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维戈塞尔塔对莱加内斯: 離體快速繁殖地烏的方法.pdf

摘要
申請專利號:

维戈塞尔塔vs皇家社会 www.vmyqew.com.cn CN200810197165.7

申請日:

20080928

公開號:

CN101390496B

公開日:

20110420

當前法律狀態:

有效性:

有效

法律詳情:
IPC分類號: A01H4/00,C12N5/04 主分類號: A01H4/00,C12N5/04
申請人: 華中農業大學
發明人: 朱端衛,張忠池,楊特武,耿明建,黃漫翔,方賢東,李宏飛,王俊,辛龍
地址: 430070 湖北省武漢市洪山區獅子山街1號
優先權: CN200810197165A
專利代理機構: 武漢宇晨專利事務所 代理人: 王敏鋒
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法律狀態
申請(專利)號:

CN200810197165.7

授權公告號:

法律狀態公告日:

法律狀態類型:

摘要

本發明屬于植物組織培養技術領域,具體涉及一種離體快速繁殖地烏的方法。該方法包括地烏外植體的選擇與消毒,不定芽的誘導與增殖,擬球莖誘導與增殖、胚性愈傷組織的誘導、增殖、分化及生根等完整步驟。本發明提出了地烏外植體無菌消毒培養體系、培養程序及專用培養基等多項關鍵技術,成功地培育出地烏試管苗。本發明克服了自然條件下地烏繁殖周期長、繁殖系數低等缺點,為工廠化快速繁殖地烏試管苗提供了實用技術。

權利要求書

1.一種離體快速繁殖地烏的方法,其特征在于以下步驟:(1)外植體的選擇與消毒:1)選擇地烏根莖帶老組織的長度為1-2cm的休眠芽和剛萌發未展開的葉片作外植體;2)將該外植體用如下方法進行消毒:a.外植體為休眠芽的消毒:先在自來水下將地烏根莖芽體表面的泥沙沖洗干凈,并用軟毛刷將地烏根莖芽體表面的老死組織刷洗干凈,至芽體呈現白色,用1.5%的多菌靈水溶液浸泡2h,再用自來水沖洗0.5h,轉移至超凈工作臺,用75%酒精消毒30-60s,無菌水沖洗1-2遍,再用0.2%升汞溶液消毒8-12min,無菌水沖洗4-5遍,使該外植體在每次無菌水中的沖洗時間至少保持為1min,備用;b.外植體為剛萌發未展開的葉片的消毒:將剛萌發未展開的葉片用自來水沖洗干凈,轉移至超凈工作臺上,用75%酒精消毒30s,0.2%升汞消毒5min,無菌水沖洗2-3遍,備用;(2)接種與培養:用無菌濾紙吸去所述外植體表面水分,將所述葉片切成1cm×1cm小塊;或將休眠芽表面的老組織切除,然后從該芽中間剖開;將所述的休眠芽或葉片的外植體接種到不定芽或擬球莖誘導培養基上,誘導產生不定芽或擬球莖;或者將所述的休眠芽或剛萌發未展開的葉片外植體接種到胚性愈傷組織誘導培養基上,使其誘導產生胚性愈傷組織;外植體培養條件為:每天光照12h,培養溫度17-20℃,光照強度3000Lux,得到地烏不定芽或擬球莖或胚性愈傷組織;(3)繼代、增殖與分化培養:將步驟(2)得到的擬球莖或不定芽轉移到不定芽或擬球莖增殖培養基上進行增殖培養;或將步驟(2)得到的胚性愈傷組織轉移到胚性愈傷組織增殖培養基上進行增殖培養,進而再轉移到分化培養基上培養,得到叢生芽;繼代、增殖和分化的條件:每天光照12h,培養溫度17-20℃,光照強度為3000Lux;(4)生根培養:將步驟(3)的擬球莖或不定芽或叢生芽轉移到生根培養基上培養40-50d,使其生根;培養條件為:5℃,暗培養;所述培養基成分如下:不定芽或擬球莖誘導培養基:MS基本培養基+2.0mg/L?6-BA+0.2mg/L?NAA,頭孢噻肟鈉300mg/L,0.8%~1%瓊脂,3%蔗糖,補充蒸餾水至1L,調pH至5.8-6.0;胚性愈傷組織誘導培養基:MS基本培養基+2.0mg/L?6-BA+1.0mg/L?NAA,頭孢噻肟鈉300mg/L,0.8%~1%瓊脂,3%蔗糖,補充蒸餾水至1L,調pH至5.8-6.0;不定芽或擬球莖增殖培養基:MS基本培養基+2.0mg/L?6-BA+0.2mg/L?NAA,頭孢噻肟鈉300mg/L,0.8%~1%瓊脂,3%蔗糖,補充蒸餾水至1L,調pH至5.8-6.0;胚性愈傷組織增殖培養基:MS基本培養基+1.0mg/L?6-BA+0.5mg/L?NAA,頭孢噻肟鈉300mg/L,0.8%~1%瓊脂,3%蔗糖,補充蒸餾水至1L,調pH至5.8-6.0;分化培養基:MS基本培養基+2.0mg/L?6-BA+0.2mg/L?NAA,頭孢噻肟鈉300mg/L,0.8%~1%瓊脂,3%蔗糖,補充蒸餾水至1L,調pH至5.8-6.0;生根培養基:1/2MS基本培養基+0.2mg/L?NAA,頭孢噻肟鈉300mg/L,0.8%~1%瓊脂,3%蔗糖,補充蒸餾水至1L,調pH至5.8-6.0。

說明書

?

技術領域

本發明屬于植物組織培養技術領域,具體涉及一種離體快速繁殖地烏的方法。?

技術背景?

地烏,其學名是林蔭銀蓮花(Anemone?Flaccida?Fr.Schmidt)為多年生草本,屬于毛茛科銀蓮花屬植物,其干燥根莖稱為地烏,俗稱地烏。每年3~5月為地烏地上部生長發育時期?;?—2片,長葉柄,五角形,長2~7cm,寬3~10cm。根狀莖近圓柱形,最大直徑為1cm,3~5年方能采收入藥。地烏野生資源主要分布于長江中下游各省海拔1500~3000m的山坡林下陰濕處,鄂西山地分布相對集中。由此看來,野生地烏分布面積有限,生長期短,生長緩慢,生物量小,屬于珍稀植物。?

地烏性味溫、辛、微苦,由地烏提取物制成的銀蓮花膠囊具有祛風濕、強筋骨、消腫止痛之功效,地烏對類風濕性關節炎有良好的治療作用,而且毒副作用很小。由于野生地烏珍稀,對地烏進行中成藥開發,不能僅僅依靠野生資源,必須規?;斯ぴ耘?,否則,將導致地烏野生資源枯竭,自然生態環境遭到破壞。?

通過檢驗,地烏種子活力很低,目前,在實驗室條件下很難用其種子直接發芽生產地烏種苗。因此,現階段地烏規?;斯ぴ耘嗟鬧置韁荒勰歉鐾ü匚詰睦胩宸敝?組織培養)來獲取,關于地烏的離體快速繁殖目前國內外文獻中尚未見報導。?

發明內容

本發明的目的在于克服現有技術的缺陷,提出一種離體快速繁殖地烏的方法,以縮短常規育苗時間,提高育苗效率,實現地烏的快速繁殖。?

本發明通過以下技術方案實現:?

一種離體繁殖地烏的方法,包括以下步驟:?

(1)外植體的選擇與消毒:?

1)選擇地烏根莖帶老組織的長度為1-2cm的休眠芽和剛萌發未展開的葉片作外植體;?

2)將該外植體用如下方法進行消毒:?

a.外植體為休眠芽的消毒:先在自來水下將地烏根莖芽體表面的泥沙沖洗干凈,并用軟毛刷將烏根莖芽體表面的老死組織刷洗干凈,至芽體呈現白色,用1.5%的多菌靈水溶液浸泡2h,在用自來水沖洗0.5h,轉移至超凈工作臺,用75%酒精消毒30-60s,無菌水沖洗1-2遍,再用0.2%升汞溶液消毒8-12min,無菌水沖洗4-5遍,使該外植體在每次無菌水中的沖洗時間至少保持為1min,備用;?

b.外植體為剛萌發未展開的葉片的消毒:將剛萌發未展開的葉片用自來水沖洗干凈,轉移至超凈工作臺上,用75%酒精消毒30s,0.2%升汞消毒5min,無菌水沖洗2-3遍,備用;?

(2)接種與培養:用無菌濾紙吸去所述外植體表面水分,將所述葉片切成1cm×1cm小塊;或將休眠芽表面的老組織切除,然后從該芽中間剖開;將所述的休眠芽或葉片的外植體接種到不定芽或擬球莖誘誘導培養基上,誘導產生不定芽或擬球莖;或者將所述的芽或剛萌發未展開的葉片外植體接種到胚性愈傷組織誘導培養基上,使其誘導產生胚性愈傷組織;外植體培養條件為:每天光照12h,培養溫度17-20℃,光照強度3000Lux,得到地烏不定芽或擬球莖或胚性愈傷組織;?

(3)繼代、增殖與分化培養:將步驟(2)得到的擬球莖或不定芽轉移到不定芽或擬球莖增殖培養基上進行增殖培養;或將步驟(2)得到的胚性愈傷組織轉移到胚性愈傷組織增殖培養基上進行增殖培養,進而再轉移到分化培養基上培養,得到叢生芽;繼代、增殖和分化的條件:每天光照12h,培養溫度17-20℃,光照強度為3000Lux;?

(4)生根培養:將步驟(3)的擬球莖或不定芽或叢生芽轉移到生根培養基上培養40-50d,使其生根;培養條件為:5℃,暗培養;?

所述培養基成分如下:?

不定芽或擬球莖誘導培養基:MS基本培養基+2.0mg/L?6-BA+0.2mg/L?NAA,頭孢噻肟鈉300mg/L,0.8%~1%瓊脂,3%蔗糖,補充蒸餾水至1L,調pH至5.8-6.0;?

胚性愈傷組織誘導培養基:MS基本培養基+2.0mg/L?6-BA+1.0mg/L?NAA,頭孢噻肟鈉300mg/L,0.8%~1%瓊脂,3%蔗糖,補充蒸餾水至1L,調pH至5.8-6.0;?

不定芽或擬球莖增殖培養基:MS基本培養基+2.0mg/L?6-BA+0.2mg/L?NAA,頭孢噻肟鈉300mg/L,0.8%~1%瓊脂,3%蔗糖,補充蒸餾水至1L,調PH至5.8-6.0;?

胚性愈傷組織增殖培養基:MS基本培養基+1.0mg/L?6-BA+0.5mg/L?NAA,頭孢噻肟鈉300mg/L,0.8%~1%瓊脂,3%蔗糖,補充蒸餾水至1L,調pH至5.8-6.0;?

分化培養基:MS基本培養基+2.0mg/L?6-BA+0.2mg/L?NAA,頭孢噻肟鈉300mg/L,0.8%~1%瓊脂,3%蔗糖,補充蒸餾水至1L,調pH至5.8-6.0;?

生根培養基:1/2MS基本培養基+0.2mg/L?NAA,頭孢噻肟鈉300mg/L,0.8%~1%瓊脂,3%蔗糖,補充蒸餾水至1L,調PH至5.8-6.0。?

為了敘述方便,在本說明書的后面部分,申請人將“休眠芽”,稱之為“芽或地烏芽”,將“剛萌發未展開的葉片”稱之為“葉片或地烏葉片”,其含義同上述的定義是一個意思。?

本發明的效果是:?

(1)本發明采用的外植體來源不受季節限制,可以周年進行地烏的組織培養;?

(2)離體培養下的地烏體細胞胚可通過次生胚不斷增殖;具有良好的增殖效果;?

(3)本發明的方法對提高不定芽、擬球莖誘導率和體細胞胚分化率顯著。?

更詳細的技術方案見《具體實施方式》。?

附圖說明

圖1a和圖1b:是以地烏剛萌發未展開的葉片為外植體誘導產生的叢生芽。?

圖2a和圖2b:是以地烏休眠芽為外植體誘導產生的叢生芽。?

圖3a和圖3b:是以地烏剛萌發未展開的葉片為外植體誘導產生的擬球莖。?

圖4a和圖4b:是以地烏休眠芽為外植體誘導產生的擬球莖。?

圖5:是以地烏休眠芽為外植體,經過體細胞胚發生途徑的不同階段外植體形態?

具體實施方式

實施例1(通用培養程序)?

一種離體快速繁殖地烏的方法,其步驟如下:?

(1)外植體的選擇與消毒:?

1)選擇地烏根莖帶老組織的長度為1-2cm的休眠芽和剛萌發未展開的葉片作外植體;?

2)將該外植體用如下方法進行消毒:?

a.外植體為休眠芽的消毒:先在自來水下將地烏根莖芽體表面的泥沙沖洗干凈,并用軟毛刷將烏根莖芽體表面的老死組織刷洗干凈,至芽體呈現白色,用1.5%的多菌靈水溶液浸泡2h,在用自來水沖洗0.5h,轉移至超凈工作臺,用75%酒精消毒30-60s,無菌水沖洗1-2遍,再用0.2%升汞溶液消毒8-12min,無菌水沖洗4-5遍,使該外植體在每次無菌水中的沖洗時間至少保持為1min,備用;?

b.外植體為剛萌發未展開的葉片的消毒:將剛萌發未展開的葉片用自來水沖洗干凈,轉移至超凈工作臺上,用75%酒精消毒30s,0.2%升汞消毒5min,無菌水沖洗2-3遍,備用;?

(2)接種與培養:用無菌濾紙吸去所述外植體表面水分,將所述葉片切成1cm×1cm小塊;或將休眠芽表面的老組織切除,然后從該芽中間剖開;將所述的休眠芽或葉片的外植體接種到不定芽或擬球莖誘誘導培養基上,誘導產生不定芽或擬球莖;或者將所述的芽或剛萌發未展開的葉片外植體接種到胚性愈傷組織誘導培養基上,使其誘導產生胚性愈傷組織;外植體培養條件為:每天光照12h,培養溫度17-20℃,光照強度3000Lux,得到地烏不定芽或擬球莖或胚性愈傷組織;?

(3)繼代、增殖與分化培養:將步驟(2)得到的擬球莖或不定芽轉移到不定芽或擬球莖增殖培養基上進行增殖培養;或將步驟(2)得到的胚性愈傷組織轉移到胚性愈傷組織增殖培養基上進行增殖培養,進而再轉移到分化培養基上培養,得到叢生芽;繼代、增殖和分化的條件:每天光照12h,培養溫度17-20℃,光照強度為3000Lux;?

(4)生根培養:將步驟(3)的擬球莖或不定芽或叢生芽轉移到生根培養基上培養40-50d,使其生根;培養條件為:5℃,暗培養;?

所述培養基成分如下:?

不定芽或擬球莖誘導培養基:MS基本培養基+2.0mg/L6-BA+0.2mg/L?NAA,頭孢噻肟鈉300mg/L,0.8%~1%瓊脂,3%蔗糖,補充蒸餾水至1L,調pH至5.8-6.0;?

胚性愈傷組織誘導培養基:MS基本培養基+2.0mg/L6-BA+1.0mg/L?NAA,頭孢噻肟鈉300mg/L,0.8%~1%瓊脂,3%蔗糖,補充蒸餾水至1L,調pH至5.8-6.0;?

不定芽或擬球莖增殖培養基:MS基本培養基+2.0mg/L6-BA+0.2mg/L?NAA,頭孢噻肟鈉300mg/L,0.8%~1%瓊脂,3%蔗糖,補充蒸餾水至1L,調pH至5.8-6.0;?

胚性愈傷組織增殖培養基:MS基本培養基+1.0mg/L6-BA+0.5mg/L?NAA,頭孢噻肟鈉300mg/L,0.8%~1%瓊脂,3%蔗糖,補充蒸餾水至1L,調pH至5.8-6.0;?

分化培養基:MS基本培養基+2.0mg/L6-BA+0.2mg/LNAA,頭孢噻肟鈉300mg/L,0.8%~1%瓊脂,3%蔗糖,補充蒸餾水至1L,調pH至5.8-6.0;?

生根培養基:1/2MS基本培養基+0.2mg/L?NAA,頭孢噻肟鈉300mg/L,0.8%~1%瓊脂,3%蔗糖,補充蒸餾水至1L,調pH至5.8-6.0。?

生根培養基:1/2MS基本培養基+0.2mg/LNAA,頭孢噻肟鈉300mg/L,0.8%~1%瓊脂,3%蔗糖,補充蒸餾水至1L,調pH至5.8-6.0。?

具體步驟:

外植體的選擇與消毒?

本發明的核心之一是對地烏外植體進行消毒,以建立地烏的無菌(消毒)培養體系,而該體系是本發明之前從未見報道。?

由于地烏是多年生地下根莖,共生真菌、內生細菌多,其作為培養材料來源,首先要解決外植體污染問題。在保證外植體成活的前提下,通過外植體的預處理,篩選消毒劑種類、濃度,優化消毒方案,以及在培養基中添加不同抗生素等方法,來消除組織培養中污染,以期建立起地烏組織培養無菌體系。?

在選用帶有老組織材料為外植體時,不同消毒劑種類、濃度和消毒時間進行組合,用0.2%升汞消毒9min,在保證一定成活率的同時能夠有效控制污染;為了有效控制外植體中出現的真菌污染,操作中對外植體用殺菌劑進行預處理,用不同濃度的多菌靈、84消毒液(購自武漢東湖星科技公司商品)、不同處理時間對比試驗發現,以1.5%多菌靈浸泡外植體2h,能夠有效控制外植體中的真菌污染,保證操作高效進行。?

為了控制培養初期和培養后期外植體中內生菌造成的污染,本發明進行了不同種類、濃度抗生素的組合試驗,以頭孢噻肟鈉(華北制藥股份有限公司)300mg/L的濃度最佳,能夠控制外植體內生菌造成的污染,同時也不會對外植體的生長造成抑制作用,所以在本實施例的全過程的培養基中均添加有該抗生素。?

以葉片、葉柄、根莖和帶老組織的芽為外植體,進行對比試驗,葉片和芽均能誘導出芽和愈傷組織,且以芽為外植體的誘導率為最高。?

具體操作步驟:以帶部分老組織的地烏根莖芽(1-2cm)為外植體,在自來水下,將外植體表面的泥沙清洗干凈,于1.5%的多菌靈水溶液中浸泡2h,將芽放入小燒杯中,將其用自來水下沖洗0.5h,轉至超凈工作臺,置于已滅菌的100mL三角瓶中,加入75%酒精,不停振蕩,30s后用無菌水沖洗一遍,再將外植體轉入另一已滅菌的100mL三角瓶中,加入0.2%的升汞,滴加2滴吐溫-20,不停振蕩,消毒7min,棄去升汞溶液,外植體用無菌水沖洗5遍,每次沖洗時間不少于1min,直至無菌水中無泡沫止。?

葉片為外植體,將葉片用自來水沖洗干凈,轉移至超凈工作臺,用75%酒精消毒時間少于15s,0.2%升汞消毒5min。其他步驟均與芽處理相同。?

2、接種?

芽接種時,按不同的接種方式進行對比試驗,接種方式有完整的芽、1/2芽(4mm)、縱切薄片(2mm)和橫切薄片(2mm)。其中以1/2芽成活率和誘導率為最高。?

具體操作:將消毒好的外植體,轉移到培養皿中的濾紙上,吸去表面的水分,將芽體外層老組織切除后,從芽體中間將芽剖開,側放于培養基表面即可,于15-20℃光照條件下培養,光照強度30001ux,光照時間為12h/d。?

以葉為外植體,接種時,進行了不同接種方式的對比,接種方式有完整未展開葉、完整展開葉背面接觸培養基、完整展開葉腹面接觸培養基、葉片0.5cm方塊背面接觸培養基和葉片0.5cm方塊腹面接觸培養基。其中以完整未展開葉誘導率和成活率為最高。?

具體操作:將消毒好的外植體,轉移到培養皿中的濾紙上,吸去表面的水分,將葉柄切除,接種至培養基表面即可,于15-20℃光照條件下培養,光照強度30001ux,光照時間為12h/d。?

3、誘導和繼代培養?

本發明在外植體芽和葉片接種成活后,對其進行誘導和繼代培養,這一過程中進行了一系列的激素配?比試驗。其中不定芽或擬球莖誘導培養基最佳配方為:MS基本培養基+2.0mg/L6-芐氨基嘌呤(6-BA)+0.2mg/L萘乙酸(NAA),同時此培養基也是不定芽和擬球莖增殖培養基。胚性愈傷組織誘導培養基的最佳配方為:MS基本培養基+2.0mg/L6-BA+1.0mg/L?NAA,胚性愈傷組織增殖培養基為:MS基本培養基+1.0mg/L6-BA+0.5mg/L?NAA。?

步驟是:外植體(地烏芽或葉片)接種于不定芽或擬球莖誘導培養基上,每30d用同樣的培養基繼代一次,培養初代芽體開始膨大,表面輕微愈傷化,形成瘤狀的小突起,50d左右,開始產生嫩綠色新芽。外植體在胚性愈傷組織誘導培養基上培養45d左右,在外植體傷口處,產生胚性愈傷組織,將胚性愈傷組織轉移到胚性愈傷組織增殖培養基上培養,使其迅速增殖。?

4、生根培養?

本發明在根的誘導試驗過程中,進行了激素種類、濃度和培養條件的試驗,以1/2MS基本培養基+0.2mg/LNAA(成分參見生根培養基),5℃,暗培養為最佳組合。?

步驟是:將離體培養的不定芽和擬球莖,轉移到生根培養基上進行生根培養(1/2MS基本培養基+0.2mg/L?NAA),在5℃下暗培養40d后長出根,煉苗后移栽。?

本發明可以快速繁殖地烏組培苗。本發明操作簡便,分化指數高。通過組織培養可快速生產地烏繁殖體,是一種投資少、見效快的組培苗生產技術。本發明可以保持地烏自身優良的生藥學特性,以用于地烏中成藥的開發,具有可觀的經濟效益。同時,應用本發明可有效?;ひ吧匚謐試?,具有良好的生態效益;?

實施例2?

試驗材料選擇、培養基設計與接種培養?

1、實驗材料來源及其處理?

選用來自湖北省長陽土家族自治縣麻池銅鼓包海拔1800米左右山區野生地烏根狀莖作為試驗材料。使用前,將地烏根狀莖用申請人在先的發明專利申請(專利申請號:200810047075.X,公開號:CN101243741,發明名稱:解除地烏根狀莖休眠的方法)所介紹的方法使其萌發、生長,提供試驗用的外植體。地烏外植體的選擇標準及其誘導結果如表1所示:?

表1離體繁殖的地烏適宜外植體的選擇及誘導結果?

表1表明,地烏芽體為本實施例的最佳外植體,其次是未展開的地烏葉片。?

2、培養基設計:?

表2列出了本實施例中各種培養基成分及激素濃度,其中,MS基本培養基的配制參見:李明浚編譯,?植物組織培養,中國農業出版社,1992年版。?

表2離體繁殖地烏的培養基設計?

說明:(1)培養基中植物激素含義如下:6-BA(6-芐基腺嘌呤),NAA(萘乙酸)?

(2)上述MS基本培養基中各組分均可以從商業上購買,也可以按照上述文獻配制。?

3、培養條件?

地烏不定芽、擬球莖的誘導和增殖,胚性愈傷的誘導和增殖及分化培養條件:每天光照12h,培養溫度17-20℃,光照強度3000Lux。?

生根條件為5℃,暗培養。?

4、外植體的發育觀察?

由圖2,地烏芽外植體培養2周,在切口處出現白色透明的愈傷組織。2次繼代后,地烏芽明顯膨大,在愈傷組織的表面開始出現很多小的突起,小突起一部分長成不定芽(見圖2a,圖2b),一部分長成擬球莖(見圖4a,圖4b)。?

由圖3,經2次繼代后,部分地烏葉片外植體在接觸培養基的地方,出現小的突起,小突起分化成不定芽(如圖1a,圖1b);部分葉片卷曲成一團逐漸膨大,產生擬球莖(如圖3a,圖3b)。?

對產生的地烏不定芽、擬球莖繼續培養,可不斷分化出新的不定芽和擬球莖,再將這些新產生的不定芽和擬球莖進行切割、繼代,可達到不斷擴繁的效果。?

將不定芽、擬球莖長成的小植株,接種到生根培養基上,進行生根培養,40d左右便可長出新生根。?

實施例3?

不同濃度的萘乙酸(NAA)對離體繁殖地烏的影響?

在植物組織培養中,6-BA是一種應用得比較廣泛的生長素類生長調節劑,它被公認是一種有效的啟動細胞脫分化,形成愈傷組織或器官發生的生長素。?

地烏芽培養2周后,從切口處便可見白色透明的愈傷組織,30d繼代1次,再經2次繼代后,便可見?到3種不同再生組織,即不定芽、擬球莖和體細胞胚,分別對應于3種不同再生途徑,不定芽再生途徑、擬球莖再生途徑和體細胞胚發生途徑。觀察發現,6-BA的濃度為2.0mg/L時,NAA的濃度變化,會導致不同再生途徑的發生,?

表3不同濃度的NAA對離體繁殖的地烏的影響?

實施例4?

生根培養?

將地烏不定芽、擬球莖長成的小植株轉移至生根培養基上進行生根培養,分別進行的光照條件下培養和暗培養,結果表明以暗培養條件為佳,溫度宜為5℃。?

表4不同激素處理對離體繁殖地烏的生根的影響?

本領域技術人員能根據本發明的內容,在不脫離本發明所述范圍內,對上述方法所做的變動和改動,并取得相應的組織培養結果。因此,這些變化和改動也被認為包括在本發明所附權利要求的?;し段е?。

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