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维戈塞尔塔VS维拉利尔: 一種紅樹莓葉中具有抗AD活性的總黃酮的提取工藝.pdf

摘要
申請專利號:

维戈塞尔塔vs皇家社会 www.vmyqew.com.cn CN201610675030.1

申請日:

20160816

公開號:

CN106138293A

公開日:

20161123

當前法律狀態:

有效性:

審查中

法律詳情:
IPC分類號: A61K36/73,A61P25/28 主分類號: A61K36/73,A61P25/28
申請人: 白銀海瑞達生化科技有限公司
發明人: 劉戰朋
地址: 730900 甘肅省蘭州市白銀市高新技術產業園孵化基地
優先權: CN201610675030A
專利代理機構: 北京輕創知識產權代理有限公司 代理人: 談杰
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法律狀態
申請(專利)號:

CN201610675030.1

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法律狀態公告日:

法律狀態類型:

摘要

本發明公開了一種紅樹莓葉中具有抗AD活性的總黃酮的提取工藝,將紅樹莓葉原料用50%?100%乙醇溶液浸泡,再對其加熱回流提取,減壓濃縮得到粗提物后用水混懸,經大孔樹脂以水醇系統洗脫可初步得到粗總黃酮,再通過聚酰胺及CHP20樹脂柱色譜獲得更高純度的總黃酮。本發明采用的原料為紅樹莓副產物樹莓葉,成本低廉;本發明提取的總黃酮具有顯著的抑制Aβ蛋白聚集活性,以及在老年癡呆模型大鼠的水迷宮實驗中顯示了良好的抗AD活性;本發明方法設計合理,具有工藝簡單、成本低、能耗低和生產過程污染低的特點。

權利要求書

1.一種紅樹莓葉中具有抗AD活性的總黃酮的提取工藝,其特征在于,包括以下步驟:A、取紅樹莓葉原料陰干,用5-10倍體積量的乙醇水溶液提取2-3次,乙醇溶液的體積濃度為50%-100%,提取采用加熱回流提??;B、將提取液合并后減壓濃縮,除去乙醇,減壓濃縮干燥即得浸膏;C、浸膏加水混懸后,上D101大孔樹脂,水洗脫5-8個體積后再用體積濃度50%-70%乙醇溶液洗脫至流出液無色,收集乙醇洗脫液,減壓回收乙醇,濃縮干燥即得到粗黃酮浸膏;D、上步所得浸膏加醇溶解后,與2倍重量的聚酰胺填料混合,常溫拌樣干燥,取5倍重量的聚酰胺填料作為柱填料,10%-20%乙醇溶液洗脫5-8個體積后,再用濃度70%-90%的乙醇溶液洗脫至流出液無色,收集乙醇洗脫液,減壓回收乙醇,濃縮干燥得到純度更高的總黃酮浸膏;E、上步所得浸膏加水混懸后,上CHP20樹脂,水洗脫5-8個體積后再用體積濃度40%-60%乙醇溶液洗脫至流出液無色,收集乙醇洗脫液,減壓回收乙醇,濃縮干燥即得到高純度精制黃酮浸膏。2.如權利要求1所述的紅樹莓葉中具有抗AD活性的總黃酮的提取工藝,其特征在于,所述的步驟A中,所述的乙醇溶液的體積濃度為60%。3.如權利要求1所述的紅樹莓葉中具有抗AD活性的總黃酮的提取工藝,其特征在于,所述的步驟C中,所述的乙醇溶液的體積濃度為60%。4.如權利要求1所述的紅樹莓葉中具有抗AD活性的總黃酮的提取工藝,其特征在于,所述的步驟D中,先用15%的乙醇溶液洗脫5-8個體積后,再用濃度80%的乙醇溶液洗脫至流出液無色。

說明書

技術領域

本發明涉及植物醫藥技術領域,尤其涉及一種紅樹莓葉中具有抗AD活性的總黃酮的提取工藝。

背景技術

老年癡呆癥是一種非特異性的疾病綜合癥,患者主要是認知功能受到損傷從而表現為記憶、語言等能力明顯下降,而阿爾茨海默病(AD)則是其中最主要的一種癥狀。AD的病變還未完全明確,β樣淀粉蛋白(Aβ)被認為是AD發生發展過程中的關鍵誘導因子,可以引起記憶功能損傷和腦部組織的病理性改變,現在關于AD的治療方法也是多方面的,其中膽堿酯酶抑制藥仍是首選的治療方法。但這些藥物只能改善患者的認知、記憶功能障礙等癥狀,并且作用靶點單一,并不能從根本上阻斷AD的發展進程,故而尋找新的有效治療AD藥物仍是廣大醫藥學者重要的研究目標。傳統中藥治療方法在中國已有幾千年的應用歷史,由于其有效成分較多,具有多靶點、多環節的作用特點,因而在治療AD方面自然成為最具潛力的方式之一。我國植物資源豐富,在植物中尋找抗AD活性成分一直是植物化學和天然產物化學研究的主流。

紅樹莓(R.idaeus L.)又稱懸鉤子、木莓等,為薔薇科懸鉤子屬多年生落葉果樹,其果實中除含有這些豐富的營養成分外,還含有一些特殊的功效成分,如揮發油類、多酚類、萜類、黃酮類等,以及高于其他水果的SOD、水楊酸和樹莓酮等。這些活性成分,使樹莓具有很高的醫療保健功能。我國應用樹莓作為中藥(覆盆子)已有上千年的歷史,在《本草綱目》、《神農本草經》、《名醫別錄》等古書中對樹莓的藥用價值有詳細記載。據《本草綱目》記載:其(樹莓)莖、根、葉、籽皆可入藥,味甘性平,無毒;固腎精,補肝明目,縮尿。民間用于治療腹瀉、目赤、酒精中毒等。在古希臘、中國、印度以及美洲(印第安人)地區,人們使用樹莓葉治療傷口,腹瀉以及分娩時用作子宮松弛劑和興奮劑;在歐洲民間,樹莓地上部分和葉子也用于治療高血壓。在我國民間樹莓根用于治療高血壓,如新疆蒙古族常用其治療高血壓、肝炎等。樹莓的果實現在已可被利用,但其葉的價值尚未引起人們的足夠重視。

目前對紅樹莓的研究與開發利用主要集中在紅樹莓果實,因其富含營養成分及活性物質而深受研究者青睞,而樹莓葉大多數時候被舍棄,沒有被開發利用,目前尚未見紅樹莓葉中總黃酮富集工藝及抗老年癡呆活性的相關報道。

發明內容

本團隊通過抑制Aβ蛋白聚集活性進行活性導向追蹤,發現紅樹莓葉提取物的70%D101大孔樹脂洗脫部分有較好的抑制Aβ蛋白聚集活性,再經過聚酰胺及CHP20樹脂等對有效部位進一步富集,使總黃酮含量達到80%以上,同時活性大幅提高。確定該有效部位(總黃酮)為紅樹莓葉的抑制Aβ蛋白聚集的有效部位,同時,我們對精制后的總黃酮進行了老年癡呆模型大鼠的水迷宮實驗,結果顯示紅樹莓葉總黃酮具有顯著的抗AD活性。

一種紅樹莓葉中具有抗AD活性的總黃酮的提取工藝,包括以下步驟:

A、取紅樹莓葉原料陰干,用5-10倍體積量的乙醇水溶液提取2-3次,乙醇溶液的體積濃度為50%-100%,提取采用加熱回流提??;

B、將提取液合并后減壓濃縮,除去乙醇,減壓濃縮干燥即得浸膏;

C、浸膏加水混懸后,上D101大孔樹脂,水洗脫5-8個體積后再用體積濃度50%-70%乙醇溶液洗脫至流出液無色,收集乙醇洗脫液,減壓回收乙醇,濃縮干燥即得到粗黃酮浸膏(總黃酮含量35%以上);

D、上步所得浸膏加醇溶解后,與2倍重量的聚酰胺填料混合,常溫拌樣干燥,取5倍重量的聚酰胺填料作為柱填料,10%-20%乙醇溶液洗脫5-8個體積后,再用濃度70%-90%的乙醇溶液洗脫至流出液無色,收集乙醇洗脫液,減壓回收乙醇,濃縮干燥得到純度更高的總黃酮浸膏(總黃酮含量60%以上);

E、上步所得浸膏加水混懸后,上CHP20樹脂,水洗脫5-8個體積后再用體積濃度40%-60%乙醇溶液洗脫至流出液無色,收集乙醇洗脫液,減壓回收乙醇,濃縮干燥即得到高純度精制黃酮浸膏(總黃酮含量80%以上)。

所得的提取物利用FeCl3顏色反應呈陽性,且HCl-Mg反應呈陽性,確定所得提取物為總黃酮。利用可見分光光度法(中國藥典一部附錄ⅤA),以蘆丁(自制,純度98%)為對照品,并采用亞硝酸鈉-硝酸鋁-氫氧化鈉比色法,根據黃酮類化合物與鋁鹽反應生成紅色絡合物,檢測波長510nm,用于檢測各個色譜洗脫柱所獲得總黃酮的含量。

本發明將紅樹莓葉原料用50%-100%乙醇溶液浸泡,再對其加熱回流提取,減壓濃縮得到粗提物后用水混懸,經大孔樹脂以水醇系統洗脫可初步得到粗總黃酮,再通過聚酰胺及CHP20樹脂柱色譜獲得更高純度的總黃酮。

本方案相比于傳統方案的有益之處在于:

(1)本發明采用的原料為紅樹莓副產物樹莓葉,成本低廉,其價值尚未引起人們的足夠重視,其制成品在市場上尚未存在。

(2)利用我國樹莓資源豐富的特點,研究紅樹莓葉加工利用的新技術、新工藝,以求生產出新型的樹莓葉加工品是突破樹莓當前發展局限的一條途徑,從長遠的發展來看,大力發展我們自己的樹莓葉加工產業潛力巨大,前景廣闊。

(3)在抑制Aβ蛋白抑制活性追蹤的指導下對原藥材中的有效部位進行了充分的提純、濃縮及富集,得到其總黃酮(其有效部位),利用分光光度法測定總黃酮含量,其含量達到80%,遠優于其粗提物直接入藥。

(4)用本方法獲得的總黃酮,具有顯著的抑制Aβ蛋白聚集活性,以及在老年癡呆模型大鼠的水迷宮實驗中顯示了良好的抗AD活性,同時,樹莓作為一種藥食同源植物,其毒副作用必然較小,在抗老年癡呆癥藥物的研究開發中勢必具有廣闊的前景。

(5)本發明方法設計合理,具有工藝簡單、成本低、能耗低和生產過程污染低的特點。

附圖說明

圖1:紅樹莓葉精黃酮對水迷宮實驗中大鼠潛伏期的影響圖(mean±SD,n=10),注:與假手術組相比,**p<0.01;與模型組相比,**p<0.01。

圖2:紅樹莓精黃酮對水迷宮實驗中大鼠在目標象限所待時間的影響圖(mean±SD,n=10),注:與假手術組相比,**p<0.01;與模型組相比,**p<0.01。

圖3:紅樹莓精黃酮對水迷宮實驗中大鼠穿過平臺位置次數的影響圖(mean±SD,n=10),注:與假手術組相比,**p<0.01;與模型組相比,**p<0.01。

具體實施方式

實施例1紅樹莓葉總黃酮的富集

取紅樹莓葉1000g粉碎,加8000mL 60%乙醇溶液,回流提取2小時,過濾后濾渣再加3000mL 60%乙醇溶液回流提取1小時,合并兩次濾液,減壓回收乙醇,得到浸膏。將此浸膏用1000mL水混懸后上D101大孔樹脂,水洗脫5個體積后再分別用體積分數為60%乙醇溶液洗脫至流出液近無色,收集洗脫液,減壓回收乙醇,噴霧干燥得到干燥粉末,得到95.2g總黃酮。

利用FeCl3顏色反應呈陽性,且HCl-Mg反應呈陽性,確定所得提取物為總黃酮。利用可見分光光度法(中國藥典一部附錄ⅤA),以蘆丁(自制,純度98%)為對照品,并采用亞硝酸鈉-硝酸鋁-氫氧化鈉比色法,根據黃酮類化合物與鋁鹽反應生成紅色絡合物,檢測波長510nm,檢測結果顯示所得餾分中,其總黃酮含量為38%。經抑制Aβ蛋白聚集實驗,具體實驗方法如下:

1、Aβ的預處理

將預先保存于-80℃冰箱中的Aβ取出,以1mg/mL的濃度溶于HFIP中。室溫下靜置30min待其二級結構完全去除后,真空冷凍干燥去除HFIP,并置于-20℃冰箱中保存。

2、磷酸緩沖液(PBS,pH=7.4,0.1M)制備

緩沖液的制備(PBS,buffer):pH=7.4,濃度為0.1mol/mL。參照中華人民共和國藥典2010年版第二部附錄,取磷酸二氫鉀1.36g,加0.l mol/L氫氧化鈉溶液79mL,用水稀釋至200mL,用精密pH酸度計進行校正,即得。

3、Aβ反應試液的制備

取預處理后的Aβ凍干粉,用pH=7.4的0.1mol/mL PBS將其配制成50μmol/L的Aβ試液,-20℃凍存備用。

4、顯色劑配置

精密稱取Th-T粉末,用pH=7.4的0.1mol/mL PBS,配制成為10μmol/L的Th-T試液,現用現配。

5、化合物溶液的配制

用pH=7.4的0.1mol/mL PBS和DMSO,將VE和待測樣品分別配置濃度為10-3,10-4,10-5,10-6和10-7mol/L,DMSO的最終體積分數不大于0.001。

6、測定方法

組別設置:

(1)空白對照組:PBS 60μL,Aβ10μL,PBS+DMSO 10μL

(2)樣品抑制組:PBS 60μL,Aβ10μL,藥物10μL

(3)空白本底組:PBS 60μL,PBS 10μL,PBS+DMSO 10μL

(4)樣品本底組:PBS 60μL,PBS 10μL,藥物10μL

于96孔板分別加入上述各組溶液,置于恒溫孵育箱中37℃孵育24h,然后向各組中加入80μL Th-T溶液,置于恒溫孵育箱中37℃孵育5min,用酶標儀于(λex=450nm;λem=485nm)處測定各組熒光值。每組重復3次。

7、結果分析:

以Aβ單獨孵育后用Th-T測定的485nm處熒光值作為對照:為了避免化合物本身具有的熒光對結果的干擾,以扣除單獨受試化合物用Th-T測定的熒光值作為本底。抑制率的計算公式如下:

結果顯示:其對該蛋白的抑制率達到49.5%,其中陽性對照藥(姜黃素)抑制率為60.1%,結果顯示本實施例獲得的總黃酮抑制Aβ蛋白的活性稍弱于陽性藥。

實施例2紅樹莓葉總黃酮的富集

取實施例1所制備的粗品黃酮95.2g,加醇溶解后,與2倍重量的聚酰胺填料混合,常溫拌樣干燥,取5倍重量的聚酰胺填料作為柱填料,15%乙醇溶液洗脫5個體積后,再用濃度80%的乙醇溶液洗脫至流出液無色,收集乙醇洗脫液,減壓回收乙醇,濃縮干燥得到純度更高的總黃酮浸膏62.8g。

利用可見分光光度法(中國藥典一部附錄ⅤA),以蘆丁(自制,純度98%)為對照品,并采用亞硝酸鈉-硝酸鋁-氫氧化鈉比色法,根據黃酮類化合物與鋁鹽反應生成紅色絡合物,檢測波長510nm,檢測結果顯示所得餾分總黃酮含量為62%。經抑制Aβ蛋白聚集實驗,具體實驗方法參照實施例1:

結果顯示:其對該蛋白的抑制率達到59.2%,其中陽性對照藥(姜黃素)抑制率為60.1%,結果顯示本實施例獲得的總黃酮抑制Aβ蛋白的活性與陽性藥相當。

實施例3紅樹莓葉總黃酮的富集

取實施例2所制備的黃酮62.8g,加水混懸后,上CHP20樹脂,水洗脫5個體積后再用體積濃度55%乙醇洗脫至流出液無色,收集乙醇洗脫液,減壓回收乙醇,濃縮干燥既得到高純度精制黃酮浸膏33.8g。

利用可見分光光度法(中國藥典一部附錄ⅤA),以蘆丁(自制,純度98%)為對照品,并采用亞硝酸鈉-硝酸鋁-氫氧化鈉比色法,根據黃酮類化合物與鋁鹽反應生成紅色絡合物,檢測波長510nm,檢測結果顯示所得餾分總黃酮含量為82%。經抑制Aβ蛋白聚集實驗,具體實驗方法參照實施例1。

結果顯示:其對該蛋白的抑制率達到87.4%,其中陽性對照藥(姜黃素)抑制率為60.1%,結果顯示本實施例獲得的總黃酮抑制Aβ蛋白的活性強于陽性藥。

取本次實施例精制后總黃酮含量超過80%的樣品,進行實施例4的老年癡呆模型大鼠的水迷宮實驗。

實施例4老年癡呆模型大鼠的水迷宮實驗

取SD大鼠,雄性,體重250-300g,建立大鼠老年癡呆模型,動物隨機分為6組:

假手術組(Sham):動物不造模,灌胃給生理鹽水,每日一次,連續給藥30天;

模型組(Model):動物造模后,灌胃給生理鹽水,每日一次,連續給藥30天;

陽性對照組(Donepezil):動物造模后,灌胃給多奈哌齊1.5mg/kg,每日一次,連續給藥30天;

紅樹莓葉三種色譜柱精制總黃酮(RLTF)低劑量組:動物造模后,灌胃給紅樹莓葉總黃酮10mg/kg,每日一次,連續給藥30天;

紅樹莓葉三種色譜柱精制總黃酮(RLTF)中劑量組:動物造模后,灌胃給紅樹莓葉總黃酮50mg/kg,每日一次,連續給藥30天;

紅樹莓葉三種色譜柱精制總黃酮(RLTF)高劑量組:動物造模后,灌胃給紅樹莓葉總黃酮100mg/kg,每日一次,連續給藥30天。

應用水迷宮實驗觀察大鼠的認知功能。水迷宮儀器由一圓形水池和一可移動的圓形平臺組成,水池直徑100cm,水深40cm,水溫控制在23±1℃,平臺直徑15cm,水面高出平臺2cm。實驗時,平臺放置于第一象限的中間,水池上方設置自動攝像系統并連接計算機,跟蹤記錄大鼠的游泳軌跡,自動計算出大鼠在水池中游過的路程及找到平臺所需要的時間。正式實驗前,將動物放置在平臺上使其適應10s,然后將大鼠放入水中,觀察90s內的運動情況。記錄大鼠找到平臺所需要的時間,若動物90s內未找到平臺,將其輕輕放置于平臺上并持續15s,再放回籠中。每天訓練動物三次,連續3天,然后開始正式實驗。觀察大鼠自放入水池中至找到平臺所需要的時間,超過90s,則時間計為90s,每天一次,連續5天。實驗結束后,各動物休息一天,再進行記憶實驗。將平臺撤出,大鼠從第三象限放入水池,觀察并記錄120s內各大鼠在第一象限所在的時間以及經過平臺所在位置的次數。

結果顯示,與假手術組比較,模型組大鼠在5天實驗中,找到平臺的時間明顯增加(潛伏期),穿過第一象限次數及在第一象限所待的時間明顯下降。與模型組比較,紅樹莓葉精制總黃酮50mg/kg、100mg/kg劑量組可明顯降低大鼠的潛伏期,增加通過第一象限的次數及延長在第一象限所待的時間,差異有顯著性(P<0.01)。其效果與多哌奈齊組相似。具體參見圖1、圖2及圖3。

以上所述,僅為本發明較佳的具體實施方式,但本發明的?;し段Р⒉瘓窒抻詿?,任何熟悉本技術領域的技術人員在本發明揭露的技術范圍內,根據本發明的技術方案及其發明構思加以等同替換或改變,都應涵蓋在本發明的?;し段е?。

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