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皇家马德里vs维戈塞尔塔比分: 一種風蘭的組織培養快速繁殖方法.pdf

摘要
申請專利號:

维戈塞尔塔vs皇家社会 www.vmyqew.com.cn CN201610560836.6

申請日:

20160715

公開號:

CN106106167A

公開日:

20161116

當前法律狀態:

有效性:

有效

法律詳情:
IPC分類號: A01H4/00 主分類號: A01H4/00
申請人: 四川天藝優境環境科技有限公司
發明人: 姜福星,陳其兵,黃遠祥,周鵬
地址: 610041 四川省成都市高新區科園南路1號3棟4層3號
優先權: CN201610560836A
專利代理機構: 北京科億知識產權代理事務所(普通合伙) 代理人: 湯東鳳
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法律狀態
申請(專利)號:

CN201610560836.6

授權公告號:

法律狀態公告日:

法律狀態類型:

摘要

本發明公開了一種風蘭的組織培養快速繁殖方法,選取風蘭的葉片作為組培用的外植體;對葉片進行珠芽誘導培養形成類原球莖;類原球莖通過循環發生和重復發生進行有效增殖,并逐漸分化形成不定芽;不定芽生根培養形成不定根后進行馴化移栽,然后正常培養。本發明風蘭的組織培養快速繁殖方法,解決了風蘭的繁殖系數低、增殖速度慢的問題,建立了風蘭的高效再生體系,該方法不受地區、季節、氣候限制,可實現優質種苗的工廠化規?;?。

權利要求書

1.一種風蘭的組織培養快速繁殖方法,其特征在于,選取風蘭的葉片作為組培用的外植體;對葉片進行珠芽誘導培養形成類原球莖;類原球莖通過循環發生和重復發生進行有效增殖,并逐漸分化形成不定芽;不定芽和類原球莖生根培養形成不定根后進行馴化移栽,然后正常培養。2.如利要求1所述的風蘭的組織培養快速繁殖方法,其特征在于,具體包括以下步驟:步驟1,外植體的選擇及處理選取風蘭的葉片為起始材料,消毒后作為組培用的外植體;步驟2,類原球莖的誘導將經過消毒的外植體接種于類原球莖誘導培養基MS+TDZ5.0mg/L上進行培養,葉片基部逐漸形成胚性愈傷組織,胚性愈傷組織逐漸形成類原球莖;步驟3,類原球莖的增殖將步驟2形成的類原球莖轉接到類原球莖增殖培養基MS+6BA2.0mg/L上進行培養,類原球莖通過重復發生和循環發生實現有效增殖,并逐漸形成不定芽;步驟4,生根成苗及馴化移栽將誘導出的不定芽和類原球莖轉接到生根培養基MS+IBA1.0mg/L上進行培養,20~30天后,長出多條肉質不定根,生根成苗成為新的植株,煉苗、緩苗后正常培養。3.如利要求2所述的風蘭的組織培養快速繁殖方法,其特征在于,類原球莖誘導培養、類原球莖增殖培養及生根培養的培養條件均為:培養溫度25℃,光照時間為12~14h/d,光照強度為40~60u.Mol.m.s。4.如利要求2所述的風蘭的組織培養快速繁殖方法,其特征在于,類原球莖誘導培養、類原球莖增殖培養及生根培養,所用的基本培養基均為MS培養基,蔗糖用量為20~40g/L,凝固劑為瓊脂粉、用量為6~7g/L,活性炭2g/L,椰子汁添加量為10%,培養基pH為5.8。5.如利要求2所述的風蘭的組織培養快速繁殖方法,其特征在于,所述煉苗、緩苗具體為:先在組培室打開瓶蓋煉苗3天,然后將其移至溫室或蔭棚,再煉苗3天;然后將組培苗從培養瓶中取出,洗凈其表面的瓊脂,移栽到培養基質中進行緩苗,然后正常培養。6.如利要求5所述的風蘭的組織培養快速繁殖方法,其特征在于,所述培養基質為苔蘚。7.如利要求5或6所述的風蘭的組織培養快速繁殖方法,其特征在于,所述培養基質含水量25%以內,空氣相對濕度80~90%,遮光50%。

說明書

技術領域

本發明屬于植物繁殖技術領域,具體地說,涉及一種風蘭的組織培養快速繁殖方法。

背景技術

風蘭(Neofinetia falcate)是蘭科風蘭屬(Neofinetia spp)的多年生附生蘭,株型小巧玲瓏,葉片革質青翠,肥厚肉質,花型奇特,花瓣反卷,猶如迎風而來的玉精靈,花色潔白無瑕,花香迷人,陣陣幽香,發達的氣生根也惹人矚目;風蘭的根、莖、葉和花均具有較高的觀賞價值,并能吸收環境中的污染物質,凈化空氣,味道清幽,聞起來舒適宜人,風韻高雅別致,也被稱為“軒蘭”“富貴蘭”,也有一定的藥用價值。

風蘭在日本、韓國等有大量栽培,我國栽培較少,但是越來越受到人們的青睞和矚目,市場潛力巨大,前景廣闊。若沿用傳統的分株繁殖方法,繁殖系數低,增殖速度慢,遠遠不能滿足人們的需要;若用種子播種,種子又存在發育不完全,難以萌發,變異變化大,難以保存親本的優良性狀;風蘭的繁殖系數低,成為制約其研究開發的瓶頸。

發明內容

有鑒于此,本發明針對風蘭的繁殖系數低、增殖速度慢的問題,提供了一種風蘭的組織培養快速繁殖方法,建立風蘭的高效再生體系,可實現優質種苗的工廠化規?;?。

為了解決上述技術問題,本發明公開了一種風蘭的組織培養快速繁殖方法,選取風蘭的葉片作為組培用的外植體;對葉片進行珠芽誘導培養形成類原球莖;對類原球莖進行增殖培養,類原球莖通過循環發生和重復發生進行有效增殖,并逐漸分化形成不定芽;不定芽和類原球莖生根培養形成不定根后進行馴化移栽,然后正常培養。

進一步地,具體包括以下步驟:

步驟1,外植體的選擇及處理

選取風蘭的葉片為起始材料,消毒后作為組培用的外植體;

步驟2,類原球莖的誘導

將經過消毒的外植體接種于類原球莖誘導培養基MS+TDZ5.0mg/L上進行培養,葉片基部逐漸形成胚性愈傷組織,胚性愈傷組織逐漸形成類原球莖;

步驟3,類原球莖的增殖

將步驟2形成的類原球莖轉接到類原球莖增殖培養基MS+6BA2.0mg/L上進行培養,類原球莖通過重復發生和循環發生實現有效增殖,并逐漸形成不定芽;

步驟4,生根成苗及馴化移栽

將誘導出的不定芽和類原球莖轉接到生根培養基MS+IBA1.0mg/L上進行培養,20~30天后,長出多條肉質不定根,生根成苗成為新的植株,煉苗、緩苗后正常培養。

進一步地,類原球莖誘導培養、類原球莖增殖培養及生根培養的培養條件均為:培養溫度25℃,光照時間為12~14h/d,光照強度為40~60u.Mol.m-2.s-1。

進一步地,類原球莖誘導培養、類原球莖增殖培養及生根培養,所用的基本培養基均為MS培養基,蔗糖用量為20~40g/L,凝固劑為瓊脂粉、用量為6~7g/L,活性炭2g/L,椰子汁添加量為10%,培養基pH為5.8。

進一步地,所述煉苗、緩苗具體為:先在組培室打開瓶蓋煉苗3天,然后將其移至溫室或蔭棚,再煉苗3天;然后將組培苗從培養瓶中取出,洗凈其表面的瓊脂,移栽到培養基質中進行緩苗,然后正常培養。

進一步地,所述培養基質為苔蘚。

進一步地,所述培養基質含水量25%以內,空氣相對濕度80~90%,遮光50%。

與現有技術相比,本發明可以獲得包括以下技術效果:

(1)本發明通過選取風蘭的葉片作為組培用的外植體;對葉片進行珠芽誘導培養形成類原球莖;類原球莖通過循環發生和重復發生進行有效增殖,并逐漸分化形成不定芽;不定芽和類原球莖生根培養形成不定根后進行馴化移栽,然后正常培養,解決了風蘭的繁殖系數低、增殖速度慢的問題,建立了風蘭的高效再生體系;

(2)通過葉片組織培養進行風蘭快繁,不受地區、季節、氣候限制,可實現優質種苗的工廠化規?;?,而且遺傳性狀相對穩定一致;

(3)為完善風蘭的遺傳轉化體系,建立分子育種的平臺,從分子水平對其進行遺傳改良,深入研究開發利用奠定了基礎。

當然,實施本發明的任一產品并不一定需要同時達到以上所述的所有技術效果。

附圖說明

此處所說明的附圖用來提供對本發明的進一步理解,構成本發明的一部分,本發明的示意性實施例及其說明用于解釋本發明,并不構成對本發明的不當限定。在附圖中:

圖1是本發明實施例風蘭的組織培養快速繁殖過程對比圖;圖中,A為風蘭葉片基部誘導形成胚性愈傷組織和類原球莖,B為類原球莖的增殖,C為類原球莖長出葉片和不定芽,D為類原球莖長出肉質根,E為風蘭生根成苗,F為風蘭盆栽。

具體實施方式

以下將配合實施例來詳細說明本發明的實施方式,藉此對本發明如何應用技術手段來解決技術問題并達成技術功效的實現過程能充分理解并據以實施。

本發明一種風蘭的組織培養快速繁殖方法,具體包括以下步驟:

步驟1,外植體的選擇及處理

選取風蘭的葉片為起始材料,消毒后作為組培用的外植體;

具體地,所述消毒具體為:將風蘭葉片用洗潔精溶液清洗30min,期間不斷輕輕攪拌,然后流水沖洗30~60min,在已經消毒的超凈工作臺上將上述清洗過的風蘭葉片轉移至無菌燒杯中,用體積濃度為75%的酒精浸泡30~60s,期間不斷晃動燒杯,倒出酒精,再用質量濃度0.1%的升汞浸泡3~5min,浸泡期間不斷輕輕晃動,倒出升汞后,用無菌水清洗經過消毒的葉片3次以上。

步驟2,類原球莖的誘導

在超凈工作臺上,將經過表面消毒的外植體轉移至無菌接種盤中,用無菌濾紙吸干外植體表面水分,用消過毒的剪刀將葉片基部向下插入類原球莖誘導培養基MS+TDZ5.0mg/L(TDZ:噻苯隆)上進行培養,20d后葉片基部形成黃色的胚性愈傷組織,再過20d后,胚性愈傷組織由黃變綠,形成小綠球,類原球莖形成,如圖1(A)所示;

培養條件:培養溫度25℃,光照時間為12~14h/d,光照強度為40~60u.Mol.m-2.s-1。

類原球莖(Protocorm-like body,PLB)是胚胎發生與器官發育的整合體,是一種復合組織,是非常有效的再生繁殖方式,類原球莖可以進行增殖,以及重復發生和循環發生,類原球莖具有明顯的“兩極性”,可以同時“上面長芽,下面生根”,形成完整的植株。

步驟3,類原球莖的增殖

將步驟2形成的類原球莖轉接到類原球莖增殖培養基MS+6BA2.0mg/L(6BA:芐氨基嘌呤)上進行培養,類原球莖通過重復發生和循環發生實現有效增殖,如圖1(B)所示,并逐漸長出葉片和不定芽,如圖1(C)所示;

培養條件:培養溫度25℃,光照時間為12~14h/d,光照強度為40~60u.Mol.m-2.s-1。

步驟4,生根成苗及馴化移栽

將誘導出的不定芽和類原球莖轉接到生根培養基MS+IBA1.0mg/L(IBA:吲哚丁酸)上進行培養,20~30天后,長出多條肉質不定根,如圖1(D)所示,生根成苗成為新的植株,如圖1(E)所示,煉苗、緩苗后正常培養,如圖1(F)所示。

培養條件均為:培養溫度25℃,光照時間為12~14h/d,光照強度為40~60u.Mol.m-2.s-1。

其中,類原球莖誘導培養、類原球莖增殖培養及生根培養,所用的基本培養基均為MS培養基,蔗糖用量為20~40g/L,凝固劑為瓊脂粉、用量為6~7g/L,活性炭2g/L,椰子汁添加量為10%,培養基pH為5.8。

進一步地,所述煉苗、緩苗具體為:先在組培室打開瓶蓋煉苗3天,然后將其移至溫室或蔭棚,再煉苗3天;然后將組培苗從培養瓶中取出,洗凈其表面的瓊脂,移栽到培養基質中進行緩苗,然后正常培養。

優選的,培養基質為苔蘚,培養基質含水量25%以內,空氣相對濕度80~90%,遮光50%。

本發明利用風蘭葉片基部在高濃度的細胞分裂素下產生類原球莖,類原球莖既可以重復發生和循環發生的特點,又因其具有兩極性可誘導成為根深葉茂的優質種苗,以類原球莖為核心,類原球莖成為調控的靶標,通過調控類原球莖的生長、分化和發育而實現優質種苗的規?;?,而且遺傳性狀相對穩定一致。

實施例1

步驟1,外植體的選擇及處理

選取風蘭的葉片為起始材料,消毒后作為組培用的外植體;

步驟2,類原球莖的誘導

在超凈工作臺上,將經過表面消毒的外植體轉移至無菌接種盤中,用無菌濾紙吸干外植體表面水分,用消過毒的剪刀將葉片基部向下插入類原球莖誘導培養基MS+TDZ5.0mg/L(TDZ:噻苯隆)上進行培養,20d后葉片基部形成黃色的胚性愈傷組織,再過20d后,由黃變綠,形成小綠球,類原球莖形成;

步驟3,類原球莖的增殖

將步驟2形成的類原球莖轉接到類原球莖增殖培養基MS+6BA2.0mg/L(6BA:芐氨基嘌呤)上進行培養,類原球莖通過重復發生和循環發生實現增殖,逐漸長出葉片和不定芽;

步驟4,生根成苗及馴化移栽

將誘導出的不定芽和類原球莖轉接到生根培養基MS+IBA1.0mg/L(IBA:吲哚丁酸)上進行培養,逐漸長出多條肉質不定根,生根成苗成為新的植株,將植株先在組培室打開瓶蓋煉苗3天,然后將其移至溫室或蔭棚,再煉苗3天;然后將組培苗從培養瓶中取出,洗凈其表面的瓊脂,移栽到培養基質(苔蘚)中,培養基質含水量25%,空氣相對濕度80%,遮光50%,進行緩苗,然后正常培養。

其中,類原球莖誘導培養、類原球莖增殖培養及生根培養的培養條件均為:培養溫度25℃,光照時間為12h/d,光照強度為60u.Mol.m-2.s-1。

其中,類原球莖誘導培養、類原球莖增殖培養及生根培養,所用的基本培養基均為MS培養基,蔗糖用量為20g/L,凝固劑為瓊脂粉、用量為6g/L,活性炭2g/L,椰子汁添加量為10%,培養基pH為5.8。

實施例2

步驟1,外植體的選擇及處理

選取風蘭的葉片為起始材料,消毒后作為組培用的外植體;

步驟2,類原球莖的誘導

在超凈工作臺上,將經過表面消毒的外植體轉移至無菌接種盤中,用無菌濾紙吸干外植體表面水分,用消過毒的剪刀將葉片基部向下插入類原球莖誘導培養基MS+TDZ5.0mg/L(TDZ:噻苯隆)上進行培養,20d后葉片基部形成黃色的胚性愈傷組織,再過20d后,由黃變綠,形成小綠球,類原球莖形成;

步驟3,類原球莖的增殖

將步驟2形成的類原球莖轉接到類原球莖增殖培養基MS+6BA2.0mg/L(6BA:芐氨基嘌呤)上進行培養,類原球莖通過重復發生和循環發生實現增殖,逐漸長出葉片和不定芽;

步驟4,生根成苗及馴化移栽

將誘導出的不定芽和類原球莖轉接到生根培養基MS+IBA1.0mg/L(IBA:吲哚丁酸)上進行培養,20~30天后,長出多條肉質不定根,生根成苗成為新的植株,將植株先在組培室打開瓶蓋煉苗3天,然后將其移至溫室或蔭棚,再煉苗3天;然后將組培苗從培養瓶中取出,洗凈其表面的瓊脂,移栽到培養基質(苔蘚)中,培養基質含水量23%,空氣相對濕度85%,遮光50%,進行緩苗,然后正常培養。

其中,類原球莖誘導培養、類原球莖增殖培養及生根培養的培養條件均為:培養溫度25℃,光照時間為14h/d,光照強度為40u.Mol.m-2.s-1。

其中,類原球莖誘導培養、類原球莖增殖培養及生根培養,所用的基本培養基均為MS培養基,蔗糖用量為30g/L,凝固劑為瓊脂粉、用量為6.5g/L,活性炭2g/L,椰子汁添加量為10%,培養基pH為5.8。

實施例3

步驟1,外植體的選擇及處理

選取風蘭的葉片為起始材料,消毒后作為組培用的外植體;

步驟2,類原球莖的誘導

在超凈工作臺上,將經過表面消毒的外植體轉移至無菌接種盤中,用無菌濾紙吸干外植體表面水分,用消過毒的剪刀將葉片基部向下插入類原球莖誘導培養基MS+TDZ5.0mg/L(TDZ:噻苯隆)上進行培養,20d后葉片基部形成黃色的胚性愈傷組織,再過20d后,由黃變綠,形成小綠球,類原球莖形成;

步驟3,類原球莖的增殖

將步驟2形成的類原球莖轉接到類原球莖增殖培養基MS+6BA2.0mg/L(6BA:芐氨基嘌呤)上進行培養,類原球莖通過重復發生和循環發生實現增殖,逐漸長出葉片和不定芽;

步驟4,生根成苗及馴化移栽

將誘導出的不定芽和類原球莖轉接到生根培養基MS+IBA1.0mg/L(IBA:吲哚丁酸)上進行培養,20~30天后,長出多條肉質不定根,生根成苗成為新的植株,先在組培室打開瓶蓋煉苗3天,然后將其移至溫室或蔭棚,再煉苗3天;然后將組培苗從培養瓶中取出,洗凈其表面的瓊脂,移栽到培養基質(苔蘚)中,培養基質含水量20%,空氣相對濕度90%,遮光50%,進行緩苗,然后正常培養。

其中,類原球莖誘導培養、類原球莖增殖培養及生根培養的培養條件均為:培養溫度25℃,光照時間為13h/d,光照強度為50u.Mol.m-2.s-1。

其中,類原球莖誘導培養、類原球莖增殖培養及生根培養,所用的基本培養基均為MS培養基,蔗糖用量為40g/L,凝固劑為瓊脂粉、用量為7g/L,活性炭2g/L,椰子汁添加量為10%,培養基pH為5.8。

實施例4

步驟1,外植體的選擇及處理

選取風蘭的葉片為起始材料,消毒后作為組培用的外植體;

步驟2,類原球莖的誘導

在超凈工作臺上,將經過表面消毒的外植體轉移至無菌接種盤中,用無菌濾紙吸干外植體表面水分,用消過毒的剪刀將葉片基部向下插入類原球莖誘導培養基MS+TDZ5.0mg/L(TDZ:噻苯隆)上進行培養,20d后葉片基部形成黃色的胚性愈傷組織,再過20d后,由黃變綠,形成小綠球,類原球莖形成;

步驟3,類原球莖的增殖

將步驟2形成的類原球莖轉接到類原球莖增殖培養基MS+6BA2.0mg/L(6BA:芐氨基嘌呤)上進行培養,類原球莖通過重復發生和循環發生實現增殖,逐漸長出葉片和不定芽;

步驟4,生根成苗及馴化移栽

將誘導出的不定芽和類原球莖轉接到生根培養基MS+IBA1.0mg/L(IBA:吲哚丁酸)上進行培養,20~30天后,長出多條肉質不定根,生根成苗成為新的植株,先在組培室打開瓶蓋煉苗3天,然后將其移至溫室或蔭棚,再煉苗3天;然后將組培苗從培養瓶中取出,洗凈其表面的瓊脂,移栽到培養基質(苔蘚)中,培養基質含水量18%,空氣相對濕度85%,遮光50%,進行緩苗,然后正常培養。

其中,類原球莖誘導培養、類原球莖增殖培養及生根培養的培養條件均為:培養溫度25℃,光照時間為13h/d,光照強度為55u.Mol.m-2.s-1。

其中,類原球莖誘導培養、類原球莖增殖培養及生根培養,所用的基本培養基均為MS培養基,蔗糖用量為25g/L,凝固劑為瓊脂粉、用量為6.8g/L,活性炭2g/L,椰子汁添加量為10%,培養基pH為5.8。

采用本發明類原球莖的繁殖方法對風蘭葉片組織培養繁殖與采用傳統的分株繁殖方法對風蘭繁殖的繁殖系數的數據對比見表1:

表1本發明繁殖方法與傳統繁殖方法對風蘭增殖系數的影響

由表1可以看出,采用本發明的繁殖方法對風蘭進行繁殖,其增殖系數呈現幾何基數式增長,遠遠高于傳統的分株繁殖方式,采用上述方法通過葉片組織培養進行風蘭快繁,繁殖系數高,增殖速度快,且不受地區、季節、氣候限制,可實現優質種苗的工廠化規?;?。

如在說明書及權利要求當中使用了某些詞匯來指稱特定成分或方法。本領域技術人員應可理解,不同地區可能會用不同名詞來稱呼同一個成分。本說明書及權利要求并不以名稱的差異來作為區分成分的方式。如在通篇說明書及權利要求當中所提及的“包含”為一開放式用語,故應解釋成“包含但不限定于”?!按籩隆筆侵岡誑山郵盞奈蟛罘段?,本領域技術人員能夠在一定誤差范圍內解決所述技術問題,基本達到所述技術效果。說明書后續描述為實施本發明的較佳實施方式,然所述描述乃以說明本發明的一般原則為目的,并非用以限定本發明的范圍。本發明的?;し段У筆鈾餃ɡ笏綞ㄕ呶?。

還需要說明的是,術語“包括”、“包含”或者其任何其他變體意在涵蓋非排他性的包含,從而使得包括一系列要素的商品或者系統不僅包括那些要素,而且還包括沒有明確列出的其他要素,或者是還包括為這種商品或者系統所固有的要素。在沒有更多限制的情況下,由語句“包括一個……”限定的要素,并不排除在包括所述要素的商品或者系統中還存在另外的相同要素。

上述說明示出并描述了發明的若干優選實施例,但如前所述,應當理解發明并非局限于本文所披露的形式,不應看作是對其他實施例的排除,而可用于各種其他組合、修改和環境,并能夠在本文所述發明構想范圍內,通過上述教導或相關領域的技術或知識進行改動。而本領域人員所進行的改動和變化不脫離發明的精神和范圍,則都應在發明所附權利要求的?;し段?。

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一種 組織培養 快速 繁殖 方法
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