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皇家马德里vs维戈塞尔塔比赛时间: 一種提高植物輻射誘變育種目標性狀定向篩選效率的方法.pdf

摘要
申請專利號:

维戈塞尔塔vs皇家社会 www.vmyqew.com.cn CN201610001412.6

申請日:

20160105

公開號:

CN105918114A

公開日:

20160907

當前法律狀態:

有效性:

審查中

法律詳情:
IPC分類號: A01H1/06,A01H1/02,C12Q1/68 主分類號: A01H1/06,A01H1/02,C12Q1/68
申請人: 湖南省核農學與航天育種研究所
發明人: 楊震,彭選明,王芊,張勇,謝洪科,張逸妍,張源海,戴睿禮
地址: 410000 湖南省長沙市芙蓉區馬坡嶺
優先權: CN201610001412A
專利代理機構: 代理人:
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法律狀態
申請(專利)號:

CN201610001412.6

授權公告號:

法律狀態公告日:

法律狀態類型:

摘要

本發明公開了一種提高植物輻射誘變育種目標性狀定向篩選效率的方法,包括如下步驟,對植物種子進行輻射誘變處理得到M0代種子;M0代種子進行多本粗插種植僅混收主穗種子得到M1代,M1代自交結實獲得M2代種子;M2代種子在室內進行發苗培養,待幼苗生長到兩葉一心時,分別提取每個單株的基因組DNA。利用輻射誘變能加快生物體基因組變異率的特點,在苗期運用分子生物學技術從輻射誘變群體中定向篩選目標性狀突變體,減少了耗費在基因無變異或變異不符合所需目標性狀導致突變中的工作量,并提高了對目標性狀突變體篩選的準確率。

權利要求書

1.一種提高植物輻射誘變育種目標性狀定向篩選效率的方法,包括如下步驟:1)對植物種子進行輻射誘變處理得到M0代種子;2)M0代種子進行多本粗插種植僅混收主穗種子得到M1代,M1代自交結實獲得M2代種子;3)M2代種子在室內進行發苗培養,待幼苗生長到兩葉一心時,分別提取每個單株的基因組DNA;4)確定育種目標性狀,在Genebank數據庫中查找目標性狀基因的CDNA序列;5)根據目標性狀基因的CDNA序列通過PrimerPremier軟件進行分子引物的設計形成優化了的分子引物;6)用優化了的分子引物,經PCR過程,對M2代單株的基因組DNA進行擴增;7)擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳,與DNAMARK比較,檢測擴增產物的分子量大小是否與目標性狀基因CDNA序列分子量大小一致;8)切膠回收進行基因組測序,與目標性狀基因CDNA序列比對;9)具有與目標性狀基因CDNA序列差異的M2代單株,再進一步進行表型鑒定;10)自交繁殖后代,最終選出遺傳穩定,目標性狀符合育種要求的單株。2.如權利要求1所述方法,其特征在于:所述植物種子為水稻種子。3.如權利要求2所述方法,其特征在于:所述水稻種子在輻射誘變處理前進行浸泡處理至露白,浸泡時間為不低于24h。4.如權利要求1所述方法,其特征在于:所述輻射誘變源為Co-γ射線。5.如權利要求1所述方法,其特征在于:輻射誘變中誘變劑劑量為150~200Gy,劑量率為1.0~2.0Gy/Min。6.如權利要求1所述方法,其特征在于:所述目標性狀為鎘低積累。

說明書

技術領域

本發明涉及一種植物篩選方法,具體涉及一種提高植物輻射誘變育種目標性狀定向篩選效率的方法。

背景技術

農作物輻射誘變育種在確保世界糧食安全和增加營養供給方面具有重要的作用。根據聯合國FAO/IAEA突變品種數據庫最新統計,截止到2013年9月底,有60多個國家在214個植物種類上育成并通過商業注冊的植物突變品種總數已達3218個,其中直接或間接利用誘發突變體培育成的新品種在世界主要作物小麥、大麥和水稻分別為274、312、824個,占整個誘變育成突變品種數的將近50%。在長期的自然環境條件下,生物體自身與外界環境相互作用,為了適應環境的改變,其體內的遺傳物質會發生一定的自發突變,然而頻率很低,約為10-5~10-8次。而利用核誘發突變技術誘發植物基因組產生突變或引起染色體畸變及結構變異,提高誘發突變頻率,從而能創造出新的性狀、類型,豐富種質資源庫和拓寬生物遺傳多樣性,還能誘導產生自然界稀缺或用常規育種方法難以獲得的新基因類型,為新品種的選育提供豐富的原始材料。植物種質資源缺乏成為制約植物育種的瓶頸,輻射誘變技術已成為創制植物種質資源的有效途徑,由于輻射誘變的隨機性,如何提高誘變頻率,進行所需目標性狀的快速、高效的篩選成為育種者最為關注的問題。

發明內容

鑒于以上所述現有技術的缺點,本發明的目的在于提供一種提高植物輻射誘變育種目標性狀定向篩選效率的方法,以克服現有技術中育種速度慢、育種效率不高的缺陷。

為了達到上述發明目的及其他目的,本發明是通過以下技術方案實現的:

一種提高植物輻射誘變育種目標性狀定向篩選效率的方法,包括如下步驟:

1)對植物種子進行輻射誘變處理得到M0代種子;

2)M0代種子進行多本粗插種植僅混收主穗種子得到M1代,M1代自交結實獲得M2代種子;

3)M2代種子在室內進行發苗培養,待幼苗生長到兩葉一心時,分別提取每個單株的基因組DNA;

4)確定育種目標性狀,在Gene bank數據庫中查找目標性狀基因的CDNA序列;

5)根據目標性狀基因的CDNA序列通過Primer Premier軟件進行分子引物的設計;

6)用優化了的分子引物,經PCR過程,對M2代單株的基因組DNA進行擴增;

7)擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳,與DNA MARK比較,檢測擴增產物的分子量大小是否與目標性狀基因CDNA序列分子量大小一致;

8)切膠回收進行基因組測序,與目標性狀基因CDNA序列比對;

9)具有與目標性狀基因CDNA序列差異的M2代單株,再進一步進行表型鑒定;

10)嚴格自交繁殖后代,最終選出遺傳穩定,目標性狀符合育種要求的單株。

優選地,所述植物種子為水稻種子。

優選地,所述水稻種子在輻射誘變處理前進行浸泡處理至露白,浸泡時間為不低于24h。

優選地,所述輻射誘變源為60Co-γ射線。

優選地,輻射誘變中誘變劑劑量為150~250Gy,劑量率為1.0~2.0Gy/Min。

優選地,所述目標性狀為鎘低積累。

本發明利用輻射誘變能加快生物體基因組變異率的特點,在苗期運用分子生物學技術從輻射誘變群體中定向篩選目標性狀突變體,減少了耗費在基因無變異或變異不符合所需目標性狀導致突變中的工作量,并提高了對目標性狀突變體篩選的準確率。

附圖說明

圖1為突變體HN186-M2-780與野生型OsNRAMP5基因CDNA序列比對結果;

圖2為突變體HN186-M2-4711與野生型OsNRAMP5基因CDNA序列比對結果;

圖3為M0代60Co-γ射線誘變處理效果;

圖4為技術流程圖。

具體實施方式

以下通過特定的具體實例說明本發明的實施方式,本領域技術人員可由本說明書所揭露的內容輕易地了解本發明的其他優點與功效。本發明還可以通過另外不同的具體實施方式加以實施或應用,本說明書中的各項細節也可以基于不同觀點與應用,在沒有背離本發明的精神下進行各種修飾或改變。

實施例1

一種提高植物輻射誘變育種目標性狀定向篩選效率的方法,包括如下步驟:

1)對植物種子進行輻射誘變處理得到M0代種子;

2)M0代種子進行多本粗插種植僅混收主穗種子得到M1代,M1代嚴格自交結實獲得M2代種子;

3)M2代種子在室內進行發苗培養,待幼苗生長到兩葉一心時,分別提取每個單株的基因組DNA;

4)確定育種目標性狀,在Gene bank數據庫中查找目標性狀基因的CDNA序列;

5)根據目標性狀基因的CDNA序列通過Primer Premier軟件進行分子引物的設計;

6)用優化了的分子引物,經PCR過程,對M2代單株的基因組DNA進行擴增;

7)擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳,與DNA MARK比較,檢測擴增產物的分子量大小是否與目標性狀基因CDNA序列分子量大小一致;

8)切膠回收進行基因組測序,與目標性狀基因CDNA序列比對;

9)具有與目標性狀基因CDNA序列差異的M2代單株,再進一步進行表型鑒定;

10)嚴格自交繁殖后代,最終選出遺傳穩定,目標性狀符合育種要求的單株。

具體地,所述植物種子為水稻種子。

具體地,所述水稻種子在輻射誘變處理前進行浸泡處理至露白,浸泡時間為24h。

具體地,所述輻射誘變源為60Co-γ射線。

具體地,輻射誘變中誘變劑劑量為250Gy,劑量率為2.0Gy/Min。

實施例2

一種提高植物輻射誘變育種目標性狀定向篩選效率的方法,包括如下步驟:

1)對植物種子進行輻射誘變處理得到M0代種子;

2)M0代種子進行多本粗插種植僅混收主穗種子得到M1代,M1代嚴格自交結實獲得M2;

3)M2代種子在室內進行發苗培養,待幼苗生長到兩葉一心時,分別提取每個單株的基因組DNA;

4)確定育種目標性狀,在Gene bank數據庫中查找目標性狀基因的CDNA序列;

5)根據目標性狀基因的CDNA序列通過Primer Premier軟件進行分子引物的設計;

6)用優化了的分子引物,經PCR過程,對M2代單株的基因組DNA進行擴增;

7)擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳,與DNA MARK比較,檢測擴增產物的分子量大小是否與目標性狀基因CDNA序列分子量大小一致;

8)切膠回收進行基因組測序,與目標性狀基因CDNA序列比對;

9)具有與目標性狀基因CDNA序列差異的M2代單株,再進一步進行表型鑒定;

10)嚴格自交繁殖后代,最終選出遺傳穩定,目標性狀符合育種要求的單株。

具體地,所述植物種子為水稻種子。

具體地,所述水稻種子在輻射誘變處理前進行浸泡處理至露白,浸泡時間為不低于30h。

具體地,所述輻射誘變源為60Co-γ射線。

具體地,輻射誘變中誘變劑劑量為200Gy,劑量率為1.0Gy/Min。

實施例3

一種提高植物輻射誘變育種目標性狀定向篩選效率的方法,包括如下步驟:

1)對植物種子進行輻射誘變處理得到M0代種子;

2)M0代種子進行多本粗插種植僅混收主穗種子得到M1代,M1代嚴格自交結實獲得M2;

3)M2代種子在室內進行發苗培養,待幼苗生長到兩葉一心時,分別提取每個單株的基因組DNA;

4)確定育種目標性狀基因,在Gene bank數據庫中查找目標性狀基因的CDNA序列;

5)根據目標性狀基因的CDNA序列通過Primer Premier軟件進行分子引物的設計;

6)用優化了的分子引物,經PCR過程,對M2代單株的基因組DNA進行擴增;

7)擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳,與DNA MARK比較,檢測擴增產物的分子量大小是否與目標性狀基因CDNA序列分子量大小一致;

8)切膠回收進行基因組測序,與目標性狀基因CDNA序列比對;

9)具有與目標性狀基因CDNA序列差異的M2代單株,再進一步進行表型鑒定;

10)嚴格自交繁殖后代,最終選出遺傳穩定,目標性狀符合育種要求的單株。

具體地,所述植物種子為水稻種子。

具體地,所述水稻種子在輻射誘變處理前進行浸泡處理至露白,浸泡時間為不低于36h。

具體地,所述輻射誘變源為60Co-γ射線。

具體地,輻射誘變中誘變劑劑量為175Gy,劑量率為1.5Gy/Min。

實施例4

本實施例為輻射誘變創制鎘低積累水稻種質突變體;

1)飽滿的水稻HN186干種子3000粒左右消毒處理,用純水浸泡24小時,使水稻種子充分吸水,催芽,待種子露白時,使用60Co-γ射線輻照誘變處理,劑量250Gy,劑量率為1.5Gy/Min,獲得M0代種子的誘變群體。隨機取50粒左右輻照處理種子和未處理種子(對照)在實驗室發芽架做發苗試驗,以觀察苗期損傷效應來判斷誘變處理效果。

2)M0代種子播種育秧,待三葉一心時,多本粗插種植僅混收主穗種子得到M1代,M1代嚴格自交結實獲得M2代群體種子,取M2代群體種子約5000粒在室內進行發苗培養,待幼苗生長到兩葉一心時,分別提取每個突變群體M2代單株葉片的基因組DNA。

3)在Gene bank數據庫中查找與鎘吸收相關基因自然抗性相關巨噬細胞蛋白OsNRAMP5的CDNA序列(ID:AB690551),根據OsNRAMP5基因的CDNA序列通過Primer Premier軟件進行特異性分子引物的設計。

4)取突變群體M2代單株葉片基因組DNA,將每個樣品的濃度稀釋為50ng/μl,每10個樣品DNA等量混合構建樣品池,5000個樣品DNA構建500個混合池,依次編號POOL1-POOL500,用優化了的特異性分子引物,經PCR過程,分別對500個基因組DNA混合池進行擴增,以每個樣品混合池的基因組DNA為模板,按照下列體系和程序進行PCR,獲得擴增產物。

擴增的反應體系及PCR擴增程序

正向引物:5′-AGAGAGCAGTGAGAGAGG-3′;

反向引物:5′-GACGGAGTCCTTCCTGAT-3′;

5)擴增出每個混合池相對應的500個PCR產物,進行瓊脂糖凝膠電泳,與DNA MARK比較,檢測擴增產物的分子量大小是否與基因CDNA序列分子量大小一致。

6)切膠回收進行基因組測序。

7)使用序列比對軟件Bioedit,與野生型OsNRAMP5基因CDNA序列比對,發現混合池POOL78,POOL356,POOL472相對應的PCR產物的序列與野生型OsNRAMP5基因CDNA序列存在差異。

8)利用步驟4)中的正、反向引物分別對混合池POOL78,POOL356,POOL472包含的突變群體中30個M2代單株基因組DNA進行PCR擴增,PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳,與DNAMARK比較,檢測擴增產物的分子量大小,切膠回收進行基因組測序,M2代突變群體中編號HN186-M2-771、HN186-M2-775、HN186-M2-780、HN186-M2-3554、HN186-M2-3558、HN186-M2-4711、HN186-M2-4718的7個單株與野生型OsNRAMP5基因CDNA序列存在差異。

9)將步驟8)中基因組序列存在差異的7個M2代單株在三葉一心時移栽至鎘含量背景值一致的大田,嚴格自交繁殖后代,在成熟期單株收獲籽粒,進行籽粒中鎘含量的測定,HN186-M2-780、HN186-M2-4711籽粒中鎘含量相對野生型HN186籽粒鎘含量降低,HN186-M2-780、HN186-M2-4711繼續種植M3代進行綜合鑒定,最終抉選出遺傳穩定,綜合性狀優良的鎘低積累突變體。

土壤鎘含量背景值為1.225mg/Kg,實驗組HN186、HN186-M2-780、和HN186-M2-4711的含量見下表所示:

名稱 精米鎘含量 HN186 0.523mg.Cd.Kg-1 HN186-M2-780 0.469mg.Cd.Kg-1 HN186-M2-4711 0.375mg.Cd.Kg-1

上述實施例僅例示性說明本發明的原理及其功效,而非用于限制本發明。任何熟悉此技術的人士皆可在不違背本發明的精神及范疇下,對上述實施例進行修飾或改變。因此,舉凡所屬技術領域中具有通常知識者在未脫離本發明所揭示的精神與技術思想下所完成的一切等效修飾或改變,仍應由本發明的權利要求所涵蓋。

關 鍵 詞:
一種 提高 植物 輻射 誘變 育種 目標 性狀 定向 篩選 效率 方法
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