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西甲皇家社会vs维戈塞尔塔: 針對多種登革病毒亞型的新穎疫苗.pdf

摘要
申請專利號:

维戈塞尔塔vs皇家社会 www.vmyqew.com.cn CN201480013820.2

申請日:

20140314

公開號:

CN105246491A

公開日:

20160113

當前法律狀態:

有效性:

審查中

法律詳情:
IPC分類號: A61K31/711 主分類號: A61K31/711
申請人: 賓夕法尼亞大學理事會,艾諾奧醫藥品有限公司
發明人: 大衛·韋納,嚴健,尼蘭詹·薩爾德賽
地址: 美國賓夕法尼亞州
優先權: 61/801,972
專利代理機構: 北京康信知識產權代理有限責任公司 代理人: 張英;宮傳芝
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法律狀態
申請(專利)號:

CN201480013820.2

授權公告號:

法律狀態公告日:

法律狀態類型:

摘要

本發明的一個方面涉及能夠表達如共有登革prME的多肽的核酸構建體和使用它們的方法,所述多肽引發哺乳動物的針對多于一種登革病毒亞型的免疫反應。另外,存在能夠在哺乳動物中產生針對多種登革病毒亞型的免疫反應的DNA質粒疫苗和使用它們的方法,所述DNA質粒疫苗包含DNA質粒和藥學上可接受的賦形劑。所述DNA質粒能夠在所述哺乳動物的細胞中以有效引發所述哺乳動物的免疫反應的量表達共有登革抗原,所述免疫反應針對所有4種登革亞型是交叉反應性的。

權利要求書

1.一種能夠表達引發哺乳動物的針對多于一種登革病毒亞型的免疫反應的多肽的核酸構建體,所述核酸構建體包含:表達所述多肽的編碼核苷酸序列,其中所述多肽包括來自至少兩種不同的登革病毒亞型的PRM/E結構域,在所述哺乳動物中調控所述多肽的表達并且與所述編碼核苷酸序列可操作地連接的啟動子。2.如權利要求1所述的核酸構建體,還包含與所述編碼序列的N端末端可操作地連接并且與所述啟動子可操作地連接的IgE前導序列。3.如權利要求1-2中任一項所述的核酸構建體,還包含與所述編碼序列的C端末端相連的聚腺苷酸化序列。4.如權利要求1-3中任一項所述的核酸構建體,其中所述核酸構建體是密碼子優化的。5.如權利要求1-4中任一項所述的核酸構建體,其中所述編碼核苷酸序列編碼包括來自登革病毒-亞型1、登革病毒-亞型2、登革病毒-亞型3或登革病毒-亞型4或它們的組合的DIII結構域的多肽。6.如權利要求1-5中任一項所述的核酸構建體,其中所述編碼核苷酸序列選自由以下組成的組:SEQIDNO:1、SEQIDNO:2、SEQIDNO:3、SEQIDNO:4和SEQIDNO:5。7.一種能夠在哺乳動物中產生針對多種登革病毒亞型的免疫反應的DNA質粒疫苗,所述疫苗包含:能夠在所述哺乳動物的細胞中以有效引發所述哺乳動物的免疫反應的量表達共有登革抗原的DNA質粒,所述共有登革抗原包括登革病毒-亞型1、登革病毒-亞型2、登革病毒-亞型3或登革病毒-亞型4或它們的組合的共有DIII結構域,和藥學上可接受的賦形劑;所述DNA質粒包含與編碼所述共有登革抗原的編碼序列可操作地連接的啟動子。8.如權利要求7所述的DNA質粒疫苗,其中所述DNA質?;拱胨霰嗦胄蛄械腘端末端相連并且與所述啟動子可操作地連接的IgE前導序列。9.如權利要求7-8中任一項所述的DNA質粒疫苗,其中所述DNA質?;拱胨霰嗦胄蛄械腃端末端相連的聚腺苷酸化序列。10.如權利要求7-9中任一項所述的DNA質粒疫苗,其中所述DNA質粒是密碼子優化的。11.如權利要求7-10中任一項所述的DNA質粒疫苗,其中所述藥學上可接受的賦形劑是佐劑。12.如權利要求11所述的DNA質粒疫苗,其中所述佐劑選自由IL-12和IL-15組成的組。13.如權利要求7-10中任一項所述的DNA質粒疫苗,其中所述藥學上可接受的賦形劑是轉染促進劑。14.如權利要求13所述的DNA質粒疫苗,其中所述轉染促進劑是聚陰離子、聚陽離子或脂質。15.如權利要求13所述的DNA質粒疫苗,其中所述轉染促進劑是濃度小于6mg/mL的聚L谷氨酸。16.如權利要求7-15中任一項所述的DNA質粒疫苗,其中所述DNA質粒疫苗具有1mg/mL或更大的總DNA質粒的濃度。17.如權利要求7-16中任一項所述的DNA質粒疫苗,其中所述DNA質粒包括多種單一DNA質粒,其中所述多種單一DNA質粒的每一種編碼包含來自登革病毒-亞型1、登革病毒-亞型2、登革病毒-亞型3或登革病毒-亞型4或它們的組合的PRM/E結構域的多肽。18.如權利要求7-17中任一項所述的DNA質粒疫苗,其中所述編碼核苷酸序列包括SEQIDNO:1、SEQIDNO:2、SEQIDNO:3、SEQIDNO:4或SEQIDNO:5。19.如權利要求7-18中任一項所述的DNA質粒疫苗,所述疫苗包含表達登革病毒PRM/E結構域的至少兩種不同的DNA質粒,所述質粒選自由以下組成的組:包含編碼共有登革病毒-亞型1的PRM/E結構域的序列的DNA質粒,包含編碼共有登革病毒-亞型2的PRM/E結構域的序列的DNA質粒,包含編碼共有登革病毒-亞型3的PRM/E結構域的序列的DNA質粒,和包含編碼共有登革病毒-亞型4的PRM/E結構域的序列的DNA質粒。20.如權利要求7-19中任一項所述的DNA質粒疫苗,所述疫苗包含:所述包含編碼共有登革病毒-亞型1的PRM/E結構域的序列的DNA質粒,所述包含編碼共有登革病毒-亞型2的PRM/E結構域的序列的DNA質粒,所述包含編碼共有登革病毒-亞型3的PRM/E結構域的序列的DNA質粒,和所述包含編碼共有登革病毒-亞型4的PRM/E結構域的序列的DNA質粒。21.如權利要求7-20中任一項所述的DNA質粒疫苗,其中所述共有登革病毒-亞型1的PRM/E結構域是SEQIDNO:1。22.如權利要求7-21中任一項所述的DNA質粒疫苗,其中所述共有登革病毒-亞型2的PRM/E結構域是SEQIDNO:2。23.如權利要求7-22中任一項所述的DNA質粒疫苗,其中所述共有登革病毒-亞型3的PRM/E結構域是SEQIDNO:3。24.如權利要求7-23中任一項所述的DNA質粒疫苗,其中所述共有登革病毒-亞型4的PRM/E結構域是SEQIDNO:4。25.如權利要求7-24中任一項所述的DNA質粒疫苗,其中所述哺乳動物是非人的靈長類。26.如權利要求7-25中任一項所述的DNA質粒疫苗,其中所述免疫反應是體液反應。27.如權利要求7-25中任一項所述的DNA質粒疫苗,其中所述免疫反應是細胞反應。28.如權利要求7-25中任一項所述的DNA質粒疫苗,其中所述免疫反應是聯合的體液反應和細胞反應。29.一種引發哺乳動物針對多種病毒亞型的免疫反應的方法,包括,向所述哺乳動物的組織遞送DNA質粒疫苗,所述DNA質粒疫苗包含能夠在所述哺乳動物的細胞中表達衍生自所述病毒的亞型的多種共有抗原以在所述哺乳動物中引發免疫反應的DNA質粒,所述多種共有抗原包括來自所述病毒的至少兩種不同亞型的抗原結構域,并且用能量脈沖以有效允許所述DNA質粒進入所述細胞的恒定電流將所述組織的細胞電穿孔。30.如權利要求29所述的方法,其中所述病毒包括西尼羅病毒、人免疫缺陷病毒、流感病毒或登革病毒。31.如權利要求29-30中任一項所述的方法,其中所述遞送步驟包括:將所述DNA質粒疫苗注射到皮內組織、皮下組織或肌肉組織中。32.如權利要求29-31中任一項所述的方法,還包括:預先設定期望被遞送到所述組織的電流;并且用能量脈沖以等于所述預設電流的恒定電流將所述組織的細胞電穿孔。33.如權利要求29-32中任一項所述的方法,其中所述電穿孔步驟還包括:測量所述電穿孔細胞中的阻抗;相對于所述測量的阻抗調整所述能量脈沖的能量水平以在所述被電穿孔的細胞中保持恒定電流;其中所述測量和調整步驟發生在所述能量脈沖的使用期內。34.如權利要求29-33中任一項所述的方法,其中所述電穿孔步驟包括:根據以分散模式遞送所述能量脈沖的脈沖序列模式將所述能量脈沖遞送至多個電極。

說明書

發明領域

本發明涉及改進的登革疫苗、用于誘導針對登革病毒的免疫反應和用于預防性地和/或治療性地針對登革病毒免疫個體的改進的方法。

背景

登革病毒(DENV)是一種新出現的引起登革熱(DF)和嚴重的威脅生命的疾病登革出血熱/登革休克綜合征(DHF/DSS)的蚊媒病原。DENV是一種小的、包膜的正鏈RNA病毒,它屬于黃病毒科(Flaviviridae)家族的黃病毒屬。登革病毒的四種不同的亞型或血清型(DV-1到DV-4)通過蚊種埃及伊蚊(Aedesaegypti)和白紋伊蚊(Aedesalbopictus)的叮咬傳播給人類。據估計每年出現5千萬至1億的DF病例和250,000至500000的DHF病例。登革成為了巨大的國際公共衛生問題,因為世界人口的五分之二生活在登革的流行區域并且每年出現估計5千萬至1億的登革感染病例。此外,在不存在有效干涉的情況下,在世界的亞熱帶和熱帶區域,25億人處在感染的危險之下。

超過100個熱帶國家具有流行性登革病毒感染,并且已證明DHF在大于60個這些國家中存在。在大多數國家缺乏對DF/DHF的監視并且過去主要集中于DHF;因此只能估計每年出現的DF病例的數目。然而在1998年,主要的流行病發生遍及亞洲和美國,其中向世界衛生組織(WHO)報告了大于120萬例DF/DHF病例。DHF的全球報告在過去20年內已平均增加五倍。在21世紀初,根據流行病活性,估計每年出現5千萬至1億的DF病例和幾十萬DHF病例。病死率(CFR)在國家之間有差異,但是在一些國家可以高達10–15%而在另一些國家<1%。

存在四種登革病毒亞型:登革1型(DV-1)、登革2型(DV-2)、登革3型(DV-3)和登革4型(DV-4)。這些亞型中的每一個在黃病毒家族內形成抗原上不同的亞類。它們是編碼十種蛋白的包膜的RNA病毒:三種結構蛋白和七種非結構蛋白。所述結構蛋白是衣殼(C)、包膜(E)和預膜前體(preM)。DV的生命周期開始于受體介導的病毒進入細胞的胞吞作用,接著病毒的包膜蛋白與晚期內含體膜融合,這導致病毒的基因組釋放到細胞質中復制。

DV感染可能無癥狀或者以發熱、寒戰、額痛、肌痛、關節痛和疹為特征。隨后感染不同的血清型可導致包括血漿滲漏或出血(登革出血熱)和休克(登革休克綜合征)的更為嚴重的疾病表現。雖然多年來已進行廣泛研究來了解DENV感染的病原性,但在特效的抗DV化合物的研制上沒有取得什么進展。目前在美國沒有批準的針對登革感染的特定抗病毒劑或疫苗。

包膜(E)糖基化蛋白是成熟的登革病毒粒子表面上存在的主要結構蛋白,是一種I型整合膜蛋白。已證明成熟登革病毒的E蛋白以反向平行方式(頭到尾方向)形成同型二聚體。每個單體被折疊成三種不同的結構域,即結構域I(DI,中心的N端結構域)、結構域II(DII,二聚化結構域)和結構域III(PRM/E,免疫球蛋白(Ig)樣的C端結構域)。E蛋白的PRM/E結構域由C端的100個氨基酸(殘基303-395)組成。這個結構域已表明是受體識別和結合結構域。PRM/E蛋白中存在的Ig樣折疊通常與具有附著功能的結構有關。這個結構域垂直地延伸到病毒的表面,具有一個從病毒粒子表面伸出的比E蛋白的任何其他部分更遠的尖端。此外,研究已證明重組PRM/E蛋白和產生的抗黃病毒的E蛋白的PRM/E的抗體均能抑制黃病毒進入靶細胞。此外,具有E蛋白的PRM/E的突變的黃病毒顯示出減弱的毒力或逃避免疫中和的能力。

研制安全且有效的針對登革病毒感染的疫苗仍是一個主要的公共衛生目標。假定免疫性與登革病毒的主要關聯被認為是中和抗體的存在,那么用于比較和優化疫苗候選物的前提是精確地測量由疫苗誘發的中和抗體反應的能力。來自所有四種血清型的包含減弱的活病毒的疫苗的組合已顯示導致幾種并發癥(GuyB,AlmondJW,CompImmunolMicrobiolInfectDis.2008年3月;31(2-3):239-52)。此外,存在很少的關于基于腺病毒的登革抗原的遞送的報告。盡管如此,腺病毒系統的這個眾所周知的問題是大多數的人類群體已知具有抗腺病毒之一的抗體,并且此類預先存在的抗體能夠引起這些基于腺病毒的疫苗失效。

因此,仍有必要研制提供針對多種且優選所有四種血清型的登革病毒的廣泛免疫性或通用免疫性(universalimmunity)的疫苗,以及優選地是經濟的且在所有血清型之間有效的疫苗。此外,存有需要向哺乳動物施用疫苗諸如DNA疫苗或DNA質粒疫苗以在預防上或治療上提供針對登革病毒的免疫的有效方法。

發明概述

本發明的一個方面提供能夠表達引發哺乳動物針對多于一種登革病毒亞型的免疫反應的多肽的核酸構建體。所述核酸構建體由編碼核苷酸序列和與所述編碼核苷酸序列可操作地連接的啟動子組成。所述編碼核苷酸序列表達所述多肽,其中所述多肽包括來自至少兩種不同的登革病毒亞型的包膜蛋白的結構域III(PRM/E結構域或PRM/E)。所述啟動子調節哺乳動物中所述多肽的表達。

本發明的另一個方面提供了能夠在哺乳動物中產生針對多種登革病毒亞型的免疫反應的DNA質粒疫苗。所述DNA質粒疫苗由能夠在所述哺乳動物中表達共有登革抗原的DNA質粒和藥學上可接受的賦形劑組成。所述DNA質粒由與編碼所述共有登革PRM/E抗原的編碼序列可操作地連接的啟動子組成。所述共有登革抗原由登革病毒亞型1、登革病毒亞型2、登革病毒亞型3或登革病毒亞型4的共有PRM/E結構域組成。

本發明的另一方面提供了引發哺乳動物針對多種病毒亞型的免疫反應的方法,所述方法包括向所述哺乳動物的組織遞送DNA質粒疫苗,并用能量脈沖以有效允許所述DNA質粒進入所述細胞的恒定電流將所述組織的細胞電穿孔,所述DNA質粒疫苗包含能夠在所述哺乳動物的細胞中表達衍生自所述病毒亞型的多種共有抗原以引發所述哺乳動物的免疫反應的DNA質粒,所述多種共有抗原包含來自所述至少兩種不同的病毒亞型的抗原結構域。

附圖簡述

圖1示出對比來自接種D1prME的小鼠的血清與來自接種DU的小鼠的血清的、針對來自亞型1的所有登革PRM/E結構域的結合滴度。

圖2示出對比來自接種D2prME的小鼠的血清與來自接種DU的小鼠的血清的、針對來自亞型2的所有登革PRM/E結構域的結合滴度。

圖3示出對比來自接種D3prME的小鼠的血清與來自接種DU的小鼠的血清的、針對來自亞型3的所有登革PRM/E結構域的結合滴度。

圖4示出對比來自接種D4prME的小鼠的血清與來自接種DU的小鼠的血清的、針對來自亞型4的所有登革PRM/E結構域的結合滴度。

圖5示出染色凝膠,所述染色凝膠展示對用來自血清型1、2、3或4的PRM/E結構域免疫的小鼠來說,針對prME蛋白類型D1、D2、D3和D4產生的結合抗體。

圖6示出展示對于對照豚鼠血清來說針對登革PRM/E蛋白類型(1至4)中的每一種的中和抗體的圖。

圖7示出展示對于DU-DIII豚鼠血清來說針對登革PRM/E蛋白類型(1至4)中的每一種的中和抗體的圖。

圖8示出展示對于D1-D4prME豚鼠血清(所有四種疫苗組合成一種混合物并且一起施用)來說針對登革PRM/E蛋白類型(1至4)中的每一種的中和抗體的圖。

圖9示出展示對于D1-D4prME豚鼠血清(單獨地施用每一種疫苗)來說針對登革PRM/E蛋白類型(1至4)中的每一種的中和抗體的圖。

圖10示出展示對于D1prME豚鼠血清來說針對登革PRM/E蛋白類型(1至4)中的每一種的中和抗體的圖。

圖11示出展示對于D2prME豚鼠血清來說針對登革PRM/E蛋白類型(1至4)中的每一種的中和抗體的圖。

圖12示出展示對于D3prME豚鼠血清來說針對登革PRM/E蛋白類型(1至4)中的每一種的中和抗體的圖。

圖13示出展示對于D4prME豚鼠血清來說針對登革PRM/E蛋白類型(1至4)中的每一種的中和抗體的圖。

圖14示出展示對于來自用所有四種D1-D4prME接種的動物的血清來說針對登革1病毒的中和抗體的圖。

圖15示出展示對于來自用所有四種D1-D4prME接種的動物的血清來說針對登革2病毒的中和抗體的圖。

圖16示出展示對于來自用所有四種D1-D4prME接種的動物的血清來說針對登革3病毒的中和抗體的圖。

圖17示出展示對于來自用所有四種D1-D4prME接種的動物的血清來說針對登革4病毒的中和抗體的圖。

優選實施方案的詳細描述

給出下述簡略或簡短的定義以幫助理解本發明的優選實施方案。這里所給出的簡略的定義絕不是詳盡的,它們與本領域理解的定義或字典含義也絕不矛盾。在這里給出簡略的定義是為了補充或更清晰地界定本領域中已知的定義。

定義

如本文使用,核苷酸和氨基酸的序列同源性可使用FASTA、BLAST和GappedBLAST(Altschul等人,Nuc.AcidsRes.,1997,25,3389,其通過引用將其全部內容并入本文)以及PAUP*4.0b10軟件(D.L.Swofford,SinauerAssociates,Massachusetts)確定。簡言之,BLAST算法代表基本局部比對搜索工具(BasicLocalAlignmentSearchTool),它適合于確定序列相似性(Altschul等人,J.Mol.Biol.,1990,215,403-410,其通過引用將其全部內容并入本文)。用于執行BLAST分析的軟件是通過國家生物技術信息中心公共可利用的。由BLAST算法提供的相似性的一個量度是最小和概率(P(N))法,它提供了兩條核苷酸序列之間的匹配偶然發生的概率的指示。例如,如果在檢測核酸與另一種核酸的比較中最小和概率小于大約1、優選地小于大約0.1、更優選地小于大約0.01且最優選地小于大約0.001,那么認為所述核酸與所述另一種核酸是相似的??墑褂肞AUP*4.0b10軟件(D.L.Swofford,SinauerAssociates,Massachusetts)計算“相似性的百分比”。計算出共有序列與系統樹(phylogenictree)中的所有序列相比的平均相似性。

如本文所用,術語“核酸構建體”是指包含編碼蛋白質的核苷酸序列的DNA或RNA分子。編碼序列或“編碼核酸序列”可包括與調控元件可操作地連接的起始信號和終止信號,所述調控元件包括能夠在施用了所述核酸分子的個體的細胞中指導表達的啟動子和聚腺苷酸化信號。

如本文使用,術語“可表達的形式”是指包含必要調控元件的核酸構建體,所述調控元件與編碼蛋白質的編碼序列可操作地連接以使得當所述編碼序列存在于個體的細胞中時,其將被表達。

本文使用術語“恒定電流”來定義由組織或界定所述組織的細胞在遞送到相同組織的電脈沖的持續期間所接受或經歷的電流。所述電脈沖是從本文所述的電穿孔裝置中遞送的。這種電流在電脈沖的使用期內在所述組織中保持恒定安培數,因為本文提供的電穿孔裝置具有反饋元件,優選地具有瞬時反饋。所述反饋元件能夠測量整個脈沖持續期間組織(或細胞)的阻抗,并引起電穿孔裝置改變其電能輸出(例如增加電壓),所以相同組織中的電流在整個電脈沖(微妙數量級)以及從脈沖到脈沖中保持恒定。在一些實施方案中,反饋元件包括控制器。

術語“反饋”或“電流反饋”可被互換使用并且表示所提供的電穿孔裝置的主動反應,所述反應包括測量在電極之間的組織中的電流并且因此改變由EP裝置遞送的能量輸出以保持電流在恒定水平。這個恒定水平由使用者在脈沖序列或電處理開始之前預先設定。優選地,反饋是由電穿孔裝置的電穿孔部件例如控制器完成,因為其中的電路能夠連續地監測在電極之間的組織中的電流,并將所述監測的電流(或組織內的電流)與預設電流比較,并且能夠連續地進行能量輸出調整以保持監測的電流在預設水平。在一些實施方案中,所述反饋環路是瞬時的,因為它是模擬閉合環路反饋。

如本文可互換使用的術語“電穿孔”、“電滲透”或“電動力學增強”(“EP”)是指使用跨膜電場脈沖來誘導生物膜中的微觀途徑(孔);這些微觀途徑的存在允許生物分子例如質粒、寡核苷酸、siRNA、藥物、離子和/或水從細胞膜的一側通過到另一側。

本文使用術語“分散電流”來定義從本文所述的電穿孔裝置的各個針電極陣列中遞送的電流模式,其中所述模式使得在被電穿孔的組織的任何區域上的電穿孔相關的熱應激的發生最小化,或者優選地將其消除。

如本文使用,術語“反饋機制”是指通過軟件或硬件(或固件)執行的過程,所述過程接收期望組織的阻抗(在遞送能量脈沖之前、過程中和/或之后)并將其與預設值(presentvalue)(優選電流)進行比較,并且調整遞送的能量脈沖以達到預設值。當討論反饋機制時,術語“阻抗”被本文使用并且能夠根據歐姆定律被轉換為電流值,由此能夠與預設電流比較。在一個優選的實施方案中,“反饋機制”通過模擬閉合環路執行。

本文使用術語“免疫反應”來表示宿主的免疫系統例如哺乳動物的免疫系統的激活,所述免疫系統的激活是對通過所提供的DNA質粒疫苗引入登革抗原例如通用登革抗原的反應。免疫反應可以是細胞反應或體液反應的形式或二者兼有。

本文使用術語“共有”或“共有序列”來表示基于特定登革亞型的多個毒株的比對分析而構建的合成的核酸序列或對應的多肽序列,其產生亞型1、亞型2、亞型3、亞型4和以下所述的通用登革的共有登革序列。所述共有通用登革可被用來誘導針對多種登革病毒亞型或血清型的寬泛的免疫性。

本文使用術語“佐劑”來表示加到本文所述的DNA質粒疫苗中以增強由所述DNA質粒和下文所述的編碼核酸序列所編碼的登革抗原的抗原性的任何分子。

術語“亞型”或“血清型”可在本文中互換使用并涉及一種病毒例如登革病毒使用,并且表示所述病毒抗原的遺傳變體以使得一個亞型區別于一個不同亞型地被免疫系統識別。例如,登革病毒亞型1在免疫學上可區別于登革病毒亞型2。

本發明的一個方面提供能夠表達引發哺乳動物針對多于一種登革病毒亞型的免疫反應的多肽的核酸構建體。所述核酸構建體由編碼核苷酸序列和與所述編碼核苷酸序列可操作地連接的啟動子組成。編碼核苷酸序列表達多肽,其中所述多肽包括來自至少兩種不同的登革病毒亞型的PRM/E結構域。所述啟動子調控哺乳動物中所述多肽的表達。

在一些實施方案中,核酸構建體還可以包括與編碼序列的N端末端可操作地連接并與啟動子可操作地連接的IgE前導序列。優選地,所述IgE前導序列具有SEQIDNO:11的序列。所述核酸構建體還可以包含與所述編碼序列的C端末端相連的聚腺苷酸化序列。優選地,所述核酸構建體是密碼子優化的。

在一些實施方案中,編碼核苷酸序列編碼包括來自登革病毒亞型1、登革病毒亞型2、登革病毒亞型3和登革病毒亞型4的PRM/E結構域的多肽。在優選的實施方案中,所述編碼核苷酸序列選自由以下組成的組:

本發明的另一個方面提供了能夠在哺乳動物中產生針對多種登革病毒亞型的免疫反應的DNA質粒疫苗。所述DNA質粒疫苗由能夠在所述哺乳動物中表達共有登革抗原的DNA質粒和藥學上可接受的賦形劑組成。所述DNA質粒由與編碼所述共有登革抗原的編碼序列可操作地連接的啟動子組成。所述共有登革抗原由登革病毒亞型1、登革病毒亞型2、登革病毒亞型3或登革病毒亞型4的共有PRM/E結構域組成。優選地,所述DNA質粒包含編碼共有登革抗原的共有登革抗原,所述共有登革抗原選自由以下組成的組:SEQIDNO:2、SEQIDNO:4、SEQIDNO:6和SEQIDNO:8。

在一些實施方案中,所述DNA質?;拱ㄓ胨霰嗦胄蛄械腘端末端相連并與啟動子可操作地連接的IgE前導序列。優選地,所述IgE前導序列具有序列MetArgTrpThrTrpIleLeuPheLeuValAlaAlaAlaThrArgValHisSer。

DNA質?;箍梢園ㄓ胨霰嗦胄蛄械腃端末端相連的聚腺苷酸化序列。優選地,DNA質粒是密碼子優化的。

在一些實施方案中,所述藥學上可接受的賦形劑是佐劑。優選地,佐劑選自由IL-12和IL-15組成的組:在一些實施方案中,所述藥學上可接受的賦形劑是轉染促進劑。優選地,轉染促進劑是聚陰離子、聚陽離子或脂質,以及更優選地是聚L谷氨酸。優選地,聚L谷氨酸為小于6mg/mL的濃度。優選地,DNA質粒疫苗具有1mg/mL或更大的總DNA質粒濃度。

在一些實施方案中,所述DNA質粒包括多種單一DNA質粒,其中所述多種單一DNA質粒的每一種都編碼包含prME登革病毒亞型1、登革病毒亞型2、登革病毒亞型3或登革病毒亞型4的多肽。

所述DNA質粒疫苗可包括包含以下編碼核苷酸序列的DNA質粒:SEQIDNO:1;編碼SEQIDNO:2、SEQIDNO:3的核苷酸序列;編碼SEQIDNO:4、SEQIDNO:5核苷酸序列;編碼SEQIDNO:6、SEQIDNO:7和SEQIDNO:8核苷酸序列。

在一些實施方案中,所述DNA質粒疫苗包含表達登革病毒prME的至少兩種不同的DNA質粒。在一些實施方案中,所述DNA質粒疫苗可包括四種共有登革病毒prME(亞型1-4)。

在一些實施方案中,其中DNA質粒疫苗產生免疫反應的哺乳動物是靈長類。優選地,哺乳動物是靈長類。免疫反應可以是體液反應或細胞反應,并且優選地二者兼有。

本發明的另一方面提供了引發哺乳動物針對多種登革病毒亞型的免疫反應的方法,所述方法包括向所述哺乳動物的組織遞送DNA質粒疫苗并且用能量脈沖以有效允許所述DNA質粒進入所述細胞的恒定電流將所述組織的細胞電穿孔。

在一些實施方案中,引發免疫反應的方法包括將DNA質粒疫苗注射到皮內組織、皮下組織或肌肉組織中的遞送步驟。

在一些實施方案中,引發免疫反應的方法還可以包括預先設定期望被遞送到組織的電流;并且用能量脈沖以等于預設電流的恒定電流將所述組織的細胞電穿孔。

在一些實施方案中,引發免疫反應的方法還包括測量被電穿孔的細胞中的阻抗;相對于測量的阻抗調整能量脈沖的能量水平以保持電穿孔細胞中的恒定電流。所述測量和調整步驟優選地發生在所述能量脈沖的使用期內。

在一些實施方案中,電穿孔步驟包括根據以分散模式遞送能量脈沖的脈沖序列模式,將能量脈沖遞送至多個電極。

在本發明的一些實施方案中,DNA質粒疫苗能夠還包括佐劑。在一些實施方案中,佐劑選自由以下組成的組:α-干擾素、γ-干擾素、血小板衍生的生長因子(PDGF)、TNFα、TNFβ、GM-CSF、表皮生長因子(EGF)、皮膚T細胞虜獲趨化因子(CTACK)、上皮胸腺表達的趨化因子(TECK)、粘膜相關上皮趨化因子(MEC)、IL-12、IL-15、MHC、CD80、CD86,包括具有被刪除信號序列的IL-15并任選地包括來自IgE的信號肽??贍蓯怯杏玫淖艏戀鈉淥虬ū嗦胍韻碌幕潁篗CP-1、MIP-l-α、MIP-1p、IL-8、RANTES、L-選擇素、P-選擇素、E-選擇素、CD34、GlyCAM-1、MadCAM-1、LFA-1、VLA-1、Mac-1、pl50.95、PECAM、ICAM-1、ICAM-2、ICAM-3、CD2、LFA-3、M-CSF、G-CSF、IL-4、IL-18的突變體形式、CD40、CD40L、血管生長因子、成纖維細胞生長因子、IL-7、神經生長因子、血管內皮生長因子、Fas、TNF受體、Flt、Apo-1、p55、WSL-1、DR3、TRAMP、Apo-3、AIR、LARD、NGRF、DR4、DR5、KILLER、TRAIL-R2、TRICK2、DR6、胱天蛋白酶ICE、Fos、c-jun、Sp-1、Ap-1、Ap-2、p38、p65Rel、MyD88、IRAK、TRAF6、IkB、無活性NIK、SAPK、SAP-1、JNK、干擾素反應基因、NFkB、Bax、TRAIL、TRAILrec、TRAILrecDRC5、TRAIL-R3、TRAIL-R4、RANK、RANK配體、Ox40、Ox40配體、NKG2D、MICA、MICB、NKG2A、NKG2B、NKG2C、NKG2E、NKG2F、TAP1、TAP2以及它們的功能片段。在一些優選的實施方案中,佐劑選自IL-12、IL-15、CTACK、TECK或MEC。

在一些實施方案中,藥學上可接受的賦形劑是轉染促進劑,它可包括以下轉染促進劑:表面活性劑,例如免疫刺激復合物(ISCOMS);弗氏不完全佐劑;LPS類似物,包括單磷酰脂質A;胞壁酰肽;醌類似物;小泡,例如角鯊烯和角鯊烯(squaleneandsqualene);透明質酸;脂質;脂質體;鈣離子;病毒蛋白;聚陰離子;聚陽離子;或納米顆?;蛘咂淥閻淖敬俳?。優選地,轉染促進劑是聚陰離子、聚陽離子、包括聚L谷氨酸(LGS)或脂質。優選地,轉染促進劑是聚L谷氨酸,并且更優選地,聚L谷氨酸以小于6mg/mL的濃度存在于DNA質粒疫苗中。在一些實施方案中,DNA質粒疫苗中聚L谷氨酸的濃度是小于4mg/mL、小于2mg/mL、小于1mg/mL、小于0.750mg/mL、小于0.500mg/mL、小于0.250mg/mL、小于0.100mg/mL、小于0.050mg/mL或小于0.010mg/mL。

在一些實施方案中,可以將DNA質粒疫苗遞送給哺乳動物以引發免疫反應;優選地,哺乳動物是靈長類動物,包括人類和非人類的靈長類動物、牛、豬、雞、狗或雪貂。更優選地,哺乳動物是人類靈長類動物。

本發明的一個方面涉及引發哺乳動物針對多種病毒亞型的免疫反應的方法。所述方法包括向所述哺乳動物的組織遞送DNA質粒疫苗,并且用能量脈沖以有效允許所述DNA質粒進入所述細胞的恒定電流將所述組織的細胞電穿孔。DNA質粒疫苗包含能夠在所述哺乳動物的細胞中表達衍生自所述病毒的亞型的多種共有抗原以引發所述哺乳動物的免疫反應的DNA質粒,所述多種共有抗原包括來自至少兩種不同病毒亞型的抗原結構域。

本發明的一個方面涉及引發哺乳動物針對多種登革病毒亞型的免疫反應的方法。所述方法包括向所述哺乳動物的組織遞送DNA質粒疫苗,所述DNA質粒疫苗包含能夠在所述哺乳動物的細胞中表達共有登革抗原以引發所述哺乳動物的免疫反應的DNA質粒,所述共有登革抗原包含編碼prME蛋白的共有序列,所述prME蛋白來自至少兩種登革亞型,以及優選地來自所有四種登革亞型。登革亞型包括亞型1、亞型2、亞型3和亞型4。引發免疫反應的方法包括用能量脈沖以有效允許DNA質粒進入細胞的恒定電流將所述組織的細胞電穿孔。

在一些實施方案中,本發明的方法包括將DNA質粒疫苗注射到皮內組織、皮下組織或肌肉組織的遞送步驟。優選地,這些方法包括使用體內電穿孔裝置來預先設定期望被遞送到組織的電流;并且用能量脈沖以等于預設電流的恒定電流將所述組織的細胞電穿孔。在一些實施方案中,電穿孔步驟還包括:測量電穿孔的細胞中的阻抗;相對于測量的阻抗調整能量脈沖的能量水平以保持電穿孔細胞中的恒定電流;其中所述測量和調整步驟發生在能量脈沖的使用期內。

在一些實施方案中,電穿孔步驟包括根據以分散模式遞送能量脈沖的脈沖序列模式,將能量脈沖遞送至多個電極。

本發明還包括編碼能夠在哺乳動物中引發免疫反應的多肽的DNA片段,所述免疫反應基本上類似于至少一種登革病毒亞型的非片段的免疫反應。當所述DNA片段應用于本文提供的特定編碼核酸序列時,它是選自于本發明的各種編碼核苷酸序列(包括SEQIDNO:1;編碼SEQIDNO:2、SEQIDNO:3的核苷酸序列;編碼SEQIDNO:4、SEQIDNO:5核苷酸序列;編碼SEQIDNO:6、SEQIDNO:7和SEQIDNO:8核苷酸序列)的至少一種的片段,并且可以是以下所述DNA片段中的任一種。在一些實施方案中,DNA片段可包括30個或更多、45個或更多、60個或更多、75個或更多、90個或更多、120個或更多、150個或更多、180個或更多、210個或更多、240個或更多、270個或更多、300個或更多、320個或更多、340個或更多或者360個或更多的氨基酸。在一些實施方案中,DNA片段可包括免疫球蛋白E(IgE)前導序列的編碼序列。在一些實施方案中,DNA片段可以包括少于60、少于75、少于90、少于120、少于150、少于180、少于210、少于240、少于270、少于300、少于320、少于340或少于360個核苷酸。

本發明包括由編碼核苷酸序列所編碼的多肽并且可包括具有SEQIDNO:2、4、6和8的氨基酸序列的多肽。本發明還包括能夠在哺乳動物中引發免疫反應的多肽片段,所述免疫反應基本上類似于至少一種登革亞型的非片段的免疫反應。當所述多肽片段應用于本文提供的特定多肽序列時,它們選自于本發明的各種多肽序列(包括SEQIDNO:2、4、6和8)的至少一種,并且可以是以下所述多肽片段中的任一種。在一些實施方案中,多肽片段可包括15個或更多、30個或更多、45個或更多、60個或更多、75個或更多、90個或更多、100個或更多、110個或更多或者120個或更多的氨基酸。在一些實施方案中,多肽片段可包括少于30、少于45、少于60、少于75、少于90、少于100、少于110或少于120個氨基酸。

在哺乳動物中引發與至少一種登革亞型的非片段的免疫反應基本上類似的免疫反應的功能片段的確定,可由本領域普通技術人員容易地確定。如由公共可利用的數據庫例如國家生物技術信息中心(NCBI)所提供的,可分析所述片段以包含至少一個、優選地更多個抗原表位。此外,可使用小鼠和抗體滴度以及酶聯免疫斑點分析(ELISpots)常規地評估免疫反應研究,例如在下文實施例中所示。

疫苗

在一些實施方案中,本發明通過提供蛋白質和編碼具有如下表位的蛋白質的遺傳構建體而提供了改進的疫苗:所述表位使得蛋白質特別有效地作為誘導免疫反應所針對的免疫原。因此,可提供疫苗以誘導治療性或預防性免疫反應。

根據本發明的一些實施方案,將根據本發明的疫苗遞送給個體來調節個體免疫系統的活性并由此增強免疫反應。當編碼所述蛋白質的核酸分子被所述個體的細胞攝取時,所述核苷酸序列在細胞中被表達并且所述蛋白質由此被遞送給個體。本發明的各方面提供了將蛋白質的編碼序列遞送到核酸分子例如質粒上的方法。根據本發明的某些方面,提供了預防性和/或治療性免疫個體的組合物和方法。

當被細胞攝取時,DNA質粒能夠作為分離的遺傳物質留在細胞中??裳≡竦?,RNA可被施用至細胞?;拱ㄌ峁┳魑咝暈⑿腿舊宓囊糯菇ㄌ?,包括著絲粒、端粒和復制起點。遺傳構建體包括核酸分子的基因表達所必需的調控元件。所述元件包括:啟動子、起始密碼子、終止密碼子和聚腺苷酸化信號。此外,編碼靶蛋白或免疫調節蛋白的序列的基因表達通常需要增強子。這些元件必須與編碼期望蛋白的序列可操作地連接,并且調節元件必須可操作地處于施用它們的個體中。

一般認為起始密碼子和終止密碼子是編碼期望蛋白的核苷酸序列的一部分。然而,這些元件在施用核酸構建體的哺乳動物中必須是有功能的。起始密碼子和終止密碼子與編碼序列必須處在框內。

所使用的啟動子和聚腺苷酸化信號必須是在個體細胞中有功能的。

實施本發明尤其是在人遺傳疫苗的生產中使用的啟動子的實例包括但不限于:來自猿猴病毒40(SV40)的啟動子、小鼠乳腺腫瘤病毒(MMTV)啟動子、人免疫缺陷病毒(HIV)例如牛免疫缺陷病毒(BIV)長末端重復(LTR)啟動子、莫洛尼(Moloney)病毒、禽類白細胞增生病毒(ALV)、巨細胞病毒(CMV)例如CMV立即早期啟動子、EB病毒(EBV)、勞斯氏肉瘤病毒(RSV)的啟動子,以及來自人類基因例如人肌動蛋白、人肌球蛋白、人血紅蛋白、人肌肉肌酸和人金屬硫蛋白(metalothionein)的啟動子;在其他實施方案中,啟動子可以是天然的或合成的組織特異性啟動子例如肌肉或皮膚特異性啟動子。此類啟動子的實例描述于美國專利申請公布第US20040175727號中,其以全文并入本文。

實施本發明尤其是在人遺傳疫苗的生產中使用的聚腺苷酸化信號的實例包括但不限于:SV40聚腺苷酸化信號、LTR聚腺苷酸化信號、牛生長激素(bGH)聚腺苷酸化信號、人生長激素(hGH)聚腺苷酸化信號和人β-珠蛋白聚腺苷酸化信號。具體而言,可使用pCEP4質粒(Invitrogen,SanDiego,CA)中的SV40聚腺苷酸化信號,稱為SV40聚腺苷酸化信號。

除了DNA表達所需的調控元件之外,其他元件也可以被包括在DNA分子中。此類其他元件包括增強子。增強子可選自于包括但不限于以下的組:人肌動蛋白、人肌球蛋白、人血紅蛋白、人肌肉肌酸和病毒增強子,例如來自CMV、RSV和EBV的增強子。

遺傳構建體可與哺乳動物復制起點一起被提供以便使構建體保持在染色體外,并且在細胞中產生構建體的多個拷貝。來自Invitrogen(SanDiego,CA)的質粒pVAX1、pCEP4和pREP4包含EB病毒的復制起點和產生未整合的高拷貝附加型復制的核抗原EBNA-1編碼區。

為了使蛋白質的產生最大化,可選擇很好地適合施用構建體的細胞中基因表達的調控序列。此外,可選擇在所述宿主細胞中被最有效率地轉錄的編碼所述蛋白質的密碼子。本領域普通技術人員可生產在細胞中有功能的DNA構建體。

在一些實施方案中,可提供其中本文所述蛋白質的編碼序列與IgE信號肽相連的核酸構建體。在一些實施方案中,本文所述的蛋白質與IgE信號肽相連。

在使用蛋白質的一些實施方案中,例如,本領域普通技術人員可使用公知技術生產并使用公知技術分離本發明的蛋白質。在使用蛋白質的一些實施方案中,例如,本領域普通技術人員可使用公知技術將編碼本發明的蛋白質的DNA分子插入到在公知表達系統中使用的可商購獲得的表達載體中。例如,可商購獲得的質粒pSE420(Invitrogen,SanDiego,CA)可被用于在大腸桿菌(E.coli)中生產蛋白。例如,可商購獲得的質粒pYES2(Invitrogen,SanDiego,CA)可被用于在酵母的釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)菌株中的生產。例如,可商購獲得的MAXBACTM完整桿狀病毒表達系統(Invitrogen,SanDiego,CA)可用于在昆蟲細胞中的生產。例如,可商購獲得的質粒pcDNA或pcDNA3(Invitrogen,SanDiego,CA)可用于在哺乳動物細胞,例如中華倉鼠卵巢(CHO)細胞中的生產。本領域普通技術人員可使用這些商購表達載體和系統或其他載體和系統通過常規技術和可容易獲得的起始材料生產蛋白質(參見例如Sambrook等人,MolecularCloningaLaboratoryManual(分子克隆實驗指南),第二版。ColdSpringHarborPress(1989))。因此,可以在原核系統和真核系統中制備期望蛋白,產生蛋白質的一系列加工形式。

本領域普通技術人員可使用其他可商購獲得的表達載體和系統,或者使用公知方法和容易獲得的起始材料來生產載體。包含必要的調控序列例如啟動子和聚腺苷酸化信號以及優選地包含增強子的表達系統可容易地獲得并且在本領域中對于各種宿主是已知的。參見例如,Sambrook等人,MolecularCloningaLaboratoryManual(分子克隆實驗指南),第二版。ColdSpringHarborPress(1989)?;蜆菇ㄌ灝ㄓ肫舳涌剎僮韉亓擁牡鞍字時嗦胄蛄?,所述啟動子在轉染構建體的細胞系或靶組織的細胞中是有功能的。組成型啟動子的實例包括來自巨細胞病毒(CMV)或SV40的啟動子。誘導型啟動子的實例包括小鼠乳腺白血病病毒或金屬硫蛋白的啟動子。本領域普通技術人員可從容易獲得的起始材料中容易地生產用于用編碼本發明的蛋白質的DNA轉染細胞的遺傳構建體。將包括編碼蛋白質的DNA的表達載體用來轉化相容的宿主,然后將所述宿主在其中發生外源DNA表達的條件下培養并保持。

通過溶解細胞或者從適當的和本領域技術人員已知的培養基中將產生的蛋白質從培養物中回收。本領域普通技術人員可使用公知技術來分離使用此類表達系統生產的蛋白質。使用與以上所述的特定蛋白特異性結合的抗體從自然來源中純化蛋白質的方法可同樣地應用于通過重組DNA方法產生的純化蛋白質。

除了通過重組技術生產蛋白質之外,還可以采用自動化肽合成儀來生產分離的、基本上純的蛋白。此類技術對于本領域普通技術人員是公知的,并且如果具有替代的衍生物沒有在DNA編碼的蛋白質的生產中提供的話,此類技術是有用的。

可使用幾種公知技術中的任一種遞送核酸分子,所述技術包括:有和沒有體內電穿孔的DNA注射(也稱為DNA接種),脂質體介導,納米顆粒促進,重組載體例如重組腺病毒、重組腺病毒相關病毒和重組牛痘苗。優選地,本文所述的核酸分子例如DNA質粒是通過DNA注射連同體內電穿孔遞送。

施用途徑包括但不限于:肌內、鼻內、腹膜內、皮內、皮下、靜脈內、動脈內、眼內和口服以及局部地、經皮、通過吸入或栓劑或者至粘膜組織例如通過灌洗至陰道、直腸、尿道、頰或舌下的組織。優選的施用途徑包括肌內、腹膜內、皮內和皮下注射。遺傳構建體可以通過如下手段施用,包括但不限于:常規注射器、無針注射裝置、“微彈轟擊基因槍(microprojectilebombardmentgonegun)”或其他物理方法例如電穿孔(“EP”)、“流體動力學方法”或超聲。

用于促進本發明的DNA疫苗的遞送的優選的電穿孔裝置和電穿孔方法的實例包括在Draghia-Akli等人的美國專利第7,245,963號、Smith等人遞交的美國專利申請公布第2005/0052630號中描述的實例,兩篇文獻的內容通過引用將它們的全部內容并入本文?;褂叛∠率鑫南字刑峁┑撓糜詿俳鳧NA疫苗的遞送的電穿孔裝置和電穿孔方法:2007年10月17號提交的共同待審和共有擁有的美國專利申請系列號11/874072,它依據美國法典第35條119款(e)要求享有2006年10月17日提交的美國臨時申請系列號60/852,149和2007年10月提交的美國臨時申請系列號60/978,982的權益,所有這些文獻均將其全部內容并入本文。

Draghia-Akli等人的美國專利第7,245,963號描述了標準電極系統和它們用于促進將生物分子導入身體或植物內選定組織的細胞中的用途。標準電極系統包括多個針狀電極;皮下針;提供從程序化恒定電流脈沖控制器到所述多個針狀電極的傳導連接的電連接器;以及電源。操作者可以抓住裝在支撐結構上的多個針狀電極并將它們牢固地插入到身體或植物內的選定組織中。然后將生物分子通過皮下針遞送到選定組織中。程序化恒定電流脈沖控制器被激活,并且恒定電流的電脈沖被應用到多個針狀電極。應用的恒定電流電脈沖促進生物分子導入到多個電極之間的細胞中。美國專利第7,245,963號的全部內容通過引用并入本文。

Smith等人遞交的美國專利申請公布第2005/0052630號描述了可被用來有效促進生物分子導入到身體或植物內選定組織的細胞中的電穿孔裝置。所述電穿孔裝置包括由軟件或固件指定操作的電動裝置(“EKD裝置”)。EKD裝置基于使用者的控制和脈沖參數的輸入在陣列中的電極之間產生一系列可程序化的恒定電流脈沖模式,并且允許電流波形數據的存儲和獲取。電穿孔裝置還包括具有針狀電極陣列的可替代的電極盤、用于注射針的中心注射通道以及可移去的引導盤。美國專利公開2005/0052630的全部內容通過引用并入本文。

美國專利第7,245,963號和美國專利申請公布第2005/0052630號中描述的電極陣列和方法適合用于深深穿入例如肌肉的組織以及其他組織或器官。因為電極陣列的配置,注射針(遞送選擇的生物分子)也被完全插入到靶器官中,并且注射被垂直施用至由電極預先劃定的區域中的靶組織。在美國專利第7,245,963號和美國專利申請公布2005/005263中描述的電極優選地是20mm長以及21厚度(gauge)。

以下是本發明的方法的一個實例,并且在以上討論的專利參考文獻中更詳細地被討論:可以配置電穿孔裝置來將產生的恒定電流的能量脈沖遞送至哺乳動物的期望組織,所述恒定電流類似于使用者的預設電流輸入。電穿孔裝置包括電穿孔部件和電極組件或手柄組件。電穿孔部件可包括并摻入電穿孔裝置的各種元件中的一個或多個,包括:控制器、電流波形發生器、阻抗測驗器、波形記錄器、輸入元件、狀態報告元件、通信端口、記憶部件、電源和電源開關。電穿孔部件能夠作為電穿孔裝置的一個元件起作用,并且其他元件是與電穿孔部件保持聯系的分開的元件(或部件)。在一些實施方案中,電穿孔部件能夠作為多于一個電穿孔裝置的元件起作用,它還能夠與電穿孔裝置的其他元件保持聯系,所述其他元件與電穿孔部件是分開的。本發明不受作為機電裝置或機械裝置的零件存在的電穿孔裝置的元件限制,因為所述元件能夠作為一個裝置或者作為彼此保持聯系的分開的元件起作用。電穿孔部件能夠遞送在期望組織中產生恒定電流的能量脈沖,并且包括反饋機制。電極組件包括在空間排布中具有多個電極的電極陣列,其中所述電極組件接收來自電穿孔部件的能量脈沖并且將此能量脈沖通過電極遞送到期望組織。多個電極中的至少一個在遞送能量脈沖的過程中是中性的,并且測量期望組織中的阻抗,并且將該阻抗傳遞到電穿孔部件。反饋機制能夠接收測量的阻抗并且能調整由電穿孔部件遞送的能量脈沖以保持恒定電流。

在一些實施方案中,所述多個電極能夠以分散模式遞送能量脈沖。在一些實施方案中,所述多個電極能夠通過在程序序列下控制電極以分散模式遞送能量脈沖,并且所述程序序列是由使用者輸入到電穿孔部件中。在一些實施方案中,程序序列包括按順序遞送的多個脈沖,其中多個脈沖中的每個脈沖是通過至少兩個活性電極和測量阻抗的一個中性電極遞送,并且其中多個脈沖中的隨后脈沖是通過至少兩個活性電極中不同的一個和測量阻抗的一個中性電極遞送。

在一些實施方案中,反饋機制是通過硬件或軟件執行的。優選地,反饋機制是通過模擬閉合環路執行的。優選地,這種反饋每50μs、20μs、10μs或1μs發生,但優選地是實時反饋或是瞬時反饋(即如通過用于確定反應時間的可用技術所確定的基本上瞬時的反饋)。在一些實施方案中,中性電極測量期望組織中的阻抗并且將該阻抗傳遞至反饋機制,該反饋機制響應該阻抗,并調整能量脈沖以將恒定電流保持在與預設電流類似的值。在一些實施方案中,反饋機制在遞送能量脈沖的過程中連續地并瞬時地保持恒定電流。

藥學上可接受的賦形劑可包括例如運載體、佐劑、載體或稀釋劑這類公共已知并且可容易獲得的功能分子。優選地,藥學上可接受的賦形劑是佐劑或轉染促進劑。在一些實施方案中,將核酸分子或DNA質粒遞送至細胞,并且施用多核苷酸功能增強劑或遺傳疫苗促進劑(或轉染促進劑)。多核苷酸功能增強劑描述于美國專利第5,593,972號、美國專利第5,962,428號和1994年1月26日提交的國際專利申請系列號PCT/US94/00899中,這些文獻各自通過引用并入本文。遺傳疫苗促進劑描述于1994年4月1日提交的美國系列第021,579號中,其通過引用并入本文。轉染促進劑能夠與核酸分子一起作為與核酸分子的混合物施用,或者在核酸分子施用的同時、之前或之后分開施用。轉染促進劑的實例包括表面活性劑,例如免疫刺激復合物(ISCOMS);弗氏不完全佐劑;LPS類似物,包括單磷酰脂質A;胞壁酰肽;醌類似物以及小泡例如角鯊烯和角鯊烯;并且也可以使用透明質酸與遺傳構建體聯合施用。在一些實施方案中,DNA質粒疫苗還可以包括轉染促進劑,例如脂質;脂質體,包括卵磷脂脂質體或本領域其他已知脂質體,為DNA脂質體混合物(參見例如W09324640);鈣離子;病毒蛋白;聚陰離子;聚陽離子或納米顆粒;或者其他已知的轉染促進劑。優選地,轉染促進劑是聚陰離子、聚陽離子,包括聚L谷氨酸(LGS)或脂質。

在一些優選的實施方案中,將DNA質粒與佐劑一起遞送,所述佐劑是進一步增強針對此類靶蛋白的免疫反應的蛋白質的基因。此類基因的實例是那些編碼其他細胞因子和淋巴因子的基因,所述細胞因子和淋巴因子例如α-干擾素、γ-干擾素、血小板衍生的生長因子(PDGF)、TNFα、TNFβ、GM-CSF、表皮生長因子(EGF)、IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-12、IL-18、MHC、CD80、CD86和IL-15,包括被刪除信號序列的IL-15并任選地包括來自IgE的信號肽??贍苡杏玫鈉淥虬ū嗦胍韻碌幕潁篗CP-1、MIP-lα、MIP-1p、IL-8、RANTES、L-選擇素、P-選擇素、E-選擇素、CD34、GlyCAM-1、MadCAM-1、LFA-1、VLA-1、Mac-1、pl50.95、PECAM、ICAM-1、ICAM-2、ICAM-3、CD2、LFA-3、M-CSF、G-CSF、IL-4、IL-18的突變體形式、CD40、CD40L、血管生長因子、成纖維細胞生長因子、IL-7、神經生長因子、血管內皮生長因子、Fas、TNF受體、Flt、Apo-1、p55、WSL-1、DR3、TRAMP、Apo-3、AIR、LARD、NGRF、DR4、DR5、KILLER、TRAIL-R2、TRICK2、DR6、胱天蛋白酶ICE、Fos、c-jun、Sp-1、Ap-1、Ap-2、p38、p65Rel、MyD88、IRAK、TRAF6、IkB、無活性NIK、SAPK、SAP-1、JNK、干擾素反應基因、NFkB、Bax、TRAIL、TRAILrec、TRAILrecDRC5、TRAIL-R3、TRAIL-R4、RANK、RANK配體、Ox40、Ox40配體、NKG2D、MICA、MICB、NKG2A、NKG2B、NKG2C、NKG2E、NKG2F、TAP1、TAP2以及它們的功能片段。

根據本發明的DNA質粒疫苗包含的DNA量為從約1納克到10毫克;約1微克到約10毫克;或者優選地約0.1微克到約10毫克;或者更優選地約100微克到約1毫克。在一些優選的實施方案中,根據本發明的DNA質粒疫苗包含約5納克到約1000微克的DNA。在一些優選的實施方案中,DNA質粒疫苗含有約10納克到約800微克的DNA。在一些優選的實施方案中,DNA質粒疫苗含有約0.1微克到約500微克的DNA。在一些優選的實施方案中,DNA質粒疫苗含有約1微克到約350微克的DNA。在一些優選的實施方案中,DNA質粒疫苗含有約25微克到約250微克的DNA。在一些優選的實施方案中,DNA質粒疫苗含有約100微克到約1毫克的DNA。

根據待使用的施用方式配制根據本發明的DNA質粒疫苗。在DNA質粒疫苗是可注射的組合物的情況中,它們是滅菌的和/或無熱原的和/或無顆粒的。優選地使用等滲制劑。一般來說,等滲性的添加劑可包括氯化鈉、右旋糖、甘露醇、山梨醇和乳糖。在一些情況中,優選等滲溶液,例如磷酸鹽緩沖鹽水。穩定劑包括明膠和白蛋白。在一些實施方案中,將血管收縮劑加到制劑中。在一些實施方案中,使得制劑在室溫或環境溫度下穩定延續的一段時間的穩定劑例如LGS或其他聚陽離子或聚陰離子被加到制劑中。

在一些實施方案中,引發哺乳動物針對共有登革抗原的免疫反應的方法包括誘導粘膜免疫反應的方法。此類方法包括向所述哺乳動物施用一種或多種CTACK蛋白、TECK蛋白、MEC蛋白和它們的功能片段或它們的可表達的編碼序列以及包括以上所述的共有登革抗原的DNA質粒。一種或多種CTACK蛋白、TECK蛋白、MEC蛋白和它們的功能片段可以在本文提供的DNA質粒登革疫苗的施用之前、同時或之后施用。在一些實施方案中,向哺乳動物施用分離的核酸分子,所述核酸分子編碼一種或多種選自由以下組成的組的蛋白質:CTACK、TECK、MEC和它們的功能片段。

在以下實施例中進一步舉例說明了本發明。應當理解這些實施例指出本發明的優選實施方案時,僅通過舉例說明方式被給出。由以上討論和這些實施例,本領域技術人員能夠確定本發明的必要特征,并且在不背離本發明的精神和范圍的情況下,能夠對本發明進行各種變動和改良以使其適合于各種運用和條件。因此,由上述描述,本發明的各種改良以及本文示出并描述的那些改良對本領域技術人員將是明顯的。此類改良也旨在落入所附權利要求書的范圍之內。

優選地,供本文所述的肌肉或皮膚EP裝置使用的DNA制劑具有小體積的高DNA濃度,優選包括微克到數十毫克量的、并且優選毫克量的DNA濃度,所述小體積對于遞送到皮膚是最佳的,優選小注射體積,理想的是25-200微升(μL)。在一些實施方案中,所述DNA制劑具有高DNA濃度,例如1mg/mL或更大(mgDNA/制劑體積)。更優選地,DNA制劑具有的DNA濃度提供了在200μL的配方中的克量的DNA,并且更優選在100μL的配方中克量的DNA。

可使用已知裝置與技術的組合配制或制造供本發明的EP裝置使用的DNA質粒,但優選地使用在以下文獻中描述的優化的質粒制造技術來制造它們:美國專利申請第12/126611號,它作為2009年1月1日公開的美國專利申請公布第20090004716號而公開。在一些實例中,在這些研究中使用的DNA質粒能夠以大于或等于10mg/mL的濃度配制。除了在美國專利申請公布第20090004716號中描述的和在2007年7月3日提交的美國專利第7,238,522號中描述的裝置和方案之外,制造技術還包括或結合了本領域普通技術人員通常知道的各種裝置和方案。供本文描述的皮膚EP裝置和遞送技術使用的高濃度質粒允許質粒以相當低的體積施用到ID/SC空間中并且幫助增強表達和免疫作用。公開文本美國專利申請公布第20090004716號和美國專利第7,238,522號均將其整體在此并入。

實施例

實施例1

prM防止E蛋白在病毒成熟期間由于形成非感染性不成熟病毒顆粒即prM-E異源二聚復合物的過早融合。不成熟顆粒通過高爾基體房室的低pH環境而轉變,并且在這個階段,在prM的加工之前,在E蛋白中發生可逆的構象變化。在prM通過反面高爾基體網狀結構中的細胞絲氨酸蛋白酶切割成M之后,產生了E的不可逆構象變化,從而維持中和抗原表位的完整性。

D1prME、D2prME、D3prME和D4prME是編碼包含pRM(預膜前體)蛋白和E(包膜)蛋白兩者中分別針對血清型D1、D2、D3或D4的共有序列的抗原的構建體。

DU是編碼包含以下共有序列的抗原的構建體:針對血清型D1的E(包膜)蛋白的DIII結構域的共有序列、針對血清型D2的E(包膜)蛋白的DIII結構域的共有序列、針對血清型D3的E(包膜)蛋白的DIII結構域的共有序列和針對血清型D4的E(包膜)蛋白的DIII結構域的共有序列,所述共有序列各自由連接體分開。構建了組合所有四種DIII結構域(通用的或通用DIII)的構建體并將其稱為DU(SEQIDNO:9),所述四種DIII結構域是由蛋白水解切割序列分開。具有序列SEQIDNO:10的共有DIII結構域DU由連接序列組成,所述連接序列連接DIII的四種亞型(DV-1-DIII、DV-2-DIII、DV-3-DIII和DV-4-DIII)中的每一種。所述連接體具有序列RGRKRRS,它是已知的切割位點并且允許將DU切割成具有特定亞型的單獨DIII序列。然而,所述連接序列可以是具有相似特征的本領域中可用的任何其他的連接序列,并且用這種連接體替換成當前利用的RGRKRRS屬于本領域的普通技術。

用100μg的D1prME、D2prME、D3prME、D4prME或DU免疫小鼠。小鼠接收用3PCellectra(ID)進行的3次免疫,每次免疫間隔3周,并且每3周在同一注射位點處采血。每一組包括5只動物(n=5)。

對來自每一小鼠的血清進行連續稀釋(1:50、1:150、1:450、1:1350和1:4050)。使血清接觸來自四種血清型D1、D2、D3或D4中的每一種的DIII(包膜蛋白E的結構域III)。通過在450nm下測量吸光度來測定血清中抗體與DIII蛋白的結合。BSA用作對照。

以下是實驗設計的概述。

表1.實驗設計

圖1-5中示出結果。如圖1所示,用D1prME免疫的所有小鼠產生結合來自D1的DIII的抗體,并且用DU免疫的所有小鼠也產生結合來自D1的DIII的抗體。如圖2所示,用D2prME免疫的所有小鼠產生結合來自D2的DIII的抗體,并且用DU免疫的所有小鼠也產生結合來自D2的DIII的抗體。如圖3所示,用D3prME免疫的小鼠3、4和5產生結合來自D3的DIII的抗體,但是并不與圖1和2所示的結合一樣良好。用D3prME免疫的小鼠1和2不產生良好結合來自D3的DIII的抗體。用DU免疫的所有小鼠產生結合來自D3的DIII的抗體。如圖4所示,用D1prME免疫的小鼠4和5產生結合來自D4的DIII的抗體,但是來自小鼠1、2和3的抗體不產生結合。用DU免疫的所有小鼠產生結合來自D4的DIII的抗體。

用蛋白質印跡分析對來自用D1prME、D2prME、D3prME或D4prME免疫的小鼠的血清分析蛋白E和蛋白prM。如圖5所示,蛋白E和prM是單獨的,并且存在于來自所有小鼠的血清中。

實施例2:登革Li-Cor測定

用100μg的D1prME、D2prME、D3prME、D4prME或DU免疫豚鼠。如以下詳細描述,在一些組中,用所有四種D1prME、D2prME、D3prME或D4prME在單個免疫位點或單獨免疫位點中免疫每一豚鼠。在單個施用位點中,以單次施用方式將所有四種混合在一起。對于單獨免疫位點來說,單獨地施用每一種。如在實施例2中,D1prME、D2prME、D3prME和D4prME是編碼包含分別來自血清型D1、D2、D3或D4的pRM(預膜前體)蛋白和E(包膜)蛋白兩者的抗原的構建體。DU是編碼包含以下共有序列的抗原的構建體:針對血清型D1的E(包膜)蛋白的DIII結構域的共有序列、針對血清型D2的E(包膜)蛋白的DIII結構域的共有序列、針對血清型D3的E(包膜)蛋白的DIII結構域的共有序列和針對血清型D4的E(包膜)蛋白的DIII結構域的共有序列,所述共有序列各自由連接體分開,如在實施例1中詳細所述。

對來自每一豚鼠的血清進行連續稀釋(1:50、1:150、1:450、1:1350和1:4050)。通過在450nm下測量吸光度來測定血清中抗體與登革熱病毒的結合。

進行血清的2倍連續稀釋,并且將它放置在96孔板中,每孔50μL。將50pfu(每孔50μL)的登革熱病毒加入每一孔中。將板在37℃下孵育1小時,以允許病毒與來自血清的抗體的中和。將整個混合物(100μL)加入VERO細胞(種子1.5x104/孔)。將板在37℃下孵育4天。使用3.7%甲醛將細胞固定30分鐘。使用0.1%TritonX-100/PBS洗滌并透化細胞。使用小鼠4G2mAb、生物素化抗小鼠IgG和IRDye800CW抗生蛋白鏈菌素+5mMDRAQ5混合物解決方案來執行基于細胞的ELISA。將板洗滌、干燥,并且使用Li-CorAerius系統掃描。計算800nm/700nm比率。

圖6-13示出結果。如圖6所示,來自兩只對照豚鼠(未免疫)的血清不結合來自D1、D2、D3或D4血清型的DIII。如圖7所示,用DU免疫豚鼠,并且僅豚鼠4產生結合來自D1、D2、D3和D4血清型的DIII蛋白的抗體。如圖8所示,用100μg的D1prME、100μg的D2prME、100μg的D3prME和100μg的D4prME的混合物免疫五只豚鼠,每只豚鼠總共400μg,全部在一個免疫位點。所有豚鼠產生結合來自D1、D2和D3的DIII蛋白的抗體。然而,僅兩只豚鼠產生結合來自D4的DIII蛋白的抗體,并且結合相對于其他血清型來說減弱。如圖9所示,用100μg的D1prME、100μg的D2prME、100μg的D3prME和100μg的D4prME在四個單獨位點處免疫五只豚鼠,每只豚鼠總共400μg。所有豚鼠產生結合來自D1、D2和D3的DIII蛋白的抗體。然而,僅三或四只豚鼠產生結合來自D4的DIII蛋白的抗體,并且結合相對于其他血清型來說減弱。如圖10所示,以每只100μg的D1prME免疫五只豚鼠。所有豚鼠產生結合來自D1的DIII蛋白的抗體。然而,僅幾只豚鼠產生結合來自D2、D3或D4的DIII蛋白的抗體,并且結合相對于D1來說減弱。如圖11所示,以每只100μg的D2prME免疫五只豚鼠。所有豚鼠產生結合來自D2的DIII蛋白的抗體。然而,僅一只豚鼠產生結合來自D1的DIII蛋白的抗體,并且結合相對于其他D1來說減弱。無豚鼠產生結合來自D3或D4的DIII蛋白的抗體。如圖12所示,以每只100μg的D3prME免疫五只豚鼠。所有豚鼠產生結合來自D1和D3的DIII蛋白的抗體。然而,僅一只豚鼠產生結合來自D2的DIII蛋白的抗體。無豚鼠產生結合來自D4的DIII蛋白的抗體。如圖13所示,以每只100μg的D4prME免疫五只豚鼠。四只豚鼠產生結合來自D4的DIII蛋白的抗體。豚鼠1產生結合來自D1和D2的DIII蛋白的抗體。僅幾只豚鼠產生結合(最小程度地)來自D2和D3的DIII蛋白的抗體。

圖8和9與圖7的比較指示:用D1prME、D2prME、D3prME和D4prME的組合(無論單獨還是混合)進行的免疫比用DU進行免疫產生對DIII更好的免疫原性。

實施例3:登革PRNT50和FRNT測定

用100μg的DU、D1prME、D2prME、D3prME或D4prME免疫豚鼠。如以下詳細描述,在一些組中,用所有四種D1prME、D2prME、D3prME或D4prME在單個免疫位點或單獨免疫位點中免疫每一豚鼠。如在實施例2和3中,D1prME、D2prME、D3prME和D4prME是編碼包含分別來自血清型D1、D2、D3或D4的pRM(預膜前體)蛋白和E(包膜)蛋白兩者的抗原的構建體。DU是編碼包含以下共有序列的抗原的構建體:針對血清型D1的E(包膜)蛋白的DIII結構域的共有序列、針對血清型D2的E(包膜)蛋白的DIII結構域的共有序列、針對血清型D3的E(包膜)蛋白的DIII結構域的共有序列和針對血清型D4的E(包膜)蛋白的DIII結構域的共有序列,所述共有序列各自由連接體分開,如在實施例2中詳細所述。

對于登革PRNT50測定來說,在第1天將VERO細胞以6孔格式接種(7.5x105至1.0x106個細胞/孔)。在第2天,在37℃下,用來自豚鼠的血清孵育50pfu的登革熱病毒/孔達1小時。所使用的登革熱病毒是菌株夏威夷、NGC、H87或H241中的一種。將混合物加入板中的細胞單層,并且在37℃下孵育1小時。用在2%培養基199中的1%甲基纖維素覆蓋細胞。在37℃下將細胞孵育達感染后5天。在第7天,用結晶紫/20%甲醇混合物固定并染色細胞(孵育2小時)。用dH2O洗滌板并且加以干燥。對噬斑計數。中和滴度被定義為:與無血清的對照相比,噬斑計數減少>50%的最高血清稀釋度的倒數。

對于FocusDiagnosticsFRNT測定來說,使用24孔板與血清的4倍稀釋。將板孵育4天。使用免疫聚焦來測定并計數噬斑的發展。

以下表2中以及圖14-17中示出結果。如圖14所示,來自用所有D1prME、D2prME、D3prME或D4prME構建體免疫的豚鼠以及來自只用D1prME免疫的豚鼠的血清產生結合來自夏威夷登革熱病毒的蛋白質的抗體。用DU進行的免疫則不產生。如圖15所示,來自用所有D1prME、D2prME、D3prME或D4prME構建體免疫的豚鼠以及來自只用D2prME免疫的豚鼠的血清產生結合來自NGC登革熱病毒的蛋白質的抗體。用DU進行的免疫則不產生。如圖16所示,來自用所有D1prME、D2prME、D3prME或D4prME構建體免疫的豚鼠以及來自只用D3prME免疫的豚鼠的血清產生結合來自H87登革熱病毒的蛋白質的抗體。在用DU進行的免疫之后觀察到的滴度是最小的。如圖17所示,來自用所有D1prME、D2prME、D3prME或D4prME構建體免疫的豚鼠以及來自只用D4prME免疫的豚鼠的血清產生結合來自H241登革熱病毒的蛋白質的抗體。用DU進行的免疫則不產生。

表2.通過LiCor、FRNT和PRNT測定來測定的1期臨床研究病毒中和抗體反應。

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