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韦斯卡维戈塞尔塔: 烏苯美司在制備用于預防和治療炎癥疾病和與炎癥相關的感染疾病的藥物制劑中的應用.pdf

摘要
申請專利號:

维戈塞尔塔vs皇家社会 www.vmyqew.com.cn CN201510323381.1

申請日:

20150612

公開號:

CN104887655A

公開日:

20150909

當前法律狀態:

有效性:

失效

法律詳情:
IPC分類號: A61K31/198,A61P29/00,A61P31/04,A61P13/10,A61P11/00,A61P17/00,A61P9/10,A61P31/06,A61P35/00,A61P31/00,A61P35/04,A61P19/02,A61P1/00,A61P7/02 主分類號: A61K31/198,A61P29/00,A61P31/04,A61P13/10,A61P11/00,A61P17/00,A61P9/10,A61P31/06,A61P35/00,A61P31/00,A61P35/04,A61P19/02,A61P1/00,A61P7/02
申請人: 上海來益生物藥物研究開發中心有限責任公司,上海交通大學
發明人: 錢峰,戈梅,何慧瓊,羅敏玉,夏興,饒敏
地址: 201203 上海市浦東新區張江高科技園區牛頓路200號8號樓5B
優先權: CN201510323381A
專利代理機構: 上?;ぷɡ攣袼?普通合伙) 代理人: 繆利明
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法律狀態
申請(專利)號:

CN201510323381.1

授權公告號:

法律狀態公告日:

法律狀態類型:

摘要

本發明提供了一種烏苯美司(Bestatin)的新應用,即其作為活性成分在制備用于預防和治療炎癥疾病和與炎癥相關的感染疾病的藥物制劑中的應用。本發明還提供了一種用于預防和治療炎癥疾病和與炎癥相關的感染疾病的藥物制劑,含有治療有效量的活性成分和藥學上可接受的載體或賦形劑,所述活性成分為烏苯美司、其旋光異構體或其藥物學上可接受的鹽。

權利要求書

1.烏苯美司作為活性成分在制備用于預防和治療炎癥疾病和與炎癥相關的感染疾病的藥物制劑中的應用,所述烏苯美司的化學結構式為:2.根據權利要求1所述的應用,其特征在于,所述炎癥疾病和與炎癥相關的感染疾病包括細菌感染、無并發癥的膀胱炎、支氣管炎、外傷、術后炎癥反應、意外傷害、心肌梗塞、結核病或肉狀瘤病、膿毒癥、轉移性腫瘤、活動期類風濕性關節炎、血清陰性的脊椎關節炎、免疫性血管炎、風濕性多肌病、局限性回腸炎、深部靜脈血栓形成的炎癥。3.一種用于預防和治療炎癥疾病和與炎癥相關的感染疾病的藥物制劑,其特征在于,含有治療有效量的活性成分和藥學上可接受的載體或賦形劑,所述活性成分為烏苯美司、其旋光異構體或其藥物學上可接受的鹽。4.根據權利要求3所述的藥物制劑,其特征在于,所述藥物制劑的劑型包括片劑、膠囊劑、口服液、顆粒劑或注射劑。

說明書

技術領域

本發明涉及烏苯美司作為活性成分在制備用于預防和治療炎癥疾病和與炎癥相關的感染疾病的藥物制劑中的應用。

背景技術

炎癥是一種十分常見而又重要的基本病理過程,任何能夠引起組織損傷的因素,如感染、非感染性組織損傷(如創傷、手術等)均可導致炎癥的發生,且這些炎癥具有很多相似的特征(Barton?GM.A?calculated?response:control?of?inflammation?by?the?innate?immune?system.J.Clin.Invest.,2008,118:413-420)。以細菌感染導致的炎癥為例,細菌分泌的內毒素(細菌脂多糖lipopolysaccharides,簡稱LPS)是細菌致病的主要因素,可引起機體的一系列炎癥反應。LPS誘導的炎癥信號與Toll樣受體(TLRs)家族等有關。當機體受到細菌感染時,LPS作用于細胞膜上TLRs受體,通過胞內信號傳遞,級聯基因表達發生變化,LPS可刺激體內多種細胞因子合成和釋放炎性因子(如NO,TNF-α,IL-6,IL-1β等),導致全身性炎癥反應發生,引起中毒性休克、全身炎癥反應綜合征(SIRS)和多器官功能障礙綜合征(MODS)等炎癥疾病(王曉東,內毒素中和蛋白及其在膿毒癥防治中的作用[J],國外醫學生理、病理科學與臨床分冊,2001,21(2):144-146;麗穎、王興鵬,阻斷內毒素信號傳導通路治療膿毒癥或膿毒性休克的研究進展[J],中華急診醫學雜志,2003,12(2):135-137;王穎、郭在晨,感染性休克的治療[J],中華實用兒科臨床雜志,2007,22(6):403-405;張雪梅、熊煥章,LPS誘導的炎癥反應信號傳導通路研究進展,中國獸醫雜志,2010,46(7):45-47)。因此,LPS可視為細菌的主要致病因子,在細菌感染的發病機理中起著十分重要的作用。同樣,在組織損傷時,機體會分泌大量細胞因子以修復損傷,但當反應過度時,也會引發SIRS、MODS等炎癥疾病。

烏苯美司(Ubenimex,又名Bestatin)是常見的抗腫瘤輔助藥物,可增強免疫功能,用于抗癌化療、放療的輔助治療等(Umezawa,H.,Aoyagi,T.,Suda,H.,Hamada,M.&Takeuchi,T.(1976).Bestatin,an?inhibitor?of?aminopeptidase?B,produced?by?actinomycetes,(29).Pp.97-99;Muskardin,D.T.,Voelkel.N.F.&Fitzpatrick,F.A.(1994).Modulation?of?pulmonary?leukotriene?formation?and?perfusion?pressure?by?bestatin,an?inhibitor?of?leukotriene?A4hydrolase.(48).pp.131-137;Hirayama,Y;Sakamaki,S;Takayanagi,N;Tsuji,Y;Sagawa,T;Chiba,H;Matsunaga,T;Niitsu,Y.(2003).“Chemotherapy?with?ubenimex?corresponding?to?patient?age?and?organ?disorder?for?18cases?of?acute?myelogeneous?leukemia?in?elderly?patients—effects,complications?and?long-term?survival”.Gan?to?kagakuryoho.Cancer&chemotherapy?30(8):1113-8)。烏苯美司的化學結構式為:

以前的研究表明,烏苯美司具有良好的體內免疫增強作用,如能增強T細胞和殺傷性NK細胞活性和功能等,但對在如細菌引起的急性炎癥中的作用尚未見報道。

發明內容

本發明的發明人在對烏苯美司(Bestatin)的功能做進一步研究中發現,其對于LPS引起的急性炎癥具有明顯的抑制作用。因此,本發明的目的在于提供一種烏苯美司(Bestatin)作為活性成分在制備用于預防和治療炎癥疾病和與炎癥相關的感染疾病的藥物制劑中的新應用。

為實現上述目的,本發明采用以下技術方案:

本發明的第一個方面是提供一種烏苯美司(Bestatin)作為活性成分在制備用于預防和治療炎癥疾病和與炎癥相關的感染疾病的藥物制劑中的應用,所述烏苯美司(Bestatin)的化學結構式為:

其中,所述炎癥疾病和與炎癥相關的感染疾病包括細菌感染、無并發癥的膀胱炎、支氣管炎、外傷、術后炎癥反應、意外傷害、心肌梗塞、結核病或肉狀瘤病、膿毒癥、轉移性腫瘤、活動期類風濕性關節炎、血清陰性的脊椎關節炎、免疫性血管炎、風濕性多肌病、局限性回腸炎、深部靜脈血栓形成的炎癥等。

發明人通過構建細菌內毒素LPS誘導的小鼠急性肺損傷模型,腹腔給予烏苯美司(Bestatin)藥物,檢測藥物對LPS引起的急性肺損傷的作用,以及檢測LPS誘導的炎性因子NO表達和釋放,檢測后發現,LPS誘導的炎性因子NO的釋放量急劇減少。

還通過髓過氧化物酶(Myeloperoxidase,MPO)活性檢測、肺盥洗液中總蛋白含量檢測,檢驗嗜中性粒細胞的浸潤情況,以評價LPS誘導的急性肺損傷嚴重程度。檢測結果表明,烏苯美司(Bestatin)對LPS誘導的小鼠肺部嗜中性粒細胞浸潤有抑制作用。

本發明的第二個方面是提供一種用于預防和治療炎癥疾病和與炎癥相關的感染疾病的藥物制劑,含有治療有效量的活性成分和藥學上可接受的載體或賦形劑,所述活性成分為烏苯美司(Bestatin)、其旋光異構體或其藥物學上可接受的鹽。

優選地,所述藥物制劑的劑型包括片劑、膠囊劑、口服液、顆粒劑或注射劑(如凍干粉針劑)。

藥物學上可接受的鹽可以是藥理學上和其藥物學上都接受的。藥理學上和其藥物學上可接受的鹽可以是堿金屬鹽或堿土金屬鹽,優選鈉鹽、鉀鹽、鎂鹽或鈣鹽。

所述藥物制劑涉及經腸的(例如口服、舌下含服或直腸給藥)、胃腸外的或局部的(如透皮藥物制劑)劑型。不與活性成分反應的有機或無機物可以作為載體,如水、油、苯甲醇、聚乙二醇、甘油三乙酸酯或其它脂肪酸甘油酯、明膠、卵磷脂、環糊精、乳二糖或淀粉等糖類、硬脂酸鎂、滑石或纖維素??詵靡┯叛∑?、糖衣丸劑、膠囊、粉、糖漿、濃縮劑或滴劑,直腸給藥優選栓劑,胃腸外給藥優選水溶液或油溶液,或凍干劑。也可以使用混懸劑、乳劑或植入劑,局部用藥可以用貼劑或乳膏劑。胃腸外使用的藥物制劑包括活性化合物的無菌含水或無水注射液,在此優選與受體血液等滲的溶液。

這些藥物制劑可以含有穩定劑、控制藥學活性化合物釋放的添加劑、抗氧劑、緩沖劑、抑菌劑和用于制備等滲溶液的佐劑。含水和無水的無菌混懸劑可以含有混懸添加劑和增稠劑。藥物制劑可以分裝在單劑量或多劑量容器如密封劑瓶中,也可以作為經凍干的制品保存,如需要,使用時可用無菌液體如水或鹽溶液配制?;箍梢砸醞姆絞絞褂夢蘧奐?、顆粒劑或片劑。

所述藥物制劑可用于人和動物中預防和治療炎癥和炎癥相關疾病。

附圖說明

圖1為構建的LPS誘導的小鼠急性肺損傷模型中,髓過氧化物酶(MPO)活性檢測結果圖表;

圖2A和圖2B為構建的LPS誘導的小鼠急性肺損傷模型中,肺盥洗液中總蛋白含量檢測結果圖表;其中,圖2A為LPS給藥4小時后肺盥洗液的總蛋白濃度測定,圖2B為LPS給藥12小時后肺盥洗液的總蛋白濃度測定;

圖3A為LPS誘導的Raw264.7細胞中,iNOS蛋白表達的兩次免疫印跡結果圖表;

圖3B為LPS誘導的Raw264.7細胞中,iNOS蛋白表達的量化分析圖表;

圖4為Griess法檢測培養上清中NO釋放量的檢測結果圖表。

具體實施方式

下面通過具體實施例對本發明進行詳細和具體的介紹,以使更好的理解本發明,但是下述實施例并不限制本發明范圍。

以下實施例中所使用的檢測方法的具體操作如下:

1、構建LPS誘導的急性炎癥模型:

將C57/BL小鼠分組,每組至少5只,稱重,分別用生理鹽水(陰性對照組)和5mg/kg的LPS(炎癥組)進行氣管給藥,在LPS注射前12小時,10分鐘后以及12小時后給予烏苯美司(Bestatin)腹腔注射(陰性對照組除外),0、4、24小時后處死,心臟取血,用1ml的PBS反復沖洗肺部,收集盥洗液后取肺組織,檢測肺盥洗液中總蛋白的含量,進行肺組織髓過氧化物酶(MPO)活性的檢測。

2、熒光定量PCR(QPCR):

Trizol裂解細胞,抽提RNA,逆轉錄PCR獲得cDNA,以此為模板進行熒光定量PCR,檢驗藥物作用前后誘導的炎癥相關細胞因子和炎性分子等的DNA轉錄水平變化。

3、免疫印跡(Western?Blot):

裂解并收集細胞,變性處理,SDS電泳80V?2小時,轉膜80V?1小時,5%牛奶封閉半小時,4℃孵育一抗過夜,TBST緩沖液(Tris-Buffered?Saline?and?Tween?20)洗膜3次,常溫孵育二抗1小時,TBST洗膜3次,Odyssey遠紅外觀測儀上觀察藥物作用前后誘導的一氧化氮合成酶iNOS蛋白表達水平變化等。

4、Griess法檢測NO釋放量:

NO在水溶液中極易形成NO2-,在酸性條件下,NO2-與重氮鹽磺胺發生重氮反應,生成重氮化合物,進一步與萘基乙烯基二胺發生偶合反應,其產物濃度與NO2-濃度具有線性關系,在540-560nm處有最大吸收峰。利用此原理可檢測細胞上清中NO的釋放量。

實施例1、烏苯美司(Bestatin)降低LPS誘導導致的肺部嗜中性粒細胞浸 潤:

將C57/BL小鼠30只,隨機分成3組,每組10只,稱重,分別進行如下操作:

陰性對照組:氣管注射0.9%的生理鹽水50μl;

LPS炎癥組:氣管注射5mg/kg的LPS?50μl;

LPS+烏苯美司治療組:在氣管注射LPS(5mg/kg,約50μl)前12小時和10分鐘后,兩次腹腔注射烏苯美司(每次10mg/kg,約200μl);

0、4、24小時后處死,心臟取血,同時取小鼠肺組織,分別進行肺組織髓過氧化物酶(MPO)活性的檢測和肺盥洗液中總蛋白的含量檢測,檢測結果分別如圖1、圖2A、圖2B所示。

通過上述三種檢測來檢驗嗜中性粒細胞的浸潤情況,以評價LPS誘導的急性肺損傷嚴重程度。

圖1為構建的LPS誘導的小鼠急性肺損傷模型中,髓過氧化物酶(MPO)活性檢測結果圖表。

從圖1的檢測結果顯示,LPS(5mg/kg)氣管給藥4小時和24小時后,與生理鹽水對照組(Saline)相比,小鼠肺部MPO活性均有3倍左右的增加,而在烏苯美司(Bestatin)(10mg/kg)干預下,MPO活性增加不超過2倍(其中,**P<0.01,***P<0.005,n>=5)。

圖2A和圖2B為構建的LPS誘導的小鼠急性肺損傷模型中,肺盥洗液中總蛋白含量檢測結果圖表;其中,圖2A為LPS給藥4小時后肺盥洗液的總蛋白濃度測定,圖2B為LPS給藥12小時后肺盥洗液的總蛋白濃度測定。

從圖2A和圖2B的肺盥洗液中總蛋白的含量測定結果顯示,烏苯美司(Bestatin)(10mg/kg)對LPS誘導的肺部總蛋白濃度增加有約50%(圖2A:4小時)和接近90%(圖2B:24小時)的抑制。

上述這些檢測結果說明,烏苯美司(Bestatin)對LPS誘導的小鼠肺部嗜中性粒細胞浸潤有明顯的抑制作用。

實施例2、烏苯美司(Bestatin)的抗炎效果:

本實施例以Raw264.7小鼠巨噬細胞系為例,比較烏苯美司(Bestatin)及其兩個衍生化合物對LPS誘導的炎性因子NO表達的影響,包括LPS刺激24小時后細胞中iNOS蛋白的表達(圖3A和圖3B)和細胞培養上清中NO的釋放量(圖4)。

本實施例涉及的烏苯美司(Bestatin)的結構式如下:

如圖3A和圖3B所示為LPS誘導的Raw264.7細胞中iNOS的蛋白表達水平檢測。將Raw264.7細胞以3.5×105/孔的密度接種于12孔板中,用含10%胎牛血清的1640培養液培養過夜,烏苯美司(Bestatin)以0.2mg/ml的濃度提前孵育30分鐘,對照組為等體積培養液(medium),用0.1μg/ml的LPS刺激誘導24小時。收集上清,裂解細胞進行免疫印跡分析。其中,圖3A為iNOS蛋白表達的兩次免疫印跡結果,β-actin為對照;圖3B為iNOS蛋白表達的量化分析,iNOS和β-actin的光密度比值用Image?J軟件測算,取三次獨立實驗的結果計算平均值標準誤差,比較烏苯美司(Bestatin)結果與LPS組,進行顯著性差異分析,其中**P<0.01。

如圖4所示為Griess法檢測培養上清中NO釋放量。細胞培養和刺激誘導如圖3A和圖3B所述,取培養上清,試劑盒檢測其中NO的釋放量。取三次獨立實驗的結果計算平均值標準誤差,比較烏苯美司(Bestatin)結果與LPS組,進行顯著性差異分析,其中**P<0.01,***P<0.005。

由圖3A、圖3B、圖4檢測結果看出,烏苯美司(Bestatin)對LPS誘導的Raw264.7細胞中的蛋白表達水平和LPS誘導的炎性因子NO的釋放量均有超過50%的減少。

因此,本發明提供了一種烏苯美司(Bestatin)的新應用,即其作為活性成分在制備用于預防和治療炎癥疾病和與炎癥相關的感染疾病的藥物制劑中的應用。由此,本發明還提供了一種用于預防和治療炎癥疾病和與炎癥相關的感染疾病的藥物制劑,含有治療有效量的活性成分和藥學上可接受的載體或賦形劑,所述活性成分為烏苯美司、其旋光異構體或其藥物學上可接受的鹽。進一步優選地,優選地,所述藥物制劑的劑型包括片劑、膠囊劑、口服液、顆粒劑或注射劑(如凍干粉針劑)。

以上對本發明的具體實施例進行了詳細描述,但其只是作為范例,本發明并不限制于以上描述的具體實施例。對于本領域技術人員而言,任何對本發明進行的等同修改和替代也都在本發明的范疇之中。因此,在不脫離本發明的精神和范圍下所作的均等變換和修改,都應涵蓋在本發明的范圍內。

關 鍵 詞:
烏苯美司 制備 用于 預防 治療 炎癥 疾病 相關 感染 藥物制劑 中的 應用
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