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维戈塞尔塔对皇家: 一種能夠提高萌發率及延長花粉活力的紅錐花粉收集保存方法.pdf

摘要
申請專利號:

维戈塞尔塔vs皇家社会 www.vmyqew.com.cn CN201610391816.0

申請日:

20160606

公開號:

CN105961377A

公開日:

20160928

當前法律狀態:

有效性:

有效

法律詳情:
IPC分類號: A01N3/00,A01H1/02 主分類號: A01N3/00,A01H1/02
申請人: 廣東省林業科學研究院
發明人: 張衛華,廖煥琴,張方秋,潘文,林元震
地址: 510520 廣東省廣州市天河區沙河龍洞廣汕一路233號
優先權: CN201610391816A
專利代理機構: 廣州粵高專利商標代理有限公司 代理人: 禹小明
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法律狀態
申請(專利)號:

CN201610391816.0

授權公告號:

法律狀態公告日:

法律狀態類型:

摘要

本發明公開了一種能夠提高萌發率及延長花粉活力的紅錐花粉收集保存方法,包括如下步驟:當父本雄花處于初花期與盛花期過渡期時,于9:00?11:00或15:00?17:00采集父本雄花序;雄花序于22~28℃無菌室內80~160W光照下干燥12~24h干燥,當花藥大量爆裂,輕輕抖動有大量黃色花粉散落時即可;干燥的雄花序過花粉篩,收集花粉,裝入容器中,封口,置于?60~?100℃或液氮中貯藏。進一步當花粉需萌發時,將貯藏的花粉置于液體培養基中,25~35℃下即可萌發。本發明首次形成了紅錐花粉采集、干燥、保存和活力檢測的體系,方法簡單、迅速且可操作性強,可提高紅錐花粉活力,提高紅錐人工雜交授粉的成功率。

權利要求書

1.一種能夠提高萌發率及延長花粉活力的紅錐花粉收集保存方法,其特征在于,包括如下步驟:S1.花粉采集:當父本雄花處于初花期與盛花期過渡期時,于9:00-11:00或15:00-17:00采集父本雄花序;S2.花粉干燥:將采集的雄花序于22~28℃無菌室內80~160W光照下干燥12~24h干燥;當花藥大量爆裂,輕輕抖動有大量黃色花粉散落時即可;S3.花粉貯藏:干燥好的雄花序過花粉篩,收集花粉,裝入容器中,封口,置于-60~-100℃或液氮中貯藏。2.根據權利要求1所述的能夠提高萌發率及延長花粉活力的紅錐花粉收集保存方法,其特征在于,當花粉需萌發時,將貯藏的花粉置于液體培養基中,25~35℃下萌發。3.根據權利要求1所述的能夠提高萌發率及延長花粉活力的紅錐花粉收集保存方法,其特征在于,步驟S1所述初花期與盛花期過渡期即為當父本雄花50~75%花絲伸出,且為淡黃色時;或為當父本雄花100%花絲伸出,且為黃色時。4.根據權利要求1所述的能夠提高萌發率及延長花粉活力的紅錐花粉收集保存方法,其特征在于,步驟S1所述采集是于9:00-11:00或15:00-17:00采集當天開的新鮮雄花序。5.根據權利要求1所述的能夠提高萌發率及延長花粉活力的紅錐花粉收集保存方法,其特征在于,步驟S2所述干燥是于25℃無菌室內100W光照下干燥18~24h。6.根據權利要求1所述的能夠提高萌發率及延長花粉活力的紅錐花粉收集保存方法,其特征在于,步驟S3所述貯藏是置于-80℃或液氮中貯藏。7.根據權利要求1所述的能夠提高萌發率及延長花粉活力的紅錐花粉收集保存方法,其特征在于,步驟S3所述花粉篩的目數為90~110目。8.根據權利要求1所述的能夠提高萌發率及延長花粉活力的紅錐花粉收集保存方法,其特征在于,步驟S3所述過篩的方法是將干燥好的雄花序倒入花粉篩中,邊用毛筆輕輕碾動花序,邊輕輕抖動,過篩。9.根據權利要求1所述的能夠提高萌發率及延長花粉活力的紅錐花粉收集保存方法,其特征在于,步驟S3所述容器為玻璃瓶,所述封口是用保鮮膜封口。10.權利要求1所述方法在提高紅錐花粉萌發率和/或延長花粉活力方面或在紅錐雜交育種方面的應用。

說明書

技術領域

本發明屬于林木育種技術領域。更具體地,涉及一種能夠提高萌發率及延長花粉活力的紅錐花粉收集保存方法。

背景技術

紅錐(Castanopsis hystrix A. DC)又名紅黎、赤黎、黎木、刺栲、紅栲、紅掾栲、紅柯,屬殼斗科栲屬常綠喬木,樹體通直,樹高可達30米,胸徑達1米以上,它是我國南亞熱帶和亞熱帶植被常綠闊葉林的優勢組成樹種,屬華南地區重要的鄉土闊葉珍貴用材和高效多用途生態公益林樹種。紅錐天然分布于東經 95o20′~118o0′,北緯 18o30′~25o0′,主產地集中于廣東、廣 西、福建南部,其周邊分布在云南南部、貴州東南部以及湖南、江西、福建、海南等省的南部,邊緣分布達西藏的墨脫縣。紅錐具有生長快、材質優、適應廣、效益高等優良特性。其主干通直、 材質堅硬、呈紅色、耐腐蝕性強、不開裂、不變形、容易加工,是優質珍貴用材,可供建筑、造 船、高檔家俱、木制地板、軍工用品、體育器材等用。種子富含淀粉,可炒食、飼料和釀酒,種 實、殼斗均富含單寧,可提制栲膠。紅錐作為華南地區地帶性植被頂極群落的重要組成部分,既具有良好的生態穩定性和優異的生態效益,又是十分優良的大徑級用材樹種。它具有旺盛的生長 期和良好的生長速度,一次造林可采伐 10 次以上,經營百年經久不衰,且枝葉濃密,混生性能好,可作為用材和水源涵養林進行純林種植,亦可為殘次林改造、生態公益林改造的混交造林進行推廣應用。因此,該樹種已成為華南地區十分重要的鄉土闊葉樹種,每年用紅錐營建的水源涵 養林、低效生態公益林改造以及純林面積超過3500公頃,目前,在廣東、廣西、福建等省區已 營造各種人工林3萬多公頃。已成為我國南方地區的重要造林樹種之一。

但是,紅錐的整體改良程度不高,改良體系尚未完善,良種供應嚴重短缺,已成為制約紅錐人工林迅速發展的瓶頸。通過雜交育種,實現優良有效基因的理想重組,一直以來是新品種培育的最有效、最快速、最安全的途徑。特別是林木新品種,目前約80%以上的林木新品種均依靠雜交育種獲得。但是,林木種類繁多且千差萬別,導致林木雜交育種技術也復雜多樣,如何高質量地針對完成紅錐的育種目標是一大難題;相比其他樹種,紅椎的雜交更為復雜,原因在于:紅錐的花序較為復雜,由純雄花序、純雌花序和兩性花序組成,花粉量較大,花粉粒小而輕,且極易受潮結塊,雌花柱頭為典型的濕性柱頭自然授粉容易授粉失敗,造成空苞率高。

因此,花期人工輔助授粉促進座果率,提高種子產量,是較為有效的解決措施?;ǚ鄄杉?、干燥、貯藏、活力測定技術,是實現該措施必須的技術環節。 花粉是種子植物的雄配子體,在有性繁殖中發揮著重要的作用?;ǚ鄣拿確?、花粉管生長是植物有性生殖的重要環節,包含許多復雜的生理過程?;ǚ垡曰ǚ酃芪ǖ朗淥途油瓿墑芫?,花粉的萌發和花粉管生長是實現受精作用的關鍵。

紅錐的花粉粒小而輕,且極易受潮結塊,因此,系統研究紅錐不同育種親本受環境影響的開花生物學特性,研制有效的花粉采集、干燥、保存技術、去雄隔離技術和高效授粉促進果實發育技術,形成一套高效的雜種人工控制授粉技術,對實現優良雜交新品種的批量化生產具有重要的意義。

發明內容

本發明要解決的技術問題是克服上述現有技術的缺陷和技術不足,提供一種紅錐花粉采集、干燥、保存以及活力檢測技術,能夠提高紅錐花粉萌發率及延長花粉活力。

本發明的目的是提供一種能夠提高萌發率及延長花粉活力的紅錐花粉收集保存方法。

本發明另一目的是上述能夠提高萌發率及延長花粉活力的紅錐花粉收集保存方法的應用。

本發明上述目的通過以下技術方案實現:

一種能夠提高萌發率及延長花粉活力的紅錐花粉收集保存方法,包括如下步驟:

S1.花粉采集:當父本雄花處于初花期與盛花期過渡期時,于9:00-11:00或15:00-17:00采集父本雄花序,裝入硫酸紙袋中;

S2.花粉干燥:將采集的雄花序于22~28℃無菌室內80~160W光照下干燥12~24h干燥,干燥時注意花粉隔離,防止交叉污染;當花藥大量爆裂,輕輕抖動有大量黃色花粉散落時即可;

S3.花粉貯藏:干燥好的雄花序過花粉篩,去除雜質和花絲,收集花粉,裝入容器中,封口,置于-60℃~-100℃或液氮中貯藏。

進一步地,當需要花粉萌發時,將貯藏的花粉置于液體培養基中,25℃~35℃下萌發。

優選地,所述萌發是于35℃恒溫下培養24h萌發。

優選地,所述液體培養基的組成為:50~200g/L蔗糖,500~1000 mg/L硼酸,5~10g/L瓊脂,余量為水。

更優選地,所述液體培養基的組成為:200g/L蔗糖,1000 mg/L硼酸,8g/L瓊脂,余量為水。

另外,優選地,上述步驟S1所述初花期與盛花期過渡期即為當父本雄花50~75%花絲伸出,且為淡黃色時;或為當父本雄花100%花絲伸出,且為黃色時。

更優選地,步驟S1所述初花期與盛花期過渡期即為當父本雄花50~75%花絲伸出,且為淡黃色時。

優選地,步驟S1所述采集是于9:00-11:00或15:00-17:00采集當天開的新鮮雄花序。

更優選地,步驟S1所述采集是于10:00或16:00采集當天開的新鮮雄花序。

優選地,步驟S2所述干燥是于25℃無菌室內100W光照下干燥18~24h。

優選地,步驟S3所述貯藏是置于-80℃或液氮中貯藏。

優選地,步驟S3所述花粉篩的目數為90~110目。

更優選地,步驟S3所述花粉篩的目數為100目。

優選地,步驟S3所述過篩的方法是將干燥好的雄花序倒入花粉篩中,邊用毛筆輕輕碾動花序,邊輕輕抖動,過篩。

優選地,步驟S3所述容器為玻璃瓶。

優選地,步驟S3所述封口是用保鮮膜封口。

另外,上述方法在提高紅錐花粉萌發率和/或延長花粉活力方面,以及在紅錐雜交育種方面的應用,都應在本發明的?;し段е?。

本發明具有以下有益效果:

1、本發明紅錐花粉干燥方法,在4000Lx日光燈下干燥12~24h,相較于以往的室內陰干或干燥器內干燥,可快速干燥又不破壞花粉活性,又亦可觀察到花藥完全爆裂時再進行刷粉過篩,解決了紅錐花粉粒小而輕,不易收集這一難題。

2、本發明紅錐花粉保存方法,分別放置在室溫、4℃、-20℃、-80℃、液氮等不同的環境中貯藏,通過花粉活力檢測,檢測出隨著保存時間不斷增長,在液氮中保存的花粉活力最強,其次是-80℃,顯著提高了紅錐花粉保存率。

3、本方法采用的液體培養基中含有0.8%瓊脂、20% 蔗糖、1000ppm的硼酸配制而成,液體穩定可靠,適合紅錐花粉離休培養。

4、將干燥后的紅錐花粉,借助手腕力量,抖動到固體培養基上,花粉可以與氧氣直接接觸,且花粉分布均勻,花粉于35℃恒溫下培養24h即可萌發。

5、本方法首次形成了紅錐花粉采集、干燥、保存和活力檢測的體系,方法具有簡單、迅速且可操作性強等特點,可提高紅錐人工雜交授粉的成功率,可有效解決紅錐種子園結實大小年的問題,提高種子園的產量和質量,使種子園能夠有效地發揮其應有的功能。

附圖說明

圖1為5種不同開花狀態雄花序。

圖2為不同雄花序狀態的鄧肯多重比較圖(α=0.01)。

圖3為紅錐花粉活力采集時間的多重比較圖(α=0.01)。

圖4為不同干燥方式紅錐花粉活力多重比較圖(α=0.01)。

圖5為5種保存方式不同保存天數紅錐花粉活力。

圖6為收集當天的紅錐花粉培養24小時后花粉萌發檢測結果。

圖7為本發明方法收集、干燥、封裝的紅錐花粉。

具體實施方式

以下結合說明書附圖和具體實施例來進一步說明本發明,但實施例并不對本發明做任何形式的限定。除非特別說明,本發明采用的試劑、方法和設備為本技術領域常規試劑、方法和設備。

除非特別說明,本發明所用試劑和材料均為市購。

實施例1 采集時機的研究

1、分別在以下五種雄花序狀態下采集紅錐雄花序:

(1)狀態1(花絲剛剛伸出);

(2)狀態2(花絲伸出20~30%,淡黃色);

(3)狀態3(花絲伸出50~75%,淡黃色);

(4)狀態4(花絲伸出100%,黃色);

(5)狀態5(花絲伸出100%,褐色)。

不同開花狀態雄花序如附圖1所示。

2、采集的雄花序于25℃室溫的無菌培養室內,4000Lx日光燈下干燥24h后,將花粉抖動到固體培養基上(0.8%瓊脂+20% 蔗糖+1000ppm),35℃恒溫下培養24h,用光學顯微鏡觀察花粉的萌發數,花粉管長度,檢測花粉活力。

3、結果如表1所示,狀態3(花絲伸出50~75%,淡黃色)時采集的雄花序,經過處理后的花粉活力最高(74.07%),狀態4(花絲伸出100%,黃色)次之,花粉活力為65.59%。

表1 不同雄花序狀態采集的紅錐花粉活力表

2、采用R-3.2.1軟件對雄花序5種狀態下的花粉活力進行方差分析,結果如表2所示,不同雄花序狀態對花粉活力有著極顯著影響,F值為54.3,p值為4.20e-09,表明不同雄花序狀態采集樣本對花粉活力存在極顯著差異。

進一步的鄧肯多重比較圖(附圖2)顯示,在顯著水平α=0.01上,狀態3(花絲伸出50~75%,淡黃色)和狀態4(花絲伸出100%,黃色)顯著大于其他狀態。

表2 紅錐花粉活力雄花序狀態的方差分析表

注:顯著水平,***:0.001。

實施例2 采集時間的研究

1、從早上8:00~18:00,每隔1h采集一次花粉,合計11次。

2、于25℃室溫的無菌培養室內,4000Lx日光燈下干燥24h后,將花粉抖動到固體培養基上(0.8%瓊脂+20% 蔗糖+1000ppm),35℃恒溫下培養24h,用光學顯微鏡觀察花粉的萌發數,花粉管長度,檢測花粉活力。

3、結果如表3所示:花粉萌發有兩個峰值,分別是10:00和16:00。時間太早,露水未散盡,花粉易粘著,不利于散粉,花粉萌發率低。正午時分,太陽暴曬,溫度較高,也不利于花粉萌發。因此選擇花粉采集時間為9:00~11:00、15:00~17:00。

表3不同采集時間的紅錐花粉活力測定表

4、采用R-3.2.1軟件對不同采集時間下的花粉活力進行方差分析,結果如表4所示,不同采集時間采集花粉,花粉活力間存在極顯著差異,F值為28.63,p值為3.80e-15。

表4 不同采集時間紅錐花粉活力的方差分析表

進一步的鄧肯多重比較圖(附圖3)顯示,在顯著水平α=0.01上,時間點3(10:00)和時間點9(16:00)花粉活力最高,顯著大于其他時間點。

實施例3 干燥方法的研究

1、將采集的雄花序進行以下9種不同方法的干燥:

(1)自然干燥24h;

(2)烘箱60度24h;

(3)100w干燥6h;

(4)100w干燥 9h;

(5)100w干燥 12h;

(6)100w干燥 18h;

(7)100w干燥 24h;

(8)100w干燥 48h;

(9)100w干燥 72h。

然后進行花粉活力檢測,5次重復。

2、結果表明:總體上100W日光燈干燥的方法明顯優于自然干燥和烘箱60干燥等常規方法。且100W日光燈干燥12~24h,效果最佳。時間過短,花粉含水量高,造成花粉萌發率;低時間過長,將花粉活力殺死,亦降低萌發率。

表5 不同干燥方式紅錐花粉活力測定表

3、采用R-3.2.1軟件對不同干燥方式處理后的紅錐花粉活力進行方差分析,結果如表6所示,F值為26.81,p值為4.30e-12,采用不同干燥方式進行處理,花粉活力存在極顯著差異。

表6 紅錐花粉活力干燥方式的方差分析表

注:顯著水平,***:0.001。

進一步的鄧肯多重比較圖(附圖4)顯示,在顯著水平α=0.01上,干燥方式2、6、7、8、9之間差異顯著,干燥方式最好的是7(100w干燥24h)。

實施例4 保存方法的研究

1、將干燥后的花粉裝入玻璃瓶中,密封,分別置于以下幾種不同保存環境下保存:

(1)室溫;

(2)4℃;

(3)-20℃;

(4)-80℃;

(5)液氮。

各分別保存0d、5d、10d、20d、30d、60d時,進行花粉活力檢測,5次重復。

2、結果如表7和附圖5所示,保存5d后,花粉活力均出現不同程度的下降,室溫保存下的花粉活力下降的最快,液氮中保存的花粉活力幾乎無變化,-80℃下降的稍慢。保存30d后,室溫保存的花粉活力已完全喪失,4℃、-20℃保存的花粉,花粉活力降低了50%,液氮保存的花粉活力變化較小。

表7不同保存方式的紅錐花粉活力測定表

3、采用R-3.2.1軟件對不同保存方式下不同保存天數測定的花粉活力進行方差分析,結果如表8所示,保存方法和保存時間間對花粉活力都有極顯著差異。隨著保存時間的延長,不同保存方式亦顯示出了明顯差異,保存方式5明顯優于其他方式,其次是保存方式4,保存方式1效果最差。

表8 紅錐花粉活力保存方式的方差分析表

注:顯著水平,***:0.001。

實施例5 紅錐花粉采集、干燥、保存的方法

1、一種能夠提高萌發率及延長花粉活力的紅錐花粉收集保存方法,包括如下步驟:

S1.花粉采集:當父本雄花50~75%花絲伸出,且為淡黃色時,于10:00或16:00采集當天開的新鮮雄花序,裝入硫酸紙袋中;

S2.花粉干燥:將采集的雄花序于25℃無菌室內100W光照下干燥18~24h,干燥時注意花粉隔離,防止交叉污染;當花藥大量爆裂,輕輕抖動有大量黃色花粉散落時即可;

S3.花粉貯藏:將干燥好的雄花序倒入100目花粉篩中,邊用毛筆輕輕碾動花序,邊輕輕抖動,過篩,去除雜質和花絲,收集花粉,裝入小玻璃瓶中,保鮮膜封口,置于液氮中貯藏。

S4.進一步地,當需要花粉萌發時,將貯藏的花粉置于液體培養基中,35℃恒溫下培養24h萌發;所述液體培養基的組成為:200g/L蔗糖,1000 mg/L硼酸,8g/L瓊脂,余量為水。

2、上述收集當天開的紅錐花粉培養24小時,檢測花粉萌發,結果如附圖6所示。

3、經過上述方法收集、干燥、封裝的紅錐花粉如附圖7所示。

另外,經過上述方法收集、干燥、封裝、貯藏的花粉,保存時間長達60d時花粉活力尚未發生顯著變化。

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