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巴塞罗那vs维戈塞尔塔: 一種豬瘟脾淋源活疫苗用稀釋液.pdf

摘要
申請專利號:

维戈塞尔塔vs皇家社会 www.vmyqew.com.cn CN201510311127.X

申請日:

20150609

公開號:

CN104873971A

公開日:

20150902

當前法律狀態:

有效性:

審查中

法律詳情:
IPC分類號: A61K39/39,A61K38/06,A61P37/04,A61K36/86,A61K31/715,A61K35/32,A61K31/4188,A61K31/519,A61K31/455,A61K31/355 主分類號: A61K39/39,A61K38/06,A61P37/04,A61K36/86,A61K31/715,A61K35/32,A61K31/4188,A61K31/519,A61K31/455,A61K31/355
申請人: 浙江美保龍生物技術有限公司
發明人: 沈建軍,張秀文,李陽
地址: 321017 浙江省金華市婺城區賓虹路二段298號308室
優先權: CN201510311127A
專利代理機構: 杭州浙科專利事務所(普通合伙) 代理人: 吳秉中
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法律狀態
申請(專利)號:

CN201510311127.X

授權公告號:

法律狀態公告日:

法律狀態類型:

摘要

一種豬瘟脾淋源活疫苗用稀釋液,屬于獸用生物制品技術領域。該稀釋液每1000ml磷酸緩沖液中含有中藥多糖15~50g、中藥黃酮20~60g、維生素5~10g、法氏囊素5~40mg,所述的中藥多糖和中藥黃酮從以下中藥組合物中提取得到:連翹、拳參、貫眾、大薊、地榆、山豆根、羚羊角和紫花地丁。采用本發明稀釋液稀釋疫苗免疫機體后,能促進機體B淋巴細胞前體的分化、增殖,加快B細胞內DNA轉錄成mRNA的速度,促進B細胞內蛋白質的生成,從而使B細胞產生和分泌抗體能力加強,從而可提高機體免疫力。

權利要求書

1.一種豬瘟脾淋源活疫苗用稀釋液,其特征在于該稀釋液每1000ml磷酸緩沖液中含有中藥多糖15~50g、中藥黃酮20~60g、維生素5~10g、法氏囊素5~40mg,所述的中藥多糖和中藥黃酮從以下中藥組合物中提取得到:連翹、拳參、貫眾、大薊、地榆、山豆根、羚羊角和紫花地丁。2.如權利要求1所述的一種豬瘟脾淋源活疫苗用稀釋液,其特征在于該凍干?;ぜ撩?000ml磷酸緩沖液中含有中藥多糖25~40g、中藥黃酮30~50g、維生素6~8g、法氏囊素10~30mg。3.如權利要求1或2所述的一種豬瘟脾淋源活疫苗用稀釋液,其特征在于所述的中藥多糖和中藥黃酮通過以下步驟制得:a、按連翹20~40份、拳參10~20份、貫眾10~30份、大薊10~30份、地榆10~30份、山豆根10~20份、羚羊角10~30份和紫花地丁10~20份稱取各中藥原料,切碎、洗凈后用冷水浸泡過夜,再加入原料重量15倍的純化水,水浴至90℃,并保持在90℃,熬制2小時,熬制過程中每10分鐘攪拌一次;b、棄去a中藥渣,收集藥液,室溫冷卻后經10000rpm離心10分鐘,棄去沉淀,收集上清;c、將b中上清進行醇沉,沉淀即為粗制中藥多糖,上清即為粗制中藥黃酮;d、用滅菌純化水洗滌c中粗制中藥多糖,洗滌后用20倍量的42℃滅菌純化水進行溶解,溶解后,按通過活性炭柱進行內毒素吸附,收集濾出液;e、將d中上濾出液通過sevag法除去蛋白;f、將e中中藥多糖進行真空冷凍干燥制得中藥多糖;g、將c中粗制中藥黃酮進行減壓真空濃縮,濃縮物用滅菌注射用水稀釋清洗,再次進行減壓真空濃縮,如此三次后經冷凍真空干燥制得中藥黃酮。4.如權利要求1或2所述的一種豬瘟脾淋源活疫苗用稀釋液,其特征在于所述的法氏囊素通過以下步驟制得:取健康法氏囊組織,將法氏囊組織剔除筋膜和脂肪組織,?pH7.2滅菌冷PBS洗凈;按1:1比例加入pH?7.2滅菌冷PBS,在組織勻漿機中進行高速勻漿;勻漿液中加入2.5%的胰蛋白酶,反復凍融3次,12000rpm離心20min,棄沉淀;上清用1000da截留分子量的超濾膜進行超濾,膜下液經0.22um濾膜過濾除菌,濾過液即為法氏囊素粗提液;粗提液經冷凍真空干燥制得法氏囊素。5.如權利要求1或2所述的一種豬瘟脾淋源活疫苗用稀釋液,其特征在于所述的維生素包括D-生物素70~80mg、葉酸20~30mg、煙酰胺2~5g和維生素E?2~5g。

說明書

技術領域

本發明屬于獸用生物制品技術領域,具體涉及一種豬瘟脾淋源活疫苗用稀釋液。

背景技術

豬瘟(CSF)是國際動物衛生組織(OIE)和中國的A類法定傳染病,是我國強制性免疫的重大動物疫病之一,是危害我國養豬業的“第一殺手”。豬瘟是由豬瘟病毒引起的,無法用藥物進行控制,疫苗免疫是最有效的辦法。

目前國內外市售的豬瘟疫苗主要有豬瘟脾淋苗、豬瘟細胞苗以及豬瘟亞單位疫苗,但市場上豬瘟疫苗的主流產品仍然是豬瘟脾淋苗和豬瘟細胞苗。作為疫苗中的經典-精制豬瘟脾淋源活疫苗仍具有不可替代的作用。

豬瘟脾淋源活疫苗選用中國豬瘟兔化弱毒株(C株),該疫苗株能激發機體快速產生免疫力、遺傳穩定、毒力不返強,是國際上公認的目前世界上最為安全有效的弱毒疫苗株。采用該毒株接種優良家兔,收獲感染家兔的脾臟制成乳劑,與凍干?;ぜ粱煸群缶潿癡嬋嶄稍鎦瞥芍砦療⒘茉椿鉅咼?。

目前市場認為豬瘟脾淋源活疫苗免疫效果不理想,對豬瘟脾淋活疫苗的認識仍存在誤區,這主要和目前國內豬瘟脾淋源活疫苗使用方法不當、混合感染豬只免疫后應激過大,以及質量參差不齊等情況有關。

多糖是中藥活性成分之一,大量研究表明,多糖及糖復合物在生物體內不僅是作為能量資源和構成材料,更重要的是它存在于一切細胞膜結構中,參與生命現象中細胞的各種活動。多糖類物質是所有生命有機體的重要組成部分,具有清除自由基、提高抗氧化酶活性和抑制脂質過氧化的能力,同時多糖也具有很好的耐熱效果,多種實驗表明中藥多糖可作為耐熱?;ぜ撂砑佑諢鉅咼綞掣殺;ぜ林?。

維生素是機體代謝中必不可少的有機化合物?;逵倘繅蛔叢擁幕こ?,不斷地進行著各種生化反應。其反應與酶的催化作用有密切關系。酶要產生活性,必須有輔酶參加。已知許多維生素是酶的輔酶或者是輔酶的組成分子。因此,維生素是維持和調節機體正常代謝的重要物質。

黃酮類化合物是自然界中存在的多元酚類物質,也是自然界藥用植物中的主要活性成分之一。它是指具有15個碳原子并以C6-C3-C6的方式構成的三環天然有機物,是植物在長期自然選擇中產生的二級代謝產物,現在已分離鑒定的有4000多種。它廣泛存在于果蔬、中草藥中,無毒副作用,它具有顯著的清除機體內自由基、抗老化、抗突變、調血脂降血壓等藥理保健功能,是一類極具開發前景的天然有機抗氧化劑,這些抗氧化活性物質可以減少和清除機體內自由基,具有預防疾病的作用。

法氏囊素(bursin,BS)?是從禽類特有的體液免疫中樞淋巴器官法氏囊(Bursa?of?fabricius)?中分離出來的一種活性三肽物質,其結構為L-Lys-His-Gly-NH2。研究表明,BS能促進禽類和哺乳動物B淋巴細胞前體的分化、增殖,能提高B細胞系Daudi細胞內第二信使cAMP和cGMP水平,加快B細胞內DNA轉錄成mRNA的速度,促進B細胞內蛋白質的生成,從而使B細胞產生和分泌抗體能力加強。

基于上述背景技術,本發明提出一種豬瘟脾淋源活疫苗用稀釋液。該?;ぜ林饕芍幸┒嗵?、中藥黃酮、維生素、法氏囊素等組成。本發明所制備的疫苗稀釋液一方面可以特異性的提高豬瘟脾淋疫苗的使用效果,同時還兼具了提高機體免疫力的功效。

發明內容

針對現有技術存在的問題,本發明的目的在于設計提供一種豬瘟脾淋源活疫苗用稀釋液的技術方案,該稀釋液能夠大幅度提高了機體的免疫力,提高體液免疫能力,刺激機體產生高效的中和抗體,提高了機體預防疾病的能力。

所述的一種豬瘟脾淋源活疫苗用稀釋液,其特征在于該稀釋液每1000ml磷酸緩沖液中含有中藥多糖15~50g、中藥黃酮20~60g、維生素5~10g、法氏囊素5~40mg,所述的中藥多糖和中藥黃酮從以下中藥組合物中提取得到:連翹、拳參、貫眾、大薊、地榆、山豆根、羚羊角和紫花地丁。

所述的一種豬瘟脾淋源活疫苗用稀釋液,其特征在于該凍干?;ぜ撩?000ml磷酸緩沖液中含有中藥多糖25~40g、中藥黃酮30~50g、維生素6~8g、法氏囊素10~30mg。

所述的一種豬瘟脾淋源活疫苗用稀釋液,其特征在于所述的中藥多糖和中藥黃酮通過以下步驟制得:

a、按連翹20~40份、拳參10~20份、貫眾10~30份、大薊10~30份、地榆10~30份、山豆根10~20份、羚羊角10~30份和紫花地丁10~20份稱取各中藥原料,切碎、洗凈后用冷水浸泡過夜,再加入原料重量15倍的純化水,水浴至90℃,并保持在90℃,熬制2小時,熬制過程中每10分鐘攪拌一次;

b、棄去a中藥渣,收集藥液,室溫冷卻后經10000rpm離心10分鐘,棄去沉淀,收集上清;

c、將b中上清進行醇沉,沉淀即為粗制中藥多糖,上清即為粗制中藥黃酮;

d、用滅菌純化水洗滌c中粗制中藥多糖,洗滌后用20倍量的42℃滅菌純化水進行溶解,溶解后,按通過活性炭柱進行內毒素吸附,收集濾出液;

e、將d中上濾出液通過sevag法除去蛋白;

f、將e中中藥多糖進行真空冷凍干燥制得中藥多糖;

g、將c中粗制中藥黃酮進行減壓真空濃縮,濃縮物用滅菌注射用水稀釋清洗,再次進行減壓真空濃縮,如此三次后經冷凍真空干燥制得中藥黃酮。

所述的一種豬瘟脾淋源活疫苗用稀釋液,其特征在于所述的法氏囊素通過以下步驟制得:取健康法氏囊組織,將法氏囊組織剔除筋膜和脂肪組織,?pH7.2滅菌冷PBS洗凈;按1:1比例加入pH?7.2滅菌冷PBS,在組織勻漿機中進行高速勻漿;勻漿液中加入2.5%的胰蛋白酶,反復凍融3次,12000rpm離心20min,棄沉淀;上清用1000da截留分子量的超濾膜進行超濾,膜下液經0.22um濾膜過濾除菌,濾過液即為法氏囊素粗提液;粗提液經冷凍真空干燥制得法氏囊素。

所述的一種豬瘟脾淋源活疫苗用稀釋液,其特征在于所述的維生素包括D-生物素70~80mg、葉酸20~30mg、煙酰胺2~5g和維生素E?2~5g。

上述的一種豬瘟脾淋源活疫苗用稀釋液,設計合理,與傳統的稀釋液相比其具有以下優點:

1.采用本發明凍干疫苗稀釋液在免疫注射時可以減少豬只疼痛感,降低豬只的應激反應。

2.采用本發明稀釋液,可以大大提高活疫苗的使用效果,快速的產生中和抗體,減少免疫空檔期,降低豬只發病幾率,提高機體抵御疾病的能力。

3.采用本發明稀釋液稀釋疫苗免疫機體后,能促進機體B淋巴細胞前體的分化、增殖,加快B細胞內DNA轉錄成mRNA的速度,促進B細胞內蛋白質的生成,從而使B細胞產生和分泌抗體能力加強,從而可提高機體免疫力。

具體實施方式

為了使本發明更加容易理解,下面結合具體實施例,進一步闡述本發明。應理解,這些實施例僅用于說明本發明而不用于限止本發明的范圍,下列實施例中未提及的具體實驗方法,通常按常規實驗方法進行。

實施例1:中藥多糖和中藥黃酮的制備

a、按連翹20份、拳參20份、貫眾10份、大薊10份、地榆30份、山豆根10份、羚羊角10份和紫花地丁20份稱取各中藥原料,切碎、洗凈后用冷水浸泡過夜,再加入原料重量15倍的純化水,水浴至90℃,并保持在90℃,熬制2小時,熬制過程中每10分鐘攪拌一次;

b、棄去a中藥渣,收集藥液,室溫冷卻后經10000rpm離心10分鐘,棄去沉淀,收集上清;

c、將b中上清進行醇沉,沉淀即為粗制中藥多糖,上清即為粗制中藥黃酮;

d、用滅菌純化水洗滌c中粗制中藥多糖,洗滌后用20倍量的42℃滅菌純化水進行溶解,溶解后,按0.5%比例加入活性炭4℃吸附過夜,吸附后經10000rpm離心10分鐘,棄去沉淀,收集上清;

e、將d中上清經0.22um濾膜過濾除菌后,進行10倍濃縮,制得中藥多糖濃縮液;

f、將e中中藥多糖濃縮液進行真空冷凍干燥即得到中藥多糖;

g、將c中粗制中藥黃酮進行減壓真空濃縮,濃縮物用滅菌注射用水稀釋清洗,再次進行減壓真空濃縮,如此三次后,再經0.22um濾膜過濾除菌,然后經冷凍真空干燥即得到中藥黃酮。

該實施例中步驟a中可以稱取連翹30份、拳參15份、貫眾20份、大薊15份、地榆20份、山豆根15份、羚羊角20份和紫花地丁10份進行加工,也可以稱取按連翹40份、拳參10份、貫眾30份、大薊30份、地榆10份、山豆根20份、羚羊角30份和紫花地丁20份進行加工。

實施例2:法氏囊素的制備

a、取健康法氏囊組織,將法氏囊組織剔除筋膜和脂肪組織,?PH7.2滅菌冷PBS洗凈。

b、稱量法氏囊重量,按1:1(W:V)比例加入PH7.2滅菌冷PBS,在組織勻漿機中進行高速勻漿。

c、勻漿液中加入2.5%的胰蛋白酶,反復凍融3次,12000rpm離心20min,棄沉淀。

d、上清用1000da截留分子量的超濾膜進行超濾,膜下液即為法氏囊素粗提液。

e、將d中粗提液通過0.22um濾膜過濾除菌,然后經冷凍真空干燥制成法氏囊素凍干粉。

實施例3:一種豬瘟脾淋源活疫苗用稀釋液的制備

在每1000ml磷酸緩沖液中加入中藥多糖25g、中藥黃酮40g、維生素7g(D-生物素70mg、葉酸30mg、煙酰胺4g和維生素E?2.9g)、法氏囊素20mg,即得到豬瘟脾淋源活疫苗用稀釋液。其中中藥多糖和中藥黃酮按照實施例1中的步驟制得,法氏囊素按照實施例2中的步驟制得。磷酸緩沖液由氯化鈉6~10g,氯化鉀0.05~0.5g,磷酸氫二鈉1~1.2g,磷酸二氫鉀0.05~0.5g,氯化鈣0.05~0.2g,含6個結晶水的氯化鎂0.05~0.2g溶于1000ml雙蒸水中,經116℃,高壓滅菌30分鐘得到。

實施例4:一種豬瘟脾淋源活疫苗用稀釋液的制備

在每1000ml磷酸緩沖液中加入中藥多糖35g、中藥黃酮30g、維生素5g(D-生物素80mg、葉酸20mg、煙酰胺2g和維生素E?2.9g)、法氏囊素30mg,即得到豬瘟脾淋源活疫苗用凍干?;ぜ?。其中中藥多糖和中藥黃酮按照實施例1中的步驟制得,法氏囊素按照實施例2中的步驟制得。磷酸緩沖液由氯化鈉6~10g,氯化鉀0.05~0.5g,磷酸氫二鈉1~1.2g,磷酸二氫鉀0.05~0.5g,氯化鈣0.05~0.2g,含6個結晶水的氯化鎂0.05~0.2g溶于1000ml雙蒸水中,經116℃,高壓滅菌30分鐘得到。

實施例5:一種豬瘟脾淋源活疫苗用稀釋液的制備

在每1000ml磷酸緩沖液中加入中藥多糖50g、中藥黃酮60g、維生素10g(D-生物素70mg、葉酸30mg、煙酰胺3.9g和維生素E?6g)、法氏囊素40mg,即得到豬瘟脾淋源活疫苗用凍干?;ぜ?。其中中藥多糖和中藥黃酮按照實施例1中的步驟制得,法氏囊素按照實施例2中的步驟制得。磷酸緩沖液由氯化鈉6~10g,氯化鉀0.05~0.5g,磷酸氫二鈉1~1.2g,磷酸二氫鉀0.05~0.5g,氯化鈣0.05~0.2g,含6個結晶水的氯化鎂0.05~0.2g溶于1000ml雙蒸水中,經116℃,高壓滅菌30分鐘得到。

實施例6:稀釋液的使用方法及對比試驗

1.豬瘟脾淋源病毒懸液制備

(1)接種家兔的選擇

選擇生長狀況良好、體重1.5-3kg的家兔100只。

(2)接種

取生產用毒種,用上述病毒稀釋液作適當稀釋(如10-1.5或10-2),每只家兔耳靜脈接種1ml。接種后家兔正常飼養。

(3)測溫觀察

家兔接種后,上、下午各測體溫一次,24小時后,每隔6小時測體溫一次。測溫至72小時。

(4)收獲

選擇定型熱和輕熱反應兔,從體溫下降及其以后的24小時內剖殺,以無菌手術采取脾臟。

(5)病毒懸液制備及檢驗

在無菌操作下剔除脂肪組織。將脾臟組織稱重、剪碎,于同一容器內混合研磨,然后濾過,測定病毒含量,脾毒對家兔的最小感染量應≤10-5/ml。

2.疫苗制備

將無菌檢驗和病毒含量檢測合格的病毒懸液,混合于同一滅菌容器內,按1:1(V:V)比例加入蔗糖牛奶?;ぜ?,充分混勻后定量分裝,經冷凍真空干燥制成豬瘟脾淋源凍干活疫苗。

3.稀釋液使用效果

(1)按實施例3-5制備的3批稀釋液,作為實驗組。

(2)常規滅菌生理鹽水稀釋液作為對照組。

(3)取40頭豬瘟抗體陰性健康仔豬,分為四組,1、2、3組為實驗組,第4組為對照組。實驗組疫苗稀釋時采用本發明稀釋液,對照組疫苗稀釋時采用滅菌生理鹽水,免疫后3天起采血檢測其中和抗體效價,結果見表1。

表1?免疫比較結果

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一種 豬瘟 脾淋源活 疫苗 稀釋液
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