯比例為1∶1并且特性黏度為0.24dL/g的PLGA購自LakeshoreBiomaterials(756TomMartinDrive,Birmingham,AL35211),產品代碼5050DLG2.5A。甲基醚封端的PEG嵌段為約5,000Da并且整體特性黏度為0.50DL/g的PLA-PEG-OMe嵌段共聚物購自LakeshoreBiomaterials(756TomMartinDrive,Birmingham,AL35211),產品代碼100DLmPEG50005CE。聚乙烯醇4-88,USP(85%至89%水解的,黏度為3.4mPa·s至4.6mPa·s)購自EMDChemicalsInc.(480SouthDemocratRoadGibbstown,NJ08027),產品代碼1.41350。Cellgro磷酸緩沖鹽水1X(PBS1X)購自Corning(9345DiscoveryBlvd.Manassas,VA20109),產品代碼21-040-CV。

方法

如下制備溶液:

溶液1:聚合物和雷帕霉素混合物通過將75mg/mLPLGA、25mg/mLPLA-PEG-OMe和12.5mg/mL雷帕霉素溶解于二氯甲烷中制備。溶液2:在100mMpH8磷酸鹽緩沖液中以50mg/mL制備聚乙烯醇。

如下制備O/W乳劑:將溶液1(1.0mL)和溶液2(3.0mL)合并在小壓力管中并使用BransonDigitalSonifier250以30%振幅進行超聲處理60秒。將O/W乳劑添加至含有70mMpH8磷酸鹽緩沖溶液(60mL)的敞口燒杯。制備另外三份相同的O/W乳劑,并添加至與第一乳劑相同的燒杯。然后,將這些乳劑在室溫下攪拌2小時以使二氯甲烷蒸發并形成納米載體。將一部分的納米載體經如下洗滌:將納米載體混懸液轉移至離心管并在75,600×g和4℃下離心35分鐘,除去上清液并將沉淀物重懸于PBS1X中。重復洗滌操作并隨后將沉淀物重懸于PBS1X中以獲得基于聚合物的標稱濃度為10mg/mL的納米載體混懸液。如上所述在獨立燒杯中制備相同的配制物并在洗滌步驟之后與第一配制物合并。使用來自Pall型號4656的1.2μmPES膜注射式過濾器過濾經混合的納米載體溶液并將其儲存在-20℃下。

通過動態光散射確定納米載體的尺寸。通過HPLC分析確定納米載體中雷帕霉素的量。通過重量法確定總干納米載體質量/mL混懸液。

NP[OVA]材料和方法

材料

卵清蛋白購自WorthingtonBiochemicalCorporation(730VassarAvenue,Lakewood,NJ08701),產品代碼LS003054)。具有54%丙交酯和46%乙交酯含量并且特性黏度為0.24dL/g的PLGA購自LakeshoreBiomaterials(756TomMartinDrive,Birmingham,AL35211),產品代碼5050DLG2.5A)。甲基醚封端的PEG嵌段為約5,000Da并且Mw為28,000Da,特性黏度為0.38dL/g的PLA-PEG嵌段共聚物購自LakeshoreBiomaterials(756TomMartinDrive,Birmingham,AL35211),產品代碼100DLmPEG50004CE。聚乙烯醇4-88,USP(85%至89%水解的,黏度為3.4mPa.s至4.6mPa.s)購自EMDChemicalsInc.(480SouthDemocratRoadGibbstown,NJ08027),產品代碼1.41350.1001。Cellgro磷酸緩沖鹽水1X(PBS1X)購自Corning(9345DiscoveryBlvd.Manassas,VA20109),產品代碼21-040-CV。

方法

如下制備溶液:

溶液1:在具有10重量%蔗糖的10mM磷酸鹽緩沖液pH8中制備50mg/mL卵清蛋白。溶液2:PLGA通過在化學通風櫥中以100mg/mL二氯甲烷溶解PLGA制備。溶液3:PLA-PEG-OMe通過在化學通風櫥中以100mg/mL二氯甲烷溶解PLA-PEG-OMe制備。溶液4:100mM磷酸鹽緩沖液,pH8中的65mg/mL聚乙烯醇。

首先,通過將溶液1至溶液3混合產生初級(W1/O)乳劑。將溶液1(0.2mL)、溶液2(0.75mL)和溶液3(0.25mL)合并在經在冰水浴中預冷卻>4分鐘的小玻璃壓力管中并使用BransonDigitalSonifier250在冰浴上以50%振幅進行超聲處理40秒。然后,如下形成次級(W1/O/W2)乳劑:向初級溶劑添加溶液4(3mL),渦旋混合以產生乳狀分散體并隨后使用BransonDigitalSonifier250在冰浴上以30%振幅進行超聲處理60秒。將次級乳劑添加至含有PBS1X(30mL)的敞口50mL燒杯。如上所述制備次級相同的雙乳劑配制物并添加至與第一乳劑配制物相同的50mL燒杯。將兩份制備物在室溫下攪拌2小時以使二氯甲烷蒸發并形成納米載體。將一部分的混懸的納米載體經如下洗滌:將納米載體混懸液轉移至離心管并在75,600rcf下旋轉50分鐘,除去上清液并將沉淀物重懸于PBS1X中。重復洗滌操作并隨后將沉淀物重懸于PBS1X中以獲得基于聚合物的標稱濃度為10mg/mL的納米載體混懸液。將混懸液冷凍儲存在-20℃下直至使用。

NP[GSK1059615]材料和方法

材料

GSK1059615購自MedChemExpress(11DeerParkDrive,Suite102DMonmouthJunction,NJ08852),產品代碼HY-12036。丙交酯∶乙交酯比例為1∶1并且特性黏度為0.24dL/g的PLGA購自LakeshoreBiomaterials(756TomMartinDrive,Birmingham,AL35211),產品代碼5050DLG2.5A。甲基醚封端的PEG嵌段為約5,000Da并且整體特性黏度為0.26DL/g的PLA-PEG-OMe嵌段共聚物購自LakeshoreBiomaterials(756TomMartinDrive,Birmingham,AL35211;產品代碼100DLmPEG50005K-E)。Cellgro磷酸緩沖鹽水1XpH7.4(PBS1X)購自Corning(9345DiscoveryBlvd.Manassas,VA20109),產品代碼21-040-CV。

方法

如下制備溶液

溶液1:將PLGA(125mg)和PLA-PEG-OMe(125mg)溶解于10mL丙酮中。溶液2:在1mLN-甲基-2-吡咯烷酮(NMP)中制備10mgGSK1059615。

如下制備納米載體:將溶液1(4mL)和溶液2(0.25mL)合并在小玻璃壓力管中并在攪拌下將混合物逐滴添加至含有20mL超純水的250mL圓底瓶。將該瓶安裝在旋轉式蒸發裝置上,并在減壓下除去丙酮。將一部分的納米載體經如下洗滌:將納米載體混懸液轉移至離心管并在75,600rcf和4℃下離心50分鐘,除去上清液并將沉淀物重懸于PBS1X中。重復洗滌操作并將沉淀物重懸于PBS1X中以獲得基于聚合物的標稱濃度為10mg/mL的納米載體混懸液。然后,使用來自Pall,型號4656的1.2μmPES膜注射式過濾器過濾經洗滌的納米載體溶液。如上所述制備相同的納米載體溶液并在過濾步驟之后與第一納米載體溶液合并。將均質混懸液冷凍儲存在-20℃下。

通過動態光散射確定納米載體的尺寸。通過351nm下的UV吸收確定納米載體中GSK1059615的量。通過重量法確定總干納米載體質量/mL混懸液。

在第-21天和第-14天,在尾靜脈內對年齡匹配的(5周至6周)雌性C57BL/6小鼠靜脈內注射鹽水(未處理),與1.2mg含雷帕霉素之納米載體(NP[Rapa])或8mg裝載GSK1059615之納米載體(NP[GSK1059615])組合的1.1mg裝載全卵清蛋白的納米載體(NP[OVA])。

在第0天,在后肢內對所有動物皮下注射與2μgCpG混合的25μg顆粒OVA(pOVA),隨后在第7天和第14天僅注射25μgpOVA。在第21天,測量抗體效價。在不存在任何處理的情況下,動物發生針對OVA的穩健免疫應答,其可通過抗OVAIgG抗體效價進行測量。圖18中所示之第21天的抗體效價證明:在相同溶液(NP[OVA]+NP[Rapa]或NP[GSK1059615])中與經包封OVA伴隨施用的兩種合成致耐受性納米載體劑量甚至在單獨注射1次OVA+CpG和注射2次OVA后有效地降低針對OVA的抗體形成。

這些結果表明:經包封的免疫抑制劑(例如,雷帕霉素和GSK1059615)當與蛋白質伴隨遞送時可在多次攻擊和多個時間段內預防針對該蛋白質的抗體形成。這證明,兩種不同種類的免疫抑制劑伴隨施用降低針對蛋白質的不期望免疫應答。最后,結果支持建立了如本文中所提供的方案。

實施例19:使用降低的藥效學有效劑量的本發明方法(預示性的)

招募3,200名患有類風濕性關節炎的人對象以進行一系列臨床試驗。在試驗性劑量范圍試驗中,將1,200名對象分成4組(安慰劑和實施例3的合成納米載體的3個不同劑量水平)。使全部4個組中的每個對象接受兩輪的HUMIRA40mgs.c.與伴隨的安慰劑或合成納米載體。將組中最大降低抗HUMIRA抗體平均水平的合成納米載體劑量認定為本試驗的“免疫抑制劑劑量”。

在另一試驗性試驗中,將招募的人對象分為4個測試組,每個組500名對象。在以免疫抑制劑劑量施用合成納米載體的情況下,根據下表伴隨施用安慰劑、HUMIRA知實施例3的合成納米載體(險測試組1之外)

測試組號 HUMIRA劑量 NC施用(sc) 1 40mg sc - 2 40mg sc + 3 20mg sc +

4 10mg sc + 5 安慰劑 安慰劑

對目標藥效學作用(“PD作用”)進行評價,在此情況下,其為每個測試組中對象的ACR20、50和70應答的平均值。觀察測試組1中對象的PD作用并將測試組1中的HUMIRA劑量主觀定義為HUMIRA的藥效學有效劑量(“PD有效劑量”)。

然后,對測試組2至4的PD作用進行評價,并將PD作用并未與測試組1的PD作用顯著不同的最低劑量認定為HUMIRA之降低的藥效學有效劑量。

在應用試驗性試驗期間所建立的信息時,將HUMIRA之降低的藥效學有效劑量與免疫抑制劑劑量(包含實施例3的合成納米載體)伴隨施用于經診斷患有類似風濕性關節炎和處于產生針對HUMIRA之抗體的風險之中的對象。在另一個實施方案中,制備使用在試驗性試驗期間建立的信息的方案以指導將HumiraTM和實施例3的合成納米載體伴隨給藥于經診斷患有類風濕性關節炎和具有或預期具有針對HUMIRA之抗體的對象。然后,使用該方案來指導將HUMIRA之降低的藥效學有效劑量和實施例3的合成納米載體伴隨施用于人對象。

實施例20:證明增強的藥效學作用的本發明方法(預示性的)

招募3,700名患有類風濕性關節炎的人對象以進行一系列臨床試驗。在試驗性劑量范圍試驗中,將1,200名對象分成4組(安慰劑和實施例3的合成納米載體的3個不同劑量水平)。使全部4個組中的每個對象接受兩輪的HUMIRA40mgs.c.與伴隨的安慰劑或合成納米載體。將組中最大降低抗HUMIRA抗體的平均水平的合成納米載體劑量認定為本試驗的“免疫抑制劑劑量”。

在另一試驗性試驗中,將招募的人對象分為3個測試組,其中兩個活性物測試組各自具有1000名對象,一個安慰劑組具有500名對象。在以免疫抑制劑劑量施用合成納米載體的情況下,根據下表伴隨施用安慰劑、HUMIRA和實施例3的合成納米載體(除測試組1之外)。

測試組號 mmRNA劑量 NC施用(sc) 1 40mg sc - 2 40mg sc + 3 安慰劑 安慰劑

對目標藥效學作用(“PD作用”)進行評價,在此情況下,其為每個測試組中對象的ACR20、50和70應答的平均值。觀察測試組1中對象的PD作用并將其與測試組2中的PD作用進行比較。當與在測試組1中觀察到的PD作用進行比較時,觀察測試組2中在伴隨施用免疫抑制劑劑量后HUMIRA之藥效學作用的任何增強。

在應用試驗性試驗期間所建立的信息時,將HUMIRA的標準40mg劑量與免疫抑制劑劑量(包含實施例3的合成納米載體)伴隨施用于經診斷患有類似風濕性關節炎和處于產生針對HUMIRA之抗體的風險之中的對象。在另一個實施方案中,制備使用在試驗性試驗期間建立的信息的方案以指導將HUMIRA和實施例3的合成納米載體伴隨給藥于經診斷患有類風濕性關節炎和已知或認為具有針對HUMIRA之抗體的對象。然后,使用該方案來指導將HUMIRA與實施例3的合成納米載體伴隨施用于人對象。使用本文中公開的方法記錄在伴隨施用之后任何增強的藥效學作用。

實施例21:證明增強的藥效學作用的本發明方法(預示性的)

招募3,200名患有化療相關性貧血的人對象以進行一系列臨床試驗。在試驗性劑量范圍試驗中,根據deFougerolles等的美國專利申請2013/0115272制備編碼紅細胞生成素的經修飾mRNA(“mmRNA”)。將1,200名對象分成4組(安慰劑和實施例3的合成納米載體的3個不同劑量水平)。使全部4個組中的每個對象伴隨接受治療劑量的mmRNA與安慰劑或合成納米載體。將組中最大降低抗mmRNA抗體的平均水平的合成納米載體劑量認定為本試驗的“免疫抑制劑劑量”。

在另一試驗性試驗中,將招募的人對象分為4個測試組,每個測試組各自具有500名對象。在以免疫抑制劑劑量施用合成納米載體的情況下,根據下表伴隨施用安慰劑、mmRNA和實施例3的合成納米載體(除測試組1之外)。

測試組號 HUMIRA劑量 NC施用(sc) 1 治療劑量sc - 2 治療劑量sc + 3 1/2治療劑量sc + 4 1/4治療劑量sc + 5 安慰劑 安慰劑

對目標藥效學作用(“PD作用”)進行評價,在此情況下,其為每個測試組中對象的化療誘導的貧血反應的平均值。觀察測試組1中對象的PD作用并將測試組1中的mmRNA劑量主觀定義為mmRNA的藥效學有效劑量(“PD有效劑量”)。

然后,對測試組2至4的PD作用進行評價,并將PD作用并未與測試組1的PD作用顯著不同的最低劑量認定為mmRNA之降低的藥效學有效劑量。在應用試驗性試驗期間所建立的信息時,將mmRNA之降低的藥效學有效劑量與免疫抑制劑劑量(包含實施例3的合成納米載體)伴隨施用于經診斷患有化療相關性貧血和處于產生針對mmRNA之抗體的風險之中的對象。

在另一個實施方案中,制備使用在試驗性試驗期間建立的信息的方案以指導將mmRNA和實施例3的合成納米載體伴隨給藥于經診斷患有化療相關性貧血和已知或認為具有針對mmRNA之抗體的對象。然后,使用該方案來指導將mmRNA之降低的藥效學有效劑量和實施例3的合成納米載體伴隨施用于人對象。

實施例22:在多次給藥期間維持生物藥物的效力的方法

生物藥物通常在多次給藥之后逐漸喪失活性。效力喪失的一個常見原因是ADA的形成。ADA可例如如下導致藥物效力喪失:1)增強對藥物的清除,使得多劑量之后藥物的PK顯著低于單劑量之后藥物的PK;或者2)中和藥物的活性,使得多劑量之后藥物的生物學活性顯著低于單劑量之后藥物的生物學活性。期望在多次給藥期間維持生物藥物的活性。

表達人TNF-α的轉基因小鼠在5周至20周齡內自發地發生關節炎。在第5周至第11周,每周在有或無來自實施例16的合成納米載體的情況下用HUMIRA(60μg/注射)處理小鼠。圖B(圖19)示出了在第一劑量之后HUMIRA的血清水平(第1天)。在6個HUMIRA劑量之后,HUMIRA的血液水平接近經單獨HUMIRA處理的小鼠的基線,并且在整個第20周內保持較低(圖C,圖19,黑色正方形)。相比之下,經HUMIRA和合成納米載體處理的小鼠表現出與第一劑量之后類似的HUMIRA血清水平(圖C,圖19,藍色三角形),表明合成納米載體處理能夠在多次給藥之后使HUMIRA維持有效的血液水平。

在經單獨HUMIRA處理的小鼠中,血清HUMIRA血液水平的降低可歸因于ADA的發生。截止第11周,經單獨HUMIRA處理的小鼠產生高效價抗藥物抗體(圖A,圖19,黑色正方形符號)。相比之下,經合成納米載體處理的小鼠表現出很低或未表現出抗HUMIRA抗體應答(圖A,圖19,藍色三角形)。在實施例16中上述的關節炎疾病評分中明顯的是,多次給藥影響HUMIRA血清水平的降低(圖D,圖19)。經單獨HUMIRA處理的小鼠在第10周至第20周表現出關節炎評分的次最佳降低(圖D,圖19,將黑色正方形與黑色圓形進行比較)。相比之下,經合成納米載體處理的小鼠表現出對關節炎的強抑制(圖C,圖19,藍色三角形)。

這些結果表明,在多次給藥下維持藥物水平對藥物效力是重要的,并表明與合成納米載體連接的免疫抑制劑通過抑制ADA應答來在多次給藥下維持藥物水平。因此,這些結果證明了如本文中所提供的將治療性大分子與免疫抑制劑重復施用的益處。結果還證明了能夠確定可在對象中實現期望的治療效果和/或降低的ADA應答的方案。

實施例23:證明增強的藥效學作用的本發明方法(預示性的)

招募3,700名患有類風濕性關節炎的人對象以進行一系列臨床試驗。在試驗性劑量范圍試驗中,將1,200名對象分成4組(安慰劑和納米結晶雷帕霉素的3個不同劑量水平)。使全部4個組中的每個對象接受兩輪的HUMIRA40mgs.c.與伴隨的安慰劑或納米結晶雷帕霉素。將組中最大降低抗HUMIRA抗體的平均水平的納米結晶雷帕霉素劑量認定為本試驗的“免疫抑制劑劑量”。

在另一試驗性試驗中,將招募的人對象分為3個測試組,其中兩個活性物測試組各自具有1000名對象,一個安慰劑組具有500名對象。在以免疫抑制劑劑量施用合成納米載體的情況下,根據下表伴隨施用安慰劑、HUMIRA和納米結晶雷帕霉素(除測試組1之外)。

測試組號 HUMIRA劑量 免疫抑制劑劑量(sc) 1 40mg sc - 2 40mg sc + 3 安慰劑 安慰劑

對目標藥效學作用(“PD作用”)進行評價,在此情況下,其為每個測試組中對象的ACR20、50和70應答的平均值。觀察測試組1中對象的PD作用并將其與測試組2中的PD作用進行比較。當與在測試組1中觀察到的PD作用進行比較時,觀察測試組2中在伴隨施用免疫抑制劑劑量后HUMIRA之藥效學作用的任何增強。

在應用試驗性試驗期間所建立的信息時,將HUMIRA的標準40mg劑量與免疫抑制劑劑量(包含納米結晶雷帕霉素)伴隨施用于經診斷患有類似風濕性關節炎和處于產生針對HUMIRA之抗體的風險之中的對象。在另一個實施方案中,制備使用在試驗性試驗期間建立的信息的方案以指導將HUMIRA和納米結晶雷帕霉素伴隨給藥于經診斷患有類風濕性關節炎和已知或認為具有針對HUMIRA之抗體的對象。然后,使用該方案來指導將HUMIRA和納米結晶雷帕霉素伴隨施用于人對象。使用本文中公開的方法記錄在伴隨施用之后任何增強的藥效學作用。

實施例24:證明增強的藥效學作用的本發明方法(預示性的)

招募3,200名患有化療相關性貧血的人對象以進行一系列臨床試驗。在試驗性劑量范圍試驗中,根據deFougerolles等的美國專利申請2013/0115272制備編碼紅細胞生成素的經修飾mRNA(“mmRNA”)。將1,200名對象分成4組(安慰劑和納米結晶雷帕霉素的3個不同劑量水平)。使全部4個組中的每個對象伴隨接受治療劑量的mmRNA與安慰劑或納米結晶雷帕霉素。將組中最大降低抗mmRNA抗體的平均水平的納米結晶雷帕霉素劑量認定為本試驗的“免疫抑制劑劑量”。

在另一試驗性試驗中,將招募的人對象分為4個測試組,每個測試組各自具有500名對象。在以免疫抑制劑劑量施用納米結晶雷帕霉素的情況下,根據下表伴隨施用安慰劑、mmRNA和實施例3的合成納米載體(除測試組1之外)。

對目標藥效學作用(“PD作用”)進行評價,在此情況下,其為每個測試組中對象的化療誘導的貧血反應的平均值。觀察測試組1中對象的PD作用并將測試組1中的mmRNA劑量主觀定義為mmRNA的藥效學有效劑量(“PD有效劑量”)。

然后,對測試組2至4的PD作用進行評價,并將PD作用并未與測試組1的PD作用顯著不同的最低劑量認定為mmRNA的降低的藥效學有效劑量。在應用試驗性試驗期間所建立的信息時,將mmRNA之降低的藥效學有效劑量與免疫抑制劑劑量(包含納米結晶雷帕霉素)伴隨施用于經診斷患有化療相關性貧血和處于產生針對mmRNA之抗體的風險之中的對象。

在另一個實施方案中,制備使用在試驗性試驗期間建立的信息的方案以指導將mmRNA和納米結晶雷帕霉素伴隨給藥于經診斷患有化療相關性貧血和已知或認為具有針對mmRNA之抗體的對象。然后,使用該方案來指導將mmRNA之降低的藥效學有效劑量和納米結晶雷帕霉素伴隨施用于人對象。

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