• / 57
  • 下載費用:30 金幣  

西班牙人vs维戈塞尔塔集锦: 用于產生和使用構象特異性抗體的方法和組合物.pdf

摘要
申請專利號:

维戈塞尔塔vs皇家社会 www.vmyqew.com.cn CN201480015102.9

申請日:

20140314

公開號:

CN105283196A

公開日:

20160127

當前法律狀態:

有效性:

有效

法律詳情:
IPC分類號: A61K38/10 主分類號: A61K38/10
申請人: 貝絲以色列女執事醫療中心
發明人: K.P.盧,X.Z.周
地址: 美國馬薩諸塞州
優先權: 61/792588
專利代理機構: 中國專利代理(香港)有限公司 代理人: 羅文鋒;石克虎
PDF完整版下載: PDF下載
法律狀態
申請(專利)號:

CN201480015102.9

授權公告號:

法律狀態公告日:

法律狀態類型:

摘要

本發明特征在于用于產生和使用構象-特異性抗體或其片段的方法和組合物。

權利要求書

1.一種分離的構象-特異性結合部分,任選地為一種抗體或單克隆抗體,其中所述部分包括一個或多個具有SEQIDNO:1-3的重鏈可變區、或其變體以及一個或多個具有SEQIDNO:4-6的輕鏈可變區、或其變體。2.如權利要求1所述的分離的結合部分,其中所述結合部分包括兩個或更多個具有SEQIDNO:1-3的重鏈可變區、或其變體以及兩個或更多個具有SEQIDNO:4-6的輕鏈可變區、或其變體。3.如權利要求1所述的分離的結合部分,其中所述結合部分包括具有SEQIDNO:1-3的重鏈可變區、或其變體和具有SEQIDNO:4-6的輕鏈可變區、或其變體。4.如權利要求1所述的分離的結合部分,其中所述單克隆抗體包含一個具有SEQIDNO:22的重鏈蛋白序列以及一個具有SEQIDNO:23的輕鏈蛋白序列。5.一種分離的構象-特異性結合部分,任選地為一種抗體或一種單克隆抗體,其中所述結合部分包括一個或多個具有SEQIDNO:7-9的重鏈可變區、或其變體以及一個或多個具有SEQIDNO:10-12的輕鏈可變區、或其變體。6.如權利要求5所述的分離的結合部分,其中所述結合部分包括兩個或更多個具有SEQIDNO:7-9的重鏈可變區、或其變體以及兩個或更多個具有SEQIDNO:10-12的輕鏈可變區、或其變體。7.如權利要求5所述的分離的結合部分,其中所述結合部分包括具有SEQIDNO:7-9的重鏈可變區、或其變體和具有SEQIDNO:10-12的輕鏈可變區、或其變體。8.如權利要求1所述的分離的結合部分,其中所述單克隆抗體包括一個具有SEQIDNO:24的重鏈蛋白序列以及一個具有SEQIDNO:25的輕鏈蛋白序列。9.如權利要求1-8中任一項所述的分離的結合部分,其中所述結合部分特異性地結合到磷酸化-蘇氨酸231-τ蛋白(pT231-τ)的順式構象上。10.如權利要求1-8中任一項所述的分離的結合部分,其中該單克隆抗體是一種單鏈抗體或一種抗體片段。11.如權利要求10所述的分離的結合部分,其中該單克隆抗體是一種嵌合抗體、一種人源化抗體、或一種人抗體。12.一種藥物組合物,該藥物組合物包括如權利要求1-11中任一項所述的結合部分以及一種藥學上可接受的載體。13.一種治療τ蛋白病變、創傷性腦損傷(TBI)、或中風的方法,所述方法包括將如權利要求1-8中任一項所述的結合部分以足以治療所述τ蛋白病變、TBI、或中風的量給予至對其有需要的一位受試者,其中所述結合部分特異性地結合至pT231-τ的順式構象上。14.如權利要求13所述的方法,其中所述τ蛋白病變選自下組,該組由以下各項組成:進行性核上性麻痹、慢性創傷性腦病(CTE)、額顳癡呆、額顳葉變性、帕金森氏病-癡呆-肌萎縮側索硬化復合征、纏結主導型癡呆、腦膜血管瘤病、亞急性硬化性全腦炎、皮克病、皮質基底節變性、和阿爾茨海默病。15.如權利要求13所述的方法,其中所述受試者是有所述τ蛋白病變的傾向或是處于所述τ蛋白病變的一個早期階段。16.如權利要求15所述的方法,其中所述τ蛋白病變的所述傾向或早期階段是通過從所述受試者獲得的樣品中順式pT231-τ的升高的水平或順式:反式pT231-τ的比率的增加確定的。17.如權利要求16所述的方法,進一步包括確定以下各項的水平:CSFt-τ、pT181-τ、Aβ42、或ApoE4水平。18.如權利要求16所述的方法,其中所述樣品選自下組,該組由以下各項組成:尿、血液、血清、血漿、唾液、羊水、和腦脊液(CSF)。19.如權利要求13所述的方法,其中所述受試者有重復腦外傷病史的傾向。20.一種用于在用如權利要求1-8中任一項所述的結合部分治療的受試者中監測治療反應的方法,所述方法包括:a.確定從所述受試者獲得的樣品中順式pT231-τ或順式:反式pT231-τ比率的水平,并且任選地b.確定CSFt-τ、pT181-τ、Aβ42、或ApoE4的水平,其中順式pT231-τ或順式:反式pT231-τ比率的水平的降低導致對所述結合部分的有效治療反應。21.如權利要求20所述的方法,其中CSFt-τ、pT181-τ、Aβ42、或ApoE4的所述水平降低。22.一種診斷受試者為患有τ蛋白病變或具有τ蛋白病變的傾向的方法,所述方法包括:a.確定從所述受試者獲得的樣品中順式pT231-τ或順式:反式pT231-τ比率的水平,b.將所述樣品中順式pT231-τ或順式:反式pT231-τ比率的所述水平與正常參比樣品進行比較,其中與所述正常參比樣品相比順式pT231-τ的升高的水平或順式:反式pT231-τ比率的增加導致診斷所述受試者為患有所述τ蛋白病變,或具有所述τ蛋白病變的傾向,并且c.以足以治療所述τ蛋白病變的量向所述受試者給予如權利要求1-8中任一項所述的結合部分。23.如權利要求20或22所述的方法,其中所述樣品選自下組,該組由以下各項組成:尿、血液、血清、血漿、唾液、羊水、和腦脊液(CSF)。24.一種分離的構象-特異性結合部分,任選地為一種抗體或一種單克隆抗體,其中所述結合部分包括一個或多個具有SEQIDNO:13-15的重鏈可變區、或其變體以及一個或多個具有SEQIDNO:16-18的輕鏈可變區、或其變體。25.如權利要求24所述的分離的結合部分,其中所述結合部分包括兩個或更多個具有SEQIDNO:13-15的重鏈可變區、或其變體以及兩個或更多個具有SEQIDNO:16-18的輕鏈可變區、或其變體。26.如權利要求24所述的分離的結合部分,其中所述結合部分包括具有SEQIDNO:13-15的重鏈可變區、或其變體以及具有SEQIDNO:16-18的輕鏈可變區、或其變體。27.如權利要求24所述的分離的結合部分,其中所述單克隆抗體包含一個具有SEQIDNO:26的重鏈蛋白序列以及一個具有SEQIDNO:27的輕鏈蛋白序列。28.一種分離的構象-特異性結合部分,任選地為一種抗體或一種單克隆抗體,其中所述結合部分包括一個或多個具有SEQIDNO:19-21的輕鏈可變區、或其變體。29.如權利要求28所述的分離的結合部分,其中所述結合部分包括兩個或更多個具有SEQIDNO:19-21的輕鏈可變區、或其變體。30.如權利要求28所述的分離的結合部分,其中所述結合部分包括具有SEQIDNO:19-21的輕鏈可變區、或其變體。31.如權利要求28所述的分離的結合部分,其中所述單克隆抗體包含一個具有SEQIDNO:28的輕鏈蛋白序列。32.如權利要求24-31中任一項所述的分離的結合部分,其中所述結合部分特異性地結合到pT231-τ的反式構象上。33.如權利要求24-31中任一項所述的分離的結合部分,其中該單克隆抗體是一種單鏈抗體或一種抗體片段。34.如權利要求33中任一項所述的分離的結合部分,其中該單克隆抗體是一種嵌合抗體、一種人源化抗體、或一種人抗體。35.一種藥物組合物,該藥物組合物包括如權利要求24-34中任一項所述的結合部分以及一種藥學上可接受的載體。36.一種試劑盒,用于診斷受試者為患有τ蛋白病變或具有τ蛋白病變的傾向,該試劑盒包括:a.特異性地結合到pT231-τ的順式構象上的、如權利要求1-8中任一項所述的結合部分,b.特異性地結合到pT231-τ的反式構象上的、如權利要求24-31中任一項所述的結合部分,以及c.用于使用a.和b.中的結合部分來診斷所述受試者為患有所述τ蛋白病變或具有所述τ蛋白病變的傾向的說明書。

說明書

相關申請的交叉引用

本申請要求2013年3月15日提交的美國臨時申請號61/792,588的申請日的權益,將其全部內容通過引用結合在此。

關于聯邦資助研究的聲明

本發明是通過政府支持在以下基金號下進行的:R01AG039405、R01CA167677、以及R01CA122434。美國政府享有本發明中的某些權利。

發明背景

總體而言,本發明涉及用于產生和使用構象-特異性抗體或其片段的多種方法和組合物。

蛋白質磷酸化作用是關鍵性細胞信號傳導機制,其誘導蛋白質構象變化。例如,緊挨著在脯氨酸殘基之前的特定絲氨酸或蘇氨酸殘基(Ser/Thr-Pro基序)的磷酸化是細胞中的中心調節機制。脯氨酸殘基的獨特立體化學意味著Ser/Thr-Pro基序的肽基-脯氨?;梢圓捎昧街植煌瓜笞刺?即,一種順式構象或一種反式構象)。肽基脯氨?;呈?反式異構酶(PPI酶)特異性地催化Ser/Thr-Pro基序的順式/反式異構化,并且因此調節這些蛋白質在兩個不同的構象之間的結構。

Pin1是特異性催化某些磷酸化的Ser/Thr-Pro(pSer/Thr-Pro)基序的順式/反式異構化的PPI酶。Pin1鑒定為磷酸化-特異性PPI酶導致一種新的信號傳導機制的理解,藉此Pin1在它們的磷酸化后催化地調節其底物的構象以進一步控制蛋白質功能。此外,Pin1由多種機制緊密調節,并且Pin1失調在一些人類疾病中起關鍵作用。

阿爾茨海默病(AD)的患病率到2050在全世界范圍內可能翻兩番,但目前尚沒有有效的治療。腦中的AD標志損傷是由Aβ肽和磷酸化τ(p-τ)的神經原纖維纏結組成的衰老斑。τ-相關病理學(τ蛋白病變(tauopathy))與AD中神經元和記憶的進行性損失相關并且也是無Aβ病理學的許多其他τ蛋白病變的一種限定特征。雖然針對Aβ肽的主動和被動免疫已經達到臨床試驗,對抗p-τ的免疫療法遠遠落在后面。最新發現,針對包含纏結的p-τ表位的主動或被動免疫減少τ聚集體并且在小鼠模型中改善了記憶缺陷,并且τ蛋白病變可在神經元之間擴散疾病,表明p-τ免疫療法是一種有前途的治療AD的新方法。然而,因為神經元功能障礙發生在纏結形成之前很久,一個主要挑戰是僅僅靶向早期致病性事件(這些事件導致AD中的τ蛋白病變和記憶喪失)的免疫療法的開發。

AD的τ蛋白病變中非常早期的事件是尤其對Ser/Thr-Pro基序的τ過度磷酸化,這導致微管破壞和神經毒性。已經發現,τ(pT231-τ)中磷酸化的Thr231-Pro-基序存在于順式和反式兩種不同構象中,并且脯氨酰異構酶Pin1加速其轉化以抑制τ蛋白病變。Pin1-無效(null)小鼠展示年齡依賴性τ蛋白病變,而Pin1過表達抑制AD小鼠模型中的τ蛋白病變。在人類MCI以及AD神經元中,Pin1由多種機制抑制,而預防其下調的Pin1SNP與延遲的AD發作相關聯?;掛丫⑾?,位于19p13.2處的人Pin1與晚發性AD相關聯,pT231-τ在預纏結神經元中位于順序p-τ表位的開始處,并且CSFpT231-τ是一種早期生物標記,它與記憶喪失相關并且追蹤MCI轉化為AD,并且將AD與額顳癡呆(FTD)相區分。因此,pT231-τ在AD中是非常早期的疾病-起始事件。

自戰爭歸來的老兵經歷與眾不同的創傷性腦損傷(TBI),其特征與先前報道的在患有持續多發性腦震蕩的運動員中的神經退行性疾病相同。顯現出在這些人中的TBI可以觸發慢性創傷性腦病(CTE)的發展,這是一種破壞性神經退行性障礙,對此沒有已知的治療。CTE的神經病理學標志是過度磷酸化的τ(p-τ)廣泛地異?;畚窬宋?τ蛋白病變),類似于在阿爾茨海默病(AD)和其他τ蛋白病變中所見的標志性損傷。因此,針對p-τ的免疫療法被證明是用于治療τ蛋白病變的新選擇。更確切地說,在本領域存在著對構象特異性抗體的需求,這些抗體特異性地結合至p-τ的一種順式或反式構象上以靶向導致τ蛋白病變的早期致病性預纏結τ修飾。

發明概述

本發明的特征在于一種分離的構象-特異性結合部分,任選地為一種抗體或一種單克隆抗體,其中該結合部分包括一個或多個具有SEQIDNO:1-3的重鏈可變區、或其變體以及一個或多個具有SEQIDNO:4-6的輕鏈可變區、或其變體。在一個實施例中,該分離的結合部分包括兩個或更多個具有SEQIDNO:1-3的重鏈可變區、或其變體以及兩個或更多個具有SEQIDNO:4-6的輕鏈可變區、或其變體。在一個第二實施例中,該分離的結合部分包括具有SEQIDNO:1-3的重鏈可變區、或其變體以及具有SEQIDNO:4-6的輕鏈可變區、或其變體。在一個第三實施例中,該分離的單克隆抗體包括一個具有SEQIDNO:22的重鏈蛋白序列以及一個具有SEQIDNO:23的輕鏈蛋白序列。

本發明的特征還在于一種分離的構象-特異性結合部分,任選地為一種抗體或一種單克隆抗體,其中該結合部分包括一個或多個具有SEQIDNO:7-9的重鏈可變區、或其變體以及一個或多個具有SEQIDNO:10-12的輕鏈可變區、或其變體。在一個實施例中,該分離的結合部分包括兩個或更多個具有SEQIDNO:7-9的重鏈可變區、或其變體以及兩個或更多個具有SEQIDNO:10-12的輕鏈可變區、或其變體。在一個第二實施例中,該分離的結合部分包括具有SEQIDNO:7-9的重鏈可變區、或其變體以及具有SEQIDNO:10-12的輕鏈可變區、或其變體。在一個第三實施例中,該分離的單克隆抗體包括一個具有SEQIDNO:24的重鏈蛋白序列以及一個具有SEQIDNO:25的輕鏈蛋白序列。

在本發明的一個方面,上述分離的結合部分特異性地結合到磷酸化-蘇氨酸231-τ蛋白(pT231-τ)的順式構象上。在本發明的另一個方面,上述分離的單克隆抗體是單鏈抗體或其抗體片段。在又另一個方面,該分離的單克隆抗體是嵌合抗體、人源化抗體、或人抗體。在本發明的所有方面,將該分離的結合部分配制成藥物組合物,該藥物組合物包括一種藥學上可接受的載體。

在另一個方面,本發明的特征還在于一種用于治療τ蛋白病變、外傷性腦損傷(TBI)、或中風的方法,該方法包括將上述結合部分以足以治療該τ蛋白病變、TBI、或中風的量給予至對其有需要的一位受試者,其中該單克隆抗體特異性地結合至pT231-τ的順式構象上。

本發明的特征進一步在于一種用于在用在此所述的結合部分治療的受試者中監測治療反應的方法,該方法包括:a.)確定從該受試者獲得的樣品中的順式pT231-τ或順式:反式pT231-τ比率的水平,以及任選地b.)確定CSFt-τ、pT181-τ、Aβ42、或ApoE4的水平,其中順式pT231-τ或順式:反式pT231-τ比率的水平的降低導致對該結合部分的有效治療反應,和/或其中CSFt-τ、pT181-τ、Aβ42、或ApoE4的水平降低。

本發明的特征還在于一種診斷受試者患有τ蛋白病變或具有τ蛋白病變的傾向的方法,該方法包括:a.)確定從該受試者獲得的樣品中順式pT231-τ或順式:反式pT231-τ比率的水平,b.)將該樣品中順式pT231-τ或順式:反式pT231-τ比率的水平與正常參比樣品進行比較,其中與該正常參比樣品相比順式pT231-τ的升高的水平或順式:反式pT231-τ比率的增加導致診斷該受試者為患有τ蛋白病變,或具有τ蛋白病變的傾向,并且以足以治療該τ蛋白病變的量向該受試者給予本發明的結合部分,其中該結合部分特異性地結合至順式pT231-τ上。

在本發明的所有方面,該τ蛋白病變選自下組,該組由以下各項組成:進行性核上性麻痹、慢性創傷性腦病(CTE)、額顳癡呆、額顳葉變性、帕金森氏病-癡呆-肌萎縮側索硬化復合征(Lytico-Bodigdisease)、纏結主導型癡呆(tangle-predominantdementia)、腦膜血管瘤病、亞急性硬化性全腦炎、皮克病、皮質基底節變性、和阿爾茨海默病。在某些方面,該受試者有τ蛋白病變的傾向或是處于τ蛋白病變的一個早期階段,其中該τ蛋白病變的傾向或早期階段是通過從該受試者獲得的樣品中順式pT231-τ的升高的水平或順式:反式pT231-τ的比率的增加確定的。在其他方面,τ蛋白病變的傾向或早期階段也是通過CSFt-τ、pT181-τ、Aβ42、或ApoE4的水平確定的。在又另一個方面中,該受試者有重復腦外傷病史的傾向。在本發明的所有方面,該樣品選自下組,該組由以下各項組成:尿、血液、血清、血漿、唾液、羊水、和腦脊液(CSF)。

本發明的特征進一步在于一種分離的構象-特異性結合部分,任選地為一種抗體或一種單克隆抗體,其中該結合部分包括一個或多個具有SEQIDNO:13-15的重鏈可變區、或其變體以及一個或多個具有SEQIDNO:16-18的輕鏈可變區、或其變體。在一個實施例中,該分離的結合部分包括兩個或更多個具有SEQIDNO:13-15的重鏈可變區、或其變體以及兩個或更多個具有SEQIDNO:16-18的輕鏈可變區、或其變體。在一個第二實施例中,該分離的結合部分包括具有SEQIDNO:13-15的重鏈可變區、或其變體以及具有SEQIDNO:16-18的輕鏈可變區、或其變體。在一個第三實施例中,該分離的單克隆抗體包括一個具有SEQIDNO:26的重鏈蛋白序列以及一個具有SEQIDNO:27的輕鏈蛋白序列。

本發明的特征還在于一種分離的構象-特異性結合部分,任選地為一種抗體或一種單克隆抗體,其中該結合部分包括一個或多個具有SEQIDNO:19-21的輕鏈可變區、或其變體。在一個實施例中,該分離的結合部分包括兩個或更多個具有SEQIDNO:19-21的輕鏈可變區、或其變體。在一個第二實施例中,該分離的結合部分包括具有SEQIDNO:19-21的輕鏈可變區、或其變體。在一個第三實施例中,該分離的單克隆抗體包括一個具有SEQIDNO:28的輕鏈蛋白質序列。

在本發明的某一方面,上述分離的結合部分特異性地結合到pT231-τ的反式構象上。在另一個方面,該分離的單克隆抗體是單鏈抗體或其抗體片段。在又另一個方面,該分離的單克隆抗體是嵌合抗體、人源化抗體或人抗體。在另一個方面,將上述結合部分配制成包括一種藥學上可接受的載體的藥物組合物。

最后,本發明的特征還在于一種試劑盒,用于診斷受試者為患有τ蛋白病變或具有τ蛋白病變的傾向,該試劑盒包括:特異性地結合到pT231-τ的順式構象上的、在此所述的結合部分,特異性地結合到pT231-τ的反式構象上的、在此所述的結合部分以及用于使用這些結合部分來診斷該受試者患有τ蛋白病變或具有τ蛋白病變的傾向的說明書。

“佐劑”是指引起免疫系統刺激的一種或多種物質。在此上下文中,佐劑用于增強對一種或多種疫苗抗原或抗體的免疫應答??梢越艏獵詬枰咼韁?、與其組合、或之后給予至受試者。用作佐劑的化學化合物的實例包括,但不局限于、鋁化合物、油、嵌段聚合物、免疫刺激復合物、維生素和礦物質(例如,維生素E、維生素A、硒、以及維生素B12)、QuilA(皂苷)、細菌和真菌細胞壁組分(例如,脂多糖(lipopolysaccaride)、脂蛋白、以及糖蛋白)、激素、細胞因子、和共刺激因子。

“足以...的量”是指當給予到一個患有一種障礙(例如,τ蛋白病變、外傷性腦損傷(TBI)、中風、或其他神經障礙)的受試者時,足以引起與該障礙相關的癥狀的定性或定量減少的量。

“抗體”是指單克隆抗體、多克隆抗體、人源化抗體、嵌合抗體、重組抗體、多特異性抗體、以及抗體片段。該抗體可以是,例如,一種構象-特異性抗體(例如,一種抗體,該抗體結合至Xaa-Pro基序的順式或反式構象上,其中Xaa是一種氨基酸)。一種抗體特異性結合到一種抗原。該抗體還可以是一種非免疫球蛋白結合多肽。

“抗原”是指抗體可以選擇性地結合至其上的一個分子。靶抗原可以是一種蛋白質(例如,一種抗原肽)、碳水化合物、核酸、脂質、半抗原、或其他天然存在的或合成的化合物。靶抗原可以是一種多肽(例如,一種包含Xaa-Pro基序(例如,磷酸化的或未磷酸化的Ser/Thr-Pro基序)的多肽)或肽模擬物(例如,一種包含Xaa-高脯氨酸基序(例如,磷酸化的或未磷酸化的Ser/Thr-高脯氨酸基序)的多肽)?;箍梢越恢摯乖瓚?,以在動物中產生一種免疫應答。

“結合親和力”是指在一個分子(例如抗體)的單一結合位點與其結合配偶體(例如,抗原或抗原肽)之間的總的非共價相互作用的強度。除非另外指明,否則如在此使用,“結合親和力”是指反映在結合對的成員(例如,抗體和抗原)之間的特異性相互作用的固有結合親和力。分子X對于其配偶體Y的親和力通??梢雜山飫氤J?Kd)表示??梢醞ü玖煊蛑幸閻謀曜擠椒ú飭殼綴土?,包括在此描述的那些。低親和力復合物含有一種通常傾向于很容易地與抗原解離的抗體,而高-親和力復合物含有一種通常傾向于保持結合至抗原更長持續時間的抗體。

“結合部分”是指一種抗體(例如,一種多克隆抗體、一種單克隆抗體、一種人源化抗體、一種嵌合抗體),一種人抗體,抗體片段,受體,配體,一種非免疫球蛋白結合多肽,或與靶分子(例如,一種多肽、蛋白質(例如,順式pT231-τ或反式pT231-τ),或包含其的軛合物)或攜帶該靶分子(例如,一種細胞表面抗原,例如,一種受體或配體)的一種細胞或組織特異性地結合的試劑的小分子部分。

“生物樣品”或“樣品”是指固體和流體樣品。生物樣品可以包括細胞、蛋白或細胞膜提取物、血液或生物流體(包括,例如,腹水液或腦液(例如,腦脊液(CSF))。固體生物樣品的實例包括取自以下各項的樣品:糞便、直腸、中樞神經系統、骨、乳腺組織、腎組織(renaltissue)、子宮頸、子宮內膜、頭部或頸部、膽囊、腮腺組織、前列腺、腦、腦垂體、腎臟組織(kidneytissue)、肌肉,食道、胃、小腸、結腸、肝、脾、胰、甲狀腺組織、心臟組織、肺組織、膀胱、脂肪組織、淋巴結組織、子宮、卵巢組織、腎上腺組織、睪丸組織、扁桃體、和胸腺。生物流體樣品的實例包括取自以下各項的樣品:血液、血清、CSF、精液(serum)、前列腺流體、精液(seminalfluid)、尿液、唾液、痰液、粘液、骨髓、淋巴液、和眼淚。樣品可以通過標準方法獲得,包括,例如,靜脈穿刺和手術活檢。在某些實施例中,該生物樣品是一種通過針穿活檢獲得的乳腺、肺、結腸、或前列腺組織樣品。

“構象-特異性抗體”是識別并且特異性地結合至其互補抗原的一種具體構象(例如,一種構象同分異構體或構象異構體)的一種抗體或其片段。例如,如在此所描述,構象特異性抗體可以特異性地結合至Xaa-Pro基序的順式構象(例如,順式pT231-τ),但不會特異性地結合至Xaa-Pro基序的反式構象(例如,反式pT231-τ),其中Xaa是任何氨基酸殘基(例如,絲氨酸或蘇氨酸)。在這種情況下,該構象-特異性抗體對Xaa-Pro基序的順式構象具有比對反式構象高例如至少10至100倍的親和力。相反地,構象-特異性抗體可以特異性地結合至Xaa-Pro基序的反式構象,但不會特異性地結合至Xaa-Pro基序的順式構象,其中Xaa是任的何氨基酸殘基(例如,絲氨酸或蘇氨酸)。在某些實施例中,該Ser/Thr-Pro基序可以是磷酸化的(即,pSer/Thr-Pro)。

“障礙”是指可以根據在此描述的本發明的方法進行治療、抑制、診斷、或者篩選的任何病癥。

“片段”是指一種核酸或多肽(例如,抗體)的一部分,包含該核酸或多肽的整個長度的至少例如10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%或更多。一個核酸片段可以包含例如10、20、30、40、50、60、70、80、90、或100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1100、1200、1300、1400、1500、2000、2500、3000、4000、4500、或5000個核苷酸或更多個核苷酸,直到該核酸全長。一個多肽片段可以包含例如10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、350、400、450、或500個氨基酸或更多個氨基酸,直到該多肽全長??捎糜詒痙⒚韉鬧瘟品椒ǖ鈉偉?,例如,保留生物活性的構象-特異性抗體的片段(例如,結合至一種特異性構象狀態的片段)??梢勻繚詿慫齙囊約叭綾玖煊蛑幸閻畝云謂行奘?。

“人源化抗體”是指一種能夠結合至預定抗原的免疫球蛋白氨基酸序列變體或其片段??固蹇梢院辛礁鑾崍?,連同該重鏈的至少可變結構域??固寤箍梢園ㄖ亓吹腃H1、鉸合部、CH2、CH3、或CH4區。人源化抗體包含一個框架區(FR)和一個互補決定區(CDR),該框架區基本上具有人免疫球蛋白的氨基酸序列,該互補決定區基本上具有非人免疫球蛋白的氨基酸序列。

通常,人源化抗體具有從非人來源引入的一個或多個氨基酸殘基。總體而言,人源化抗體可以包含至少一個、并且通常是兩個可變結構域(例如,Fab、Fab′、F(ab′)2、Fabc、或Fv)的基本上全部,其中CDR區的全部或基本上全部與非人免疫球蛋白的那些相對應,并且FR區的全部或基本上全部與人免疫球蛋白共有序列的那些相對應。人源化抗體可以包含典型地是人免疫球蛋白的免疫球蛋白恒定區(Fc)的至少一部分?!盎ゲ咕齠ㄇ?CDR)”是指在免疫球蛋白輕鏈和重鏈每一者內的可變區中的三個高變序列?!翱蚣芮筆侵肝揮諉庖咔虻鞍濁崍春橢亓吹娜齦弒湫蛄械娜我徊嗌系陌被嶁蛄?。參見,例如,瓊斯(Jones)等人,自然(Nature)321:522-525(1986);理查曼(Riechmann)等人,自然(Nature)332:323-329(1988);和普雷斯塔(Presta),結構生物學新見(Curr.Op.Struct.Biol.)2:593-596(1992),以及美國專利號4,816,567和5,530,101,將它們通過引用結合在此。

如本文使用的,術語“單克隆抗體”指從基本上均質抗體群體中獲得的抗體(即構成群體的單獨抗體是相同的,除了可以少量存在的可能天然存在的突變)。單克隆抗體是高度特異性的,其針對單個抗原性位點。此外,與常規(例如多克隆)抗體制劑(其典型地包括針對不同決定簇(例如,表位)的不同抗體)不同,每種單克隆抗體針對抗原上的單個決定簇。修飾語“單克隆”指示獲得自基本上均質的抗體群體的抗體的特征,并且不應理解為要求通過任何具體方法產生抗體。例如,根據本發明所用的單克隆抗體可通過科勒(Kohler)等人(參見,例如,自然(Nature)256:495,1975)首次描述的雜交瘤方法或可以通過重組DNA方法(參見,例如美國專利號4,816,567)制備?;箍梢允褂美?,在克拉克森(Clackson)等人(自然(Nature)352:624-628,1991)和馬克思(Marks)等人(分子生物學雜志(J.Mol.Biol.)222:581-597,1991)中描述的技術自噬菌體抗體文庫分離單克隆抗體。

“神經障礙”是指由發育異常、障礙、損傷、或毒素導致的神經系統的結構或功能的紊亂。示例性的神經障礙包括阿爾茨海默病(AD)、輕度認知缺損(MCI)、帕金森氏病(PD)、多發性硬化癥(MS)、肌肉營養不良、皮質基底節變性、拳擊員癡呆、唐氏綜合征、額顳癡呆、強直性肌營養不良、尼曼-皮克病、皮克病、朊病毒病、進行性核上性麻痹、亞急性硬化性全腦炎、驚厥性障礙(例如,癲癇)、血管性癡呆、年齡相關性癡呆、頭部創傷、中風、神經纖維瘤、路易小體病、肌萎縮性側索硬化(ALS)、外周神經病、以及黃斑變性。

“藥學上可接受的載體”是指一種載體,其對于所治療的受試者是生理學上可接受的,同時保持與其一起給予的組合物(例如,構象-特異性抗體)的治療特性。一種示例性的藥學上可接受的載體物質是生理鹽水。其他生理學上可接受的載體以及它們的配制品是本領域技術人員已知的并且描述于,例如,雷明頓藥物科學(Remington′sPharmaceuticalSciences)(第20版,A.真納羅(A.Gennaro)編輯),2000,利平科特威廉姆斯&威爾金斯出版社,費城,賓夕法尼亞州(Lippincott,Williams&Wilkins,Philadelphia,PA))。

“蛋白質”、“多肽”、“多肽片段”或“肽”是指多于兩個氨基酸殘基的任何鏈,無論翻譯后修飾(例如,糖基化或磷酸化)、構成一種天然存在的多肽或肽的全部或部分、或構成一種非天然存在的多肽或肽。當已經使用物理的、機械的、或化學方法從細胞成分去除多肽時,一種多肽或肽可以被認為是“分離的”或“基本上純的”。一種“分離的多肽”(例如,一種分離的抗體)、“基本上純的多肽”、或“基本上純的和分離的多肽”典型地被認為是從細胞成分去除的并且是基本上純的(當它按重量計至少60%不含與其天然相關聯的蛋白質和天然存在的有機分子時)。該多肽可以是至少75%、80%、85%、90%、95%、或99%純的(按重量計)。一種基本上純的多肽(例如,一種基本上純的抗體或其片段)可以通過標準技術獲得,例如,通過從一種天然來源(例如,細胞系或生物流體)提取,通過編碼該多肽的重組核酸的表達,或通過化學合成該多肽??梢醞ü魏問實鋇姆椒?,例如柱層析、聚丙烯酰胺凝膠電泳或HPLC分析來測量純度??商媧?,如果已經通過人為干預將多肽改變,或者置于不是它的天然位點的位置,或者如果將它導入一種或多種細胞,那么多肽被認為是分離的。

如上文所定義,本發明的肽和多肽包括所有“模擬物”和“肽模擬物”形式。術語“模擬物”和“肽模擬物”是指一種合成的化學化合物,其具有與本發明的肽(例如抗原性肽)或多肽基本上相同的結構和/或功能特征。該模擬物可以完全是由氨基酸的合成的非天然類似物構成的,或可以是天然氨基酸和氨基酸的非天然類似物的一種嵌合分子。該模擬物還可以具有任何量的保守取代,只要此類取代基本上不改變該模擬物的結構或活性。

“降低”是指引起總體減少20%或更大、50%或更大、或75%、80%、85%、90%、95%、或更大的能力。對于治療應用,“降低”可以是指與這種障礙(例如,τ蛋白病變、TBI、或中風)相關的多肽或蛋白水平的下降。對于診斷或監測應用,“降低”可以是指通過診斷或監測測定檢測的蛋白或核酸水平的下降。

“升高或增加”是指與來自正?;蠆偽妊返畝哉障啾然蟣澩锘虻鞍妝澩锏腦黽?例如,與對照或正常參比樣品相比增加至少2倍,例如從約2倍至約150倍,例如,從5倍至150倍,從5倍至100倍、從10倍至150倍、從10倍至100倍、從50倍至150倍、從50倍至100倍、從75倍至150倍、或從75倍至100倍)?;蟣澩锘虻鞍妝澩锏腦黽踴蚣跎倏墑褂帽玖煊蛑幸閻幕蛟詒疚鬧忻枋齙娜魏斡杏玫姆椒ɡ慈范?例如,如通過PCR、凝膠電泳、ELISA確定的)。

“參比”是指用于比較目的的任何樣品、標準、或水平?!罷2偽妊貳笨梢允且恢秩∽醞皇蓯哉叩腦諞恢終習?例如,τ蛋白病變、外傷性腦損傷(TBI)、中風、或其他神經障礙)發作之前的先有樣品,來自不患有該障礙的受試者、已經成功地治療該障礙的受試者的樣品,或處于已知正常濃度的經純化的參比多肽的樣品?!安偽缺曜薊蛩健筆侵稈萇圓偽妊返囊桓鮒禱蚴?。正常參比標準或水平可以是衍生自正常受試者的一個值或數字,該正常受試者與受試者樣品以至少一種下列標準匹配:年齡、體重、疾病階段、和整體健康狀況。在一個實例中,例如,指示障礙的多肽或指示障礙的多肽構象的正常參比水平是在一個血清樣品中小于5ng/ml、小于4ng/ml、小于3ng/ml、小于2ng/ml,或在一個血清樣品中小于1ng/ml?!把糶圓偽取毖?、標準、或值是源自已知患有一種障礙(例如,τ蛋白病變、TBI、中風、或其他神經障礙)的受試者的樣品、標準、值、或數字,該受試者與受試者樣品以至少一種下列標準匹配:年齡、體重、疾病階段、和整體健康狀況。例如,像針對指示一種障礙的多肽的一個陽性參比值是大于5ng/ml血清、大于10ng/ml血清、大于20ng/ml、大于30ng/ml、大于40ng/ml、或大于50ng/ml血清。

“特異性地結合”是指一種分子(例如,一種抗體)識別并且結合另一種分子(例如,抗原),但基本上并不識別并且結合其他分子。在一個實例中,特異性地結合pT231-τ的順式構象的抗體不特異性地結合pT231-τ的反式構象。如在此使用的,術語“特異性結合”、“特異性地結合至”一種具體分子(例如,多肽、多肽上的一個表位、或多肽構象)或是對這種具體分子“特異性的”可以例如通過以下分子展示,該分子具有對結合至其上的分子至少約10-4M、10-5M、10-6M、10-7M、10-8M、10-9M、10-10M、10-11M、10-12M、或更高的Kd。

術語“特異性地結合”還可以指如下結合,其中一種分子(例如,一種抗體)結合至一種特定多肽(例如,一種含有Xaa-Pro基序的多肽,其中Xaa是任何氨基酸殘基(例如,絲氨酸或蘇氨酸))、一種特定多肽上的一個表位、或一種特定多肽的一種構象(例如,Xaa-Pro基序的順式構象,例如,順式pT231-τ),并且基本上不會結合至任何其他多肽、多肽表位、或多肽構象(例如,Xaa-Pro基序的反式構象,例如,反式pT231-τ)。例如,構象-特異性抗體與例如Ser/Thr-Pro基序的一種構象(例如,順式構象)的親和力可以比與其另一種構象(例如,反式構象)的親和力高至少10至100倍(例如,親和力高101倍、102倍、103倍、104倍、105倍、106倍、107倍、108倍、109倍、或1010倍)。

“受試者”是指哺乳動物,包括但不局限于,人或非人類哺乳動物,如牛、馬、犬、綿羊、或貓。

“治療”是指給予一種用于治療目的的藥物組合物,或向已經患有障礙的受試者給予治療以改善受試者的病癥?!爸瘟痞擁鞍撞”?、TBI、或中風”是指與τ蛋白病變、TBI、或中風相關的癥狀得以例如減輕、降低、治愈,或者處于一種緩解狀態。

“變體CDR”是指CDR可以在單個氨基酸位置(例如,1、2、3、4、5或更多個氨基酸取代)發生改變,或與來自重鏈和輕鏈的不同CDR組合(例如,重鏈中的CDR1和3與輕鏈中的CDR1和2的組合)。此類變體可以具有如在此描述的取代(示例性或優選的)。在此描述的變體CDR將優選地保持所描繪抗體之間保守的殘基同時具有顯示在抗體之間改變的殘基變化。含有變體CDR的結合部分將保持它們特異性地結合如在此描述的p-τ蛋白表位的一種順式(或反式)構象的能力。

本發明的其他特征和優點從以下詳細說明、附圖、和權利要求書將是清楚的。

附圖簡要說明

圖1是一個圖示,顯示在阿爾茨海默病(AD)中針對τ蛋白病變pT231-τ?;さ腜in1-催化的順式至反式異構化,如通過在體外、細胞模型、離體和小鼠模型中操縱Pin1所示,并且分析與AD相關聯的SNP。

圖2是一個圖示,顯示順式-和反式-特異性抗體的發展,揭示了順式而非反式pT231-τ失去正常τ功能且獲得毒性功能,并且是早期致病性構象,在輕度認知缺損(MCI)以及AD中導致τ蛋白病變和記憶喪失。Pin1預防順式pT231-τ的積累(通過將其轉化為非病理性的反式)。

圖3A-3E示出了與順式和反式pT231-τ小鼠單克隆抗體(mAb)的發展相關的數據。使用pT231-Pipτ肽作為一種抗原來免疫小鼠,獲得順式(圖3A、3B)和反式(圖3C)pT231-τ小鼠mAb各自的兩種雜交瘤克隆。圖3D顯示在使用誘導Pin1降解的小分子確認的免疫印跡上,順式和反式mAb識別pT231-τ的能力(Cpd1比Cpd1E更有效力,其中使用非活性Cpd1A類似物作為對照)。圖3E顯示如使用同種型ELISA試劑盒確定的mAb的免疫球蛋白同種型。

圖4A-4I是免疫染色結果,顯示人類AD和CTE發展過程中顯著的順式而非反式p-τ(尤其是在神經炎中)。對相同人腦切片用具有不同IgG亞型的順式和反式mAb進行雙重免疫染色。反式p-τ甚至是在正常對照中定位于非常有限數目的神經元胞體處(B和C),而順式p-τ在AD和CTE的進展期間早早顯現和累積并且定位于神經炎(小圖B、C、E、F、H、和I)。

圖5A-5E是結果,顯示順式和反式mAb定位于預期的神經元區室并且順式mAb以pT231-依賴性方式在體外和離體減少τ水平。在圖5A和5B中,SY5Y細胞用τ和p25/Ckd5進行轉染,隨后將mAb添加到培養基中,之后用抗小鼠抗體進行染色(圍繞圓圈輕輕涂抹)。順式mAb顯示到達神經炎(圖5A)并且反式mAb顯示到達細胞本體(圖5B)。圖5C是一個印跡,示出了只有在p25/Cdk5共轉染于SY5Y細胞中時,順式mAb減少內源和外源τ的τ水平,但不減少T231A水平。圖5D是一個印跡,示出了順式mAb減少離體τ-Tg小鼠腦切片中的τ。圖5E是一種印跡,示出了有或沒有順式或反式mAb時血清耗盡的SY5Y細胞。順式mAb強力地減少順式pT231-τ,而反式mAb減少反式pT231τ。IgG重鏈和輕鏈顯示,順式和反式mAb進入細胞并且肌動蛋白用作上樣對照。

圖6A-6E是結果,顯示順式而非反式mAb強力地抑制由p-τ和血清耗盡誘導的微管破壞和神經毒性。圖6A顯示用p25、Cdk5和τ+GFP轉染的SY5Y細胞,并且圖6B和6C顯示將SY5Y細胞用GFP-τ或T231Aτ突變體轉染,接著添加順式或反式pT231-τmAb,之后針對微管破壞(圖6A)和神經毒性(圖6B)對微管(MT)和細胞核進行免疫染色。在圖6C中通過時程活細胞共聚焦成像確認來自免疫染色的結果。圖6D是免疫染色圖像,針對的是在順式或反式mAb的存在下經受血清耗盡持續72小時的SY5Y細胞的MT。圖6E是細胞形態的免疫染色圖像,顯示在順式或反式mAb的存在下經受血清耗盡持續72小時的SY5Y細胞的神經毒性。

圖7A-7B顯示CSF順式pT231-τ的顯著存在,其中順式/反式比率在AD患者中一致地升高。圖7A顯示在來自8個健康對照和五個晚期AD患者的腦脊液(CSF)中,通過ELISA使用順式-和反式抗體測定的順式和反式pT231-τ。圖7B顯示順式/反式比率(nd:不可檢測的,na:不適用)。

圖8顯示實驗產生的兩種順式mAb(#113,#74)(分別是SEQIDNO:23和25)和兩種反式mAb(#25,#69)(分別是SEQIDNO:27和28)的輕鏈的比對,其中在所述實驗中如先前描述于中村(Nakamura)等人,細胞(Cell)149:232-244,2012中的,將小鼠用74%的順式pT231-Pipτ肽進行免疫。CDR1-3用標記有CDR1-3的框指示。陰影框指示相似的殘基并且空心框指示一致的殘基。

圖9顯示實驗產生的兩種順式mAb(#113,#74)(分別是SEQIDNO:22和24)和一種反式mAb(#25)(SEQIDNO:26)的重鏈的比對,其中在所述實驗中如先前描述于中村(Nakamura)等人,細胞(Cell)149:232-244,2012中的,將小鼠用74%的順式pT231-Pipτ肽進行免疫。CDR1-3用標記有CDR1-3的框指示。陰影框指示相似的殘基并且空心框指示一致的殘基。

圖10是一系列免疫染色的結果,顯示中風后在受損腦區域中的神經元中的顯著的順式而非反式p-τ。將相同的小鼠腦切片用具有不同IgG亞型的順式和反式mAb進行雙重免疫染色。順式p-τ(淺色)僅在受損區域早早顯現,但在非受損區域不顯現。

圖11是一個圖示,顯示了順式pT231-τmAb如何可以用于對TBI/CTe和MCI/AD中的τ蛋白病變的早期診斷和治療。

圖12A-12E是這樣的結果,其顯示順式而非反式mAb有效地中和p-τ誘導微管破壞、神經元死亡、以及神經元脅迫(如營養耗盡)后細胞凋亡的能力。營養耗盡誘導順式而非反式pT231-τ,但這兩種異構體都有效地通過它們各自的mAb處理被去除(圖12A)。順式mAb有效地抑制脅迫-誘導的微管破壞(圖12B)、由活和死細胞染料染色顯示的神經元死亡(圖12C)、以及通過PARP裂解(圖12D)或膜聯蛋白VFCAS(圖12E)的細胞凋亡,而反式mAb增強這些表型。

圖13A和13B是這樣的結果,其顯示順式而非反式mAb完全阻斷分泌的順式p-τ在受體神經元中誘導神經毒性。在營養耗盡后48小時,順式而非反式p-τ被分泌到培養基中(圖13A)。將在48小時收集的細胞培養基用順式或反式mAb或對照進行孵育,隨后使用蛋白G去除該mAb,之后添加到受體神經元持續3天(圖13B)。

圖14是一系列免疫染色的結果,顯示順式而非反式mAb完全阻斷人AD腦裂解物在受體神經元中誘導神經毒性。人AD腦裂解物用順式或反式mAb孵育、隨后使用蛋白G去除該mAb,之后添加到受體神經元持續3天。

圖15A-15D是結果,顯示順式p-τ隨著TBI嚴重性增加并且在TBI小鼠腦中在其他τ表位之前很久顯現。圖15A是一個印跡,表明順式p-τ隨著TBI嚴重性增加,如在采用不同的重物墜落高度造成的TBI之后2周對腦樣品進行的免疫印跡所示。圖15B和圖15C是免疫染色結果,顯示穩健的順式而非反式p-τ以一種時間依賴性方式在TBI后顯現,如針對順式或反式p-τ和DNA通過免疫染色所示。圖15D示出了TBI2周后腦中穩健的順式p-τ而非AT8、TG3、AT100、或PHF1的存在。

圖16A-16C是結果,顯示順式mAb有效地消除順式pT231-τ誘導并且在小鼠腦在單次嚴重TBI之后抑制細胞死亡。IP或IV注射生物素-順式mAb后72小時,針對生物素-順式mAb對小鼠腦切片進行染色(圖16A)。將三只小鼠經受單次嚴重TBI,并用順式mAb或對照IgG每四天一次持續三次進行處理,然后在TBI兩周后針對順式p-τ和總τ(圖16B)或針對裂解的PARP作為細胞凋亡的標記進行免疫印跡(圖16C)。

圖17A和17B是結果,顯示單次嚴重TBI后順式mAb有效地恢復微管破壞、線粒體破壞和強迫性行為缺陷。使小鼠經受單次嚴重TBI并用順式mAb或對照IgG每四天一次共三次持續兩周進行處理以用于電子顯微術分析(圖17A),并且隨后每周一次持續兩個月進行行為測試(圖17B)。

詳細說明

總體而言,本發明涉及用于產生和使用構象-特異性抗體或其片段的多種方法和組合物。我們已經發現,順式而非反式pT231-τ是一個極早期致病性構象,在AD中導致τ蛋白病變和記憶喪失。我們已研發了一種定量ELISA測定以表明,順式p-τ在對照腦脊液(CSF)中不可檢測,順式和反式p-τ兩者在AD中均升高,其中順式水平大大高于反式,并且順式:反式比率是增加的且在AD患者中類似。這些結果連同在此描述的構象-特異性抗體的產生提供了一種新穎的方法來診斷和治療AD和處于早期致病性階段的其他τ蛋白病變(通過檢測順式pT231-τ,采用反式pT231-τ作為內部對照)。

PPI酶和PPI酶底物的順式/反式構象

脯氨酸是一種氨基酸殘基,獨特之處在于其采用順式或反式構象的能力。由于其異構化的相對大的能量屏障(εu=14至24kcalmol-1),非催化性異構化是一個緩慢的過程,但是可以被PPI酶加速。PPI酶有助于蛋白質折疊并且包括,例如,親環蛋白(Cyp)、FK506-結合蛋白(FKBP)和細小蛋白樣PPI酶(例如,Ess1和Pin1)。

Pin1(與NIMA(從未存在于有絲分裂A中)-1具有相互作用的蛋白質)特異性地異構化某些多肽的磷酸化Ser/Thr-Pro(pSer/Thr-Pro)基序,這是重要的,因為脯氨酸-定向激酶(例如,蛋白激酶,磷酸化脯氨酸殘基之前的某些Ser/Thr殘基)并且磷酸酶是構象-特異性的且通常僅作用于反式構象。Pin1具有雙結構域結構,包括一個N-末端WW結構域和一個C-末端PPI酶結構域,并且結構-功能分析已經顯示Pin1針對特異性pSer/Thr-Pro基序的獨特底物特異性是由于由WW結構域和PPI酶結構域兩者提供的相互作用造成的。Pin1的PPI酶活性促進以下項的調節,例如,生長-信號應答、細胞周期進展、細胞脅迫應答、神經元功能和免疫應答。

Pin1的示例性底物(各自包含能夠異構化的基序),列于表1中?;沽諧雋說孜鏌旃夠墓δ芐越峁?。

表1.Pin1底物

還已經論述了磷酸化-獨立的脯氨?;旃夠鬧匾?。例如,PPI酶CypA催化在Crk蛋白的Gly237-Pro238位置處的脯氨?;乃呈?反式異構化。以磷酸化-獨立的方式異構化的其他PPI酶底物包括但不限于,類固醇受體、c-Myb、H3P30、H3P38、Itk、5-羥色胺類型3(5-HT3)受體,噬菌體尖端蛋白G3P、人免疫缺陷病毒-1(HIV-1)病毒顆粒的Gag聚蛋白、細胞內鈣釋放通道、CrkII/CrkL蛋白、中心體蛋白55kDa(Cep55)、逆轉錄病毒Rel蛋白、PKB/Akt、人T細胞白血病病毒類型1(HTLV-1)Tax癌蛋白、Stat3、HER2/Neu、缺刻蛋白(Notch)、FAK、FOXO、PML、C/EBP、以及SMRT。PPI酶活性的失調(例如,PPI酶活性的上調或下調(例如,增加或減少PPI酶活性))可以,例如,導致PPI酶底物中存在的更大順式或反式含量的Ser/Thr-Pro基序,這可影響PPI酶底物的功能并且導致例如,細胞增殖障礙、神經障礙、哮喘、衰老相關障礙和τ蛋白病變的發展(例如,參見圖1和2)。

構象-特異性抗體

本發明描述了用于產生和使用構象-特異性抗體或其片段的方法和組合物。構象-特異性抗體可以,例如,特異性地結合至一種多肽的順式或反式構象上。在一個具體的實施例中,本發明的構象-特異性抗體可以結合至一種多肽(例如,順式pT231-τ或反式pT231-τ)的磷酸化或未磷酸化的Xaa-Pro基序的順式或反式構象上。Xaa-Pro基序可以是一種多肽(例如,一種Pin1底物(例如,pT231-τ))的磷酸化Ser/Thr-Pro基序。一種構象特異性抗體與其抗原(例如,一種Pin1底物,例如pT231-τ)的結合可用于治療、診斷或監測一種障礙或一種障礙的進展。

用于制備和使用用于治療目的的抗體的方法在此進行了描述,并且,例如,描述于在美國專利號6,054,297;5,821,337;6,365,157;和6,165,464、國際申請號PCT/US2012/035473、以及美國專利申請號:13/504,700中,將其通過引用結合在此。

抗原

本發明的構象特異性抗體可以使用免疫原性抗原(例如、抗原肽)產生,免疫原性抗原包含,例如,一種磷酸化的或未磷酸化的Xaa-Pro基序,其中Xaa是固定為一個特定構象(例如,順式或反式構象)或混合的順式和反式構象的任何氨基酸殘基(例如,絲氨酸或蘇氨酸)或能夠順式/反式異構化的任何其他基序或氨基酸序列。例如,本發明的磷酸化或未磷酸化的、含Ser/Thr-Pro的抗原性肽的順式或反式含量可以通過(Z)-和(E)-烯烴模擬物的立體選擇性合成通過斯蒂爾-維蒂希(Still-Wittig)和愛爾蘭-克萊森(Ireland-Claisen)重排(有機化學雜志(J.Org.Chem.),68:2343-2349,2003;通過引用結合在此)固定??商媧?,本發明的磷酸化或未磷酸化的、含Ser/Thr-Pro的抗原性肽的順式或反式含量可以通過用脯氨酸類似物取代脯氨酸氨基酸殘基來增加或固定。脯氨酸類似物包括但不限于高脯氨酸、六氫吡啶羧酸(Pip)、二甲基脯氨酸(DMP)、氮雜環丁烷-2-羧酸(Aze)、叔丁基-L-脯氨酸(TBP)、反式-4-氟-L-脯氨酸(t-4F-Pro)、以及順式-4-氟-L-脯氨酸(c-4F-Pro)。給定抗原的順式或反式含量可以通過,例如,核磁共振(NMR)分析進行分析。

本發明的抗原性肽可以包含一種磷酸化或未磷酸化Xaa-Pro基序,其中Xaa是能夠順式/反式異構化的任何氨基酸殘基(例如,絲氨酸或蘇氨酸)。該抗原性肽可以包含Pin1底物(其實例被提供于表1中)的Xaa-Pro基序的氨基酸殘基,其中該脯氨酸殘基被一個脯氨酸類似物取代。該抗原性肽還可以包含一種全長多肽的Xaa-Pro基序的氨基酸殘基。該抗原性肽可以進一步包含圍繞該全長多肽的Xaa-Pro基序的另外的殘基。例如,該抗原性肽可以包含到全長多肽的Xaa殘基的3-10個氨基酸殘基N-末端以及到全長多肽的脯氨酸的3-10個氨基酸殘基C-末端。本發明的抗原肽可以是,例如,至少4、5、6、7、或8個氨基酸殘基的長度。該抗原性肽可以是8和20個氨基酸殘基之間的長度(例如,8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、或20個氨基酸殘基的長度)或可以是超過20個氨基酸殘基的長度。

通過本領域技術人員已知的多種方法中的任一種可產生和純化此類抗原。通過,例如,固相化學合成、體外轉錄/翻譯、或通過重組技術可以產生和純化抗原性肽??乖噪目梢勻窩〉乇換劑揭恢衷靨宓鞍字噬匣螂目梢圓諍系鞍滓栽黽涌乖???乖噪目梢曰謁怯盞脊瓜?特異性抗體產生的能力進行篩選。在這個方面,此類篩選技術可以包括,但不局限于,酶聯免疫吸附測定(ELISA)、免疫沉淀、或其他免疫測定。

在構象-特異性抗體生產中有用的示例性抗原包括包含一種磷酸化的或未磷酸化的Ser/Thr-高脯氨酸、Ser/Thr-Pip、Ser/Thr-DMP、Ser/Thr-Aze、Ser/Thr-TBP、Ser/Thr-t-4F-Pro、Ser/Thr-c-4F-Pro基序的抗原。此類抗原的具體實例包括,例如,pT668-Pip和pT668-DMPAPP肽(VDAAV-pT668-Pro-EERHLSK)、pT231-Pipτ肽、以及pT231-DMPτ肽(KVAVVR-pT231-Pro-PKSPS)。其他示例性抗原也描述于美國專利申請公開號2008/0058276中,將其通過引用結合在此。此類肽可以用作抗原以產生,例如,多克隆或單克隆抗體(例如,兔或小鼠單克隆抗體)。

在優選實施例中,本發明的抗原將結合至具有以下序列的可變區:

順式mAb-#113

重鏈CDR

CDR1:SYWIH(SEQIDNO:1)

CDR2:VIDPSDSYTRYNQKFKG(SEQIDNO:2)

CDR3:WEVDYWGQGTTLTVSS(SEQIDNO:3)

順式mAb-#113

輕鏈CDR

CDR1:RSSQSLVHSDGNTYLH(SEQIDNO:4)

CDR2:KVSNRFS(SEQIDNO:5)

CDR3:SQSTHVPWT(SEQIDNO:6)

順式mAb-#74

重鏈CDR

CDR1:SGYYWN(SEQIDNO:7)

CDR2:YISYDGSNNYNPSLKN(SEQIDNO:8)

CDR3:LRRDAYWGQGTLVTVSA(SEQIDNO:9)

順式mAb-#74

輕鏈CDR

CDR1:RASQDISNYLN(SEQIDNO:10)

CDR2:YTSRLHS(SEQIDNO:11)

CDR3:QQGNTLPWT(SEQIDNO:12)

反式mAb-#25

重鏈CDR

CDR1:DTYMH(SEQIDNO:13)

CDR2:RIDPANGNTRYDPKFQG(SEWIDNO:14)

CDR3:RVGYYFDYWGQGTTLTVSS(SEQIDNO:15)

反式mAb-#25

輕鏈CDR

CDR1:KSSQSVLYSSDLKNYLA(SEQIDNO:16)

CDR2:WASTRES(SEQIDNO:17)

CDR3:HQYLSSYT(SEQIDNO:18)

反式mAb-#69

輕鏈CDR

CDR1:KSSQSLLYTGNQKNYLA(SEQIDNO:19)

CDR2:WASTRES(SEQIDNO:20)

CDR3:QQYYSYPWT(SEQIDNO:21)

構象特異性抗體的產生和純化

本發明的抗原可用于通過本領域中已知的任何方法產生,例如,單克隆的、多克隆的、嵌合的、人源化的、或重組構象-特異性抗體。這些方法包括由如以下文獻描述的免疫學方法:科勒(Kohler)和米爾斯坦(Milstein)(自然(Nature)256:495-497,1975和歐洲免疫學雜志(Eur.J.Immunol.)6:511-519,1976)以及坎貝爾(Campbell)(“單克隆抗體技術,嚙齒動物和人雜交瘤的產生和表征(MonoclonalAntibodyTechnology,TheProductionandCharacterizationofRodentandHumanHybridomas)”,伯登(Burdon)等人編輯,生化與分子生物學實驗室技術(LaboratoryTechniquesinBiochemistryandMolecularBiology),卷13,愛思唯爾科學出版社(ElsevierSciencePublishers),阿姆斯特丹,1985),連同由休斯(Huse)等人,(science(科學)246:1275-1281,1989)描述的重組DNA方法。

簡言之,本發明的抗原可以與佐劑組合,給予至宿主動物(例如,兔、小鼠、山羊、綿羊、或雞)。此類抗原的給予可以通過多種方法中的任一種來完成,這些方法包括,但不限于,皮下或肌內注射。一旦被給予,監測宿主動物中產生的抗體滴度的結果,這可以通過在本領域中熟知的多種技術中的任何一種來進行(例如,常規抽血),其中分離抗血清(例如,經由離心),并且此后篩選對于例如一種多肽或多肽片段的順式或反式構象具有結合親和力的抗體的存在。篩選所希望的抗體可以通過以下技術完成,包括,例如,放射免疫測定、ELISA、夾心免疫測定、免疫放射測定、凝膠擴散沉淀反應、原位免疫測定(例如,使用膠體金、酶、或放射性同位素標記)、蛋白質印跡、沉淀反應、凝集測定(例如,凝膠凝集測定或血細胞凝集測定)、補體固定測定、免疫熒光測定、蛋白質A測定、以及免疫電泳測定。

可以對從宿主動物得到的抗血清進行親和純化以得出用于本發明的抗體??寡蹇梢醞ü9婕際醮炕?,例如將抗血清引入到一個分離柱中。本發明的這些抗原可以被固定在柱上來分離和純化構象-特異性抗體。例如,一種包含Ser/Thr-DMP基序的抗原肽(用于產生一種順式-特異性抗體)可以被固定在一個柱上并且用于從例如反式構象抗體純化所得順式-特異性抗體。然后可以將該柱洗滌以去除對固定在該柱上的抗原不具有特異性的抗體,其中將剩余的構象-特異性抗體最終從該柱洗脫。然后可以按照本領域技術人員已知的常規實踐儲存分離的構象-特異性抗體。

可替代地,可篩選抗體文庫(例如,天然抗體文庫、合成抗體文庫、半合成抗體文庫,或組合文庫)以用于鑒定構象-特異性抗體。此類文庫可商購自多種來源(例如,劍橋抗體公司(CambridgeAntibody),劍橋,英國,基納塔斯緹斯公司(GenetastixCorporation),太平洋西北部實驗室(PacificNorthwestLaboratory),里奇蘭(Richland),華盛頓特區(Washington),和莫弗西斯公司(MorphoSysAG),慕尼黑(Munich),德國(例如,HuCalGOLD))。參見,例如,美國專利號6,696,248;6,706,484;6,828,422;和7,264,963,將其通過引用結合在此。

可以通過使用本領域技術人員已知的方法中的一種進行抗體文庫的篩選,該方法包括,例如,噬菌體展示、選擇性感染噬菌體、多核糖體技術、和用于酶活性或蛋白質穩定性的測定系統??梢?,例如,通過相對應的核酸序列的測序,通過氨基酸測序、或通過質譜法鑒定具有所希望的特性的抗體。通過用不同序列(例如,隨機序列)代替子-序列并且然后重復該篩選步驟一次或多次進行優化??梢遠哉廡┛固逭攵砸韻孿罱猩稈?,例如,對于一種靶分子(例如,一種靶分子的順式或反式構象)的優化的親和力或特異性、優化的表達量、優化的穩定性、或優化的溶解度。

本發明的構象特異性抗體識別并且特異性地結合至其互補抗原的例如一個特定構象(例如,順式或反式構象)。例如,如在此所描述,該構象特異性抗體可以特異性地結合至一種多肽(例如,Pin1底物的Ser/Thr-Pro基序,例如,pT231-τ)的磷酸化或未磷酸化Xaa-Pro基序的順式構象上,但不會特異性結合于該多肽的磷酸化的或未磷酸化Xaa-Pro基序的反式構象上。在這種情況下,構象-特異性抗體與其抗原之間的Kd是例如至少約10-4M、10-5M、10-6M、10-7M、10-8M、10-9M、10-10M、10-11M、或10-12M或更高。除了結合特異性,構象-特異性抗體與Xaa-Pro基序的一種構象(例如,順式構象)具有比另一種構象(例如,反式構象)高例如至少10至100倍的親和力。該構象-特異性抗體與一種構象(例如,順式構象)的親和力可以比另一種構象(例如,反式構象)高例如,至少103倍、104倍、105倍、106倍、107倍、108倍、109倍、或1010倍。

本發明的特征還在于根據本發明方法開發的、基于若干種新單克隆抗體的抗體。這些抗體的序列,及其互補決定區(CDR)在下文列出。

順式mAb-#113

重鏈CDR

CDR1:SYWIH(SEQIDNO:1)

CDR2:VIDPSDSYTRYNQKFKG(SEQIDNO:2)

CDR3:WEVDYWGQGTTLTVSS(SEQIDNO:3)

SEQIDNO:22(重鏈全長蛋白序列)

MGVSLQLLGTQDLTMRWSCIILFLVATATGVNSQVQLQQPGAELVKPGASVKMSCKASGY

TFTSYWIHWVKQRPGQGLEWIGVIDPSDSYTRYNQKFKGKATLTVDTSSSTAYMQLSSLT

SEDSAVYYCTTWEVDYWGQGTTLTVSSAKTTPPSVYPLAPGSL

SEQIDNO:29(重鏈全長核酸序列)

ATGGGGGTCTCTCTACAGTTACTAGGCACACAGGATCTCACCATGAGATGGAGCTGTATCATCCTCTTCTTGGTAGCAACAGCTACAGGTGTCAACTCCCAGGTCCAACTGCAGCAGCCTGGGGCTGAGCTGGTGAAGCCTGGGGCTTCAGTGAAGATGTCCTGCAAGGCTTCTGGCTACACCTTCACCAGCTACTGGATACACTGGGTGAAGCAGAGGCCTGGACAAGGCCTTGAGTGGATCGGAGTGATTGATCCTTCTGATAGTTATACTAGGTACAATCAAAAGTTCAAGGGCAAGGCCACGTTGACTGTAGACACATCCTCCAGCACAGCCTACATGCAACTCAGCAGCCTGACATCTGAGGACTCTGCGGTCTATTACTGTACAACATGGGAGGTTGACTACTGGGGCCAAGGCACCACTCTCACAGTCTCCTCAGCCAAAACAACACCCCCATCAGTCTATCCCCTGGCCCCTGGAAGCTTGGG

順式mAb-#113

輕鏈CDR

CDR1:RSSQSLVHSDGNTYLH(SEQIDNO:4)

CDR2:KVSNRFS(SEQIDNO:5)

CDR3:SQSTHVPWT(SEQIDNO:6)

SEQIDNO:23(輕鏈全長蛋白序列)

MGTDQSPQAVSSGCLLKMKLPVRLLVLMFWIPASNSDVVMTQTPLSLPVSLGDQASISCR

SSQSLVHSDGNTYLHWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRLE

AEDLGVYFCSQSTHVPWTFGGGTKLEIKRADAAPTVSIFPPSSKLG

SEQIDNO:30(輕鏈全長核酸序列)

ATGGGGACTGATCAGTCTCCTCAGGCTGTCTCCTCAGGTTGCCTCCTCAAAATGAAGTTGCCTGTTAGGCTGTTGGTGCTGATGTTCTGGATTCCTGCTTCCAACAGTGATGTTGTGATGACCCAAACTCCACTCTCCCTGCCTGTCAGTCTTGGAGATCAAGCCTCCATCTCTTGCAGATCTAGTCAGAGCCTTGTCCACAGTGATGGAAACACCTATTTACATTGGTACCTGCAGAAGCCAGGCCAGTCTCCAAAGCTCCTGATCTACAAAGTTTCCAACCGATTTTCTGGGGTCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGATCAGGGACAGATTTCACACTCAAGATCAGCAGACTGGAGGCTGAGGATCTGGGAGTTTATTTCTGCTCTCAAAGTACACATGTTCCGTGGACGTTCGGTGGAGGCACCAAGCTGGAAATCAAACGGGCTGATGCTGCACCAACTGTATCCATCTTCCCACCATCCAGTAAGCTTGGG

順式mAb-#74

重鏈CDR

CDR1:SGYYWN(SEQIDNO:7)

CDR2:YISYDGSNNYNPSLKN(SEQIDNO:8)

CDR3:LRRDAYWGQGTLVTVSA(SEQIDNO:9)

SEQIDNO:24(重鏈全長蛋白序列)

MKVLSLLYLLTAIPGILSDVQLQESGPGLVKPSQSLSLTCSVTGYSITSGYYWNWIRQFP

GNKLEWMGYISYDGSNNYNPSLKNRISITRDTSKNQFFLKLNSVTTEDTATYYCAGLRRD

AYWGQGTLVTVSAAKTTPPSVYPLAPGSL

SEQIDNO:31(重鏈全長核酸序列)

ATGAAAGTGTTGAGTCTGTTGTACCTGTTGACAGCCATTCCTGGTATCCTGTCTGATGTACAGCTTCAGGAGTCAGGACCTGGCCTCGTGAAACCTTCTCAGTCTCTGTCTCTCACCTGCTCTGTCACTGGCTACTCCATCACCAGTGGTTATTACTGGAACTGGATCCGGCAGTTTCCAGGAAACAAACTGGAATGGATGGGCTACATAAGCTACGACGGTAGCAATAACTACAACCCATCTCTCAAAAATCGAATCTCCATCACTCGTGACACATCTAAGAACCAGTTTTTCCTGAAGTTGAATTCTGTGACTACTGAGGACACAGCTACATATTACTGTGCGGGGTTACGACGTGATGCTTACTGGGGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTCTCTGCAGCCAAAACAACACCCCCATCAGTCTATCCACTGGCCCCTGGAAGCTTGGG

順式mAb-#74

輕鏈CDR

CDR1:RASQDISNYLN(SEQIDNO:10)

CDR2:YTSRLHS(SEQIDNO:11)

CDR3:QQGNTLPWT(SEQIDNO:12)

SEQIDNO:25(輕鏈全長蛋白序列)

MMSSAQFLGLLLLCFQGTRCDIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISNYLNWYQQKP

DGTVKLLIYYTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPWTFGG

GTKLEIKRADAAPTVSIFPPSSKLG

SEQIDNO:32(輕鏈全長核酸序列)

ATGATGTCCTCTGCTCAGTTCCTTGGTCTCCTGTTGCTCTGTTTTCAAGGTACCAGATGTGATATCCAGATGACACAGACTACATCCTCCCTGTCTGCCTCTCTGGGAGACAGAGTCACCATCAGTTGCAGGGCAAGTCAGGACATTAGCAATTATTTAAACTGGTATCAGCAGAAACCAGATGGAACTGTTAAACTCCTGATCTACTACACATCAAGATTACACTCAGGAGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGAACAGATTATTCTCTCACCATTAGCAACCTGGAGCAAGAAGATATTGCCACTTACTTTTGCCAACAGGGTAATACGCTTCCGTGGACGTTCGGTGGAGGCACCAAGCTGGAAATCAAACGGGCTGATGCTGCACCAACTGTATCCATCTTCCCACCATCCAGTAAGCTTGGGG

反式mAb-#25

重鏈CDR

CDR1:DTYMH(SEQIDNO:13)

CDR2:RIDPANGNTRYDPKFQG(SEWIDNO:14)

CDR3:RVGYYFDYWGQGTTLTVSS(SEQIDNO:15)

SEQIDNO:26(重鏈全長蛋白序列)

MKCSWVIFFLMAVVTGVTSEVQLQQSGAELVKPGASVKLSCTASGFNIKDTYMHWVKQRP

EQGLEWIGRIDPANGNTRYDPKFQGKATITSDTSSNTAYLQLSSLTSEDTAVYYCARRVG

YYFDYWGQGTTLTVSSAKTTPPSVYPLVPGSL

SEQIDNO:33(重鏈全長核酸序列)

ATGAAATGCAGCTGGGTTATCTTCTTCCTGATGGCAGTGGTTACAGGGGTCACTTCAGAGGTTCAGCTGCAGCAGTCTGGGGCAGAACTTGTGAAACCAGGGGCCTCAGTCAAGTTGTCCTGCACAGCTTCTGGCTTCAACATTAAAGACACCTATATGCACTGGGTGAAGCAGAGGCCTGAACAGGGCCTGGAGTGGATTGGAAGGATTGATCCTGCGAATGGTAATACTAGATATGACCCAAAATTCCAGGGCAAGGCCACTATAACATCAGACACATCCTCCAACACAGCCTACCTGCAGCTCAGCAGCCTGACATCTGAGGACACTGCCGTCTATTACTGTGCTAGGCGGGTGGGGTACTACTTTGACTACTGGGGCCAAGGCACCACTCTCACAGTCTCCTCAGCCAAAACGACACCCCCATCTGTCTATCCCCTGGTCCCTGGAAGCTTGGG

反式mAb-#25

輕鏈CDR

CDR1:KSSQSVLYSSDLKNYLA(SEQIDNO:16)

CDR2:WASTRES(SEQIDNO:17)

CDR3:HQYLSSYT(SEQIDNO:18)

SEQIDNO:27(輕鏈全長蛋白序列)

MESQTQVFLSLLLWVSGTCGNIMMTQSPSSLAVSAGEKVTMSCKSSQSVLYSSDLKNYLA

WYQQKPGQSPTLLIYWASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVQAEDLAVYYCHQYLSS

YTFGGGTKLEIKRADAAPTVSIFPPSSK

SEQIDNO:34(輕鏈全長核酸序列)

ATGGAATCACAGACTCAGGTCTTCCTCTCCCTGCTGCTCTGGGTATCTGGTACCTGTGGGAACATTATGATGACACAGTCGCCATCATCTCTGGCTGTGTCTGCAGGAGAAAAGGTCACTATGAGCTGTAAGTCCAGTCAAAGTGTTTTATACAGTTCAGATCTGAAGAACTACTTGGCCTGGTACCAGCAGAAACCAGGGCAGTCTCCTACACTGCTGATCTATTGGGCATCCACTAGGGAATCTGGTGTCCCTGATCGCTTCACAGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTTACTCTTACCATCAGCAGTGTACAAGCTGAAGACCTGGCAGTTTATTACTGTCATCAATACCTCTCCTCGTACACGTTCGGAGGGGGGACCAAGCTGGAAATAAAACGGGCTGATGCTGCACCAACTGTATCCATCTTCCCACCATCCAGTAAGC

反式mAb-#69

輕鏈CDR

CDR1:KSSQSLLYTGNQKNYLA(SEQIDNO:19)

CDR2:WASTRES(SEQIDNO:20)

CDR3:QQYYSYPWT(SEQIDNO:21)

SEQIDNO:28(輕鏈全長蛋白序列)

MDSQAQVLMLLLLWVSGTCGDIVMSQSPSSLAVSVGEKVTMSCKSSQSLLYTGNQKNYLA

WYQQKPGQSPKLLIYWASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVKAEDLAVYYCQQYYSY

PWTFGGGTKLEIKRADAAPTVSIFPPSSKLG

SEQIDNO:35:(輕鏈全長核酸序列)

ATGGATTCACAGGCCCAGGTTCTTATGTTACTGCTGCTATGGGTATCTGGTACCTGTGGGGACATTGTGATGTCACAATCTCCATCCTCCCTAGCTGTGTCAGTTGGAGAGAAGGTTACTATGAGCTGCAAGTCCAGTCAGAGCCTTTTATATACTGGCAATCAAAAGAACTACTTGGCCTGGTACCAGCAGAAACCAGGGCAGTCTCCTAAACTGCTGATTTACTGGGCATCCACTAGGGAATCTGGGGTCCCTGATCGCTTCACAGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTGTGAAGGCTGAAGACCTGGCAGTTTATTACTGTCAGCAATATTATAGCTATCCGTGGACGTTCGGTGGAGGCACCAAGCTGGAAATCAAACGGGCTGATGCTGCACCAACTGTATCCATCTTCCCACCATCCAGTAAGCTTGGG

因此,本發明的特征在于以上列出的反式或順式特異性抗體(或由其衍生的抗體)在本發明的診斷和治療方法中的用途。例如,本發明特征在于具有以上各抗體重鏈或輕鏈(或兩者)的CDR的一個、兩個、或三個的單克隆(例如,人源化抗體或人抗體)。這些CDR可以并入如在此描述的框架區(例如,人框架)。此外,可以改變這些CDR的(例如,包含1、2、3、4、5、或更多個)氨基酸取代。此類變體可以具有如顯示在下表2中的取代(示例性或優選的):

表2.氨基酸取代

原始殘基 示例性的取代 優選的取代 Ala(A) Val;Leu;Ile Val Arg(R) Lys;Gln;Asn Lys Asn(N) Gln;His;Asp、Lys;Arg Gln Asp(D) Glu;Asn Glu Cys(C) Ser;Ala Ser Gln(Q) Asn;Glu Asn Glu(E) Asp;Gln Asp Gly(G) Ala Ala His(H) Asn;Gln;Lys;Arg Arg Ile(I) Leu;Val;Met;Ala;Phe; Leu Leu(L) Ile;Val;Met;Ala;Phe Ile Lys(K) Arg;Gln;Asn Arg Met(M) Leu;Phe;Ile Leu Phe(F) Trp;Leu;Val;Ile;Ala;Tyr Tyr Pro(P) Ala Ala Ser(S) Thr Thr Thr(T) Val;Ser Ser Trp(W) Tyr;Phe Tyr Tyr(Y) Trp;Phe;Thr;Ser Phe Val(V) Ile;Leu;Met;Phe;Ala; Leu

另外地或可替代地,這些變體可以包含如圖8和9中所述的取代。此類變體將優選地保持所描繪的抗體之間保守的殘基同時具有顯示在抗體之間的改變的殘基變化(例如,該殘基可以是根據上表取代的或是用這些圖中所描繪的替代性殘基取代的)。變體還可以包括重鏈和輕鏈CDR的組合。例如,變體可以包括:重鏈的CDR1和3以及輕鏈的CDR1和3或CDR1和2、或CDR2和3;重鏈的CDR1和2以及輕鏈的CDR1和3或CDR1和2、或CDR2和3;重鏈的CDR2和3以及輕鏈的CDR1和3或CDR1和2、或CDR2和3;輕鏈的CDR1和3以及重鏈的CDR1和3或CDR1和2、和/或CDR2和3;輕鏈的CDR1和2以及重鏈的CDR1和3或CDR1和2、或CDR2和3;輕鏈的CDR2和3以及重鏈的CDR1和3或CDR1和2、或CDR2和3,或其組合。在所有情況下,上述抗體的變體將保持它們特異性地結合如在此描述的pτ蛋白表位的一種順式(或反式)構象的能力。

人源化抗體

本發明包括人源化抗體。各種人源化非人抗體的方法是本領域中已知的。例如,一種人源化抗體可以具有從非人來源引入其的一個或多個氨基酸殘基。這些非人氨基酸殘基通常被稱為“輸入”殘基,它們是典型地取自一種“輸入”可變結構域?;舊峽勺裱綠?Winter)和合作者(瓊斯(Jones)等人,自然(Nature)321:522-5,1986;瑞秋曼(Riechmann)等人,自然(Nature)332:323-7,1988;維霍演(Verhoeyen)等人,科學(Science)239:1534-6,1988)的方法,通過將高變區序列取代為相應的人抗體序列進行人源化。因此,這種“人源化”抗體是嵌合抗體(美國專利號4,816,567),其中基本上小于完整的人可變結構域已經被來自非人物種的相應序列取代。在實踐中,人源化抗體典型地是人抗體,其中至少一些高變區殘基連同其他可變區殘基被來自嚙齒動物抗體中類似位點的殘基取代。

在制備人源化抗體中使用的人可變結構域(重鏈和輕鏈兩者)的選擇對于降低抗原性可能是重要的。根據所謂的“最佳適配”法,嚙齒動物抗體的可變結構域的序列可對照已知人可變結構域序列的整個文庫而篩選。然后將與嚙齒動物最接近的人序列接受為人源化抗體的人框架。參見,例如,西姆斯(Sims)等人,免疫學雜志(J.Immunol.)151:2296-308,1993;喬西亞(Chothia)等人,分子生物學雜志(J.Mol.Biol.)196:901-17,1987。另一種方法使用從具有特定輕鏈或重鏈亞組的所有人抗體的共有序列中衍生的特定框架。該相同的框架可以用于若干種不同的人源化抗體。參見,例如,卡特(Carter)等人,美國國家科學院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)89:4285-9,1992;普雷斯塔(Presta)等人,免疫學雜志(J.Immunol.)151:2623-32,1993。

進一步地,總體上希望的是抗體是人源化,同時保留針對抗原的高親和力和其他有利的生物學特性。為了實現這個目標,根據一種方法,通過使用親本序列和人源化序列的三維模型,分析親本序列和多種概念性人源化產物的過程而制備人源化抗體。三維免疫球蛋白模型通常是可獲得的且是本領域技術人員熟悉的。說明并展示所選擇的候選免疫球蛋白序列的可能三維構象結構的計算機程序是可獲得的。對這些展示的檢驗允許分析殘基在候選免疫球蛋白序列的功能發揮中的可能作用,即,分析影響候選免疫球蛋白結合其抗原的能力的殘基。以這種方式,可以從受體序列和輸入序列選出并且組合FR殘基,從而實現所希望的抗體特征,如對靶抗原增加的親和力。總體而言,這些高變區殘基直接且最重要地涉及抗原結合的影響。

人抗體

可以通過將選自人類-衍生的噬菌體展示文庫的一個或多個Fv克隆可變結構域序列與一個或多個已知的人恒定結構域序列進行組合來構造本發明的人抗體(霍格伯母(Hoogenboom)等人,分子生物學雜志(J.Mol.Biol.)227:381-8,1992;馬克斯(Marks)等人,分子生物學雜志(J.Mol.Biol.)222:581-97,1991)??商媧?,本發明的人單克隆抗體可以通過雜交瘤方法制備。用于產生人單克隆抗體的人骨髓瘤和小鼠-人異源骨髓瘤細胞系中已經被描述于,例如,克佐伯(Kozbor),免疫學雜志(J.Immunol.)133:3001-5,1984;波狄厄(Brodeur)等人,單克隆抗體生產技術和應用(MonoclonalAntibodyProductionTechniquesandApplications),第51-63頁(馬塞爾德克爾公司(MarcelDekker,Inc.),紐約(NewYork),1987);和博納(Boerner)等人,免疫學雜志(J.Immunol.)147:86-95,1991。

現在可能產生在免疫能夠在不存在內源免疫球蛋白產生的情況下產生全套人抗體庫的轉基因動物(例如,小鼠)。例如,已經描述了在嵌合和種系突變小鼠中的抗體重鏈連接區(JH)基因的純合性缺失導致內源抗體產生的完全抑制。將人種系免疫球蛋白基因排列轉移到這樣的種系突變小鼠中將導致在抗原激發后人抗體的產生。參見,例如,雅克博維次(Jakobovits)等人,美國國家科學院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)90:2551-5,1993;雅克博維次(Jakobovits),自然(Nature)362:255-8,1993;布魯格曼(Brüggemann)等人,免疫學年報(YearImmunol.)7:33-40,1993。

基因改組也可以用來從非人(例如、嚙齒動物)抗體獲得人抗體,其中該人抗體具有與起始非人抗體相似的親和力和特異性。根據這種方法(其也稱為“表位印?!?,通過如在此描述的噬菌體展示技術獲得的非人抗體片段的重鏈或輕鏈可變區被全范圍的人V結構域基因取代,產生非人鏈/人鏈scFv或Fab嵌合體群。用抗原進行的選擇導致非人鏈/人鏈嵌合scFv或Fab的分離,其中該人鏈恢復最初噬菌體展示克隆中在移除相應的非人鏈后被破壞的抗原結合位點,即,表位控制(印記)人鏈配偶體的選擇。當重復該過程以替代剩余的非人鏈,獲得一種人抗體(參見PCT公開案WO93/06213)。不同于傳統的通過CDR接枝的非人抗體的人源化,本技術提供了不具有非人來源的FR或CDR殘基的完全人抗體。

抗體片段

本發明的特征還在于包括完整抗體的一個部分、優選包括其抗原結合區的抗體片段??固迤蔚氖道‵ab、Fab′、F(ab′)2、和Fv片段;雙抗體;線性抗體;單鏈抗體分子;和從抗體片段形成的多特異性抗體。

用木瓜蛋白酶消化抗體產生了各自含有單一抗原-結合位點的兩個相同的抗原結合片段(稱為Fab片段)和殘留的“Fc”片段(此名稱反映了其易于結晶的能力)。胃蛋白酶處理得到具有兩個抗原結合位點的F(ab’)2片段,該片段仍能交聯抗原。

Fv是最小抗體片段,其含有完整抗原-結合位點。在一個實施例中,兩鏈Fv種類由緊密非共價締合的一個重鏈可變結構域和一個輕鏈可變結構域的二聚體組成。在一個單鏈Fv(scFv)種類中,一個重鏈以及一個輕鏈可變結構域可以通過一個柔性肽連接物共價連接,使得該輕鏈和重鏈能夠在一個類似于兩鏈Fv種類的“二聚”結構中締合。正是以這種構型,每個可變結構域的三個高變區(HVR)的相互作用以限定VH-VL二聚體表面上的抗原結合位點。總之,六個HVR賦予抗體抗原結合特異性。然而,甚至單個可變結構域(或僅包含3個對抗原有特異性的HVR的半個Fv)具有識別并結合抗原的能力,雖然通常以比完整結合位點更低的親和力進行。

Fab片段包含重鏈和輕鏈可變結構域并且還包含輕鏈的恒定結構域和重鏈的第一恒定結構域(CH1)。Fab’片段與Fab片段的區別在于在包括來自抗體鉸鏈區的一或多個半胱氨酸的重鏈CH1結構域的羧基末端加入幾個殘基。Fab′-SH是本文對于Fab′的命名,其中恒定結構域的一個或多個半胱氨酸殘基攜帶游離巰基。F(ab′)2抗體片段最初是作為Fab′片段對(在其之間有鉸鏈半胱氨酸)生產的??固迤蔚鈉淥劑從σ彩且閻?。

單鏈Fv或scFv抗體片段包含抗體的VH和VL結構域,其中這些結構域存在于單一多肽鏈中。通常,scFv多肽進一步包含在VH和VL結構域之間的一種多肽接頭,該多肽接頭使得scFv形成所希望的用于抗原結合的結構。關于scFv的綜述,參見,例如,普拉克圖恩(Pluckthün),單克隆抗體的藥理學(ThePharmacologyofMonoclonalAntibodies),第113卷,羅森堡(Rosenburg)和摩爾(Moore)編輯,施普林格出版社(Springer-Verlag),紐約,1994),第269-315頁。

雙抗體是具有兩個抗原結合位點的抗體片段,這些片段包含與相同多肽鏈(VH-VL)中的一個輕鏈可變結構域(VL)連接的一個重鏈可變結構域(VH)。通過使用太短以至于不允許在相同鏈上的兩個結構域之間配對的接頭,這些結構域被迫與另一條鏈的互補結構域配對并且產生兩個抗原結合位點。雙抗體可以是二價的或雙特異性的。雙抗體更全面地描述于,例如,歐洲專利號404,097;PCT公開案WO1993/01161;哈得遜(Hudson)等人,自然醫學(Nat.Med.)9:129-34,2003;和霍林格(Hollinger)等人,美國國家科學院院刊(roc.Natl.Acad.Sci.USA)90:6444-8,1993中。三抗體和四抗體還被描述于哈得遜(Hudson)等人,自然醫學(Nat.Med.)9:129-34,2003中。

抗體片段可以通過傳統方法,例如酶消化,或可以通過重組技術產生。在某些情況下存在使用抗體片段,而不是整個抗體的優點。較小尺寸的片段允許快速清除,并且可能會導致改進的實體瘤接觸。關于某些抗體片段的綜述,參見哈得遜(Hudson)等人,自然醫學(Nat.Med.)9:129-134,2003。

已開發了各種技術來產生抗體片段。傳統上,這些片段經由蛋白酶解消化完整抗體而衍生(參見,例如森本(Morimoto)等人,生物化學與生物物理學方法(J.Biochem.Biophys.Methods)24:107-17,1992;以及布倫南(Brennan)等人,科學(Science)229:81-3,1985)。然而,現在可以通過重組宿主細胞直接產生這些片段。所有Fab、Fv和scFv抗體片段都可以表達在大腸桿菌中并且從其分泌,因而允許大量這些片段的容易生產??固迤慰梢源涌固迨刪邐目夥擲???商媧?,可以從大腸桿菌直接回收Fab′-SH片段并且將其以化學方法偶聯以形成F(ab′)2片段(卡特(Carter)等人,生物/技術(Bio/Technology)10:163-7,1992)。在另一種方法中,直接從重組宿主細胞培養物中分離出F(ab′)2片段。包括補救受體結合表位殘基的、具有增加的體內半衰期的Fab和F(ab′)2片段被描述在美國專利號5,869,046中。用于產生抗體片段的其他技術對于技術熟練的行業者將是清楚的。

治療配制品

本發明的構象特異性抗體可以用于治療、抑制、或預防τ蛋白病變、TBI、或中風。這些構象特異性抗體也可以被用來改善τ蛋白病變、TBI、或中風的癥狀。

本發明的構象特異性抗體能被配制和以多種方式給予(例如,針對具體適應癥已知的途徑,包括,但不局限于局部、經口、皮下、支氣管注射、靜脈內、腦內、鼻內、透皮、腹膜內、肌內、肺內、經陰道、經直腸、動脈內、病灶內、腸胃外、腦室內、或眼內給予)。例如,包含構象-特異性抗體的藥物組合物可以處于以下形式:用于口服給予的丸劑、片劑、膠囊、液體、或緩釋片劑;用于靜脈內或皮下給予的一種液體;用于局限性給予(localadministration)的一種聚合物或其他緩釋運載體;或用于局部給予(topicaladministration)的一種軟膏、乳膏、凝膠、液體、或貼片。

構象-特異性抗體的連續全身性輸注或周期性注射可以用來治療或預防τ蛋白病變、TBI、或中風。治療可持續范圍為從一天至該受試者一生的一段時間,例如,1至100天、1至60天,或直至障礙的癥狀減少或除去。劑量取決于障礙的嚴重程度或障礙的癥狀變化?;菏拖低澈桶臚感?、可植入的膜裝置還可用作一種用于遞送本發明的藥物組合物的手段。在另一個實施例中,該組合物是局限性給予,例如,通過吸入,并且這種給予可以周期性地重復。

使用本領域中已知的標準方法通過混合具有所需純度的活性成分與任選的生理學上可接受的載體、賦形劑或穩定劑制備治療配制品(凍干配制品或水性溶液形式)(參見,例如,雷明頓藥物科學(Remington′sPharmaceuticalSciences),第20版,A.真納羅(A.Gennaro)編輯),2000,利平科特威廉姆斯&威爾金斯出版社,費城,賓夕法尼亞州(Lippincott,Williams&Wilkins,Philadelphia,PA)??山郵艿腦靨灝?,例如,鹽水;緩沖液如磷酸鹽、檸檬酸鹽和其他有機酸;抗氧化劑,包括抗壞血酸;低分子量(小于約10個殘基)的多肽;蛋白質,如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白;親水性聚合物如聚乙烯吡咯烷酮;氨基酸,如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸、或賴氨酸;單糖、二糖和其他碳水化合物,包括葡萄糖、甘露糖、或糊精;螯合劑,如EDTA;糖醇,如甘露糖醇或山梨糖醇;成鹽抗衡離子,如鈉;和/或非離子型表面活性劑,如吐溫(TWEEN)TM、普朗尼克類(PLURONICS)TM或PEG。

任選地,但是優選地,該配制品包括一種藥學上可接受的鹽,優選氯化鈉,并且優選處于生理濃度。任選地,本發明的配制品可以含有藥學上可接受的防腐劑。在一些實施例中,防腐劑濃度的范圍是從0.1%至2.0%v/v。適合的防腐劑包括制藥領域中已知的那些。芐醇、苯酚、間甲酚、尼泊金甲酯和尼泊金丙酯是優選的防腐劑。任選地,該本發明的配制品可以包括一種藥學上可接受的表面活性劑。優選的表面活性劑是非離子型洗滌劑。優選的表面活性劑包括吐溫-20和普朗尼克酸(F68)。合適的表面活性劑濃度是,例如,0.005%至0.02%。

將本發明的構象特異性抗體以治療有效的量給予受試者。優選地,這些抗體是通過腸胃外、或靜脈內經連續輸注給予。劑量和給藥方案取決于障礙的嚴重性和受試者的總體健康狀況。所給予的抗體的量典型地是在約0.001至約10mg/kg受試者體重的范圍內,優選0.01至約5mg/kg受試者體重。

對于腸胃外給予,構象-特異性抗體被配制為一種單位劑量可注射形式(例如,溶液、懸浮液或乳液),與一種藥學上可接受的腸胃外運載體結合。此類運載體是固有地無毒和非治療性的。此類運載體的實例包括,例如,水、鹽水、林格氏溶液、右旋糖溶液和5%人血清白蛋白。也可使用非水性運載體,例如固定油和油酸乙酯。脂質體可以用作載體。該運載體可以含有少量的添加劑,例如增強等滲性和化學穩定性的物質(例如,緩沖液和防腐劑)。這些抗體典型地被配制于濃度為約1mg/ml至10mg/ml的此類運載體中。

所需的劑量取決于所選擇的給予途徑;配制品的性質;受試者的障礙的性質;受試者的體型、體重、體表面積、年齡、和性別;正給予的其他藥物;以及受試者的醫師的判斷??悸塹嬌捎枚嚯囊約捌蔚畝嘌院筒煌柰揪兜男什煌?,預期所需劑量的變化很大。例如,預計口服施用要求的劑量比靜脈內注射要大。正如本領域完全領會的,可使用標準經驗性路徑來調整這些劑量水平的變化以進行優化。給予可以是單次或多次(例如,2-、3-、6-、8-、10-、20-、50-、100-、150-、或更多次給予)??梢栽諶魏問焙蚋韙米楹銜?例如,障礙或與該障礙相關的病癥的診斷或檢測之后(例如,使用本領域中已知的或在此描述的診斷方法)或在障礙的診斷之前對一位處于發展該障礙的風險中的受試者進行給予)。將該抗體封裝在一種適合的遞送運載體(例如,聚合微?;蛘嚦芍踩胱爸?中可增加遞送效率,特別是用于口服遞送。

在希望構象-特異性抗體的緩釋給予處于具有適用于需要給予該抗體的任何障礙的治療的釋放特性的配制品形式的情況下,可以考慮該抗體的微膠囊化。已經使用人生長激素(rhGH)、干擾素-(rhIFN-)、白細胞介素-2、以及MNrgp120成功地進行了用于緩釋的多肽的微膠囊化(參見,例如,約翰遜(Johnson)等人,自然·醫學(Nat.Med.)2:795-799,1996;安田(Yasuda),生物醫學理論(Biomed.Ther.),27:1221-1223,1993;霍拉(Hora)等人,生物/技術(Bio/Technology)8:755-7581990;克萊蘭德(Cleland),“使用多乳酸化合物聚乙交酯微球系統進行單次免疫疫苗的設計和生產(DesignandProductionofSingleImmunizationVaccinesUsingPolylactidePolyglycolideMicrosphereSystems)”,“疫苗設計:亞單位和佐劑法(VaccineDesign:TheSubunitandAdjuvantApproach)”鮑威爾(Powell)和紐曼(Newman)編著,普萊南出版社(PlenumPress):紐約(NewYork),第439-462頁,1995;WO97/03692;WO96/40072;WO96/07399;和美國專利號5,654,010,通過引用結合在此)。

這些緩釋配制品可以包括使用聚乳酸羥基乙酸共聚物(PLGA)聚合物開發的那些。PLGA的降解產物,乳酸和羥基乙酸,可以快速自人體清除。此外,這種聚合物的可降解性可以從數月至數年調整,取決于其分子量和組合物(參見,例如,路易斯(Lewis),“生物活性劑從丙交酯/乙交酯聚合物的控釋”,M.蔡辛(M.Chasin)和蘭格博士(Dr.Langer)(編著),作為藥物遞送系統的生物可降解的聚合物(馬塞爾德克爾公司(MarcelDekker,Inc.),紐約,第1-41頁,1990)。

在本發明中使用的抗體還能以形成嵌合分子的方式進行修飾,該嵌合分子包括融合于另一種異源性多肽或氨基酸序列(如一種Fc序列或一種另外的治療分子(例如,一種化療劑))的一種構象特異性抗體。

本發明的構象特異性抗體可以單獨包裝或與其他治療化合物組合為試劑盒。非限制性實例包括,例如,試劑盒,這些試劑盒包含,例如,一種丸劑、兩種丸劑、一種粉末(任選地與一種丸劑或片劑組合)、在一個小瓶中的一種栓劑與一種液體,或兩種局部乳膏。該試劑盒可以包括任選的部件,該任選的部件幫助給予單位劑量至患者,如用于重建粉末形式的小瓶、用于注射的注射器、定制靜脈內注射(IV)遞送系統、或吸入器。另外,單位劑量試劑盒可以含有用于組合物的制備和給予的說明書。該試劑盒可以被制造為用于一個受試者的一個一次性使用單位劑量、用于具體受試者的多劑量(例如,處于恒定劑量或其中單獨化合物的效力可以隨治療進展而變化),或該試劑盒可以包含適合用于給予至多個受試者的多個劑量(例如,“散化包裝”)。這些試劑盒部件可被組裝在紙箱、泡罩包裝、瓶、管、或小瓶中。

適應癥

本發明的抗體對于治療以下障礙是有用的,這些障礙特征在于,例如,病理學高水平的p-τ蛋白的順式或反式構象。這種治療可以用在被鑒定為具有例如病理學高水平的p-τ蛋白的順式或反式構象的患者(例如,通過在此描述的這些方法診斷的那些)或被診斷為患有已知是與此類病理學水平相關的疾病的患者中。此類障礙包括神經障礙,例如,阿爾茨海默病(AD)、輕度認知缺損(MCI)、帕金森氏病(PD)、多發性硬化癥(MS)、肌肉營養不良、皮質基底節變性、拳擊員癡呆、唐氏綜合征、額顳癡呆、強直性肌營養不良、尼曼-皮克病、皮克病、朊病毒病、進行性核上性麻痹、亞急性硬化性全腦炎、驚厥性障礙(例如,癲癇)、血管性癡呆、年齡相關性癡呆、頭部創傷、中風、神經纖維瘤、路易小體病、肌萎縮性側索硬化(ALS)、外周神經病、以及黃斑變性??梢醞ü痙⒚韉目固逯瘟頻鈉淥習ǎ捍瓷誦閱運鶘?TBI)、慢性創傷性腦病(CTE)、進行性核上性麻痹、額顳葉變性、帕金森氏病-癡呆-肌萎縮側索硬化復合征、纏結主導型癡呆、腦膜血管瘤病、亞急性硬化性全腦炎。

診斷

本發明特征在于用來治療、診斷、和監測在此所述的一種障礙(例如,τ蛋白病變、TBI、或中風)的進展的方法和組合物。這些方法和組合物可以包括以下的檢測和測量:例如,含有一種磷酸化Ser/Thr-Pro基序的Pin1底物(或其任何片段或衍生物,例如,pT231-τ),所述底物處于順式或反式構象(例如,順式pT231-τ和/或反式pT231-τ)。這些方法可以包括與正常參比相比對處于順式或反式構象的pT231-τ的絕對水平的測量。例如,小于5ng/ml、4ng/ml、3ng/ml、2ng/ml、或小于1ng/ml血清的、處于順式或反式構象的pT231-τ的血清水平在診斷患有一種障礙(例如,一種τ蛋白病變)的患者中被認為預示出良好結果。大于5ng/ml、10ng/ml、20ng/ml、30ng/ml、40ng/ml、或50ng/ml的、處于順式或反式構象的底物的血清水平在已經被診斷患有一種障礙的受試者中被認為診斷出較差結果。

對于基于處于具體構象的底物(例如,處于順式或反式構象的一種pT231-τ)的相對水平進行的診斷,一個患有一種障礙(例如,一種τ蛋白病變)的受試者將顯示處于例如順式構象的底物的量的改變(例如,增加10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、或更多)或順式和反式構象之間比率的改變。正常參比樣品可以是,例如,在該障礙或表明該障礙的癥狀的發展之前取自同一受試者的先有樣品,來自不患有該障礙的受試者的樣品,來自不具有該障礙的癥狀的受試者的樣品,或以已知正常濃度處于給定構象(即,不指示該障礙)的經純化的參比多肽的樣品。

本發明的特征還在于受試者的輕度認知缺損(MCI)τ蛋白病變(例如,AD、CTE)、或TBI的早期診斷或傾向。這些方法和組合物包括順式pT231-τ和順式:反式pT231-τ比率的檢測和測量。升高水平的順式pT231或順式:反式比率將指示受試者是處于AD的風險中并且這樣一個受試者群體將受益于在此描述的順式pT231-τ靶向免疫療法。本發明的早期診斷和監測方法也可用于評估患者在潛在臨床試驗中的治療反應。順式:反式pT231-τ比率降低將指示該治療有效于靶向MCI、τ蛋白病變(例如,AD、CTE)、或TBI。此類早期診斷可以在神經障礙的任何癥狀已經呈現(例如,在已知或疑似具有腦外傷(例如,重復腦外傷)或神經疾病家族史的患者中)之前進行。

標準方法可以用來測量任何體液中的底物水平,包括,但不限于,尿、血液、血清、血漿、唾液、羊水、或腦脊液(CSF)。此類方法包括免疫測定、ELISA、蛋白質印跡、以及定量酶免疫測定技術。

出于診斷目的,可以標記構象特異性抗體??固宓謀曇侵莢諍峭ü劑?例如,物理連接)可檢測物質至抗體進行的抗體的直接標記,連同通過使抗體與另一種直接標記的試劑發生反應進行的該抗體的間接標記。例如,可以將該抗體標記有一種放射性或熒光標記,該放射性或熒光標記在受試者中的存在和定位可以通過標準的成像技術檢測。

在此描述的診斷方法可以單獨使用或與在此描述的任何其他診斷方法組合使用,以用于更準確地診斷障礙(例如,一種τ蛋白病變)的存在或嚴重性。用于診斷此類障礙的另外的方法的實例包括,例如,確定其他生物標記(例如,CSFt-τ、pT181-τ、Aβ42、或ApoE4)的水平、檢查受試者的健康史、組織的免疫組織化學染色、計算機斷層攝影(CT)掃描、或培養生長。

診斷試劑盒

本發明還提供了一種診斷測試試劑盒。例如,一種診斷測試試劑盒可以包括多肽(例如,特異性地結合至順式pT231-τ或反式pT231-τ、其片段的構象特異性抗體)和用于檢測和/或評估該多肽(例如,抗體)和p-τ蛋白之間的結合的部件??商媧?,該試劑盒可以包括順式pT231-τ或反式pT231-τ多肽或順式pT231-τ或反式pT231-τ片段,以用于檢測存在于受試者樣品的血清、血液、或CSF中的順式pT231-τ或反式pT231-τ。在另一個實例中,本發明的診斷試劑盒可以用來鑒別順式pT231-τ或反式pT231-τ多肽水平相對于一個參比(例如存在于一種正常對照中的水平)的改變。這樣一種試劑盒可以包括一個參比樣品或指示陽性參比或正常對照參比的標準曲線。

為了檢測,將該抗體或該順式pT231-τ或反式pT231多肽進行標記,并且該抗體或順式pT231-τ或反式pT231多肽進行底物結合,使得可以在抗體和順式pT231-τ或反式pT231多肽之間結合之后,通過確定附接至該底物的標記的量確立多肽-抗體相互作用。常規的免疫測定(例如,ELISA)可以用于檢測抗體-底物相互作用并且可以配備有本發明的試劑盒。本發明的多肽可以在生物樣品,例如血液、血漿、CSF、或血清中檢測。

該診斷試劑盒可以包括用于使用該試劑盒的說明書。在一個實例中,該試劑盒包括用于使用該試劑盒以診斷τ蛋白病變(例如、AD、CTE)、TBI、和/或MCI、或處于發展它們的風險的說明書。在又另一個實例中,該試劑盒包括用于使用該試劑盒以監測治療性治療、劑量方案、或處于發展一種τ蛋白病變(例如,AD、CTE)、TBI、和/或MCI的風險中的受試者的說明書。

受試者監測

在此描述的診斷方法也可以用來在治療期間監測障礙的進展(例如,MCI、TBI、τ蛋白病變(例如,AD、CTE))或用來確定治療化合物的劑量。在一個實施例中,例如,反復測量處于順式或反式構象的、具有Ser/Thr-Pro基序的多肽(例如,pT231-τ)的水平,作為診斷該障礙和監測該障礙的治療或管理的方法。為了監測受試者體內障礙的進展,可以將受試者樣品在若干個時間點獲得并且然后可以進行比較。例如,診斷方法可以用于在治療之前、期間、和之后監測受試者。在這個實例中,使用本發明的構象-特異性抗體密切監測受試者中處于順式構象的pT231-τ的水平,并且,如果處于順式構象的pT231-τ的水平在治療期間開始降低,可以修改用于治療該障礙的治療方案,如通過臨床醫師確定(例如,可以改變治療劑量或可以給予不同的治療劑)。本發明的監測方法也可以用于,例如,在受試者中評估一種具體藥物或療法的效力,確定劑量,或評估感染的進展、狀態、或階段。

實例

實例1:順式和反式pT231-τ小鼠單克隆抗體(mAb)的產生和其DNA序列的確定

為了開發順式和反式pT231-τ小鼠mAb,如先前描述于中村(Nakamura)等人,細胞(Cell)149:232-244,2012中的,用74%的順式pT231-Pipτ肽進行小鼠免疫。該方法產生480種雜交瘤克隆,然后將這些克隆進行表征。在通過ELISA,使用pT231-τ肽(這些肽都是野生型順式+反式(pT231-Pro)、鎖定為順式(pT231-Dmp)或反式(pT231-Ala)或非磷酸化(T231-Pro),描述于中村(Nakamura)等人,細胞(Cell)149:232-244,2012中)篩選的第一批96種雜交瘤培養上清液中,鑒別出兩種順式雜交瘤克隆,#113和#74,它們識別野生型和順式pT231-τ肽,但既不識別反式也不識別非磷酸化肽(圖3A、3B);鑒別出兩種反式雜交瘤克隆,#25和#69,它們識別野生型和反式pT231-τ肽,但既不識別順式也不識別非磷酸化肽(圖3C)。包括mAb重鏈和輕鏈的CDR的核酸和蛋白序列如下所示。此外,順式是穩定的并且反式被降低,如通過在用Pin1抑制劑、Cpd1和更低活性的1E處理的細胞中,用無活性Cpd1A作為對照分別對順式mAb-#113和反式mAb-#25檢測的(圖3D)。圖3E顯示mAb的IgG亞類,如使用同種型ELISA試劑盒(伊格爾公司(Eagle))確定的。使用5′RACERT-PCR技術確定這些mAb的重鏈和輕鏈的DNA序列,如在布拉德伯里(Bradbury)等人,老化神經生物學(NeurobiolAging)16:465-475,1995中所述。BLAST搜索顯示,這四個mAb克隆是完全新穎的。預測的蛋白序列在框架區內是高度保守的,在互補決定區(CDR)1-3中存在明顯不同(圖8和9)。值得注意地是,兩個順式mAb克隆包含兩個反式mAb中不存在的一些保守的殘基,并且反之亦然(圖8和9)。

順式mAb-#113

重鏈CDR

CDR1:SYWIH(SEQIDNO:1)

CDR2:VIDPSDSYTRYNQKFKG(SEQIDNO:2)

CDR3:WEVDYWGQGTTLTVSS(SEQIDNO:3)

SEQIDNO:22(重鏈全長蛋白序列)

MGVSLQLLGTQDLTMRWSCIILFLVATATGVNSQVQLQQPGAELVKPGASVKMSCKASGY

TFTSYWIHWVKQRPGQGLEWIGVIDPSDSYTRYNQKFKGKATLTVDTSSSTAYMQLSSLT

SEDSAVYYCTTWEVDYWGQGTTLTVSSAKTTPPSVYPLAPGSL

SEQIDNO:29(重鏈全長核酸序列)

ATGGGGGTCTCTCTACAGTTACTAGGCACACAGGATCTCACCATGAGATGGAGCTGTATCATCCTCTTCTTGGTAGCAACAGCTACAGGTGTCAACTCCCAGGTCCAACTGCAGCAGCCTGGGGCTGAGCTGGTGAAGCCTGGGGCTTCAGTGAAGATGTCCTGCAAGGCTTCTGGCTACACCTTCACCAGCTACTGGATACACTGGGTGAAGCAGAGGCCTGGACAAGGCCTTGAGTGGATCGGAGTGATTGATCCTTCTGATAGTTATACTAGGTACAATCAAAAGTTCAAGGGCAAGGCCACGTTGACTGTAGACACATCCTCCAGCACAGCCTACATGCAACTCAGCAGCCTGACATCTGAGGACTCTGCGGTCTATTACTGTACAACATGGGAGGTTGACTACTGGGGCCAAGGCACCACTCTCACAGTCTCCTCAGCCAAAACAACACCCCCATCAGTCTATCCCCTGGCCCCTGGAAGCTTGGG

順式mAb-#113

輕鏈CDR

CDR1:RSSQSLVHSDGNTYLH(SEQIDNO:4)

CDR2:KVSNRFS(SEQIDNO:5)

CDR3:SQSTHVPWT(SEQIDNO:6)

SEQIDNO:23(輕鏈全長蛋白序列)

MGTDQSPQAVSSGCLLKMKLPVRLLVLMFWIPASNSDVVMTQTPLSLPVSLGDQASISCR

SSQSLVHSDGNTYLHWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRLE

AEDLGVYFCSQSTHVPWTFGGGTKLEIKRADAAPTVSIFPPSSKLG

SEQIDNO:30(輕鏈全長核酸序列)

ATGGGGACTGATCAGTCTCCTCAGGCTGTCTCCTCAGGTTGCCTCCTCAAAATGAAGTTGCCTGTTAGGCTGTTGGTGCTGATGTTCTGGATTCCTGCTTCCAACAGTGATGTTGTGATGACCCAAACTCCACTCTCCCTGCCTGTCAGTCTTGGAGATCAAGCCTCCATCTCTTGCAGATCTAGTCAGAGCCTTGTCCACAGTGATGGAAACACCTATTTACATTGGTACCTGCAGAAGCCAGGCCAGTCTCCAAAGCTCCTGATCTACAAAGTTTCCAACCGATTTTCTGGGGTCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGATCAGGGACAGATTTCACACTCAAGATCAGCAGACTGGAGGCTGAGGATCTGGGAGTTTATTTCTGCTCTCAAAGTACACATGTTCCGTGGACGTTCGGTGGAGGCACCAAGCTGGAAATCAAACGGGCTGATGCTGCACCAACTGTATCCATCTTCCCACCATCCAGTAAGCTTGGG

順式mAb-#74

重鏈CDR

CDR1:SGYYWN(SEQIDNO:7)

CDR2:YISYDGSNNYNPSLKN(SEQIDNO:8)

CDR3:LRRDAYWGQGTLVTVSA(SEQIDNO:9)

SEQIDNO:24(重鏈全長蛋白序列)

MKVLSLLYLLTAIPGILSDVQLQESGPGLVKPSQSLSLTCSVTGYSITSGYYWNWIRQFP

GNKLEWMGYISYDGSNNYNPSLKNRISITRDTSKNQFFLKLNSVTTEDTATYYCAGLRRD

AYWGQGTLVTVSAAKTTPPSVYPLAPGSL

SEQIDNO:31(重鏈全長核酸序列)

ATGAAAGTGTTGAGTCTGTTGTACCTGTTGACAGCCATTCCTGGTATCCTGTCTGATGTACAGCTTCAGGAGTCAGGACCTGGCCTCGTGAAACCTTCTCAGTCTCTGTCTCTCACCTGCTCTGTCACTGGCTACTCCATCACCAGTGGTTATTACTGGAACTGGATCCGGCAGTTTCCAGGAAACAAACTGGAATGGATGGGCTACATAAGCTACGACGGTAGCAATAACTACAACCCATCTCTCAAAAATCGAATCTCCATCACTCGTGACACATCTAAGAACCAGTTTTTCCTGAAGTTGAATTCTGTGACTACTGAGGACACAGCTACATATTACTGTGCGGGGTTACGACGTGATGCTTACTGGGGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTCTCTGCAGCCAAAACAACACCCCCATCAGTCTATCCACTGGCCCCTGGAAGCTTGGG

順式mAb-#74

輕鏈CDR

CDR1:RASQDISNYLN(SEQIDNO:10)

CDR2:YTSRLHS(SEQIDNO:11)

CDR3:QQGNTLPWT(SEQIDNO:12)

SEQIDNO:25(輕鏈全長蛋白序列)

MMSSAQFLGLLLLCFQGTRCDIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISNYLNWYQQKP

DGTVKLLIYYTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPWTFGG

GTKLEIKRADAAPTVSIFPPSSKLG

SEQIDNO:32(輕鏈全長核酸序列)

ATGATGTCCTCTGCTCAGTTCCTTGGTCTCCTGTTGCTCTGTTTTCAAGGTACCAGATGTGATATCCAGATGACACAGACTACATCCTCCCTGTCTGCCTCTCTGGGAGACAGAGTCACCATCAGTTGCAGGGCAAGTCAGGACATTAGCAATTATTTAAACTGGTATCAGCAGAAACCAGATGGAACTGTTAAACTCCTGATCTACTACACATCAAGATTACACTCAGGAGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGAACAGATTATTCTCTCACCATTAGCAACCTGGAGCAAGAAGATATTGCCACTTACTTTTGCCAACAGGGTAATACGCTTCCGTGGACGTTCGGTGGAGGCACCAAGCTGGAAATCAAACGGGCTGATGCTGCACCAACTGTATCCATCTTCCCACCATCCAGTAAGCTTGGGG

反式mAb-#25

重鏈CDR

CDR1:DTYMH(SEQIDNO:13)

CDR2:RIDPANGNTRYDPKFQG(SEWIDNO:14)

CDR3:RVGYYFDYWGQGTTLTVSS(SEQIDNO:15)

SEQIDNO:26(重鏈全長蛋白序列)

MKCSWVIFFLMAVVTGVTSEVQLQQSGAELVKPGASVKLSCTASGFNIKDTYMHWVKQRP

EQGLEWIGRIDPANGNTRYDPKFQGKATITSDTSSNTAYLQLSSLTSEDTAVYYCARRVG

YYFDYWGQGTTLTVSSAKTTPPSVYPLVPGSL

SEQIDNO:33(重鏈全長核酸序列)

ATGAAATGCAGCTGGGTTATCTTCTTCCTGATGGCAGTGGTTACAGGGGTCACTTCAGAGGTTCAGCTGCAGCAGTCTGGGGCAGAACTTGTGAAACCAGGGGCCTCAGTCAAGTTGTCCTGCACAGCTTCTGGCTTCAACATTAAAGACACCTATATGCACTGGGTGAAGCAGAGGCCTGAACAGGGCCTGGAGTGGATTGGAAGGATTGATCCTGCGAATGGTAATACTAGATATGACCCAAAATTCCAGGGCAAGGCCACTATAACATCAGACACATCCTCCAACACAGCCTACCTGCAGCTCAGCAGCCTGACATCTGAGGACACTGCCGTCTATTACTGTGCTAGGCGGGTGGGGTACTACTTTGACTACTGGGGCCAAGGCACCACTCTCACAGTCTCCTCAGCCAAAACGACACCCCCATCTGTCTATCCCCTGGTCCCTGGAAGCTTGGG

反式mAb-#25

輕鏈CDR

CDR1:KSSQSVLYSSDLKNYLA(SEQIDNO:16)

CDR2:WASTRES(SEQIDNO:17)

CDR3:HQYLSSYT(SEQIDNO:18)

SEQIDNO:27(輕鏈全長蛋白序列)

MESQTQVFLSLLLWVSGTCGNIMMTQSPSSLAVSAGEKVTMSCKSSQSVLYSSDLKNYLA

WYQQKPGQSPTLLIYWASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVQAEDLAVYYCHQYLSS

YTFGGGTKLEIKRADAAPTVSIFPPSSK

SEQIDNO:34(輕鏈全長核酸序列)

ATGGAATCACAGACTCAGGTCTTCCTCTCCCTGCTGCTCTGGGTATCTGGTACCTGTGGGAACATTATGATGACACAGTCGCCATCATCTCTGGCTGTGTCTGCAGGAGAAAAGGTCACTATGAGCTGTAAGTCCAGTCAAAGTGTTTTATACAGTTCAGATCTGAAGAACTACTTGGCCTGGTACCAGCAGAAACCAGGGCAGTCTCCTACACTGCTGATCTATTGGGCATCCACTAGGGAATCTGGTGTCCCTGATCGCTTCACAGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTTACTCTTACCATCAGCAGTGTACAAGCTGAAGACCTGGCAGTTTATTACTGTCATCAATACCTCTCCTCGTACACGTTCGGAGGGGGGACCAAGCTGGAAATAAAACGGGCTGATGCTGCACCAACTGTATCCATCTTCCCACCATCCAGTAAGC

反式mAb-#69

輕鏈CDR

CDR1:KSSQSLLYTGNQKNYLA(SEQIDNO:19)

CDR2:WASTRES(SEQIDNO:20)

CDR3:QQYYSYPWT(SEQIDNO:21)

SEQIDNO:28(輕鏈全長蛋白序列)

MDSQAQVLMLLLLWVSGTCGDIVMSQSPSSLAVSVGEKVTMSCKSSQSLLYTGNQKNYLA

WYQQKPGQSPKLLIYWASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVKAEDLAVYYCQQYYSY

PWTFGGGTKLEIKRADAAPTVSIFPPSSKLG

SEQIDNO:35:(輕鏈全長核酸序列)

ATGGATTCACAGGCCCAGGTTCTTATGTTACTGCTGCTATGGGTATCTGGTACCTGTGGGGACATTGTGATGTCACAATCTCCATCCTCCCTAGCTGTGTCAGTTGGAGAGAAGGTTACTATGAGCTGCAAGTCCAGTCAGAGCCTTTTATATACTGGCAATCAAAAGAACTACTTGGCCTGGTACCAGCAGAAACCAGGGCAGTCTCCTAAACTGCTGATTTACTGGGCATCCACTAGGGAATCTGGGGTCCCTGATCGCTTCACAGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTGTGAAGGCTGAAGACCTGGCAGTTTATTACTGTCAGCAATATTATAGCTATCCGTGGACGTTCGGTGGAGGCACCAAGCTGGAAATCAAACGGGCTGATGCTGCACCAACTGTATCCATCTTCCCACCATCCAGTAAGCTTGGG

實例2:穩健的順式、而非反式pT231-τ較早出現于MCI/AD和CTE腦的軸突內,并且隨著疾病進展進一步累積

為了檢查順式pT231-τ在AD和CTE腦中何時出現以及出現在何處,我們用順式和反式mAb、隨后通過同種型二級抗體進行了腦切片的雙重免疫染色,反式mAb僅在少量神經元胞體(甚至在正常腦內)處染色,順式mAb并不染色正常腦,但是在MCI神經元的直神經突中有力地檢測到信號,其在AD神經元的變形神經突中進一步累積和定位(圖4A-4C)。值得注意的是這個模式與通過描述于中村(Nakamura)等人,細胞(Cell)149:232-244,2012)中的多克隆順式和反式抗體檢測到的類似,不僅證實了順式和反式mAb的特異性,而且也表明,順式、而非反式mAb靶向人MCI以及AD中的早期致病性構象。麥基博士(Dr.McKee)提供的8個運動-和8個老兵相關的CTE的染色腦切片(李亮(Liliang)等人,外科研究(JSurgRes)160:302-307,2010;陳(Chen)等人,癌癥研究(CancerRes)73:3951-3962,2013)顯示穩健的順式、而非反式p-τ在II期神經突是容易檢測到的并且在III期進一步累積(圖4D-4I)。通過與軸突標記物神經絲或樹突標記物MAP2共染色,這些順式-陽性神經突被證實為軸突。值得注意的是,極罕見有神經元具有順式及反式p-τ這二者,支持它們是體內易互變的。因此,順式非常早地出現在AD和CTE中。

實例3:順式和反式mAb進入神經元并且到達不同神經元區室,并且順式mAb以一種pT232依賴性的方式在體外和離體減少τ水平

為了確定順式和反式mAb是否可以進入神經元并且到達預期神經元區室,用τ和p25/Cdk5(τ激酶)或載體對照轉染人SY5Y神經元,隨后將mAb添加至培養基48小時,然后經受僅用第二抗體進行的免疫染色或免疫印跡。不僅在神經元,而且在不同神經元區室中容易地檢測到了順式和反式mAb兩者。順式mAb主要在神經突中檢測到,而反式mAb主要在胞體中檢測到(圖5A和5B),如在MCI以及AD腦中所預期的(圖4)。更令人感興趣的是,順式mAb僅在p25/Cdk5過表達后顯著減少內源和外源τ的總水平,對τT231A突變體沒有明顯效果(圖5C)。將順式mAb添加至人野生型τ-Tg小鼠海馬體切片的培養基中還極大地降低了τ水平(圖5D)。此外,當SY5Y神經元經受血清耗盡(一種類似于創傷性腦損傷(TBI)的脅迫條件)時,發現在SY5Y神經元中的順式pT231-τ通過血清耗盡以時間-依賴性方式明顯增加,但是這種增加被順式、而非反式mAb有效地消除(圖5E)。因此,順式mAb在體外和離體減少τ水平。

實例4:順式而非反式mAb強力地抑制神經元中的由p-τ誘導的微管破壞和神經毒性

為了檢查順式mAb是否可以影響p-τ誘導微管破壞和神經毒性的能力,我們用p25/Cdk5、τ和GFP共轉染SY5Y細胞并且添加順式或反式mAb持續48-72小時,隨后免疫染色微管蛋白和DNA(圖6A)。此外,我們用Cdk5-p25和GFP-τ或其T231A突變體共轉染SY5Y神經元,然后添加順式或反式mAb,隨后進行針對細胞形態和神經毒性的活細胞共聚焦成像(圖6B和6C)。兩個測定清楚地表明順式、而非反式mAb強力地抑制由p-τ誘導的神經元中的微管破壞(圖6A)和神經毒性(圖6B和6C);在對照和反式mAb處理的細胞中大多數GFP-τ-陽性細胞死亡,其中細胞核周圍的微管(MT)網塌陷(圖6A)。大多數順式mAb-處理的GFP-τ-陽性細胞存活良好,在神經突中甚至具有MT網(圖6B,圖6C中的箭頭)。當添加至培養基時,順式而非反式mAb還有效地抑制SY5TY神經元中由血清耗盡誘導的微管破壞和神經毒性(圖6D和6E)。

實例5:順式pT231-τ顯著存在于AD患者的細胞外腦脊液(CSF)中

CSFpT231-τ是一種早期AD生物標記。為了測定CSFpT231-τ構象,在CSF中使用INNOTESThτELISA試劑盒(Innogenetics公司)用順式或反式Ab作為檢測抗體測量順式和反式pT231-τ。在所有8個對照CSF中,沒有可檢測出的順式pT231-τ,但是在8個案例的3個中檢測到少量的反式pT231-τ(圖7A),這可預期,因為反式與神經原纖維纏結(NFT)不相關。引人注目地,在晚期AD患者中,反式并且尤其是順式pT231-τ顯著增加(圖7A),這與在腦組織所見的一致(圖4)。此外,盡管順式或反式水平中存在一個寬的個體間差異,順式:反式比率在AD患者中是非常相似的(圖7B)。

實例6:評估順式τmAb終止腦損傷和其擴散在TBI小鼠模型中的潛力和血清順式pT231-τ水平鑒別患有顯著TBI的患者的潛力

我們已經開發了創新的肽化學以產生第一順式和反式pT231-τ抗體,使Pin1-催化的構象變化可視化(圖11)。值得注意的是,順式而非反式pT231-τ在MCI神經元早期出現并且隨著AD進展僅在具有退化神經元的軸突中進一步積累,與認知缺陷良好相關。此外,順式而非反式pT231-τ喪失其正常的微管-組裝能力,并且獲得毒性功能,對去磷酸化和降解產生抗性,并且傾向于聚集(圖11)。因此順式pT231-τ在MCI以及AD中是一種早期和致病性事件。我們現在已經開發了中和性的順式和反式pT231-τ單克隆抗體(mAb),它們在神經元并且甚至在小鼠TBI腦中高度有效于消除其對應p-τ異構體。

鑒于我們使用順式τmAb治療單一嚴重TBI小鼠的有前景的療效結果,通過追蹤在腦、CSF和血清中的順式pT231-τ,我們將在處于不同嚴重程度的重復性輕度TBI的小鼠模型中系統地評估順式τmAb用以終止腦損傷及其擴散的潛力及其劑量需求,及其與順式mAb治療后在不同時間時的行為和病理變化的關系。

鑒于血清τ水平顯現與TBI嚴重性相關,并且我們的初步結果表明順式p-τ(用反式作為對照)可以是一種優于總τ的生物標記,我們將進一步改進我們的ELISA以在嚴重急性TBI后的30-50位患者以及匹配的對照中測定順式和反式p-τ和總τ。38-41這可能最終提供一種靈敏方法以用于針對順式τmAb治療鑒定TBI患者。

預期的結果將構成針對τ蛋白病變中非常早期、分泌的和毒性的順式pT231-τ的創新的構象-特異性生物標記和免疫療法,增加了停止或預防處于早期階段的TBI、CTE以及AD患者中τ蛋白病變和記憶喪失的難得機會的。

實例7:順式mAb不僅有效地消除順式pT231-τ誘導,而且還中和在不同神經元脅迫下其誘導軸突微管破壞,線粒體運輸缺陷和最終細胞凋亡的能力

我們發現各種神經元脅迫(如缺氧或營養耗盡)有力地以時間-依賴性方式誘導順式pT231-τ,進而MT網破壞和最終通過細胞凋亡進行的細胞死亡,如通過活(綠色)/死(紅色)細胞測定試劑盒(艾碧康公司(Abcam))和膜聯蛋白5FACS顯示的(圖12A-12E)。我們的活細胞視頻成像也證實了時間-依賴性的MT塌陷以及線粒體的軸突運輸的缺陷(數據未顯示)。引人注目地,順式mAb治療幾乎完全消除順式p-τ誘導、并且還有效地挽救軸突MT破壞、線粒體運輸缺陷、和細胞凋亡,而反式mAb去除反式p-τ并加速這些表型(沒有交叉-耗盡)(圖12)。順式p-τ誘導細胞凋亡的能力與如下先前證據是一致的:人AD神經元中存在半胱天冬酶和細胞凋亡(熱爾韋(Gervais)等人,細胞(Cell)97:395-406,1999)。類似地,順式mAb消除順式p-τ并減少總τ的能力與我們的如下發現是一致的:順式p-τ是比反式更穩定(中村(Nakamura)等人,細胞(Cell)149:232-244,2012),并且抗體復合物可以由TRIM21識別以用于蛋白降解(馬勒里(Mallery)等人,美國科學院院刊(PNAS)107:19985-1998590,2010;麥克尤恩(McEwan)等人,生物測定(Bioessays)33:803-809,2011)。

實例8:順式而非反式mAb有效阻止自受脅迫神經元分泌的順式pT231-τ肽在受體神經元中誘導神經毒性

因為豐富的pT231-τ存在于AD患者的CSF中并且培養的神經元經由一種非常規機制分泌τ進入培養基,我們檢查了在受脅迫后神經元是否分泌順式和反式p-τ。實際上,當順式及反式p-τ這二者連同肌動蛋白釋放時,受脅迫神經元在40小時處分泌順式而非反式pT231-τ進入培養基,之后在72小時處細胞死亡(圖13A)。更重要的是,當添加至健康神經元持續3天后,該含順式的培養基通過細胞凋亡殺死神經元。用順式而非反式mAb進行該培養基的預處理,隨后用蛋白G耗盡mAb,完全挽救了神經元死亡(圖13B)。

實例9:順式而非反式mAb有效阻止人AD或CTE腦裂解物在受體神經元中誘導神經毒性

為了檢查人AD腦是否還包含毒性順式pT231-τ,我們添加人AD腦裂解物至培養的神經元中并在受體神經元中檢測到順式pT231-τ而非順式-τ(當使用對照腦裂解液時)。更重要的是,AD而非正常腦裂解物誘導受體神經元中的細胞凋亡,所述細胞凋亡通過用順式而非反式mAb預處理AD腦裂解物而得以完全挽救(圖14)。用人CTE腦裂解物也獲得相似結果。

實例10:順式pT231-τ隨著TBI的嚴重性增加并且在TBI小鼠腦中在纏結-相關表位之前很久即出現在軸突中

為了檢查順式p-τ和TBI嚴重性之間的關系,我們在不同高度使用重物墜落裝置以在小鼠中誘導不同嚴重性的閉合性頭部腦損傷(模擬運動-相關的TBI),測試了TBI48小時后腦中的順式p-τ。TBI48小時后,順式和總τ隨著TBI嚴重性的增加有力地增加(圖15A),這與我們的發現即順式p-τ對降解具有抗性相一致。爆破-誘導的TBI(模仿軍事-相關的TBI)48小時后,還發現了穩健的順式p-τ。時程研究顯示在嚴重TBI后,12小時后順式而非反式p-τ出人意料地被誘導并且隨時間繼續增加,維持至少2周(圖15B和15C)。順式-陽性神經突再次為軸突而非樹突(dentrite)。值得注意的是,在WT小鼠中TBI后,使用我們已使用的mAb,包括AT8、AT180、TG3、AT100、MC1、Alz50或PHF1(圖15D),我們不能找到任何纏結-相關的表位,如果有的話,其出現耗時長。

實例11:在小鼠中嚴重TBI后,順式mAb不僅消除順式pT231-τ,而且還恢復軸突MT破壞、線粒體運輸缺陷、細胞凋亡和甚至腦功能

為了檢查順式mAb是否進入并消除順式pT231-τ及其在TBI小鼠腦內的毒性,我們首先腹腔內或靜脈內給予生物素化的順式mAb至B6小鼠并且在之后3天檢測順式mAb。注射的mAb是腦中容易檢測到的(圖9A)。接下來嚴重TBI后我們用腹腔內250μg順式mAb每4天一次持續3次處理小鼠,并且在14天之后進行腦分析。引人注目地,順式mAb有效阻止TBI-誘導的順式pT231-τ誘導并在小鼠腦中減少總τ(圖9B)。此外,順式mAb而非對照IgG的治療有效地恢復軸突MT破壞和線粒體破壞(圖10A)和甚至細胞凋亡,如通過PARP裂解測定的(圖9C)。

為了檢查順式mAb是否恢復了嚴重TBI后腦的功能,我們使用了高架十字迷宮,其被廣泛用于測定小鼠中焦慮-相關的強迫行為。嚴重TBI2個月后,用IgG處理的小鼠顯示出在閉臂中的活動減少并且在開臂中的活動增加,反映焦慮-相關的強迫行為,指示額皮質-相關的功能障礙,但順式mAb-處理的小鼠和假處理的小鼠(shamemice)沒有顯著不同(圖10B),表明順式mAb能夠恢復TBI-誘導的腦功能。因此,順式mAb高度有效于消除順式p-τ及其神經毒性,并在神經元和TBI小鼠模型中恢復腦功能,與表明τmAb可以進入腦中神經元的先前工作一致(言曼達(Yanamandra)等人,神經元(Neuron)80(2):402-414,2013;克里希納穆爾蒂(Krishnamurthy)等人,精神病療法前沿(FrontPsychiatry)2:59,2011;穆罕默德(Mohamed)等人,神經科學研究(JNeurosciRes)69:110-116,2002)并且與表明mAb可以觸發細胞中的靶向降解的先前工作一致(馬勒里(Mallery)等人,美國科學院院刊(PNAS)107:19985-1998590,2010;麥克尤恩(McEwan)等人,生物測定(Bioessays)33:803-809,2011)。

其他實施例

從前述說明中,將清楚的是,可以對本文所述的發明作出變更和修改以使其適應于各種用途和狀況。這樣的實施例也在下述權利要求書的范圍內。

在本說明書中提到的所有出版物、專利申請、以及專利都通過引用結合在此,其程度如同每個單獨的出版物、專利申請或專利被具體地并且單獨地指明通過引用結合在此。

從前述說明書,本領域技術人員可以很容易地確定本發明的實質特征;可以對本發明作不同變化和變更,以使它適應不同用途和條件。因此,其他實施例也在權利要求書范圍內。

關 鍵 詞:
用于 產生 使用 構象 特異性 抗體 方法 組合
  專利查詢網所有資源均是用戶自行上傳分享,僅供網友學習交流,未經上傳用戶書面授權,請勿作他用。
關于本文
本文標題:用于產生和使用構象特異性抗體的方法和組合物.pdf
鏈接地址://www.vmyqew.com.cn/p-6872359.html
關于我們 - 網站聲明 - 網站地圖 - 資源地圖 - 友情鏈接 - 網站客服客服 - 聯系我們

[email protected] 2017-2018 www.vmyqew.com.cn網站版權所有
經營許可證編號:粵ICP備17046363號-1 
 


收起
展開