• / 38
  • 下載費用:30 金幣  

维戈塞尔塔vs皇家马德里优酷直播: 通過抑制TL1A治療纖維化和炎癥.pdf

摘要
申請專利號:

维戈塞尔塔vs皇家社会 www.vmyqew.com.cn CN201480030128.0

申請日:

20140327

公開號:

CN105246501A

公開日:

20160113

當前法律狀態:

有效性:

審查中

法律詳情:
IPC分類號: A61K38/12,A61K38/16,C12Q1/68 主分類號: A61K38/12,A61K38/16,C12Q1/68
申請人: 雪松-西奈醫學中心
發明人: D·Q·施,S·R·塔爾干,李大林,J·比爾斯伯勒
地址: 美國加利福尼亞州洛杉磯
優先權: 61/805,806,61/872,020
專利代理機構: 北京市浩天知識產權代理事務所(普通合伙) 代理人: 劉云貴
PDF完整版下載: PDF下載
法律狀態
申請(專利)號:

CN201480030128.0

授權公告號:

法律狀態公告日:

法律狀態類型:

摘要

本發明涉及治療纖維化和炎性腸病的方法。在一個實施方案中,本發明通過向個體施用治療有效劑量的TL1A抑制劑和/或DR3抑制劑治療腸炎癥。在另一實施方案中,本發明提供一種通過抑制TL1A-DR3信號傳導功能逆轉個體的組織纖維化的方法。

權利要求書

1.一種治療受試者的纖維化的方法,其包括:提供包含一種或多種TL1A-DR3信號傳導功能的抑制劑的組合物;和向所述受試者施用治療有效劑量的所述組合物。2.如權利要求1所述的方法,其中所述組合物包含一種或多種TL1A阻斷抗體。3.如權利要求1所述的方法,其中所述組合物包含一種或多種Dr3阻斷抗體。4.如權利要求1所述的方法,其中所述組合物包含一種或多種通過直接與TL1A結合而抑制TL1A功能的化合物。5.如權利要求1所述的方法,其中所述組合物包含一種或多種Ifnγ、IL17、Ctgf和IL31Ra的抑制劑。6.如權利要求1所述的方法,其中所述組合物包含一種或多種Tgfβ和Igf1的抑制劑。7.如權利要求1所述的方法,其中所述組合物包含一種或多種IL31信號傳導的抑制劑。8.如權利要求1所述的方法,其中施用治療有效劑量的所述組合物使得所述纖維化逆轉到發炎前水平。9.如權利要求1所述的方法,其中所述纖維化為結腸纖維化。10.如權利要求1所述的方法,其中施用治療有效劑量的所述組合物進一步導致對受試者的腸炎癥的抑制。11.如權利要求1所述的方法,其中施用治療有效劑量的所述組合物減少所述受試者的成纖維細胞和/或肌成纖維細胞的數量。12.如權利要求1所述的方法,其中施用治療有效劑量的所述組合物減少所述受試者的原發腸道肌成纖維細胞的數量。13.一種治療受試者的疾病的方法,其包括:提供包含IL31Ra信號傳導的抑制劑的組合物;和向所述受試者施用有效劑量的所述組合物。14.如權利要求13所述的方法,其中所述疾病為TL1A相關疾病。15.如權利要求13所述的方法,其中所述疾病為炎性腸病(IBD)。16.如權利要求13所述的方法,其中所述疾病與在所述小腸形成的狹窄和/或腸炎癥相關。17.如權利要求13所述的方法,其中所述疾病為小腸和大腸纖維狹窄。18.如權利要求13所述的方法,其中所述疾病為纖維化。19.如權利要求13所述的方法,其中所述組合物包含一種或多種TL1A抗體。20.如權利要求13所述的方法,其中所述組合物包含一種或多種IL31RA、IFNγ、IL17、Ctgf、TgfB1和/或Igf1信號傳導的抑制劑。21.如權利要求13所述的方法,其中施用治療有效劑量的所述組合物減少所述受試者的成纖維細胞和/或肌成纖維細胞的數量。22.一種診斷受試者對TL1A相關疾病的易感性的方法,其包括:從所述受試者獲得樣本;分析所述樣本以確定相對于正常個體的高水平的IL31Ra表達的存在或不存在;和根據所述相對于正常個體的高水平的IL31RA表達的存在來診斷對所述TL1A相關疾病的易感性。23.如權利要求22所述的方法,其中所述TL1A相關疾病為炎性腸病(IBD)。24.如權利要求22所述的方法,其中所述TL1A相關疾病與在所述小腸形成的狹窄和/或腸炎癥相關。25.如權利要求22所述的方法,其中所述TL1A相關疾病為小腸和大腸纖維狹窄。26.如權利要求22所述的方法,其中所述TL1A相關疾病為纖維化。27.如權利要求22所述的方法,其進一步包括確定相對于正常個體的膠原蛋白、IL31RA、IFNγ、IL17、Ctgf、TgfB1和/或Igf1的高水平表達的存在。28.一種診斷受試者的TL1A相關疾病的方法,其包括:從所述受試者獲得樣本;分析所述樣本以確定一種或多種與所述TL1A相關疾病相關的危險變體和/或標志物的存在或不存在;和根據與所述TL1A相關疾病相關的一種或多種危險變體和/或標志物的存在診斷所述TL1A相關疾病。29.如權利要求28所述的方法,其中所述一種或多種危險變體和/或標志物包括高表達的IL31RA。30.如權利要求28所述的方法,其中所述一種或多種危險變體和/或標志物包括高表達的IFNγ、IL17、Ctgf、TgfB1和/或Igf1。31.如權利要求28所述的方法,其中所述TL1A相關疾病為炎性腸病(IBD)。32.如權利要求28所述的方法,其中所述TL1A相關疾病與在所述小腸形成的狹窄和/或腸炎癥相關。33.如權利要求28所述的方法,其中所述TL1A相關疾病為小腸和大腸纖維狹窄。34.如權利要求28所述的方法,其中所述TL1A相關疾病為纖維化。35.如權利要求28所述的方法,其進一步包括通過施用一種或多種TL1A抑制劑治療所述TL1A相關疾病。36.如權利要求28所述的方法,其進一步包括通過施用TL1A抑制劑治療所述TL1A相關疾病。37.如權利要求28所述的方法,其中所述受試者為人。38.如權利要求28所述的方法,其進一步包括通過施用Dr3抑制劑治療所述TL1A相關疾病。39.一種治療受試者的纖維化的方法,其包括:提供包含TL1A抑制劑和DR3抑制劑的組合物;和向所述受試者施用治療有效劑量的所述組合物。40.如權利要求39所述的方法,其中所述TL1A抑制劑為TL1A抗體。41.如權利要求39所述的方法,其中所述DR3抑制劑使DR3的表達缺失。42.如權利要求39所述的方法,其中所述纖維化減少。43.如權利要求39所述的方法,其中所述組合物抑制TL1A-DR3信號傳導功能。44.一種逆轉受試者的纖維化的方法,其包括:提供包含TL1A抑制劑和DR3抑制劑的組合物;和向所述受試者施用治療有效劑量的所述組合物。45.如權利要求44所述的方法,其中所述組合物進一步包含IFNγ、IL17、Tgfβ、Ctgf和/或IL31RA信號傳導功能的抑制劑。46.如權利要求44所述的方法,其中所述組合物抑制TL1A-DR3信號傳導功能。47.一種治療炎癥的方法,其包括:提供包含TL1A抑制劑和/或DR3抑制劑的組合物;并且向所述受試者施用治療有效劑量的所述組合物。48.如權利要求47所述的方法,其中所述組合物進一步包含IFNγ、IL17、Ctgf和/或IL31RA信號傳導功能的抑制劑。49.如權利要求47所述的方法,其中所述組合物抑制TL1A-DR3信號傳導功能。50.一種治療受試者的疾病的方法,其包括:抑制Ifnγ和Il-17表達,下調Tgfβ信號傳導,和/或減少成纖維細胞/肌成纖維細胞;并且治療所述受試者。51.如權利要求50所述的方法,其中所述疾病為炎性腸病。52.如權利要求50所述的方法,其中所述疾病為纖維化。53.如權利要求50所述的方法,其中所述疾病為腸炎癥。54.如權利要求50所述的方法,其中所述疾病為與炎性腸病相關的并發癥。55.一種組合物,其包含:一種或多種TL1A、DR3和IL31RA信號傳導功能的抑制劑;以及藥學上可接受的載體。56.如權利要求55所述的組合物,其中所述一種或多種TL1A抑制劑為TL1A抗體。57.如權利要求55所述的組合物,其中所述一種或多種DR3抑制劑為DR3抗體。58.一種治療與IBD相關的并發癥的方法,其包括:提供包含TL1A、DR3和IL31RA信號傳導功能的抑制劑的組合物;和向所述受試者施用治療有效劑量的所述組合物。59.如權利要求58所述的方法,其中將所述組合物通過靜脈施用至所述受試者。

說明書

發明領域

本發明提供用于治療和診斷與TL1A功能及纖維化相關的病癥的方法和組合物。

背景技術

本文所有出版物以引用的方式并入,其程度如同每個單獨出版物或專利申請被具體地且單獨地指出是以引用的方式并入那樣。下列描述包括可用于理解本發明的信息。不是承認本文提供的任何信息為現有技術或與目前要求?;さ姆⒚饗喙?,或者任何明確或含蓄引用的出版物為現有技術。

克羅恩氏病(CD)是具有諸如補丁型透壁性炎癥和纖維狹窄的病理學特征的慢性炎性病癥。盡管采用有效的抗炎治療,仍有高達20%的CD患者會發展為需要手術干預的組織并發癥。調節纖維化的途徑可能不同于介導炎癥的那些途徑。TL1A,TNF超家族的成員,與死亡結構域受體3(DR3)結合并調節適應性免疫應答。TL1A可能與CD、腸道纖維狹窄和較大手術需要有關。需要新型且有效的用于治療與TL1A/DR3信號傳導途徑(signalingpathway)相關的疾病、CD以及相關并發癥的療法,包括用于逆轉已形成的纖維化的療法。

發明概述

本文各種實施方案包括治療受試者的纖維化(fibrosis)的方法,其包括提供包含一種或多種TL1A功能抑制劑的組合物,并向所述受試者施用治療有效劑量的所述組合物。在其它實施方案中,所述組合物包含一種或多種TL1A阻斷抗體。在另一實施方案中,所述組合物包含一種或多種Dr3阻斷抗體。在另一實施方案中,所述組合物包含一種或多種通過直接與TL1A結合而抑制TL1A功能的化合物。在另一實施方案中,所述組合物包含一種或多種Ifnγ(Ifngamma,干擾素γ)、IL17(白細胞介素17)、Ctgf(結締組織生長因子)和IL31Ra(白細胞介素31受體a)的抑制劑。在另一實施方案中,所述組合物包含一種或多種Tgfβ(Tgfbeta1,轉化生長因子)和Igf1(胰島素樣生長因子)的抑制劑。在另一實施方案中,所述組合物包含一種或多種IL31信號傳導(signaling)的抑制劑。在另一實施方案中,施用治療有效劑量的所述組合物使得纖維化逆轉到發炎前水平。在另一實施方案中,所述纖維化為結腸纖維化。在另一實施方案中,施用治療有效劑量的所述組合物進一步導致對受試者的腸炎癥的抑制。

其它實施方案包括治療受試者的疾病的方法,其包括提供包含IL31Ra信號傳導的抑制劑的組合物,并向所述受試者施用有效劑量的所述組合物。在另一實施方案中,所述疾病為TL1A相關疾病。在另一實施方案中,所述疾病為炎性腸病(IBD)。在另一實施方案中,所述疾病與在小腸形成的狹窄和/或腸炎癥相關。在另一實施方案中,所述疾病為小腸和大腸纖維狹窄(fibrostenosis)。在另一實施方案中,所述疾病為纖維化。在另一實施方案中,所述組合物包含一種或多種TL1A抗體。在另一實施方案中,所述組合物包含一種或多種IL31RA、IFNγ、IL17、Ctgf、TgfB1和/或Igf1信號傳導的抑制劑。

其它實施方案包括診斷受試者對TL1A相關疾病的易感性的方法,其包括從所述受試者獲得樣本,分析所述樣本以確定是否存在相對于正常個體來說是高水平的IL31Ra表達,和根據相對于正常個體來說是高水平的IL31表達的存在來診斷對所述TL1A相關疾病的易感性。在另一實施方案中,所述TL1A相關疾病為炎性腸病(IBD)。在另一實施方案中,所述TL1A相關疾病與在小腸形成的狹窄和/或腸炎癥相關。在另一實施方案中,所述TL1A相關疾病為小腸和大腸纖維狹窄。在另一實施方案中,所述TL1A相關疾病為纖維化。在另一實施方案中,所述方法進一步包括確定相對于正常個體的IL31RA、IFNγ、IL17、Ctgf、TgfB1和/或Igf1的高水平表達的存在。

各種實施方案包括診斷受試者的TL1A相關疾病的方法,其包括從所述受試者獲得樣本,分析所述樣本以確定是否存在與所述TL1A相關疾病有關的一種或多種危險變體和/或標志物,和根據與所述TL1A相關疾病有關的一種或多種危險變體和/或標志物的存在來診斷所述TL1A相關疾病。在另一實施方案中,所述一種或多種危險變體和/或標志物包括高表達的IL31RA。其它實施方案包括一種或多種危險變體和/或標志物,所述危險變體和/或標志物包括高表達的IFNγ、IL17、Ctgf、TgfB1和/或Igf1。在另一實施方案中,所述TL1A相關疾病為炎性腸病(IBD)。在另一實施方案中,所述TL1A相關疾病與在小腸形成的狹窄和/或腸炎癥相關。在另一實施方案中,所述TL1A相關疾病為小腸和大腸纖維狹窄。在另一實施方案中,所述TL1A相關疾病為纖維化。在另一實施方案中,所述方法進一步包括通過施用一種或多種TL1A抑制劑治療所述TL1A相關疾病。在另一實施方案中,所述方法進一步包括通過施用TL1A抑制劑治療所述TL1A相關疾病。在另一實施方案中,所述受試者為人。在另一實施方案中,所述方法進一步包括通過施用Dr3抑制劑治療所述TL1A相關疾病。

其它實施方案包括治療受試者的纖維化的方法,其包括提供包含TL1A抑制劑和DR3抑制劑的組合物,和向所述受試者施用治療有效劑量的所述組合物。在另一實施方案中,所述TL1A抑制劑為TL1A抗體。

其它實施方案包括逆轉受試者的纖維化的方法,其包括提供包含TL1A抑制劑和DR3抑制劑的組合物,并向所述受試者施用治療有效劑量的所述組合物。在另一實施方案中,所述組合物進一步包含IFNγ、IL17、Ctgf和/或IL31RA信號傳導功能的抑制劑。

各種實施方案包括治療炎癥的方法,其包括提供包含TL1A抑制劑和/或DR3抑制劑的組合物,并向所述受試者施用治療有效劑量的所述組合物。在另一實施方案中,所述組合物進一步包含IFNγ、IL17、Ctgf和/或IL31RA信號傳導功能的抑制劑。

其它實施方案包括治療受試者的疾病的方法,其包括抑制Ifnγ和Il-17表達,下調Tgfβ信號傳導,和/或減少成纖維細胞/肌成纖維細胞,并治療所述受試者。在另一實施方案中,所述疾病為炎性腸病。在另一實施方案中,所述疾病為纖維化。在另一實施方案中,所述疾病為腸炎癥。在另一實施方案中,所述疾病為與炎性腸病相關的并發癥。

其它實施方案包括包含一種或多種抑制劑和藥學上可接受的載體的組合物,其中,所述抑制劑是TL1A、DR3和IL31RA信號傳導功能的抑制劑。在另一實施方案中,一種或多種TL1A抑制劑為TL1A抗體。在另一實施方案中,一種或多種DR3抑制劑為DR3抗體。

本文的各種實施方案包括治療與IBD相關的并發癥的方法,其包括提供包含TL1A、DR3和IL31RA信號傳導功能的抑制劑的組合物,并向所述受試者施用治療有效劑量的所述組合物。在另一實施方案中,將所述組合物靜脈內施用至所述受試者。

附圖簡述

示例性實施方案示于附圖。預期本文公開的實施方案和附圖被認為是說明性的而不是限制性的。

根據本文實施方案,圖1描述Tl1aAb減少結腸疾病特征。(A)用于過繼轉移模型的Tl1aAb處理示意圖;基線Rag-/-對照小鼠(RagCo),基線野生型對照小鼠(WTCo),預處理組(Pre-Tx),同種型抗體組(IsoAb),處理后組(Post-Tx)。(B)在Iso和Tl1aAb處理組之間比較DAI。(C)顯示帶有定量炎癥評分(右圖)的結腸代表性大體形態(左圖)。將數據表示為平均值±SD。(D)將總數量的單核細胞從MLN和LPMC中分離。每一個實心圓代表一只獨立的小鼠。將Tl1aAb處理組與Pre-Tx和IsoAb組比較。*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001。

根據本文實施方案,圖2描述Tl1aAb處理逆轉已形成的結腸炎癥。(A)放大200倍的代表性H&E染色的中部結腸切片。(B)對過繼轉移模型的定量組織學評分。對至少20個獨立視野進行評分并且將數據表示為平均值±SD。(C)測量髓過氧化物酶活性并表示為每克(g)結腸蛋白提取物的活性單位(u)。每一個實心圓代表一只獨立的小鼠。將Tl1aAb處理組與基線RagCo、Pre-Tx和IsoAb實驗組相比較。*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001。

根據本文實施方案,圖3描述Tl1aAb減少Th-1和-17免疫應答。(A)顯示對于MLN(上圖)和LPMC(下圖)的染色用于細胞內Ifnγ和Il17表達的分類的CD4+細胞的代表性流式細胞術曲線。定量了對于MLN(B)和LPMC(C)的CD4+Il17+、CD4+Ifnγ+和CD4+Il17+Ifnγ+T-細胞的百分比。用抗-CD3和抗-CD28刺激從MLN和LPMC分離的單核細胞并通過ELISA(酶聯免疫吸附測定)評估分泌的Il17(D)和Ifnγ(E)水平。每一個實心圓代表從一只獨立的小鼠獲得的值。將Tl1aAb處理組與Pre-Tx和IsoAb實驗組相比較。*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001。

根據本文實施方案,圖4描述在過繼轉移模型中利用Tl1aAb治療對已形成的纖維化的逆轉。(A)放大200倍下在中部結腸組織切片中膠原蛋白沉積的代表性天狼猩紅染色。黑色箭頭表示膠原蛋白沉積的厚度。(B)顯示來自中部結腸切片的波形蛋白(綠色)和αSMA(紅色)的代表性免疫熒光染色。橙色箭頭表示共表達波形蛋白和αSMA的肌成纖維細胞。顯示來自所述中部結腸切片的膠原蛋白厚度(C)的定量和激活的成纖維細胞(D)的百分比并表示為平均值±SD。每組至少對20個獨立的視野進行評分。將Tl1aAb處理組與基線RagCo、Pre-Tx和IsoAb實驗組相比較。*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001。

根據本文實施方案,圖5描述Dr3缺失的腸道成纖維細胞的增殖減少。(A)小鼠Dr3內源基因座和基因靶向策略的示意圖。(B)顯示Dr3基因型的代表性聚合酶鏈式反應,目標(Dr3KO)帶在506bp水平,且內源Dr3基因座在353bp水平。(C)表示從同窩WT和Dr3-/-結腸中重新獲得的腸道成纖維細胞的6張照片(左圖)以及繪制了每一結腸的個體總成纖維細胞(右圖)。(D)顯示自WT和Dr3-/-小鼠的增殖的成纖維細胞(上圖)和正在經歷細胞凋亡的成纖維細胞(下圖)的定量的代表性細胞計數直方圖。CellTraceViolet(細胞示蹤紫色)熒光強度下降表明增殖。膜聯蛋白V染色增強表明細胞凋亡。所示出的為具有相似結果的至少6個獨立實驗的代表性流式細胞計數直方圖。***p<0.001。

根據本文實施方案,圖6描述腸道成纖維細胞表達Dr3并響應Tl1a刺激。(A)在WT中檢測到Dr3mRNA而在Dr3-/-成纖維細胞中未檢出(上)。ND=未檢出。WT成纖維細胞的免疫熒光染色顯示陽性Dr3染紅色(下)。(B)原發腸道成纖維細胞用Dr3、αSMA和波形蛋白染色。如圖所示將αSMA陽性和陰性成纖維細胞分類并在αSMA+WT中發現Dr3染色而在Dr3-/-和αSMA陰性細胞中未發現。顯示的數據代表具有相似結果的至少3個獨立實驗。(C)Col1a2和Il31RamRNA在WT原發腸道成纖維細胞內的表達隨Tl1a刺激(0-200ng/mL)增加并表示為平均值±SD。(D)Tl1a在WT和Dr3-/-腸道中對Col1a2和Il31RamRNA的相對誘導,并表示為平均值±SD。*p<0.05。

根據本文實施方案,圖7描述由于長期的DSS施用Tl1aAb降低炎性疾病活性。(A)在同種型Ab(n=14)和Tl1aAb(n=9)處理組之間比較DAI。(B)顯示帶有定量的炎癥評分(右圖)的結腸的代表性大體形態(左圖)。將數據表示為平均值+/-SD。(C)將總數量的單核細胞從MLN和LP中分離。每一個填充符號代表一只獨立的小鼠。將Tl1aAb處理組與Pre-Tx和IsoAb組相比較。*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001。

根據本文實施方案,圖8描述Tl1aAb逆轉在長期DSS模型中已形成的結腸炎癥。(A)顯示代表性的H&E染色的放大200倍的中部結腸切片。(B)對來自至少20個獨立的中部結腸視野的組織學炎癥的定量進行評分并將數據表示為平均值+/-SD。(C)測量髓過氧化物酶活性并表示為每克(g)結腸蛋白提取物的活性單位(u)。將Tl1aAb處理組與基線WTCo、Pre-Tx、和IsoAb實驗組相比較。每一個實心圓代表來自獨立結腸的MPO活性。*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001。

根據本文實施方案,圖9描述Tl1aAb減少在長期DSS結腸炎模型中的Th-1和-17免疫應答。(A)來自(上圖)和LPMC(下圖)的對于細胞內Ifnγ和Il17染色的分類的CD4+細胞的代表性流式細胞術曲線。定量了對于MLN(B)和LPMC(C)的CD4+Il17+、CD4+Ifnγ+和CD4+Il17+Ifnγ+T-細胞的百分比。(C)用抗-CD3ε和抗-CD28刺激來自MLN和LPMC的分離的單核細胞并通過ELISA評估分泌的Il17(D)和Ifnγ(E)的水平。每一個實心圓代表從一只獨立的小鼠獲得的值。*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001。

根據本文實施方案,圖10描述在長期DSS結腸炎模型中利用Tl1aAb逆轉已形成的纖維化。顯示放大200倍下在中部結腸組織切片中膠原蛋白沉積的代表性天狼猩紅染色。黑色箭頭表示膠原蛋白沉積的厚度。(B)顯示來自中部結腸切片的波形蛋白(綠色)和αSMA(紅色)的代表性免疫熒光染色。橙色箭頭表示共表達波形蛋白和αSMA的肌成纖維細胞。顯示來自所述中部結腸切片的膠原蛋白厚度(C)的定量和激活的成纖維細胞(D)的百分比并表示為平均值±SD。每組至少對20個獨立的視野進行評分。*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001。

根據本文實施方案,圖11描述Tl1aAb減少肌成纖維細胞數量和Dr3和Tl1a的表達。顯示了放大630倍的來自所述過繼轉移模型(a)和長期DSS模型(b)的中部結腸切片的波形蛋白(綠色)和αSMA(紅色)的代表性免疫熒光染色。橙色箭頭表示共表達波形蛋白和αSMA的肌成纖維細胞。對于過繼轉移模型(a,右圖)和長期DSS模型(b,右圖),定量來自所述中部結腸切片的肌成纖維細胞的百分比并表示為平均值±SD。對于(a)和(b),每組對至少10個獨立的視野進行評分。顯示來自所述過繼轉移模型(c)和長期DSS模型(d)的中部結腸切片的波形蛋白(綠色)和Dr3(紅色)的代表性免疫熒光染色。(c)和(d)的插圖為需要放大200倍的圖像的較大視圖。每組對至少8個獨立的視野定量,且繪圖為每個高倍視野(HPF)的Dr3+細胞。定量結腸Dr3(e)和Tl1a(f)mRNA并顯示為平均值±SD(n=5-14)。將Tl1aAb處理組與基線RagCo、WtCo、Pre-Tx和IsoAb實驗組相比較。*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001。特別地,圖11(c)和(d)顯示,與Tl1aAb處理組(與較低膠原蛋白沉積相關)相比,在預處理和同種型抗體組(兩者都與較高膠原蛋白沉積相關)中成纖維細胞上的Dr3染色增加。此外,圖11(e)和(f)通過RT-PCR表達分析顯示,與同種型組(與較高膠原蛋白沉積相關)相比,Tl1a和Dr3在Tl1aAb組(與較低膠原蛋白沉積相關)中的表達均被下調。

根據本文實施方案,圖12描述Dr3缺失降低腸道成纖維細胞。(a)上圖顯示了放大100倍下帶有炎癥定量的代表性H&E染色的結腸。中間圖顯示了放大200倍下每個HPF帶有成纖維細胞定量的代表性波形蛋白/αSMA染色的結腸(插圖為放大200倍的較大視圖)。顯示了從同窩WT和Dr3-/-結腸中重新獲得的腸道成纖維細胞和每個結腸各自總成纖維細胞的代表性照片(a,下圖)。顯示了來自WT和Dr3-/-小鼠的增殖的成纖維細胞(b)和正在經歷細胞凋亡的成纖維細胞(c)的代表性細胞計數直方圖。下降的CellTraceViolet熒光強度表明增殖。增強的膜聯蛋白V染色表明細胞凋亡。顯示至少6個獨立實驗的代表性細胞計數直方圖具有相似結果。*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001。特別地,關于12(a),上圖顯示組織學炎癥在野生型和Dr3KO結腸之間沒有差異,說明它不是引起Dr3KO結腸中成纖維細胞數量減少的根本炎癥。12(a)中間顯示,在結腸切片中直接染色時在Dr3缺失結腸中波形蛋白陽性細胞減少(圖12a,中圖),這對于說明在從所述結腸分離成纖維細胞之前成纖維細胞減少在所述結腸已經預先存在非常重要。

根據本文實施方案,圖13描述腸道成纖維細胞表達Dr3并響應Tl1a刺激。(a)原發腸道成纖維細胞用Dr3、αSMA和波形蛋白染色并通過流式細胞術進行分析。如圖所示,將αSMA高表達、αSMA中表達和αSMA低表達的成纖維細胞分類,并且Dr3染色以αSMA高>中>低的順序優先被發現。進行三個獨立實驗。特別地,圖13(a)顯示在Dr3表達和αSMA表達之間有直接關聯。這對于說明具有較高αSMA表達的成纖維細胞(更活躍的成纖維細胞)具有較高(Dr3表達)非常重要,表明這些更活躍的成纖維細胞更容易接受Tl1a信號轉導。對于這個實驗,本發明人將αSMA低、中和高表達的肌成纖維細胞分別分類然后展示表達Dr3的細胞的比例(圖13a)。該圖表明Dr3在成纖維細胞中的表達存在αSMA高>αSMA中>αSMA低的順序。(b)數據代表放大200倍下3個獨立分類的αSMA陽性肌成纖維細胞。在WT有Dr3的共染色,而在Dr3缺失αSMA陽性肌成纖維細胞中沒有。特別地,圖13(b)直接表明Dr3(Tl1a受體)在肌成纖維細胞上表達。這對于說明介導纖維化的肌成纖維細胞可以接收來自Tl1a的信號轉導非常重要。為了進行這個實驗,本發明人將用抗-αSMA和DR3抗體染色的αSMA陽性細胞分類。然后他們使用免疫熒光顯微術表明Dr3在αSMA陽性WT上表達而不是在DR3KO肌成纖維細胞上(圖13b)。(c)顯示Col1a2和Il31RamRNA在WT初生腸道成纖維細胞中的表達隨Tl1a刺激(0-200ng/mL)增加而增加,并表示為平均值±SD(n=3)。(d)顯示通過Tl1a、Tgfβ/Igf1和Tnfα在WT和Dr3-/-腸道中對Col1a2和Il31RamRNA的誘導并表示為平均值±SD(n=3)。*P<0.05,**P<0.01。特別地,圖13(d)顯示附加實驗以增強所述體外實驗(圖13d)。本發明人使用Tgfβ和Igf1作為原型成纖維細胞生長因子并表明Col1a2和Il31Ra表達的誘導在WT和Dr3缺失原發腸道成纖維細胞之間沒有差異(圖13d)。他們使用Tnfα作為所述原型促炎刺激并表明,比較WT和Dr3缺失原發腸道成纖維細胞發現Col1a2和Il31Ra的誘導沒有差異。這與使用Tl1a的刺激形成對照,在Tl1a刺激中,與在Dr3缺失原發腸道成纖維細胞中相比,在WT中有明顯的Col1a2和Il31Ra表達的誘導。

發明描述

本文中引用的全部參考文獻以引用的方式整體并入,如同全文引用一般。除非另外限定,否則本文所用的技術和科學術語都具有與本發明所屬領域普通技術人員通常理解的含義相同的含義。下述文獻向本領域技術人員提供了對本申請中使用的很多術語的一般指導:Singleton等人,微生物學與分子生物學詞典第4版,約翰.威利出版社(紐約,NY2012)(Singletonetal.,DictionaryofMicrobiologyandMolecularBiology4thed.,J.Wiley&Sons(NewYork,NY2012));高等有機化學-反應、機理與結構第5版,約翰.威利出版社(紐約,NY2001)(March,AdvancedOrganicChemistryReactions,MechanismsandStructure5thed.,J.Wiley&Sons(NewYork,NY2001));以及Sambrook和Russel,分子克隆實驗指南第4版,冷泉港出版社(冷泉港,NY2012)(SambrookandRussel,MolecularCloning:ALaboratoryManual4thed.,ColdSpringHarborLaboratoryPress(ColdSpringHarbor,NY2012))。本領域技術人員將會意識到與本文描述的方法和材料類似或等效的許多方法和材料,這些方法和材料可以用在本發明的實踐中。事實上,本發明決不限于所述的方法和材料。

如本文所公開,腸道纖維狹窄是嚴重的克羅恩氏病的特征。具有某些TNFSF15變體的患者會過表達TL1A并具有較高在小腸中形成狹窄的風險。此外,具有持續Tl1a表達的小鼠在致結腸炎(colitogenic)條件下會導致小腸和大腸纖維狹窄。本發明人研究了中和Tl1a功能是否可以逆轉已形成的鼠類結腸炎和結腸纖維化。

如本文進一步所公開,向已經患有慢性鼠類結腸炎和結腸纖維化的小鼠施用Tl1a阻斷抗體(12F6A)或同型對照Ig(免疫球蛋白)。產生具有Dr3缺失(Dr3-/-)的小鼠。將原發(primary)鼠類腸道成纖維細胞分離。使用組織學和免疫熒光染色、流式細胞術、ELISA和mRNA水平比較炎癥和纖維化的程度。使用CellTrace(細胞示蹤)和膜聯蛋白V(AnnexinV)染色分別確定細胞增殖和細胞凋亡。本發明人發現使用Tl1a抗體的治療減輕了鼠類結腸炎并使結腸纖維化恢復到最初的發炎前水平。這可能是由于降低的Ifnγ、Il17、Ctgf、Il31Ra表達和Tgfβ1和Igf1信號傳導的下調。此外,阻斷Tl1a功能會導致成纖維細胞和肌成纖維細胞數量減少。原發腸道肌成纖維細胞表達Dr3并且可以通過增加膠原蛋白和Il31Ra表達在功能上響應直接Tl1a信號傳導。總之,TL1A信號傳導的調節抑制腸炎癥和纖維化。

在一個實施方案中,本發明提供治療受試者的疾病的方法,其包括提供包含IL31信號傳導抑制劑的組合物,并向所述受試者施用有效劑量的所述組合物。在另一實施方案中,所述疾病為TL1A相關疾病。在另一實施方案中,所述疾病為炎性腸病(IBD)。在另一實施方案中,所述疾病與在小腸形成的狹窄和/或腸炎癥相關。在另一實施方案中,所述疾病為小腸和大腸纖維狹窄。在另一實施方案中,所述疾病為纖維化。在另一實施方案中,所述組合物包含一種或多種TL1A抗體。在另一實施方案中,所述組合物包含一種或多種IL31RA、IFNγ、IL17、Ctgf、TgfB1和/或Igf1信號傳導的抑制劑。

在另一實施方案中,本發明提供治療受試者的疾病的方法,其包括提供包含IL31Ra信號傳導抑制劑的組合物,并向所述受試者施用有效劑量的所述組合物。在另一實施方案中,所述疾病為TL1A相關疾病。在另一實施方案中,所述疾病為炎性腸病(IBD)。在另一實施方案中,所述疾病與在小腸形成的狹窄和/或腸炎癥相關。在另一實施方案中,所述疾病為小腸和大腸纖維狹窄。在另一實施方案中,所述疾病為纖維化。在另一實施方案中,所述組合物包含一種或多種TL1A抗體。在另一實施方案中,所述組合物包含一種或多種IL31RA、IFNγ、IL17、Ctgf、TgfB1和/或Igf1信號傳導的抑制劑。在另一實施方案中,施用治療有效劑量的所述組合物降低受試者的成纖維細胞和/或肌成纖維細胞的數量。

在一個實施方案中,本發明提供診斷受試者對TL1A相關疾病的易感性的方法,其包括從所述受試者獲得樣本,分析所述樣本以確定相對于正常個體的高水平的IL31表達的存在或不存在,并根據所述相對于正常個體的高水平的IL31表達的存在來診斷對所述TL1A相關疾病的易感性。在另一實施方案中,所述TL1A相關疾病為炎性腸病(IBD)。在另一實施方案中,所述TL1A相關疾病與在小腸形成的狹窄和/或腸炎癥相關。在另一實施方案中,所述TL1A相關疾病為小腸和大腸纖維狹窄。在另一實施方案中,所述TL1A相關疾病為纖維化。在另一實施方案中,所述方法進一步包括確定相對于正常個體而言存在IL31RA、IFNγ、IL17、Ctgf、TgfB1和/或Igf1的高水平表達。

一種診斷受試者對TL1A相關疾病的易感性的方法,其包括從所述受試者獲得樣本,分析所述樣本以確定相對于正常個體的高水平的IL31Ra表達的存在或不存在,并根據所述相對于正常個體的高水平的IL31RA表達的存在診斷對所述TL1A相關疾病的易感性。在另一實施方案中,所述TL1A相關疾病為炎性腸病(IBD)。在另一實施方案中,所述TL1A相關疾病與在小腸形成的狹窄和/或腸炎癥相關。在另一實施方案中,所述TL1A相關疾病為小腸和大腸纖維狹窄。在另一實施方案中,所述TL1A相關疾病為纖維化。在另一實施方案中,本發明進一步包括確定相對于正常個體而言存在膠原蛋白、IL31RA、IFNγ、IL17、Ctgf、TgfB1和/或Igf1的高水平表達。

在另一實施方案中,本發明提供診斷受試者的TL1A相關疾病的方法,其包括從所述受試者獲得樣本,分析所述樣本以確定與所述TL1A相關疾病相關的一種或多種危險變體和/或標志物的存在或不存在,并根據所述一種或多種與所述TL1A相關疾病相關的危險變體和/或標志物的存在來診斷所述TL1A相關疾病。在另一實施方案中,所述一種或多種危險變體和/或標志物包括高表達的IL31RA。在另一實施方案中,所述一種或多種危險變體和/或標志物包括高表達的IFNγ、IL17、Ctgf、TgfB1和/或Igf1。在另一實施方案中,所述TL1A相關疾病為炎性腸病(IBD)。在另一實施方案中,所述TL1A相關疾病與在小腸形成的狹窄和/或腸炎癥相關。在另一實施方案中,所述TL1A相關疾病為小腸和大腸纖維狹窄。在另一實施方案中,所述TL1A相關疾病為纖維化。在另一實施方案中,所述方法進一步包括通過施用一種或多種TL1A抑制劑治療所述TL1A相關疾病。在另一實施方案中,所述方法進一步包括通過施用TL1A抑制劑治療所述TL1A相關疾病。在另一實施方案中,所述受試者為人。在另一實施方案中,所述方法進一步包括通過施用Dr3抑制劑治療所述TL1A相關疾病。

如本文所公開,在兩種不同的慢性結腸炎模型中,已顯示Tl1aAb(Tl1a抗體)改善結腸炎疾病并且逆轉腸道纖維化。TL1A信號傳導的調節可通過治療腸炎癥和纖維化改變克羅恩氏病的自然發展過程(naturalhistory)。阻斷TL1A/DR3信號傳導途徑提供了治療克羅恩氏病及其相關并發癥的治療方法,包括逆轉已形成的纖維化。

在一個實施方案中,本發明提供一種治療受試者炎性腸病(IBD)相關的纖維化的方法,診斷受試者的纖維化,然后施用一種或多種TL1A-DR3信號傳導功能的抑制劑,諸如施用治療有效的TL1A抗體,或者,使DR3表達缺失,或使編碼TL1A表達(TNFSF15表達)的dsRNA或siRNA缺失?;蛘?,在其它實施方案中,通過抑制一種或多種TL1A-DR3的下游分子。

在一個實施方案中,本發明提供通過向所述受試者施用包含治療有效劑量的TL1A抑制劑和/或DR3抑制劑的組合物來治療疾病的方法。在另一實施方案中,所述疾病為纖維化。在另一實施方案中,所述疾病為炎性腸病。在另一實施方案中,所述疾病為克羅恩氏病。在另一實施方案中,所述疾病為結腸炎。在另一實施方案中,所述受試者為人。在另一實施方案中,所述TL1A抑制劑為TL1A抗體。在另一實施方案中,所述DR3抑制劑為DR3抗體。

在另一實施方案中,本發明提供通過向所述受試者施用包含治療有效劑量的TL1A抑制劑和/或DR3抑制劑的組合物來逆轉個體的纖維化的方法。

在另一實施方案中,本發明提供治療受試者的纖維化的方法,其包括提供包含一種或多種TL1A-DR3信號傳導功能的抑制劑的組合物,并向所述受試者施用治療有效劑量的所述組合物。在另一實施方案中,所述組合物包含一種或多種TL1A阻斷抗體。在另一實施方案中,所述組合物包含一種或多種Dr3阻斷抗體。在另一實施方案中,所述組合物包含一種或多種通過直接與TL1A結合而抑制TL1A功能的化合物。在另一實施方案中,所述組合物包含一種或多種Ifnγ、IL17、Ctgf和IL31Ra的抑制劑。在另一實施方案中,所述組合物包含一種或多種Tgfβ和Igf1的抑制劑。在另一實施方案中,所述組合物包含一種或多種IL31信號傳導抑制劑。在另一實施方案中,施用治療有效劑量的所述組合物使得纖維化恢復到發炎前水平。在另一實施方案中,所述纖維化為結腸纖維化。在另一實施方案中,施用治療有效劑量的所述組合物進一步導致對所述受試者的腸炎癥的抑制。在另一實施方案中,施用治療有效劑量的所述組合物減少所述受試者的成纖維細胞和/或肌成纖維細胞的數量。在另一實施方案中,施用治療有效劑量的所述組合物減少所述受試者的原發腸道肌成纖維細胞的數量。

在一個實施方案中,本發明提供治療受試者的纖維化的方法,其包括提供包含TL1A抑制劑和DR3抑制劑的組合物;和向所述受試者施用治療有效劑量的所述組合物。在另一實施方案中,所述TL1A抑制劑為TL1A抗體。在另一實施方案中,所述DR3抑制劑使DR3的表達缺失。在另一實施方案中,所述纖維化減少。在另一實施方案中,所述組合物抑制TL1A-DR3信號傳導功能。

在一個實施方案中,本發明提供逆轉受試者的纖維化的方法,其包括提供包含TL1A抑制劑和DR3抑制劑的組合物,并向所述受試者施用治療有效劑量的所述組合物。在另一實施方案中,所述組合物進一步包含IFNγ、IL17、Tgfβ、Ctgf和/或IL31RA信號傳導功能的抑制劑。在另一實施方案中,所述組合物抑制TL1A-DR3信號傳導功能。

在一個實施方案中,本發明提供治療炎癥的方法,其包括提供包含TL1A抑制劑和/或DR3抑制劑的組合物,并向所述受試者施用治療有效劑量的所述組合物。在另一實施方案中,所述組合物進一步包含IFNγ、IL17、Ctgf和/或IL31RA信號傳導功能的抑制劑。在另一實施方案中,所述組合物抑制TL1A-DR3信號傳導功能。

在一個實施方案中,本發明提供治療受試者的疾病的方法,其包括抑制Ifnγ和Il-17表達,下調Tgfβ信號轉導,和/或減少成纖維細胞/肌成纖維細胞,并治療所述受試者。在另一實施方案中,所述疾病為炎性腸病。在另一實施方案中,所述疾病為纖維化。在另一實施方案中,所述疾病為腸炎癥。在另一實施方案中,所述疾病為與炎性腸病相關的并發癥。

在一個實施方案中,本發明提供治療與IBD相關的并發癥的方法,其包括提供包含TL1A、DR3和IL31RA信號傳導功能的抑制劑的組合物,并向所述受試者施用治療有效劑量的所述組合物。在另一實施方案中,通過靜脈注射將所述組合物施用至所述受試者。

在一個實施方案中,本發明提供包含一種或多種TL1A抑制劑和/或一種或多種DR3抑制劑和藥學上可接受的載體的組合物。在另一實施方案中,所述一種或多種TL1A抑制劑為TL1A抗體。在另一實施方案中,所述一種或多種DR3抑制劑為DR3抗體。

在另一實施方案中,本發明提供通過向受試者施用包含治療有效劑量的TL1A抑制劑和/或DR3抑制劑的組合物來降低所述受試者的炎癥的方法。

在另一實施方案中,本發明提供通過抑制Ifnγ和Il-17表達,下調Tgfβ信號傳導,和/或減少成纖維細胞/肌成纖維細胞來抑制與纖維化相關的病癥的方法。

在一個實施方案中,本發明提供包含一種或多種TL1A、DR3和IL31RA信號傳導功能的抑制劑和藥學上可接受的載體的組合物。在另一實施方案中,所述一種或多種TL1A抑制劑為TL1A抗體。在另一實施方案中,所述一種或多種DR3抑制劑為DR3抗體。

在本領域中有很多現有技術,用于檢測是否存在多肽或其它標志物/生物標志物,包括蛋白質微陣列。例如,為此目的可采用的一些檢測范式包括光學方法、電化學方法(伏安法和電流分析技術)、原子力顯微技術和射頻方法,例如,多極共振光譜法。除顯微鏡檢查(共焦和非共焦)外,示例性的光學方法還有熒光、冷光、化學發光、吸光度、反射率、透光率和雙折射或折射率的檢測(例如,表面等離子體共振、橢圓偏振、共振成像方法、光柵耦合器波導方法或干涉法)。

類似地,有很多用來分離(isolate)和/或分級(fractionate)生物標志物的技術。例如,可使用生物特異性捕捉劑(capturereagent)來捕獲生物標志物,所述生物特異性捕捉劑例如是抗體、適體(aptamer)或識別該生物標志物及其修飾形式的抗體。這種方法也可導致蛋白質交互子(interactor)的捕獲,該交互子與蛋白質結合或者另外被抗體識別,并且其本身可為生物標志物。所述生物特異性捕捉劑也可與固相結合。然后,被捕獲的蛋白質可通過SELDI質譜法檢測或通過將蛋白質從所述捕捉劑中洗脫并通過傳統MALDI或通過SELDI檢測洗脫的蛋白質來檢測。SELDI的一個實例稱為"親和捕獲質譜法",或"表面增強親和捕獲(Surface-EnhancedAffinityCapture)"或"SEAC”,其涉及探針的使用,所述探針表面具有能夠捕獲分析物的材料,通過所述材料和所述分析物之間的非共價親和作用(吸附)來捕獲所述分析物。質譜儀的一些實施例為飛行時間法、扇形磁場、四極濾質器、離子捕集器、離子回旋共振、靜電扇形分析器及這些的混合。

或者,例如,可使用傳統的免疫測定技術檢測諸如多肽的生物標志物的存在。免疫測定需要生物特異性捕捉劑,諸如抗體,來捕獲所述分析物。所述測定還可設計用于特異性辨別蛋白質及蛋白質的修飾形式,其可通過采用夾心(sandwich)測定完成,在所述夾心測定中一種抗體捕獲不止一種形式,并且其次明顯標記的抗體,特異性結合,并提供對各種形式的不同檢測??賞ü褂蒙鋟腫用庖叨錮床固?。傳統的免疫測定可包括夾心免疫測定(包括ELISA),或者基于熒光的免疫測定,以及其它酶免疫測定。

在檢測之前,可將生物標志物分級以將其與溶液或血液中的其它可能干擾檢測的組分分離。分離可包括將血小板與其它血液成分分離、血小板組分的亞細胞分離和/或將所期望的生物標志物與血小板中發現的其它生物分子分離,所采用的技術諸如是色譜法、親和純化、1D和2D映射技術,和本領域技術人員已知的其它用于純化的方法。在一個實施方案中,通過生物芯片分析樣本。生物芯片通常包括固體基質并具有通常是平滑的表面,捕捉劑(也稱為吸附劑或親和試劑)粘著與所述表面上。常常,生物芯片的表面包含多個可訪問的位點,其中每個位點都結合有捕捉劑。

上述各種方法和技術提供實現本發明的多種方式。當然,應理解,未必所有描述的目的和優點都根據本文描述的任何特定實施方案實現。因此,例如,本領域技術人員將認識到,所述方法可以通過一種方式進行,這種方式實現或最優化如本文中所教導的一個優點或一組優點而未必實現如本文中可能教導或提出的其它優點。本文提及多種有利或不利的可選方案。應理解一些優選實施方案明確包括一種、另一種或幾種有利特征,而其它實施方案明確排除一種、另一種或幾種不利特征,然而仍有其它實施方案通過包含一種、另一種或幾種有利特征明確減少了目前不利特征。

此外,本領域技術人員將認識到不同實施方案的各種特征的適用性。類似地,以上討論的各種元素、特征和步驟,以及其它已知的每一種此類元素、特征和步驟的等效物,可由本領域普通技術人員混合或匹配以進行根據本文描述的原理的方法。在所述各種元素、特征和步驟中,一些明確包括在不同實施方案中而其它被明確排除。

盡管本發明已在某些實施方案和實施例的上下文中公開,本領域技術人員將理解本發明的實施方案從明確公開的實施方案延伸到其它可選實施方案和/或用途以及其修改及等效物。

許多變化和可選元素已在本發明的實施方案公開。再進一步變化和可選元素對本領域技術人員將是顯而易見的。這些變化包括但不限于所述發明組合物的組成分子的選擇,以及用其可診斷、預測和治療的所述疾病和其它臨床癥狀。本發明的各種實施方案可明確包括或排除任何這些變化或元素。

在一些實施方案中,表達用于描述和要求?;け痙⒚髂承┦凳┓槳傅某煞?、性質(諸如濃度、反應條件等等)的量的數字應理解為在一些實例中被術語“約”修飾。因此,在一些實施方案中,在書面描述和所附權利要求中闡述的數值參數為近似值,其可根據特定實施方案要尋求獲得的所需性質而變化。在一些實施方案中,應當根據報道的有效數字個數并通過應用普通舍入技術解釋所述數值參數。盡管闡明本發明的一些實施方案的廣泛范圍的數字范圍和參數是近似值,但具體實施例中闡述的數值應盡可能予以精確報道。在本發明的一些實施方案中提出的所述數值可包含由發現于它們各自的測試測量中的標準偏差必然導致的某些誤差。

在一些實施方案中,描述本發明特定實施方案(特別是某些下列權利要求的上下文)的上下文中使用的術語“一個/一種(a)”和“一個/一種(an)”和“該(the)”以及類似的提及可被解釋為涵蓋單數和復數兩者。本文中值范圍的引用僅僅意圖充當單獨涉及落在范圍內的每個不同值的簡易方法。除非本文另外指出,將每個單個值并入說明書,如同其在本文中被單獨引用一樣。本文描述的所有方法可以以任何合適的順序進行,除非本文另外指出或與上下文明顯矛盾。本文相對于某些實施方案提供的任何和所有的實施例或示例性語言(例如,“諸如”)的使用僅僅意圖更好地闡明本發明,而并不是對另外要求?;さ謀痙⒚韉姆段Ч鉤上拗?。說明書中的語言不應解釋為指出對實施本發明必需的任何未要求?;さ囊?。

本文所公開的本發明的替代要素或實施方案的群組不應解釋為限制。每一群組成員可單獨地或以與組的其它成員或本文中存在的其它要素進行任何組合的方式被提及和被要求?;?。為方便性和/或專利性原因,組的一個或多個成員可包括于組中或從組中刪除。當發生任何這種包括或刪除時,說明書被視為包含改變的組,因而符合所附權利要求中使用的馬庫什(Markush)組的書面描述。

在本文中描述了本發明的優選實施方案,包括發明人已知的實施本發明的最佳方式。本領域普通技術人員在閱讀上述說明時,這些所述優選實施方案的變化將變得顯而易見。預期熟練技術人員在適當情況下可以采用這些變化,并且本發明可以以不同于本文具體描述的方式實施。因此,此發明的許多實施方案包括如適用法律所許可的所附的權利要求所列舉的對象的所有修改和等效物。而且,在其所有可能的變化中,上述要素的任何組合均由本發明涵蓋,除非本文另外指出或另外與上下文明顯矛盾。

此外,本說明書通篇參考了大量的專利和印刷的出版物。每個上述引用的參考文獻和印刷的出版物各自以引用的方式整體并入本文。

最后,應理解本文公開的本發明的實施方案闡明了本發明的原則。其它可被采用的修改可處于本發明的范圍內。因此,通過實例但不是限制的方式,可根據本文的教導使用本發明的替代性構造。因此,本發明的實施方案不限于本文所精確顯示和描述的。

實施例

提供下面的實施例以更好地示出要求?;さ謀痙⒚?,而不應解釋為限制本發明的范圍。就提到的特定材料來說,這僅是為了說明的目的并且不打算限制本發明。本領域的技術人員在無需具有創造性能力且不脫離本發明的范圍的情況下可開發等效方法或反應物。

實施例1

慢性結腸炎的誘導及治療

C57BL/6J小鼠購自杰克遜實驗室。如前所述進行長期葡聚糖硫酸鈉(DSS)結腸炎誘導。在所述過繼轉移模型中,通過將從WT小鼠分離的500,000個CD4+CD45RBhi初始T-細胞腹腔內注射到Rag1-/-小鼠誘導結腸炎。倉鼠抗-小鼠Tl1aAb(12F6A,梯瓦制藥工業有限公司,北威爾士,賓夕法尼亞)(12F6A,TEVA,NorthWales,Pennsylvania)阻斷Tl1a的功能并按20-或80-mg/kg施用,或者對照免疫球蛋白(Ig)G(Leinco技術公司,圣路易斯,密蘇里州)(LeincoTechnologies,St.Louis,Missouri)按80-mg/kg的劑量一周兩次腹腔內注射到小鼠中,對于長期DSS模型在第15天開始注射,并且對于過繼轉移模型注射在第29天開始注射(圖1A)?;叨哉?RagCo或WTCo)為在DSS治療或過繼轉移初始T-細胞之前進行分析的小鼠。預治療(Pre-Tx)對照為在對于長期DSS模型第14天和對于過繼轉移模型第28天進行分析的小鼠。治療組為在對于長期DSS模型第28天和對于過繼轉移模型第56天進行分析的小鼠(圖1A)。所有小鼠在雪松-西奈醫學中心(Cedars-SinaiMedicalCenter,CSMC)的動物設施(AnimalFacility)中的無特異病原體條件下進行飼養。該研究嚴格按照美國國家衛生研究院的實驗動物管理與使用指南(GuidefortheCareandUseofLaboratoryAnimalsoftheNationalInstitutesofHealth)進行。動物研究由CSMC動物管理與使用委員會批準(AnimalCareandUseCommittee)(方案3813)。

實施例2

疾病活動指數、髓過氧化物酶、宏觀及組織病理學分析

如前所述,對于DSS模型每隔一天確定一次疾病活動指數(DAI)分數,對于過繼轉移模型每周確定兩次DAI分數。使用髓過氧化物酶熒光檢測試劑盒(MyeloperoxidaseFluorometricDetectonKit)根據制造商的方案(恩佐生命科學,普利茅斯密亭,賓夕法尼亞州)(EnzoLifeSciences,PlymouthMeeting,PA)評估髓過氧化物酶活性。使用已確立的分類對炎癥的宏觀證據盲打分。處理組織樣本并由CSMC組織學中心(CSMCHistology-Core)利用蘇木精和伊紅(H&E)染色。使用諾瓦超級金天狼猩紅染色試劑盒(NovaUltraSiriusStainKit)根據制造商的方案(IHCWorld公司,伍德斯托克,馬里蘭州)(IHCWorld,Woodstock,MD)進行天狼猩紅染色。使用驢α-兔IgG和羊α-雞IgY(艾博抗,劍橋,馬薩諸塞州)(Abcam,Cambridge,MA)二抗對用10%福爾馬林固定并用稀釋100倍的α-SMAAb(Abcam)和稀釋2000倍的α-波形蛋白Ab(科文斯,圣地亞哥,加利福尼亞州)(Covance,SanDiego,CA)染色的4μM的冷凍切片進行免疫熒光染色。如前所述,組織病理學分數由兩位受訓動物病理學家(DQS和JC)以盲模式給出。使用萊卡(Leica)TCSSP光譜共聚焦顯微鏡對每只小鼠的每段腸區域在放大200倍下觀察≥5個不同的視野來確定組織學分數和膠原蛋白沉積,并在放大630倍下計算成纖維細胞/肌成纖維細胞數量。

實施例3

Dr3-/-小鼠的產生

與genOway公司(genOway公司,里昂,法國)(genOway,Lyon,France)合作進行Dr3目標載體的克隆和Dr3+/-創始者小鼠的產生。簡單來講,使用來自C57BL/6J小鼠的基因組DNA通過PCR擴增產生包含1.5kb上游外顯子1和3kb下游外顯子8的Dr3內源基因座并克隆到pCR4-TOPO載體(英俊公司,卡爾斯巴德,加利福尼亞州)(Invitrogen,Carlsbad,CA)。隨后,將兩個loxP位點插入Dr3外顯子2至5側翼(圖5A)。將側接有FRT位點的陽性選擇新霉素基因插入到外顯子1和2之間的內含子來產生目標載體(圖5A)。通過限制性分析和測序確認該克隆方法的每個步驟。使所述Dr3基因目標構建體線性化,并通過電穿孔將其轉染至具有C57BL/6J背景的genOway專用胚胎干(ES)細胞。通過G418選擇同源重組體并通過DNA印跡分析確認。將具有正確5’和3’重組的ES克隆顯微注射到C57BL/6J囊胚并引入假孕C57BL/6J小鼠。繁殖雄性嵌合后代以得到種系突變小鼠,然后將其與Flpe缺失小鼠品系繁殖以去除新霉素盒,然后與Cre缺失小鼠繁殖以切除loxP側翼序列(圖5A),通過DNA印跡確認,并維持在C57BL/6J遺傳背景上。

實施例4

表達分析

使用RNeasy微陣列組織微型試劑盒(RNeasyMicroarrayTissueMiniKit)(凱杰公司,巴倫西亞,加利福尼亞州)(Qiagen,Valencia,CA)分離總RNA,并且使用RT2HT第一鏈(RT2HTFirstStrand)進行逆轉錄聚合酶鏈式反應(RT-PCR)并按照制造商方案使用RT2定制纖維化陣列CAPM11248(RT2CustomFibrosisArrayCAPM11248)(Qiagen,Valencia,CA)試劑盒測量基因表達。按照制造商方案使用多重免疫測定,小鼠Th1/Th2/Th17/Th2213叢流式細胞混合試劑盒(MouseTh1/Th2/Th17/Th2213plexKitFlowCytomix)(eBioscience公司,圣地亞哥,加利福尼亞州)(eBioscience,SanDiego,CA)測定細胞因子濃度。確認的Dr3qPCR測定Mm.PT.51.17321439、Il31RaqPCR測定Mm.PT.56a.32787326和β-肌動蛋白qPCR測定Mm.PT.39a.22214843購自IDTTechnologies公司(斯科基,伊利諾州)(Skokie,IL)。

實施例5

細胞分離,培養,細胞內細胞因子表達和流式細胞術

進行固有層單核細胞(LPMC)、腸系膜淋巴結(MLN)和脾細胞的分離和培養以及由抗-CD28和抗-CD3ε對它們進行隨后刺激。對于LPMC分離,本發明人使用整個結腸和回腸的10cm末梢。從在1mMDTT(飛世爾科技,塔斯廷,加利福尼亞州)(FisherScientific,Tustin,CA)中于37℃孵育15min,然后在含有5mMEDTA的1mMDTT(普洛麥格,麥迪遜,威斯康星州)(Promega,Madison,WI)中于37℃孵育30min的結腸分離小鼠原發結腸成纖維細胞。剩余的結腸組織用1xHBSS(康寧公司的品牌為Cellgro的產品,斯韋茲伯勒,新澤西州)(CorningCellgro,Swedesboro,NJ)沖洗,切碎,然后用1.5mg/mL膠原酶II(沃辛頓,萊克伍德,新澤西州)(Worthington,Lakewood,NJ)、0.3mg/mLDNA酶I和3mg/mL透明質酸酶(西格瑪,圣路易斯,密蘇里州)(Sigma,St.Louis,MO)在DMEM(康寧公司的品牌為Cellgro的產品,斯韋茲伯勒,新澤西州)(CorningCellgro,Swedesboro,NJ)中于37℃消化30min。所分離的細胞在補充有10%FCS、青霉素/鏈霉素(100IU/mL)、兩性霉素(0.5μg/mL)的DMEM中培養。原發腸道成纖維細胞在第二代使用。在LSRII流式細胞儀(BD生物科學公司,圣何塞,加利福尼亞州)(BDBiosciences,SanJose,CA)上獲取細胞并使用FlowJo分析軟件分析。

實施例6

離體腸道成纖維細胞增殖和細胞凋亡測定

按照制造商說明書分離原發腸道成纖維細胞并用CellTraceViolet(英俊公司,卡爾斯巴德,加利福尼亞州)(Invitrogen,Carlsbad,CA)染色。之后用100ng/mL的Tl1a將染色的細胞在補充有10%FCS、青霉素/鏈霉素(100IU/mL)和兩性霉素(0.5μg/mL)的DMEM中孵育。48小時后,按照制造商說明書使用膜聯蛋白V細胞凋亡檢測試劑盒(AnnexinVApoptosisDetectionKit)(eBioscience公司,圣地亞哥,加利福尼亞州)(eBioscience,SanDiego,CA)將培養的腸道成纖維細胞染色。膜聯蛋白V染色后,收獲成纖維細胞,洗滌并用2%多聚甲醛固定,用BDLSRII流式細胞儀進行流式細胞術分析并通過FlowJo軟件分析。

實施例7

統計分析

將數據表示為平均值±標準偏差(SD)。在兩組間通過雙尾費舍爾精確檢驗(two-tailedFisher’sExactTest)比較分類變量以及通過學生t-檢驗比較連續變量。根據檢驗假設的實行使用參數檢驗和非參數檢驗。使用方差分析(ANOVA)在三組間進行比較,隨后通過使用圖凱HSD(Turkey’sHSD)和貝倫斯-費舍爾-檢驗(Behrens-fisher-Test)修正的成對事后分析進行多重比較。p<0.05認為是顯著的。

實施例8

Tl1aAb施用減弱疾病活性和已形成的慢性結腸炎的總炎癥

使用Tl1aAb在用初始CD4+CD45RBhiT-細胞過繼轉移的免疫缺陷Rag1-/-小鼠中評估中和Tl1a功能對慢性鼠類結腸炎的影響。轉移后第29天當結腸炎形成時開始按20-和80-mg/kg、每周兩次施用Tl1aAb或按80-mg/kg、每周兩次施用同種型對照Ab(IsoAb)(圖1A)。到第6周以及持續至第8周研究結束,用Tl1aAb處理的小鼠的疾病活動指數(DAI)明顯低于接受IsoAb的小鼠(圖1B)。與IsoAb組相比,在兩種劑量下接受Tl1aAb的小鼠的總結腸炎癥明顯減少(圖1C)。與IsoAb組相比,在Tl1aAb處理的情況下,從腸系膜淋巴結(MLN)和固有層(LP)重新獲得的單核細胞的數量也減少(圖1D)。在Tl1a80-mg/kgAb處理的小鼠中,比Pre-Tx組較輕的總結腸炎癥和明顯減少的LP單核細胞(LPMC)的數量顯示了已形成的結腸炎及細胞浸潤的改善(圖1C和D)。

使用長期DSS結腸炎模型得出類似發現。在這個模型中,在第15天當結腸炎形成時開始按一周兩次施用Tl1aAb(20-mg/kg)(圖1A)。與IsoAb組相比,我們觀察到較低的DAI(圖7A),減少的總炎癥(圖7B),和從MLN和LP中重新獲得的較少的單核細胞(圖7C)。DAI和單核細胞的減少同樣小于Pre-Tx組。這些數據表明用Tl1aAb處理會導致腸內炎癥總指標減少以及炎性細胞積累減少。

實施例9

Tl1aAb施用減輕已形成的鼠類結腸炎的組織病理學特征

在過繼轉移模型中,結腸的組織學檢查顯示,與IsoAb組相比,通過Tl1aAb治療的以細胞浸潤減少、粘蛋白損耗、隱窩膿腫和結構變化為特征的炎癥的減少(圖2A和B)。與4周Pre-Tx組相比,組織學炎癥的減少也明顯降低(圖2A和B),表明炎癥部分解決。一致地,與IsoAb組相比,通過兩種劑量的Tl1aAb施用,以及與Pre-Tx組相比,通過80-mg/kg的Tl1aAb施用,結腸髓過氧化物酶(MPO)活性明顯降低(圖2C)。隨著Tl1aAb劑量當結腸MPO活性降低到與Rag基線對照(RagCo)組沒有明顯差異的水平時提出結腸炎的黏膜分辨率(圖2C)。

類似地,在長期DSS模型中,與IsoAb和Pre-Tx組相比,使用Tl1aAb結腸的組織病理學會有改善(圖8A和B)。盡管通過Tl1aAb處理使組織學炎癥減少,但與基線WTCo組相比,結腸炎癥仍明顯較高(圖8B)。此外,與IsoAb和Pre-Tx組相比,通過Tl1aAb處理結腸MPO活性明顯較低(圖8C)。這些結果表明施用Tl1aAb導致結腸組織病理學正?;?。

實施例10

Tl1aAb抑制Th-1和-17免疫應答

為了評估在兩種致結腸炎模型中降低的已形成的鼠類結腸炎的可能免疫機理,測量Ifnγ、Il13和Il17的表達。在過繼轉移模型中,與IsoAb組和Pre-Tx組相比,Tl1aAb降低在MLN和LPMC中的CD4+Il17+T-細胞的頻率(圖3A和B)。通過兩種劑量的Tl1aAb處理CD4+Ifnγ+T-細胞同樣減少,在LPMC中(按20-mg/kg施用Tl1aAb并沒有導致與Pre-Tx組相比明顯的CD4+Ifnγ+T-細胞減少)除外(圖3A和C)。此外,本發明人還發現在MLN和LPMC中,與Pre-Tx和IsoAb組相比,通過Tl1aAb處理Ifnγ+和Il17+雙陽性CD4+T-細胞明顯減少(圖3B和C,右圖)。使用CD3/CD28刺激的MLN和LPMC細胞,在Tl1aAb處理的小鼠中看到與接受IsoAb的小鼠和預治療組相比更低的Il17產生(圖3D)。除了在MLN以外,兩種劑量下的Tl1aAb處理導致與IsoAb和Pre-Tx組相比較低的Ifnγ分泌(圖3E)。各組之間的CD4+Il13+T-細胞的百分比和Il13產生并無明顯差異。在長期DSS結腸炎模型中,通過Tl1aAb處理在MLN和LPMC中同樣觀察到CD4+Il17+、CD4+Ifnγ+和CD4+Il17+Ifnγ+T-細胞的減少(圖9A-C)。一致地,Tl1aAb處理導致Il17和Ifnγ在分離的用CD3/CD28刺激的MLN和LPMC細胞中的較低產生(圖9D和E)。在長期DSS結腸炎模型中各組之間的CD4+Il13+T-細胞的百分比和Il13產生沒有不同。這些數據表明Tl1aAb降低Th-1和-17促炎免疫應答。

實施例11

Tl1aAb逆轉已形成的結腸纖維化

先前顯示具有組成型Tl1a表達的小鼠形成了增強的腸纖維化。為了評估阻斷Tl1a信號傳導是否可以減少結腸纖維化,我們進行天狼猩紅染色以測量膠原蛋白沉積的程度。本發明人發現,在初始T細胞轉移的第4周之前,與基線RagCo組相比,在Pre-Tx組中膠原蛋白沉積增強(圖4A和C)。在接受對照IsoAb的小鼠中在第8周之前膠原蛋白沉積的程度越來越大。然而,與接受IsoAb的小鼠或Pre-Tx組相比時,Tl1aAb處理導致膠原蛋白沉積的明顯減少(圖4A和C)。值得注意的是,當80mg/kg的Tl1a處理與正常RagCo小鼠相比時膠原蛋白沉積并沒有明顯不同(圖4C)。在長期DSS模型中,與IsoAb或Pre-Tx組相比,通過Tl1aAb處理觀察到類似的膠原蛋白沉積減少(圖4A和C)。此外,Tl1a處理導致膠原蛋白沉積減少到與WT基線對照沒有統計學差異的水平(圖4A和C)。總之,這些數據表明阻斷Tl1a信號傳導將膠原蛋白沉積逆轉到炎癥發作前的相似水平。

實施例12

阻斷Tl1a-Dr3信號轉導減少腸道成纖維細胞和肌成纖維細胞數量

為了開始研究使用Tl1aAb減少膠原蛋白沉積的機理,測量腸道成纖維細胞和肌成纖維細胞的頻率。腸道肌成纖維細胞是涉及腸纖維發生的細胞群。波形蛋白陽性細胞為成纖維細胞,其在α平滑肌肌動蛋白(αSMA)共表達的情況下,代表肌成纖維細胞。所述數據表明初始T-細胞轉移4周后(Pre-Tx組),成纖維細胞和肌成纖維細胞的數量增加(圖4B和D)。在接受IsoAb的小鼠中成纖維細胞和肌成纖維細胞的數量在第8周之前進一步增加。然而,Tl1aAb處理導致成纖維細胞和肌成纖維細胞的數量減少到與正常RagCo相似的水平(圖4B和D)。有趣的是,在接受80-mg/kg的Tl1aAb的小鼠中肌成纖維細胞的減少達到與RagCo小鼠無統計學差異的水平(圖4B和D),表明纖維發生的逆轉。

在長期DSS模型中,當與同種型或Pre-Tx組相比時,通過Ab處理觀察到類似的成纖維細胞和肌成纖維細胞的數量的減少(補充圖4B和D)。與過繼轉移模型一致,通過Tl1aAb處理腸成纖維細胞和肌成纖維細胞的數量的減少達到與WT基線對照無統計學差異的水平(圖10B和D)。

本發明人生成Dr3缺失(Dr3-/-)的小鼠(圖5A和B)來描述腸道成纖維細胞和肌成纖維細胞的數量的減少是否起因于直接Tl1a-Dr3信號傳導。與野生型同窩基線(非結腸炎)小鼠相比在Dr3-/-內腸道成纖維細胞明顯較少(圖5C)。然后,本發明人進行離體CellTraceViolet測定和膜聯蛋白V染色以確定腸道成纖維細胞在WT和Dr3-/-小鼠之間的差異是否分別起因于增殖和/或細胞凋亡。流式細胞術分析通過在WT和Dr3-/-腸道成纖維細胞之間的重疊的CellTraceViolet強度證實顯示相似的增殖速率(圖5D,上圖)。在野生型和Dr3-/-腸道成纖維細胞之間沒有觀察到細胞凋亡速率差異(圖5D,下圖)。

實施例13

通過Tl1aAb治療逆轉纖維發生

為了研究使用Tl1aAb逆轉已形成的腸道纖維化的分子機理,測量膠原蛋白、纖維發生程序介體(mediator)(Tgfβ1、Ctgf、Igf1、Pten和Il31Ra)和涉及細胞外基質(ECM)重構的因素(Mmp和Timp)的表達。在過繼轉移模型和長期DSS模型中都發現較低水平的膠原蛋白表達(本文表1和表2)。觀察到使用Tl1aAb的具有前-纖維化介體(包括在過繼轉移模型和長期DSS模型中的Tgfβ1和Il31Ra以及在過繼轉移模型中的Igf1)的較低表達的纖維發生程序的正?;?表1和表2)。在過繼轉移模型中,通過Tl1aAb施用結締組織生長因子(Ctgf),Tgfβ信號轉導的下游介體的表達與Pre-Tx和IsoAb組相比減少。通過測量金屬蛋白酶(Mmp)和金屬蛋白酶的組織抑制劑(Timp)的表達評估ECM重構。與同種型Ab組相比,在過繼轉移模型(Mmp2、Mmp3;表1)和長期DSS模型(Mmp2、Mmp3、Mmp13;表2)中的Tl1aAb處理的小鼠中涉及ECM降解的基因的表達減少。值得注意的是,在過繼轉移模型(Timp2,表1)和在長期DSS模型(Timp1,Timp2;表2)中,通過Tl1a治療Timp的表達較低。這些結果表明使用Tl1aAb纖維發生程序減少,其導致膠原蛋白合成減少。Mmp和Timp的較低表達可能有助于已形成的ECM組分的強化去除而不是誘導組織損傷。因此,所述數據表明通過Tl1aAb的已形成的纖維化的逆轉可能是纖維發生程序減少和可能Mmp和Timp的減少的凈結果。

實施例14

腸道成纖維細胞表達Dr3并響應Tl1a刺激

本發明人研究了腸道成纖維細胞是否可以在功能上響應直接Tl1a信號傳導。測量了Dr3(唯一已知的Tl1a受體)的mRNA水平,并發現其在WT中以低水平表達而在Dr3缺失初生腸道成纖維細胞中卻沒有(圖6A,上圖)。一致地,免疫熒光染色表明Dr3在WT初生腸道成纖維細胞上表達(圖6A,下圖)。使用流式細胞術,本發明人發現,與無αSMA表達的成纖維細胞相比,Dr3優先在共表達αSMA的成纖維細胞上表達(圖6B)。本發明人接著檢查腸道成纖維細胞是否可以響應Tl1a刺激并用膠原蛋白(Col1a2)和Il31受體(Il31Ra)作為成纖維細胞激活的標志物。本發明人表明Tl1a可劑量依賴性地增加Col1a2和Il31Ra在鼠類初生腸道成纖維細胞中的離體表達(圖6C)。在離體Dr3-/-鼠類腸道成纖維細胞中Col1a2和Il31Ra的遲鈍誘導顯示Tl1a刺激的特異性(圖6D)。這些數據表明腸道成纖維細胞表達Dr3并可以在功能上響應直接Tl1a信號轉導。

實施例15

纖維化介體的表達分析的結果

表1.纖維化介體在過繼轉移結腸炎模型中的表達分析。

ns=不顯著

表2.纖維化介體在DSS模型中的表達分析。

ns=不顯著

實施例16

阻斷TL1A-Dr3信號傳導降低腸道成纖維細胞和肌成纖維細胞的數量–附加結果

結腸肌成纖維細胞為涉及腸纖維發生的細胞群。為了研究使用Tl1aAb的膠原蛋白沉積減少的分子機理,測量了波形蛋白的成纖維細胞的表達以及波形蛋白和α平滑肌肌動蛋白(αSMA)的肌成纖維細胞共表達,以評估這些細胞類型的數量。將初始T-細胞轉移到Pre-Tx和IsoAb組后,結腸成纖維細胞和肌成纖維細胞的數量增加(圖11a)。然而,Tl1aAb治療導致成纖維細胞和肌成纖維細胞的數量減少到與正常RagCo相似的水平(圖11a)。

在長期DSS模型中,與Iso或Pre-Tx組相比,用Tl1aAb處理的小鼠顯示出結腸成纖維細胞和肌成纖維細胞數量的相似的減少(圖11b)。與在過繼轉移模型中觀察到的一致,通過Tl1aAb處理腸成纖維細胞和肌成纖維細胞的數量減少至與WT基線對照無統計學差異的水平(圖11b)。由于在長期DSS結腸炎模型中通過Tl1aAb處理與WTCo組相比仍然有明顯惡化的結腸炎,肌成纖維細胞和成纖維細胞減少的數量與,至少部分,中和Tl1a的直接結果一致,而不僅僅是通過炎癥減少的二次效應。

接下來評估在這些慢性結腸炎的鼠類模型中是否有與纖維化變化相關聯的Dr3表達變化。免疫熒光染色顯示,在過繼轉移和長期DSS結腸炎模型中與基線對照組(RagCo和WTCo)和Tl1aAb處理組相比,Dr3在Pre-Tx和IsoAb組中的表達增加(圖11c,d)。值得注意的是,在Pre-Tx和同種型Ab組中存在Dr3按成纖維細胞的百分比表達(圖11c,d)。實時定量逆轉錄酶-PCR分析表明,在兩種模型中,Dr3在IsoAb組中的表達與在基線對照(RagCo和WTCo)和Tl1aAb治療組中的小鼠相比明顯較高(圖11e)。此外,在過繼轉移和長期DSS結腸炎模型中,Tl1amRNA在IsoAb組中的表達與未發炎對照(RagCo和WTCo)和Tl1aAb處理組相比明顯增加(圖11f)。這些結果與Dr3-Tl1a表達和腸道纖維化的增加之間的直接關系一致。

為了確定腸道成纖維細胞和肌成纖維細胞的數量的減少是否可以起因于直接Tl1a-Dr3信號傳導,生成Dr3缺失(Dr3-/-)小鼠。盡管在高達8周齡的WT或Dr3-/-小鼠中沒有自發結腸炎(圖12a,上圖),但如通過波形蛋白的免疫熒光染色(圖12a,中圖)和每個結腸的總的重新獲得的成纖維細胞的定量(圖12a,下圖)所顯示,與WT同窩小鼠相比,在Dr3-/-中的腸道成纖維細胞明顯較少。通過使用波形蛋白和αSMA的免疫熒光染色(圖12a,中圖)或使用光學顯微鏡檢查(圖12a,下圖),在WT和Dr3-/-成纖維細胞之間沒有形態學差異。使用離體CellTraceViolet測定和膜聯蛋白V染色確定WT和Dr3-/-小鼠之間的腸道成纖維細胞的數量差異是否分別起因于增殖和/或細胞凋亡。流式細胞術分析顯示相似的增殖速率,如用WT和Dr3-/-腸道成纖維細胞之間的重疊的CellTraceViolet強度(圖12b)所證明。在WT和Dr3-/-腸道成纖維細胞之間未觀察到細胞凋亡速率的差異(圖12c)。

實施例17

腸道成纖維細胞表達Dr3和響應TL1A刺激–附加結果

為了確定腸道成纖維細胞是否在功能上響應直接Tl1a信號傳導,測量了Dr3的mRNA水平并發現其在WT中(0.0018±0.001%β-肌動蛋白)以低水平表達,但在Dr3缺失初生腸道成纖維細胞中檢測不到。進行流式細胞術分析確定Dr3是否在波形蛋白+αSMA-成纖維細胞或波形蛋白+αSMA+肌成纖維細胞上表達。所述結果表明,與波形蛋白+αSMA-成纖維細胞相比,Dr3優先在波形蛋白+αSMA+肌成纖維細胞上表達。此外,Dr3表達與肌成纖維細胞上的αSMA水平有直接關聯;在肌成纖維細胞上有較高比例的Dr3表達,有最高的αSMA表達(圖13a)。此外,用αSMA和Dr3免疫染色的分類的αSMA陽性原發腸道成纖維細胞在WT中顯示Dr3的共染色而在Dr3缺陷肌成纖維細胞中無顯示,表明Dr3在αSMA陽性初生腸道成纖維細胞上表達(圖13b)。

為了確定腸道成纖維細胞是否可以響應直接Tl1a刺激,通過加入外源Tl1a蛋白質測量了膠原蛋白(Col1a2,成纖維細胞功能標志物)和Il31Ra(Il31Ra在成纖維細胞上表達)的表達的變化。結果顯示在離體鼠類原發腸道成纖維細胞中Col1a2和Il31Ra表達的Tl1a劑量依賴性增加(圖13c)。在離體Dr3-/-鼠類腸道成纖維細胞中通過Col1a2和Il31Ra的遲鈍Tl1a誘導顯示了Tl1a刺激的特異性(圖13d)。相反,使用已知的成纖維細胞生長因子(Tgfβ和Igf1)或促炎刺激(Tnfα)沒有看到Col1a2或Il31Ra的差異誘導(圖13d)。這些數據表明腸道成纖維細胞表達Dr3并且可在功能上響應直接Tl1a信號傳導。

實施例18

通常

腸道纖維狹窄是嚴重克羅恩氏病的特征。具有特定TNFSF15(基因名稱為TL1A)變體的患者過度表達TL1A并具有較高在小腸中形成狹窄的風險。此外,小鼠中的持續Tl1a表達在致結腸炎情況下導致小腸和大腸纖維狹窄。本發明人確定了是否可以用Tl1a抗體逆轉已形成的鼠類結腸纖維化。由于結締組織生長因子(Ctgf)、Il31Ra、轉化生長因子(Tgf)β1和胰島素樣生長因子-1(Igf1)的較低表達,通過中和Tl1a抗體的治療將結腸纖維化逆轉回原始的發炎前水平。此外,通過中和Tl1a抗體或缺失死亡結構域受體3(Dr3)來阻斷Tl1a功能減少了成纖維細胞和肌成纖維細胞(介導組織纖維化的原發細胞類型)的數量。初生腸道肌成纖維細胞表達Dr3并且通過增加膠原蛋白和Il31Ra表達在功能上響應直接Tl1a信號傳導。這些數據表明TL1A-DR3信號傳導在組織纖維化中的直接作用以及TL1A-DR3信號傳導的調節抑制腸纖維化。

本發明的各種實施方案在以上詳細說明中描述。盡管這些描述直接描述上述實施方案,但應當理解,本領域技術人員可設想本文顯示和描述的具體實施方案的修改和/或變化。任何落在本說明范圍內的此類修改和變化也旨在包括在其中。除非具體說明,發明人的意圖是,為可應用領域的普通技術人員給出說明書和權利要求中的詞和短語的普通和習慣含義。

在申請本申請的同時,本申請人已知的本發明的各種實施方案的上述說明已被提出并旨在用于說明和描述的目的。本描述不旨在窮盡或將本發明限制到所公開的精確形式,并且鑒于上面的教導許多修改和變化是可能的。所描述的實施方案用于解釋本發明的原理及其實際應用,以使本領域其他技術人員利用本發明的不同實施方案和不同的修改以適于預期的特定用途。因此,希望本發明不限于公開的用于實施本發明的特定實施方案。

盡管本發明的特定實施方案已經示出和描述,對本領域技術人員將是顯而易見的是,基于本文的教導,再不背離本發明及其更廣泛的方面的情況下可以進行變化和修改,并且因此,所附權利要求將涵蓋其范圍內所有此類改變和修改如在本發明的真正精神和范圍內。本領域人員將理解的是,一般地,本文使用的術語通常意指“開放的”術語(例如,術語“包括”應該被解釋為“包括但不限于”,術語“具有”應該被解釋為“具有至少”,術語“包括”應該被解釋為“包括但不限于”等)。

關 鍵 詞:
通過 抑制 TL1A 治療 纖維化 炎癥
  專利查詢網所有資源均是用戶自行上傳分享,僅供網友學習交流,未經上傳用戶書面授權,請勿作他用。
關于本文
本文標題:通過抑制TL1A治療纖維化和炎癥.pdf
鏈接地址://www.vmyqew.com.cn/p-6872361.html
關于我們 - 網站聲明 - 網站地圖 - 資源地圖 - 友情鏈接 - 網站客服客服 - 聯系我們

[email protected] 2017-2018 www.vmyqew.com.cn網站版權所有
經營許可證編號:粵ICP備17046363號-1 
 


收起
展開