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艾拄维斯对维戈塞尔塔: 萵苣中抗生理學病癥的抗性.pdf

摘要
申請專利號:

维戈塞尔塔vs皇家社会 www.vmyqew.com.cn CN200780006217.1

申請日:

20070108

公開號:

CN101400252B

公開日:

20140611

當前法律狀態:

有效性:

有效

法律詳情:
IPC分類號: A01H1/00,A01H5/12 主分類號: A01H1/00,A01H5/12
申請人: 瑞克斯旺種苗集團公司
發明人: C·M·P·范杜恩,J·S·威爾特羅普,J·舒特,R·H·G·狄爾克斯
地址: 荷蘭德利爾
優先權: 06075040.3,06025321.8
專利代理機構: 中國國際貿易促進委員會專利商標事務所 代理人: 羅菊華
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法律狀態
申請(專利)號:

CN200780006217.1

授權公告號:

法律狀態公告日:

法律狀態類型:

摘要

本發明涉及用于就個體在其中的存在而篩選植物群體的方法,所述個體與對照植物相比,顯示減少的對乙烯和生理病癥特別是銹斑病和黃化的易感性,其中在黑暗處和在乙烯存在的情況下萌發種子群體以獲得幼苗,所述幼苗,當在乙烯下與原始的對乙烯敏感的對照相比,具有更長的下胚軸時,被選擇作為顯示減少的對乙烯和生理病癥特別是銹斑病和黃化的易感性的植物。本發明還涉及所選擇的植物。

權利要求書

1.有效鑒定對銹斑病和/或黃化具有抗性的萵苣植物的方法,其包括:在包含乙烯的氣氛下生長大量來自包含隨機誘導的突變的群體的變白的萵苣幼苗,通過鑒定具有與其中氣氛是由不含乙烯的空氣組成的情況下相比的下胚軸延長的幼苗來選擇與起始群體相比具有減少的乙烯敏感性的幼苗,和就針對銹斑病和/或黃化的抗性篩選對乙烯不敏感的幼苗。2.權利要求1的方法,其中鑒定具有與其中氣氛是由不含乙烯的空氣組成的情況下相比的下胚軸延長包括:測量在乙烯下萌發的幼苗的下胚軸對在空氣中萌發的幼苗的下胚軸的相對生長以將在乙烯和空氣中與原始的對乙烯敏感的對照相比,都具有更長的下胚軸的植物與只在乙烯下與原始的對乙烯敏感的對照相比,具有更長的下胚軸的植物區分開來,其中只在乙烯下與原始的對乙烯敏感的對照相比具有更長的下胚軸的植物被鑒定為顯示減少的對乙烯敏感的植物。3.權利要求1或2中所述的方法,其中植物是葉用蔬菜植物。4.權利要求3中所述的方法,其中植物屬于萵苣屬。5.權利要求4中所述的方法,其中植物屬于Lactuca?sativa種。6.權利要求1至5任一項中所述的方法,其中包含隨機誘導的突變的群體是突變體植物的群體、種質集合體或轉基因植物的群體。7.權利要求6中所述的方法,其中通過使用化學物質和/或輻射的誘變處理獲得突變體植物的群體。8.權利要求1至7任一項中所述的方法,其中乙烯的濃度為11至25μg/L。9.生產顯示與對照植物相比減少的對乙烯和銹斑病和/或黃化的易感性的植物的方法,該方法通過將其代表性種子在2007年1月3日在NCIMB保藏并具有41449、41450、41448、41451、41452或41453的保藏目錄號的植物與另一萵苣植物雜交來獲得后代和從具有減少的對乙烯和銹斑病和/或黃化的易感性的后代植物來進行選擇。10.權利要求9的方法,其中選擇是通過權利要求1-8中任一項所述的方法來進行的。11.萵苣植物在生產后代中的用途,其中所述的萵苣植物的代表性種子在2007年1月3日在NCIMB保藏并具有41449、41450、41448、41451、41452或41453的保藏目錄號。12.萵苣植物在生產種子中的用途,其中所述的萵苣植物的代表性種子在2007年1月3日在NCIMB保藏并具有41449、41450、41448、41451、41452或41453的保藏目錄號。13.萵苣植物在生產蔬菜產品中的用途,其中所述的萵苣植物的代表性種子在2007年1月3日在NCIMB保藏并具有41449、41450、41448、41451、41452或41453的保藏目錄號。14.權利要求13的用途,其中所述蔬菜產品是萵苣葉球或其部分,所述部分選自葉子或經加工的葉球。15.權利要求13的用途,其中所述蔬菜產品是經切割的葉子或嫩葉。

說明書

發明領域

本發明涉及用于就個體在其中的存在而篩選植物的群體的方法,所述個體在它們的乙烯反應模式方面發生了改變。本發明還涉及所鑒定的植物和植物部分,特別是葉類蔬菜。更特別地,本發明涉及顯示改變的對乙烯的反應的萵苣(Lactuca?sativa?L.),所述改變的反應導致該作物物種對生理病癥例如銹斑病(Russet?Spotting)和黃化(Yellowing)的減少的易感性。本發明還涉及這些植物和植物部分的種子和后代。

發明背景

葉類蔬菜如萵苣的育種目的在于產生最適合于產生銷路好的產品的商業品種。在選擇過程中需要考慮與輸入和輸出性狀都相關的許多特征。在該方面最重要的性狀中的一個性狀涉及收獲后質量特別是貯藏期。生理病癥,更特別地銹斑病和黃化的避免是可延長萵苣作物或其部分的貯藏期的重要因子。

乙烯是公知的刺激與衰老相關的生理過程的植物激素。在萵苣中,該刺激通過癥狀例如銹斑病和黃化的形成表現出來。

銹斑病癥的特征在于褐斑沿著葉的中脈的出現,而黃化是在作為葉綠素分解的結果在老化過程中發生的葉子的整體性變白。

盡管已知萵苣的成熟的葉球(head)產生僅僅微量的乙烯,但植物對該植物激素高度敏感。因此,與乙烯敏感性相關的生理病癥(所述生理病癥可降低萵苣的收獲后質量)主要由外源乙烯引起的。對此類外源乙烯的暴露可在收獲過程中、產品的加工和貯藏過程中發生。

例如,當將萵苣與乙烯產生性水果例如蘋果、梨或桃相鄰運輸或相鄰貯藏時,可發生嚴重的變質。此外,當加工萵苣并將其用于包裝的鮮切混合物中時,可能由于一種或多種成分導致乙烯釋放的原因而對可使用的成分存在限制。

銹斑病是表現在沿著葉的中脈出現許多褐斑的生理病癥。褐變病癥可在病癥的漸進階段擴展至整個葉片。已知銹斑病特別地在成熟萵苣葉球于低濃度(ppm水平)的乙烯存在的情況下在較低的溫度(5℃)下貯藏時易于發生。

可通過使用植物激素生長素或鈣來拮抗癥狀的形成。此外,包含低氧水平的改變的氣氛減少了癥狀發展的速度

在生物化學水平上,銹斑病表現為作為木質素生物合成的局部刺激結果而發生的,所述木質素的生物合成引起木質化和圍繞將出現可見癥狀的葉子區域的細胞壁增厚。

褐色變色由酚類代謝的刺激引起。已顯示由乙烯誘導的苯丙氨酸氨解酶(PAL)催化苯基丙酸類路徑的第一關鍵步驟。形成的酚類化合物主要包括咖啡酸衍生物和許多黃酮類例如(+)兒茶素和(-)表兒茶素(epicatechin)。多酚氧化酶(PPO)對這些化合物的隨后氧化導致通常在銹斑病中觀察到的褐色變色。最后,由于組織的塌陷和細胞死亡,病癥可變得更加嚴重。

衰老是在植物或植物器官的生命周期結束時天然發生的發育過程,在該過程中代謝被重新編程以將資源重新動員入生殖結構如種子。盡管衰老是由內源因子如生理年齡引起的發育過程,但存在許多可調控衰老的外源因子。

葉子的黃化是最明顯的衰老癥狀,是葉綠素在衰老的相對晚期中分解的結果,一旦葉子接受乙烯,乙烯可增強所述衰老。衰老的眾所周知的其他因子是損傷、黑暗和營養物的缺乏。盡管乙烯是已知刺激衰老的最重要的植物激素,但其他激素如茉莉酮酸酯也促進該過程。

從萵苣作物收獲時刻直至消費時刻,產品可能暴露于促進衰老的不同外源因子。這些因子可以是收獲和加工過程中的損傷、貯藏過程中的黑暗和營養物的缺乏以及加工和貯藏期間的乙烯。這些因子強烈地刺激可表現為銹斑病和黃化的收獲后病癥。盡管這些效應主要是表面性的,但產品的吸引力大大減少,從而導致沒有銷路。

為了抵抗變質效應,可采取可減少這些效應的許多收獲后措施。例如,可在低溫下貯藏收獲的萵苣以延緩衰老。盡管這可減少黃化的速度,但可增加銹斑病。此外,可執行減少從田間至消費者所需的運輸時間或防止萵苣貯藏在乙烯源的附近的物流措施。此外,可應用防止收獲后變質的化學處理,盡管食品安全和消費的接受明顯地成問題。

許多收獲后措施在一定程度上是成功的,但存在一定的提高空間。此外,有關的成本可以是很重要的,這是探尋減少對使用收獲后處理的需要的另外的選擇的另一個原因。優選,發現減少或消除對采用目前用于保持高水平的收獲后質量的昂貴的、預防性措施的需要的遺傳解決方法。

本發明的目的是提供允許鑒定對乙烯不敏感的植物的篩選方法。本發明的進一步目的是提供可通過所述方法獲得的植物。

按照本發明通過如下方法實現該目的,所述方法用于就個體(所述個體與對照植物相比顯示減少的對乙烯和生理病癥特別是銹斑病和黃化的易感性)在其中的存在篩選植物的群體,所述方法包括:

a)提供種子的群體;

b)在黑暗處和在乙烯存在的情況下萌發種子以獲得幼苗;

c)選擇顯示比對乙烯敏感的對照的下胚軸更長的下胚軸的幼苗;

d)將選擇的幼苗自交以產生種子;

e)在黑暗處和在乙烯存在的情況下,萌發一部分從各選擇的幼苗產生的種子,在黑暗處和在空氣中萌發另一部分來自各選擇的幼苗的種子;和

f)測量在乙烯下萌發的幼苗的下胚軸對在空氣中萌發的幼苗的下胚軸的相對生長以將在乙烯和空氣中與原始的對乙烯敏感的對照相比,都具有更長的下胚軸的植物與只在乙烯下與原始的對乙烯敏感的對照相比,具有更長的下胚軸的植物區分開來,

其中只在乙烯下與原始的對乙烯敏感的對照相比具有更長的下胚軸的植物被鑒定為顯示減少的對乙烯和生理病癥特別是銹斑病或黃化敏感的植物。

本發明基于這樣的假設,即對乙烯不敏感的植物特別是萵苣將對收獲后生理病癥例如銹斑病或黃化具有抗性。

在優選實施方案中,本發明的方法包括就它們的對銹斑病和/或黃化的抗性檢測已在之前的步驟中鑒定為顯示減少的對乙烯的敏感性的植物的進一步步驟。

可通過與標準比較和進行從1(該評分表示等于在乙烯下的對乙烯敏感的標準品種)至3(該評分表示等于在空氣下的對乙烯敏感的標準品種)的評分來觀察下胚軸長度和根長度。如果希望,可進行精確至毫米的測量。通過使用這些測量中的一種,可進行對于本領域技術人員來說是熟知的簡單統計分析如t檢驗來確定植物或植物群體對乙烯的敏感性是否比對乙烯敏感的標準如對′Troubadour′(RijkZwaan,De?Lier,NL)顯著更低。所使用的單側檢驗的顯著性水平是0.001。

對于突變體,優選進行原始品種的(所述原始品種被用于誘變處理,其為最佳的可得的標準)的下胚軸長度和任選地根長與個體突變體和/或它們的后代的下胚軸和根的長度之間的統計比較。

為了發現現有植物材料中的對乙烯不敏感的植物,選擇品種、繁殖系和/或基因庫目錄號的的一個或多個代表性樣品。然后合適地進行處于研究中的個體與群體的其余部分的下胚軸和根的長度之間的統計比較。當就顯著更長的下胚軸和/或根統計檢測個體時,可能需要多重試驗以保持適當的總體顯著性水平(Dunnett,CW,J.Amer.Statist.Assoc.50:1096-1121(1955)),例如使用一個標準的Dunnett多重比較。

待篩選的植物通常是多葉植物,特別地屬于萵苣屬和特別地屬于萵苣種(Lactuca?sativa)的植物。

植物群體優選是突變體植物的群體,因為在該變異體群體中發現本發明的植物的概率更高。然而,可按照本發明篩選在它們的遺傳組成方面不同的任何其他植物群體。

優選通過使用化學物質和/或輻射的誘變處理獲得突變體植物的群體。誘變處理是眾所周知的且在下文中進一步描述。

步驟b)中的乙烯的濃度是至少10μg/升,優選11至25μg/升。步驟d)中的乙烯的濃度是大約4至5μg/升。

本發明的篩選方法中的選擇步驟基于下胚軸的延長。黑暗中生長萌發的幼苗對乙烯的暴露引起下胚軸的徑向膨大以及根和下胚軸生長的抑制。該現象通常稱為三重反應(參見例如Guzman,P?&?Ecker,J,Plant?Cell?2:513-523(1990))。該反應的重現性允許篩選在乙烯存在或不存在的情況下顯示改變的三重反應的突變體。除了測量下胚軸的延長外或代替測量下胚軸的延長,本發明的選擇可基于三重檢驗的一個或多個其他因素。

根據其的其他方面,本發明提供了與對照植物相比顯示減少的對乙烯和生理病癥特別銹斑病和黃化的易感性的植物,可通過將植物種子的群體經歷本發明的篩選方法和從群體選擇與對乙烯敏感的對照植物相比,顯示更長的下胚軸作為顯示減少的對乙烯和物理病癥特別是銹斑病或黃化的易感性的植物來獲得所述植物。

本發明的植物優選是葉類蔬菜植物,特別地屬于萵苣屬和特別地屬于萵苣種的植物。

通過使用本發明的篩選方法,鑒定和篩選對乙烯不敏感的突變體。2007年1月3日將這些突變體的種子保藏在NCIMB?Ltd,FergusonBuilding,Craibstone?Estate,Bucksburn,Aberdeen,AB21?9YA?UK,并且如表1所示將目錄號賦予所述種子。在實施例3和實施例4中提供了關于保藏物的種子后代的詳細描述。制備這些保藏物,因為它們具有顯著減少的對乙烯的敏感性的單個特異性特征。未就品種注冊的DUS標準即關于所有注冊特征的可區別性、均一性、穩定性對它們進行檢測,并且不預期它們以任何方式滿足這些標準。

表1

??植物編號 ?內部參照?(=NCIMB參照) ??NCIMB目錄號 ??00D.7856 ??07D.826509 ??41449 ??00D.6876 ??07D.826514 ??41450 ??00D.7871 ??07D.826502 ??41448 ??00D.6883 ??07D.826522 ??41451 ??00D.6896 ??07D.826540 ??41452 ??00D.7845 ??07D.826542 ??41453

本發明還涉及顯示減少的對乙烯和生理病癥特別是銹斑病或黃化的易感性的植物,所述植物可通過將本發明的植物與相同種的另一個植物雜交來獲得。因此可將特征“減少的對乙烯和生理病癥特別是銹斑病或黃化的易感性”引入原先不具有該特征的其他植物??賞ü廡┲參錁痙⒚韉納稈》椒ɡ醇觳庥燒庋腦詠徊鬧參鍤欠袢肥凳潛痙⒚韉鬧參?。

本發明還涉及顯示減少的對乙烯和生理病癥特別是銹斑病或黃化的易感性的本發明的親本植物的后代。這樣的后代可以遠離親本許多代。只要特征“對乙烯和生理病癥特別是銹斑病或黃化的易感性”存在,后代植物就是本發明的植物。

本發明還涉及本發明的植物的部分。植物部分是例如萵苣的葉球或葉子,例如嫩葉(baby?leave)、經加工的葉球或經切割的葉子。

本發明的植物部分可用于組織培養以再生具有在植物(用于組織培養的組織所來源的植物)中發現的減少的對乙烯和生理病癥特別是銹斑病或黃化的易感性的植物。此類再生的植物也是本發明的部分。

本發明還涉及本發明的植物的種子??紗鈾鮒腫由こ鲆簿哂刑卣鰲凹跎俚畝砸蟻┖蛻聿≈⑻乇鶚切獍卟』蚧蘋囊贅行浴鋇鬧參???稍詒痙⒚韉納稈》椒ㄖ屑觳庵腫雍鴕虼舜悠瀋さ鬧參鍤欠癖3指錳卣?。本發明還涉及保留在原始種子中發現的減少的對乙烯和生理病癥特別是銹斑病或黃化的易感性的下一代的種子。

根據其的其他方面,本發明涉及蔬菜植物,包括本發明的植物或其部分。優選,蔬菜是葉類蔬菜,更特別地蔬菜是萵苣。

當在本發明的方法中篩選時,蔬菜產品顯示減少的對乙烯和生理病癥特別是銹斑病或黃化的易感性。

應當指出,本發明的篩選方法是相對簡單的方法??稍謐愎淮蟮娜魏偽湟焯迦禾逯屑ň哂屑跎俚畝砸蟻┖蛻聿≈⑻乇鶚切獍卟』蚧蘋囊贅行緣謀痙⒚韉鬧參?。不需要過多的實驗實施來再現本發明,因此本發明的植物一定不能解釋為限定于被保藏的植物。

因為它們的對乙烯的不敏感,本發明的萵苣植物材料和從其來源的種子顯示了在它們的收獲后質量(特別與衰老相關現象(所述衰老相關現象例如為銹斑病和黃化)相關的收獲后質量)方面具有強烈的增加。

發明詳述

因為乙烯是刺激衰老的最重要的植物激素和因為銹斑病和黃化與衰老相關,因而采用其中產生遺傳變異體和就乙烯的不敏感性選擇遺傳變異體的遺傳方法。發現該方法間接導致在它們的收獲后衰老反應中受到影響的突變體的鑒定。

使用植物模式種例如擬南芥以及作物種的詳細研究已提供了關于參與乙烯的生物合成和感知的生物化學途徑的信息。已就它們在該方面的作用表征了基因的許多等位基因形式,提供乙烯在植物中的功能的復雜狀況。乙烯,和其他植物激素一樣,在復雜的相互作用的調節網絡中包括的許多生理過程中起著重要作用。

尤其地,在乙烯生物合成、乙烯的感知、信號轉導以及下游效應蛋白的激活的背后的基因表達的水平上確定激素的空間和時間活性。

以不同水平牽涉的基因的等位變異體可確定反應的強度和與其他信號轉導途徑的交叉對話的水平。由于萵苣中乙烯的生物合成和感知未得到良好的表征以及為了允許鑒定不同的反應強度和它們背后的等位基因變異體,可推論出,無偏方法在該方面與被靶向的基因修飾方法相比會更成功。

這樣的無偏方法優選包括與有效率的表型篩選和基于變白的幼苗對乙烯的反應的選擇方法相結合的化學或物理隨機誘變方法。這樣的基于幼苗的選擇系統在每人小時可被評估的植物數目方面與使用成熟萵苣葉球相比要有效得多。此外,在幼苗的情況下,產生用于篩選的植物材料的時間與成熟的葉球相比明顯減少得多。

該方法的其他有利方面是,一旦已鑒定出成功的事件,幼苗階段的選擇條件在用作連續代中的收獲后性狀的預測性表型標記。明顯的風險存在于這樣的事實中,即幼苗階段的選擇可能不導致以成熟的、收獲后的水平表達選擇的性狀的遺傳變異體。此外,公認植物激素如乙烯參與許多可導致多效性作用的生理過程。取決于作物和其栽培條件,這些作用可以是正的或負的。因此采用的方法優選包括下列步驟:

1.通過用誘變劑例如甲磺酸乙酯(ems)或γ輻射處理種子或植物組織來產生突變體群體。

2.有效率的表型篩選的建立,在所述篩選中,選擇基于植物特別是萵苣的變白的幼苗對乙烯的反應,所述反應的特征在于下胚軸延長的強烈減少、縮短的、增厚的根以及夸張的頂部鉤曲率(apical?hookcurvature)。該反應稱為三重反應,所述三重反應通常用于變白的幼苗,且發現在許多植物種(當暴露于包含乙烯的氣氛中時)中不同程度地發生(參見例如Ecker?J,Science?268(5211):667-675(1995))。

3.在它們的三重反應中的至少一個試驗中在收獲后變質(所述變質包括銹斑病和黃化)方面發生改變的突變體的表征。任選地,改變的多效性不包括可影響植物的價值的負面多效性的確定。

因此在本發明的篩選方法中,待檢測的植物種子的群體優選是可通過如下方法獲得的突變種子的群體,所述方法包括:

a)用誘變劑處理待改變的植物種的M0種子以獲得M1種子;

b)從所獲得的M1種子生長植物以獲得M1植物;

c)通過M1植物的自體受精產生M2種子;和

d)任選地重復步驟b)和c)n次以獲得M1+n種子。

然后在黑暗處和在高乙烯濃度存在的情況下萌發所獲得的M1+n種子以獲得幼苗。然后,選擇不顯示對乙烯的反應的幼苗。待測量的反應是與對乙烯敏感的幼苗的下胚軸相比延長的下胚軸的發育。

然后,將各選擇的植物的后代分組并且在黑暗中生長:一半的后代在乙烯下,一半的后代在空氣下。在兩種條件下測量各后代的乙烯下對空氣下的下胚軸的相對生長。這些觀察用于區別后代(所述后代在乙烯下和在空氣下都具有比原始的對乙烯敏感的對照更長的下胚軸,從而可得出是對乙烯敏感的和不希望的)與真正具有減少的對乙烯的易感性的后代。

熟知的誘變劑的實例是ems。Ems主要烷基化:DNA鏈的G殘基,這在DNA復制期間引起與T而不是C的配對。因此,GC配對以由ems的有效劑量和植物的錯配修復系統的活性確定的頻率改變成AT配對。Ems的有效劑量取決于所使用的濃度、種子的大小和其他物理性質以及種子在ems溶液中的溫育時間。已用ems處理的種子通常稱為M1種子。作為處理的結果,M1種子的組織在它們的細胞的基因組中包含隨機點突變,存在于將形成種系組織(生殖細胞)細胞的亞群中的這些點突變將被傳遞至稱為M2的下一代。為單倍不足(haplo-insufficient)從而引起不育或誘導胚胎致死現象的突變或其組合將不被傳遞至M2代。

上述使用ems的相似方法同樣可用于其他誘變劑。M2群體可用于目的在于減少的變白的幼苗的三重反應的篩選方法。

其他誘變劑,特別地烷基化誘變劑,是硫酸二乙酯(des)、乙烯亞胺(ei)、丙磺酸內酯、N-甲基-N-亞硝基烏拉坦(nitrosourethane)(mnu)、N-亞硝基-N-甲脲(NMU)、N-乙基-N-亞硝基脲(enu)、疊氮化納。

可選擇地,通過輻射誘導突變,所述輻射選自例如X射線、快中子、紫外線照射。

在本發明的另一個實施方案中,通過基因工程例如通過使用嵌合寡核苷酸、同源重組、與內源產物競爭的經修飾的靶基因的導入、通過RNA干擾進行的下調等來誘導突變。

允許以特定的方式改變存在于植物的基因組中的基因靶的技術對于本領域技術人員來說是已知的。例如已證明嵌合寡核苷酸是具有特定作用模式的有效誘變劑。另一個方法是通過同源重組或基因打靶改變基因靶。通過使用該方法,通過導入的包含希望的變化的DNA片段交換基因的片段。轉基因方法也是可行的,在所述方法中導入與內源產物競爭的已改變的靶基因。這可導致顯性負效應。此外,通過RNA干擾特異性下調基因的表達是可行的。

在誘變寡核苷酸的情況下,基因打靶或轉基因方法用于改變參與乙烯功能的遺傳因子,很明顯,相關基因的一級結構應當是已知的。然而目前,對于萵苣,關于這樣的基因的知識是有限的。

優選,本發明還包括疊加(pyramiding)對乙烯的減少的易感性的等位基因。

合適地通過自花受粉實現M1和M1+n種子的產生。

本發明還涉及在它們的基因組中具有負責減少的對生理病癥例如銹斑病和黃化的易感性的和在表1中所列的在萵苣植物的基因組中發現的遺傳信息的植物或植物部分。

所述的植物的后代也是本發明的部分。此處所用的“后代”意欲包括具有與此處描述的原始植物相同的或相似的減少的對乙烯和生理病癥特別是銹斑病或黃化的易感性的和以任何方式(例如通過有性繁殖如自體受精或與相同屬的另一種植物異體受精或營養繁殖例如扦插、組織培養、單倍體培養、原生質體培養、原生質體融合或其他技術)從所述原始植物產生的所有植物。因此這樣的后代是按照本發明鑒定的植物的第一代,和是通過一種或多種這些技術產生的植物的第一代,也是通過一種或多種這些技術產生的每一個下一代,只要產生的植物具有減少的易感性。

為了確定變白的萵苣幼苗對乙烯的反應,使用特別設計的容器,在所述容器中,在其中乙烯水平可發生改變的氣氛下將萵苣幼苗在濾紙上生長。確實發現,萵苣幼苗通過下胚軸的減少的延長對乙烯的存在作出反應,這在原理上允許選擇對乙烯不敏感的突變體(如果此類突變體存在于所述可獲得的群體中且如果不敏感性在所使用的實驗條件下在幼苗水平上通過表型表達出來)。

通過在包含乙烯的氣氛下生長大量來自包含隨機誘導的突變的群體的變白的萵苣幼苗,發現可獲得和選擇與起始群體的乙烯敏感性相比,顯示減少的乙烯敏感性的幼苗。選擇顯示下胚軸延長至可與其中氣氛是由不含乙烯的空氣組成的情況下相比的程度的幼苗。證明以該方式鑒定的幼苗對乙烯不敏感。

為了確認對乙烯不敏感的突變體具有對褐斑和黃化的抗性,就它們對褐斑和/或黃化的抗性檢測篩選中鑒定的突變體。

褐斑檢測合適地包括在8℃的溫度下在黑暗處,在密閉的容器中貯藏收獲的成熟葉球,將它們暴露于6至7vpm(每百萬分之一體積部分)的濃度的乙烯氣體,在7天后,優選9天后評估褐斑病癥的存在。合適地,將對乙烯敏感的對照葉球與待檢測的植物一起溫育,將待檢測的植物的銹斑病與之比較。

黃化檢測包括將待檢測的萵苣植物的成熟葉球在8℃下貯藏在不含乙烯的貯藏室中,在10天后,優選14天后評估基葉(base?leaves)的黃化??夠蘋鬧參鍤竊?4天后不顯示基葉黃化的植物。合適地將對乙烯敏感的對照葉球與待檢測的植物一起溫育,將待檢測的植物的黃化反應與之比較。

如實施例中所舉例說明的,第一次證明對乙烯不敏感導致對不是由乙烯誘導的銹斑病和黃化的抗性。

令人吃驚地,也發現顯示與對照條件相比減少的延長反應但與敏感對照相比更長的幼苗,所述幼苗也被認為是對乙烷不敏感的,雖然是部分不敏感。

觀察到的乙烯不敏感性的可變水平可反映影響該性狀的不同突變基因座或相同基因座的不同等位基因形式在原始群體中的存在。

在隱性突變的情況下,可通過進行等位性測定來容易地區分這兩種可能性,所述測定包括將兩個突變事件雜交,確定雜種的表型。在突變的等位性的情況下,乙烯不敏感性將在F1中表現出來,然而如果突變體中的表型由不同的隱性基因座決定時,情況將不是這樣。

當隨機誘變用作產生起始群體的優選方法時,遺傳背景中的突變也可在實驗條件下促成幼苗表型的變化。為了區分不同強度的單個突變與遺傳背景中的突變的組合效應,應當進行回交以產生不同的對乙烯不敏感的事件的一致的遺傳背景。為了確定特定基因座上參與乙烯敏感性的突變是否異展示多效性,該方法也是適用的。

使用基于減少的對乙烯的反應所選擇的M2植物生長M3種子。在一些情況下,在三重反應檢測中就減少的乙烯敏感性選擇從M3種子長出的M3植物,將所述M3植物自交,從而產生M4種子。在少數情況下這被重復至M5。

在一個情況下,在三重反應檢測中就減少的乙烯敏感性選擇從M3種子生長的M3植物,然后將該M3植物與對乙烯和褐斑敏感的親本雜交,從而獲得F1種子。將從F1種子生長的F1植物自交從而產生F2種子。在三重反應檢測中就減少的乙烯敏感性選擇從這些F2種子生長的F2植物,將該F2植物自交,從而產生F3種子。將該F3系加入至成M3和M4近交系的組。隨后,就它們對乙烯的反應重新評估來自對乙烯不敏感的事件的近交系?;讜詘蟻┑鈉斬鑰掌鈉障掠酌緄南嘍隕ざ愿鶻幌檔牟幻舾行緣乃澆釁婪??;詬帽曜?,早期被評分為對乙烯不敏感的54個系中的12個系現分類為敏感的系。在M2水平上進行的最初的篩選中的這些假陽性可在下一代的事件的重新評估中容易地除去。

在常規的萵苣生產條件下在溫室中播種和栽培在乙烯檢測中顯示確定的和顯著的對乙烯的不敏感性的近交系,從而產生就銹斑病和黃化進行評估的成熟葉球(也參見實施例)。

作為陰性對照,栽培源于用于選擇對乙烯不敏感的事件的群體的對乙烯敏感的植物。令人吃驚地,當在盆栽土中種植時,所有對乙烯不敏感的突變體的種子正常萌發,即可與近等基因(near-isogenic)乙烯敏感型對照植物的種子相當。

這與其他植物種例如擬南芥(當在盆栽土中栽培時顯示萌發能力的急劇減少)(Harpham,N.J.V.等人(1991)Annals?of?Botany68,55-61)中的情況形成鮮明的對比。對于萵苣,很明顯可能按照正常的栽培實踐栽培對乙烯不敏感的突變體,所述栽培實踐在許多情況下包括在盆栽土塊或盆栽土塞(potting?soil?plug)中播種。

在栽培后,收獲成熟的葉球,將其暴露于乙烯。在包含乙烯的氣氛下在8℃下收獲后溫育葉球一周導致對乙烯敏感的對照植物的葉頭的銹斑病的強誘導。然而,被評估的37件對乙烯不敏感的事件中有29件顯示根本無銹斑病的跡象,這令人吃驚地證明在幼苗水平上選擇的乙烯抗性可在成熟植物水平甚至收獲后階段減少生理病癥。

可就在亞適溫下在不含乙烯的貯藏條件下就對許多乙烯不敏感的事件證明黃化抗性。這是令人吃驚的,因為到現在為止黃化抗性只在乙烯存在的情況下報導過(Saltveit等人,Postharvest?Biologyand?Technology?27:277-283(2003))。

將在下列的且不以任何方式限定本發明的實施例中舉例說明本發明。特別地,對萵苣進行實施例中的實驗,但本發明更廣泛地用于當與乙烯接觸時遭遇相似的收獲后困境的其他植物種。

在實施例中參考下列附圖。

圖:在8℃下在黑暗中,在暴露于乙烯9天的時間后,萵苣的成熟葉頭的表型。左圖顯示品種Troubadour的抗乙烯(乙烯.R)和對乙烯敏感的對照(-對照)葉頭的代表性樣品。右圖顯示來源于品種Apache的突變體的相似的圖。

實施例

實施例1

通過甲磺酸乙酯(ems)對萵苣進行的遺傳修飾

通過將每品種大約2000粒種子在室溫下浸入0.05%(w/v)或0.07%(w/v)的ems的充氣溶液中進行24小時來用ems處理Troubadour、Apache和Yorvik(所有三個品種來自Rijk?Zwaan,DeLier,the?Netherlands)。

萌發大約每ems劑量每品種大約1500粒處理的種子,將所得的植物從5月至9月栽培在荷蘭(Netherland)的溫室中以產生種子。

在成熟后,收獲M2種子,以每處理每品種將種子聚集成一群。將所得的6群M2種子用作起始材料以鑒定包含減少的易感性的等位基因的M2植物個體。

通過確定變白的植物的發生率來評估遺傳修飾的功效,所述變白表示由于直接或間接地參與葉綠素的形成或積累的基因的修飾而導致葉綠素的丟失。在所有6群M2種子中,觀察到變白的個體植物,這證明所用的處理導致遺傳修飾。

實施例2

已獲得減少的對乙烯的易感性的等位基因的萵苣植物的鑒定

在16℃下在黑暗中,在具有1020vpm(每百萬分之一體積部分)的乙烯濃度的小塑料容器中的紙上萌發M2萵苣種子。1vpm包含0.41μmol/升或1.14μg/升。將對乙烯不敏感的突變體與對乙烯敏感的對照進行比較,基于延長的下胚軸和/或根(即三重反應檢測)選擇對乙烯不敏感的突變體。將這些對乙烯不敏感的突變體生長至通過自體受精產生M3系。使用三重反應檢測以這些M3系進行重新檢測,從而驗證對乙烯的不敏感性。

當就乙烯的不敏感性發生系分離時,選擇植物,然后進行一個或兩個額外的近交循環,最后進行三重反應檢測,如果可能的話,選擇純合的對乙烯不敏感的系。

在一個情況下,在三重反應檢測中就減少的對乙烯的敏感性選擇從M3種子生長的M3植物,將M3植物與對乙烯和褐斑敏感的親本Troubadour雜交,從而獲得F1種子。將從F1種子生長而來的F1植物自交從而產生F2種子。在三重反應檢測中就減少的對乙烯的敏感性選擇從這些F2種子生長而來的F2植物,將所述F2植物自交從而產生F3種子。將所得的F3系加入至53個M3、M4和M5近交系的組。在該情況下,F3系只是原始M2突變體植物的代表,因為不存在從這些植物留下的自交種子。

在密閉的容器中在4至4.5vpm的乙烯的濃度下,在黑暗中在泥炭塊上(peat?block)萌發來自實施例1的54個M3和M4系的組。通過它們更長的下胚軸(與敏感型對照品種(Troubadour,Apache,Yorvik,)相比)鑒定對乙烯不敏感的突變體。結果顯示于表1中。通過三重反應檢測鑒定的54個系中的42個系至少在乙烯檢測中顯示為至少部分對乙烯不敏感。這些系代表40株M2植物,因為2株M2植物代表了2次。

表2顯示結果。

表2

密閉容器檢測和三重反應檢測(trt)中的突變系的乙烯反應。當顯示沒有相同的反應時,分別顯示對下胚軸和根的觀察。中間反應表示為partial。R=對乙烯不敏感的;S=對乙烯敏感的;R/S=分離(segregating);T=Troubadour;A=Apache;Y=Yorvik;hypo=下胚軸。

實施例3

具有獲得的對褐斑的減少的易感性的等位基因的萵苣植物的鑒定

將來自在實施例2中發現的42個系的37個對乙烯不敏感的系播種在溫室中以在常規的萵苣生產條件下產生成熟的葉球(位置:Maasdijk,the?Netherlands;播種:1月10日;移植:2月17日;收獲:4月18日)。將收獲的成熟葉球在8℃下于黑暗處貯藏在密閉的容器中。將它們暴露于6至7vpm(每百萬分之一體積部分)的濃度的乙烯氣體。1vpm包含0.41mol/升或1.14μg/升。在9天后,鑒定展示銹斑病的植物。所有對照植物,除了Yorvik外,都展示銹斑病。受試的37個系中的29個系與原始品種相比顯示不存在銹斑病或存在較少的銹斑病(表3)。

選擇6個系以進行繁殖和保藏在NCIMB?Ltd,Ferguson?Building,Craibstone?Estate,Bucksburn,Aberdeen?AB21?9YA,UK。第一系編號為02D.91445。其為來源于對乙烯不敏感的Troubadour-M2-植物00D.7856的M4系。對乙烯不敏感的M4植物選自實施例2中的密閉的容器檢測中的02D.91445,將所述M4植物自產以產生M5種子。從這些種子生長出16株M5植物以通過自交產生M6種子批。該種子批編號為07D.826509,并且以NCIMB號41449(第一性)將其保藏。

第二系編號02D.90047。其是來源于對乙烯不敏感的Troubadour-M2-植物00D.6876的M4系。對乙烯不敏感的M4植物選自實施例2中的密閉容器檢測中的02D.90047,將所述M4植物自交以產生M5種子。從這些種子生長出16株M5植物以通過自交產生M6種子批。該種子批編號為07D.826514,并且以NCIMB編號41450(第二系)將其保藏。通過檢測來源于02D.90047的M4植物的M5系03D.90323來確定該來源不存在銹斑病。

第三系編號為00D.88578。其是來源于對乙烯不敏感的Troubadour-M2-植物00D.7871的M3系。從00D.88578生長出16株M3植物以通過自交產生M4種子批。該種子批編號為07D.826502,并且以NCIMB編號41448(第三系)保藏其。

第四系編號為03D.90452。其是來源于對乙烯不敏感的Apache-M2-植物00D.6883的M5系。對乙烯不敏感的M5植物選自實施例2中的密閉容器檢測中的03D.90542,將所述M5植物自交以產生M6種子。從這些種子生長出16株M6植物以通過自交產生M7種子批。該種子批編號為07D.826522,并且NCIMB編號41451(第四系)保藏其。

第五系編號為01D.85780。其是來源于對乙烯不敏感的Apache-M2-植物00D.6896的M3系。對乙烯不敏感的M3植物選自實施例2中的密閉容器檢測中的01D.85780,將所述M3植物自交以產生M4種子。從這些種子生長出16株M4植物以通過自交產生M5種子批。該種子批編號為07D.826540,并且以NCIMB編號41452(第五系)保藏其。

第六系編號為04D.801660。其是來源于對乙烯不敏感的Yorvik-M3-植物02D.8484與對乙烯敏感的品種Troubadour的植物之間的雜交的F3系。M3植物02D.8484來源于對乙烯不敏感的Yorvik-M2-植物00D.7845。對乙烯不敏感的F3植物選自實施例2中的密閉容器檢測中的04D.801660,將所述F3植物自交以產生F4種子。從這些種子生長出16株F4植物以通過自交產生F5種子批。該種子批編號為07D.826542,并且以NCIMB編號41453(第六系)保藏其

圖1顯示抗性和對照植物。

實施例4

顯示較少的收獲后黃化的萵苣植物的鑒定

收獲如實施例3中所述在溫室條件下栽培的對乙烯不敏感的系,將成熟的修剪的葉球在8℃下貯藏在不含乙烯的貯藏室中。2周后,綠色對照品種Yorvik和Troubadour的基葉開始變黃。在該時刻和甚至在1周后,3個系表現出具有比它們的原始品種(所述品種是用于該試驗的對照)更少的黃色基葉。這3個系編號為04D.800900、03D.90323、04D.801660。

盡管報導了葉子黃化和乙烯存在之間的關系(Saltveit等人(2003)Postharvest?Biology?and?Technology?27:277283),但令人吃驚的是,在甚至無乙烯的條件中,對乙烯不敏感的系中的一些系表達較少的黃化表型。

表3

在乙烯條件中貯藏9天后,成熟的葉球上的銹斑病的觀察。0=癥狀不存在;1=較弱的癥狀;2=強癥狀;NA=不可獲得。

種子號?????乙烯????????trt??????褐斑????種子號??????乙烯??????trt????????褐斑

01D.85762??partial?R???R?hypo;?2???????00D.88565???R?????????R??????????0

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03D.90452??R???????????R????????0???????02D.91445???R?????????R??????????0.5

01D.85764??R/S?????????R?hypo;?1???????00D.88577???R/S???????R?hypo;???0

???????????partial?R???S根????????????????????????????????????S根

02D.90070??R???????????R????????0???????02D.91446???R?????????R??????????0

03D.90457??R???????????R????????0???????02D.91447???R?????????R??????????0

01D.85768??R???????????R????????0???????01D.85754???S????????R/S????????0

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02D.90129??R???????????R????????2???????02D.90047???R?????????R??????????NA

02D.90130??R???????????R????????2???????01D.85758???R?????????R??????????0

03D.90462??R???????????R????????2???????02D.91442???R?????????R??????????0

Apache?????S???????????S????????2???????Troubadour??S?????????S??????????1

03D.90464??R???????????R????????0???????00D.88569???R?????????R??????????0

02D.90133??R???????????R????????2???????00D.88573???R?????????R??????????0

02D.90134??R???????????R????????2???????00D.88578???R?????????R??????????0

00D.88600??R/S?????????R????????NA??????00D.88582???R?????????R??????????0

02D.91479??R???????????R????????0???????01D.85748???R/S???????R/S????????01

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