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维戈塞尔塔vs毕尔巴鄂: 溶菌酶-脫乙??嵌嗵悄?pdf

摘要
申請專利號:

维戈塞尔塔vs皇家社会 www.vmyqew.com.cn CN200580015976.5

申請日:

20050317

公開號:

CN1972602A

公開日:

20070530

當前法律狀態:

有效性:

失效

法律詳情:
IPC分類號: A23L1/056,A23L1/0562,A23L3/3571 主分類號: A23L1/056,A23L1/0562,A23L3/3571
申請人: 俄勒岡州,由高等教育州委員會代表俄勒岡州立大學
發明人: 趙艷云,樸首一,馬克·A·達埃舍爾
地址: 美國俄勒岡
優先權: 60/554,623
專利代理機構: 中原信達知識產權代理有限責任公司 代理人: 楊青;樊衛民
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法律狀態
申請(專利)號:

CN200580015976.5

授權公告號:

法律狀態公告日:

法律狀態類型:

摘要

本發明公開的一個方面涉及包括摻入脫乙??嵌嗵薔酆銜锘誓詰娜芫傅母春夏?。另一個方面中,本發明公開了包括脫乙??嵌嗵?,以及基于脫乙??嵌嗵侵亓考圃?0至約200重量百分比的溶菌酶的膜?;構酥票改さ姆椒?,所述方法包括將脫乙??嵌嗵嗆腿芫溉芙饣蚍稚⒂謁嘟櫓手脅贍と芤夯蚍稚⑻?;將成膜溶液或分散體施加至基質表面;以及將所述成膜溶液或分散體轉化為膜。在尤其有用的應用中,所述膜為用于食品的抗微生物?;ぜ?。

權利要求書

1.包含溶菌酶的復合膜,所述溶菌酶被摻入脫乙??嵌嗵薔酆銜锘手?。2.權利要求1的膜,其中膜的所有組分是可食用并可更新的。3.權利要求1的膜,其中脫乙??嵌嗵薔哂兄遼僭?0%的脫乙酰程度。4.權利要求1的膜,進一步包含至少一種選自增塑劑或交聯劑的其他組分。5.權利要求4的膜,進一步包含至少一種增塑劑和至少一種交聯劑。6.權利要求3的膜,進一步包含至少一種交聯劑。7.權利要求1的膜,其中所述脫乙??嵌嗵前巖陰?嵌嗵且宜嵫?、脫乙??嵌嗵巧嚼嫠嵫?、脫乙??嵌嗵潛嵫?、脫乙??嵌嗵僑樗嵫?、脫乙??嵌嗵槍勸彼嵫?、脫乙??嵌嗵潛郊姿嵫?、脫乙??嵌嗵悄仕嵫?、脫乙??嵌嗵鍬砝此嵫?、脫乙??嵌嗵歉蝕妓嵫?、脫乙??嵌嗵潛┧嵫?、脫乙??嵌嗵晴晁嵫?、脫乙??嵌嗵遣菟嵫?、脫乙??嵌嗵強夠笛嵫?、脫乙??嵌嗵薔剖嵫位蚱浠旌銜?。8.權利要求1的膜,其中所述溶菌酶以抗微生物的有效量存在。9.權利要求1的膜,其中膜具有約1至約300gmm/mdkPa的水蒸氣滲透率。10.權利要求1的膜,其中溶菌酶的量足以使所述膜施加至基質約24小時后高達約30%的溶菌酶并未從所述膜釋放,并且約48小時后高達約20%的所述溶菌酶并未從所述膜釋放。11.膜,包含:(a)脫乙??嵌嗵?;和(b)基于所述脫乙??嵌嗵塹鬧亓考圃?0至約200重量百分比的溶菌酶。12.權利要求11的膜,包含約10至約100重量百分比的溶菌酶。13.權利要求11的膜,進一步包含至少一種選自增塑劑或交聯劑的其它組分。14.權利要求13的膜,其中所述增塑劑以基于脫乙??嵌嗵侵亓考圃?至約50重量百分比的量存在。15.用于制備膜的方法,包括:將脫乙??嵌嗵嗆腿芫溉芙饣蚍稚⒂謁嘟櫓手脅贍と芤夯蚍稚⑻?;將成膜溶液或分散體施加至基質表面;以及將所述成膜溶液或分散體轉化為膜。16.權利要求15的方法,其中所述脫乙??嵌嗵僑苡謁嚶謝嶂?。17.權利要求16的方法,其中所述水相有機酸選自乙酸、山梨酸、丙酸、乳酸、谷氨酸、苯甲酸、檸檬酸、馬來酸、甘醇酸、丙烯酸、琥珀酸、草酸、抗壞血酸、酒石酸或其混合物。18.權利要求16的方法,其中所述溶菌酶溶于水中產生溶菌酶溶液,然后將所述溶菌酶溶液與所述脫乙??嵌嗵僑芤夯旌?。19.權利要求18的方法,其中在環境室內條件下發生所述溶菌酶溶液和所述脫乙??嵌嗵僑芤旱幕旌?。20.權利要求18的方法,其中所述溶菌酶溶液包括約5至約20重量百分比的溶菌酶。21.權利要求15的方法,其中經干燥所述成膜溶液或分散體轉化為膜。22.權利要求15的方法,其中所述基質表面包括食品表面。23.權利要求22的方法,其中所述膜包括抗微生物有效量的溶菌酶,并且所述膜的所述抗-微生物活性持續至少三周。24.權利要求15的方法,進一步包括將至少一種其它的添加劑溶解或分散在水介質中。25.權利要求15的方法,進一步包括將膜置于食品表面上。26.權利要求22的方法,其中成膜溶液或分散體通過噴涂、刷涂、滴涂或浸涂施加于食品表面。27.通過權利要求15的方法產生的膜。28.權利要求27的膜,其中所述溶菌酶以抗微生物有效量存在于膜中。29.在食品至少一部分表面上包括抗微生物膜的食品,其中所述抗微生物膜包含摻入聚合物基質內的溶菌酶。30.權利要求29的食品,其中所述溶菌酶以基于脫乙??嵌嗵侵亓考圃?0至約200重量百分比的量存在于膜中。31.權利要求29的食品,其中膜具有約1至約300gmm/mdkPa的水蒸氣滲透率。32.權利要求29的食品,其中膜通過以下方法制備,包括:將脫乙??嵌嗵嗆腿芫溉芙饣蚍稚⒂謁櫓手脅贍と芤夯蚍稚⑻?;將所述成膜溶液或分散體施加至基質表面;以及將所述成膜溶液或分散體轉化為膜。

說明書

?溶菌酶-脫乙??嵌嗵悄?p>有關申請的交叉引用

本申請要求2004年3月18日提交的美國臨時專利申請No.60/554, 623的優先權,其在此處引入作為參考。

技術領域

本發明公開了特定用于?;な稱返目刮⑸錟?。

背景技術

在固體或半固體食品中,微生物生長主要發生在表面上。加熱處 理和化學防腐劑是用于維持微生物學安全和食物質量的最廣泛使用的 方法。微生物抗性增強的包裹膜通過抗微生物物質從承載膜結構至食 物表面的緩釋而具有用于確保食物表面微生物學安全性的巨大潛力。 此外,消費者對于合成化學食品防腐劑的擔憂已引起對替代的更“有 利于消費者”的可食用?;つじ惴旱男巳?。

溶菌酶為在許多天然系統中發現的經過充分研究的水解酶。其為 具有充分研究的空間結構和序列的小并且穩定的酶。溶菌酶由于其在 寬范圍的pH和溫度條件下的穩定性而具有用于食品保藏中的潛力。然 而,其對革蘭氏陰性細菌有限的抗菌效力限制了其在食品工業中的應 用。脫乙??嵌嗵俏閻某贍ど錁酆銜?,其也表現出抗微生物活 性。

如今,對具有增強的微生物抗性并且機械性能沒有顯著削弱的膜 具有持續的需求。

發明內容

本發明公開的一個方面涉及包括整合在脫乙??嵌嗵薔酆銜锘?內的溶菌酶的復合膜。另一個方面中,本發明公開了包括脫乙??嵌?糖,以及基于脫乙??嵌嗵侵亓康腦?0至約200重量百分比的溶菌酶 的膜。

本發明還公開了用于制備膜的方法,包括將脫乙??嵌嗵嗆腿芫?酶溶解或分散于水介質中而產生成膜溶液或分散體;向基質表面施加 該成膜溶液或分散體;并且將成膜溶液或分散體轉化為膜。

在尤其有效的應用中,該膜為用于食品的抗微生物?;ぜ?。

附圖說明

圖1圖示了作為時間的函數的溶菌酶從溶菌酶脫乙??嵌嗵歉春?膜基質向0.15M磷酸鹽緩沖液的釋放模式圖。N=6;L0=0%溶菌酶(w/w 脫乙??嵌嗵?;L20=20%溶菌酶(w/w脫乙??嵌嗵?;L60=60%溶菌 酶(w/w脫乙??嵌嗵?;L100=100%溶菌酶(w/w脫乙??嵌嗵?。膜 厚度為72.6±8.2μm。

圖2A和2B圖示了溶菌酶-脫乙??嵌嗵歉春夏ざ訠HI肉湯培養 基中E.coli(2A)和MRS肉湯培養基中糞鏈球菌(2B)的作用效果的 圖。N=6;對照=無膜;L0=0%溶菌酶(w/w脫乙??嵌嗵?;L20=20% 溶菌酶(w/w脫乙??嵌嗵?;L60=60%溶菌酶(w/w脫乙??嵌嗵?; L100=100%溶菌酶(w/w脫乙??嵌嗵?。

圖3A-3D為在1,000X放大倍數時溶菌酶脫乙??嵌嗵歉春夏け?面的掃描電子顯微鏡照片;L0(3A)、L20(3B)、L60(3C)、L100(3D)。 L0=0%溶菌酶(w/w脫乙??嵌嗵?;L20=20%溶菌酶(w/w脫乙???多糖);L60=60%溶菌酶(w/w脫乙??嵌嗵?;L100=100%溶菌酶(w/w 脫乙??嵌嗵?。

圖4A-4D為在1,000X放大倍數時溶菌酶-脫乙??嵌嗵歉春夏?橫截面的掃描電子顯微鏡照片;L0(4A)、L20(4B)、L60(4C)、L100 (4D)。L0=0%溶菌酶(w/w脫乙??嵌嗵?;L20=20%溶菌酶(w/w 脫乙??嵌嗵?;L60=60%溶菌酶(w/w脫乙??嵌嗵?;L100=100% 溶菌酶(w/w脫乙??嵌嗵?。

發明詳述

為了便于理解,以下更詳細描述了此處所用的下列術語:

“環境室內條件”指約10℃至約40℃,通常約20℃至約25℃的 室溫,大約1個大氣壓的壓力,以及包含一定量濕氣的氣氛。

“類似物”為化學結構不同于親本化合物的分子,例如同系物(因 化學結構的增加而不同,如烷基鏈長度的不同)、分子片段,一個或多 個官能團不同,或電離改變的結構。

“抗微生物有效量”為相比缺乏抗微生物組分的對照樣品,足以 抑制樣品中至少一種微生物的生長達到統計上顯著的程度,優選至少 約25%,更優選至少約50%,且最優選完全抑制該微生物的生長的抗 微生物組分或組分混合物的量。

如下文更詳細描述的“脫乙??嵌嗵恰?還稱為聚-(1→4)-β-D- 葡糖胺)包括去乙?;目嵌嗵?殼多糖也稱為β-(1→4)-聚-N-乙 ?;?D-葡糖胺)及其鹽。甲殼類水生物和甲殼綱動物的殼為脫乙???多糖所來源的殼多糖的常見來源。

“膜”包括涂層,并且該膜在其施用的食品表面或在其形成的食 品表面可以是間斷的或基本上連續的。例如,“膜”包括可覆蓋于食品 上的獨立膜以及通過噴涂、浸涂、點涂或類似的技術在食品上形成的 涂層。

“抑制”指此處公開的膜減緩或終止某些微生物在某時段的生長 或增殖。

“溶菌酶”表示催化某些細菌細胞壁粘多糖水解,具體地為N-乙 酰胞壁酸和N-乙酰葡糖胺之間的β(1-4)糖苷鍵,并引起細菌溶解的 酶家族??捎糜詿舜Φ娜芫赴ㄌ烊?存在的溶菌酶、合成的溶菌酶 以及下文更詳細描述的重組溶菌酶。

“微生物”或“微生物的”用于指顯微鏡可見的生物體或物質, 包括能感染人或動物和/或引起食物腐敗或其他不合需要的食物降解或 改變的真菌和細菌生物體。因此,術語“抗-微生物的”此處用于指殺 死或抑制真菌和/或細菌生物體生長的材料或試劑。

以上術語描述僅用以幫助讀者而提供,而不應該視為具有小于本 領域普通技術人員所理解的范圍或限制所附權利要求的范圍。

除非上下文另有明確表明,單數術語“一”、“一個”和“這個” 包括復數對象。類似地,除非上下文另有明確表明,單詞“或者”包 括“和”。單詞“包含”指“包括”。除非另有陳述,化學命名法中組 分的描述指在添加至說明書中任何指定組合時的組分,但不一定預先 排除一旦混合后混合物組分中的化學相互作用。

此處公開的膜包括至少一種脫乙??嵌嗵嗆橢遼僖恢秩芫?,其 中兩者都為可大量獲得的可更新材料。已發現基于脫乙??嵌嗵塹哪?基質可有效攜帶產生溶菌酶-脫乙??嵌嗵歉春夏さ母吲ǘ鵲娜芫?。 溶菌酶可以緩釋的方式從聚合脫乙??嵌嗵悄せ適頭挪⑶冶A羝潿?細菌細胞壁基質的溶解活性。例如,抗微生物組分溶菌酶(以及某些 情況中的脫乙??嵌嗵?可從膜釋放并且遷移入食品結構中。與單獨 的脫乙??嵌嗵腔虻ザ賴娜芫趕啾?,這種復合膜具有對革蘭氏陽性 和革蘭氏陰性細菌的增強、協同的抗微生物活性,而不削弱該膜的防 潮層特性。在膜的某些例子中,所有組分為對人或動物消耗而言都是 可安全食用的并且可從可更新的來源得到。此外,膜為可生物降解的。

溶菌酶基本上均勻分布于脫乙??嵌嗵欠腫有緯傻木酆賢唇峁?中。溶菌酶可以分布于脫乙??嵌嗵峭唇峁鼓詰奈⒖帕P問醬嬖?, 其中溶菌酶分子與脫乙??嵌嗵欠腫憂餳蝦?或通過范德華力互相 作用。

脫乙??嵌嗵俏叢捶岣?、可更新的并且無毒的聚合物,與許多 其他物質可以生物相容??剎捎萌魏渦問交虻燃?例如食物或醫用) 的脫乙??嵌嗵侵票改?。例如,脫乙??嵌嗵塹惱扯繞驕腫恿靠稍?約20至約2,000kD的范圍,并且脫乙酰作用的程度在約70至約90% 的范圍。根據一種用于產生膜的示例性方法,脫乙??嵌嗵親櫸?或 不同脫乙??嵌嗵塹幕旌銜?最初溶于引起脫乙??嵌嗵茄渦緯傻乃?水溶液中。產生存在于膜中的脫乙??嵌嗵茄蔚睦影ㄍ巖陰?嵌?糖乙酸鹽、脫乙??嵌嗵巧嚼嫠嵫?、脫乙??嵌嗵潛嵫?、脫乙???多糖乳酸鹽、脫乙??嵌嗵槍勸彼嵫?、脫乙??嵌嗵潛郊姿嵫?、脫乙 ??嵌嗵悄仕嵫?、脫乙??嵌嗵鍬砝此嵫?、脫乙??嵌嗵歉蝕妓嵫?、 脫乙??嵌嗵潛┧嵫?、脫乙??嵌嗵晴晁嵫?、脫乙??嵌嗵遣菟?鹽、脫乙??嵌嗵強夠笛嵫?、脫乙??嵌嗵薔剖嵫魏推浠旌銜?。 膜中脫乙??嵌嗵塹牧靠篩菟璧哪ば災識謀?。例如,基于膜的 總固體重量,膜可包含約25至約90,更尤其約35至約65重量百分比 的脫乙??嵌嗵?。

溶菌酶為存在于各種生物體,包括病毒、禽類、哺乳動物和植物 中的天然抗微生物多肽。人體內,溶菌酶可見于脾臟、肺、腎、白血 球、血漿、唾液、乳汁、眼淚和軟骨中。因此,溶菌酶可從人的乳汁、 淚液、唾液和鼻涕中分離。在牛的乳汁和初乳中也得以發現?;箍贍?從花椰菜汁分離溶菌酶。然而,允許溶菌酶以工業規模提取的最重要 的來源為雞的清蛋白。溶菌酶亦稱為胞壁酸酶或N-乙?;邗K?酶。人形式還可以重組產生。在此處公開的膜中,溶菌酶的有效量可 根據溶菌酶的來源而改變。一些溶菌酶比其它的更有效,雞的溶菌酶 比人的溶菌酶活性要低。膜中溶菌酶的抗微生物有效量還可根據所需 的膜性質而改變。尤其是,溶菌酶的最低量應足以提供抗微生物活性。 溶菌酶的最大量不應大至明顯降低膜的機械或水蒸氣滲透率性質。例 如,以脫乙??嵌嗵塹鬧亓考?,溶菌酶可以約10至約200重量百分比 的量,更尤其約10至約100重量百分比,并且最尤其約30至約90重 量百分比存在于膜中?;謊災?,膜可包括上至兩倍脫乙??嵌嗵橇康?溶菌酶的量。如果溶菌酶的量超過以脫乙??嵌嗵塹鬧亓考頻陌俜種?200,膜可能變得非常易碎并且機械強度較弱。

膜的任選組分為至少一種增塑劑,其可以是或不是可更新的材料。 增塑劑降低膜的脆性,并且提高膜的撓性和沖擊抗性。示例性的增塑 劑包括甘油、山梨糖醇、丙二醇、乙二醇、二甘醇、三甘醇、聚乙二 醇(例如,PEG300和PEG400)、酒石酸二丁酯、丙二醇、丁二醇、乙 酰單酸甘油乙酯和其混合物。膜中增塑劑的量可根據所需的膜性質而 改變。尤其是,由于溶菌酶較弱的成膜性質,增塑劑的量應隨著溶菌 酶濃度的增加而提高。例如,以脫乙??嵌嗵塹鬧亓考?,膜可包含約1 至約50,更尤其約20至約30重量百分比的增塑劑。

膜的另一種任選組分為至少一種交聯劑,其可以是或不是可更新 的材料。交聯劑可改進膜的防水汽特性并降低膜的水溶性。示例性的 交聯劑包括戊二醛、甲醛、乙二醛、雙醛淀粉、包含多價離子(例如 鈣和鎂陽離子)的物質和其混合物。膜中交聯劑的量可根據所需的膜 性質而改變。例如,基于脫乙??嵌嗵塹鬧亓?,膜可包含約1至約20, 更尤其約5至約10重量百分比的交聯劑。

此外任選的組分包括抗氧化劑、另外的抗菌劑、調味劑/著色劑、 疏水劑、營養藥品和類似的添加劑。為了改進防水性質,疏水添加劑, 如脂肪酸(即油酸、月桂酸、肉豆蔻酸、棕櫚酸和硬脂酸)、乙?;?油酯、蠟(即巴西棕櫚蠟、蜂蠟和石蠟)以及油劑(即,礦物油和植 物油)可以脫乙??嵌嗵侵亓考頻腦?0至約100%的濃度范圍整合到 膜組合物中。營養劑,如礦物質和維生素可整合到膜基質中以增強包 裝或涂層產品的營養價值。例如,可摻入鈣、鋅和維生素E以增強包 裝或涂層產品的健康益處(參見Park,S.-I.和Zhao,Y.2004.Incorporation of?High?Concentration?of?Mineral?or?Vitamin?into?Chitosan-Based?Films. Journal?of?Agricultural?and?Food?Chemistry.2004,vol.52,PP.1933-1939)。

膜可通過任何成膜技術包括澆鑄(即獨立成膜)、浸涂、噴涂、刷 涂、降-膜和類似的方法制備。根據一種變化,膜的所有組分混合于液 體混合物中(即,膜-形成混合物),其隨后形成膜。例如,液體混合物 可基本上均勻分布于基質表面并且隨后干燥而形成膜。在具體的例子 中,膜的組分為水溶性的或可分散的或經修飾而變成水溶性的或可分 散的(即溶解的)。組分一起混合于水溶液中(即,水為載體溶劑或介 質),其隨后在環境室溫和濕度下風干而形成膜?;蛘?,膜組分在有機 溶劑載體中為可溶的。膜組分可以任何順序一起混合。

膜-形成混合物應該相對便于制造和使用。膜-形成混合物的粘度應 該足夠低以允許混合物施加和涂布于基質上而無需任何高-強度涂布技 術或設備。例如,膜-形成混合物的粘度可在約10cps至約200cps的范 圍。

脫乙??嵌嗵竊謁嚶謝蛭藁嶂形扇艿?。合適的水相有機 酸包括乙酸、山梨酸、丙酸、乳酸、谷氨酸、苯甲酸、檸檬酸、馬來 酸、羥基乙酸、丙烯酸、琥珀酸、草酸、抗壞血酸、酒石酸和其混合 物。通常,有機酸為非常淡的例如,根據特定類型酸,約0.5至約5, 更尤其約1至約2的重量百分比的濃度。

通常,脫乙??嵌嗵竊は熱范ǖ牧吭諢肪呈椅孿氯芙庥謁嚶謝?酸中以產生脫乙??嵌嗵茄穩芤??;旌銜锏膒H可以為約2.5至約6.3, 更尤其約5.0至約6.0。溶于酸水溶液中的脫乙??嵌嗵橇?,根據水的 重量以及取決于膜終產品中所需的脫乙??嵌嗵橇?,可以為約1至約5, 更尤其約2的重量百分比。脫乙??嵌嗵茄穩芤夯箍砂ㄈ魏我隕?所 述的任選組分如增塑劑。

溶菌酶隨后可添加至脫乙??嵌嗵茄穩芤褐?。溶菌酶可以純凈、 工業級、食物級或藥物級的溶液形式添加,其可從不同商品供應商處 獲得?;蛘?,溶菌酶原液可通過將預定量的溶菌酶溶解于蒸餾水中而 制備。溶于水中的溶菌酶的量,根據水的重量以及取決于膜終產品中 所需的溶菌酶濃度,可以為約1至約20,更尤其約10至約15的重量 百分比。如果溶菌酶的量太大,膜-形成溶液可能變得不能接受的淡, 將不利地影響膜的性質。溶菌酶原液還可包括任何以上-所述的任選組 分如增塑劑。

脫乙??嵌嗵茄穩芤漢腿芫岡涸諢肪呈夷諤跫亂黃鴰旌隙?產生成膜溶液?;蛘?,成膜溶液可在約50℃的溫度加熱或加熱至約50 ℃的溫度以增強溶解。相對于溶菌酶原液的量,選擇脫乙??嵌嗵茄?溶液的量以提供所需濃度的溶菌酶。產生的水相成膜溶液的pH可調節 至在約5至約6的范圍內以通過提供低酸性環境而?;な澄?。

膜可通過任何方法用于食物。膜通過將成膜溶液涂至基質而從成 膜溶液形成。例如,成膜溶液可噴涂或刷涂在表面上以形成防護涂層, 或食品可浸入該成膜溶液中?;蛘?,澆鑄膜可通過包裝或類似的方法 而用于食品表面。涂布溶液的基質可在約25℃至約65℃的溫度加熱約 2小時至約48小時以形成膜。在涉及直接涂布食品的改變中,干燥時 間通常較短(例如,帶有加壓氣流約5至約60分鐘)。

膜抗微生物活性的持續時間取決于環境條件。在高水分環境中, 涂層組分進入食品的遷移率將提高,因此降低抗微生物活性的有效持 續時間。某些例子中,在環境室內條件中,膜可保持完好(即,膜保 持其顏色、大小和機械強度)高達約四個月。另外的例子中,抗微生 物活性可保持高達約三周。

施加于食品表面的涂層量應足以在表面上形成基本上連續的膜。 所述量隨各種因素的變化而變化,包括食品類型、施加方法和所需性 質,但其可在約2至約30,更尤其約5至約10mg/cm2基質表面積的 范圍。根據某些例子,獨立膜應具有至少約20μm,更尤其約30至約 80μm的厚度。小于20μM的厚度對于直接在食物表面上形成的涂層 (例如通過浸涂)為示例性的。

此處公開的膜設計為尤其針對抑制食物表面上的致病和腐敗細菌 以及真菌。示例性的細菌包括胚牙乳桿菌(Lactobacilus?plantarum)、單 核細胞增多性李氏桿菌(Listeria?monocytogenes)、大腸桿菌(Escherichia coli)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus?aureus)、肉毒桿菌(Clostridium botulinum)、沙門氏菌(Salmonella?spp)和假單胞菌(Pseudomonas?spp)。 示例性的真菌包括黑曲霉(Aspergillus?niger)、Monoilinia?fructicola、灰 葡萄孢菌(Botrytis?cinerea)和根霉(Rhizopus?spp)。

如此處所述?;さ氖稱吠ǔN資苡晌⑸鍔?、脫水(失水) 和/或因呼吸作用的成熟所引起的質量變質影響的食品。通常,乳酪(切 片的或塊的)和加工的肉制品(火腿、熱狗、香腸等等)可利用開發 的膜包裝或用成膜溶液涂層。易壞的水果和蔬菜商品,如漿果、櫻桃、 葡萄、蘋果、梨、油桃、李子和杏可被涂層而增強微生物安全性并延 長產品的貯存期限。

膜呈現所希望的透水汽特性。例如,膜的水蒸氣滲透率可在約1 至約300,更尤其約10至約100g?mm/m2?dkPa的范圍。膜的水蒸氣滲 透率和機械性質取決于成膜期間的相對濕度(RH),因為水可用作脫乙 ??嵌嗵悄ぶ械腦鏊薌?。在低RH環境中(例如,低于40%),膜為具 有改進的防水特性的相對較好的防氣材料。50%RH中,膜可以顯示出 比得上商業-可得的低密度聚乙烯(LDPE)膜的中等機械性質(例如, 10至100MPa的張力強度以及10至50%的斷裂伸長率)。膜的防水性 質可通過添加脂類材料而得以改進。

實施例

如下所述具體的實施例為用于說明性目的的并且不應認為限制附 加權利要求的范圍。

實施例1

材料

使用來自Vanson?Inc.(Redmond,WA)的蝦脫乙??嵌嗵嵌扌?進一步純化。蝦脫乙??嵌嗵峭ü?5℃時1%w/w乙酸水溶液的11cps 粘度以及89.9%的脫乙酰作用得以表征。蛋清溶菌酶獲自Eiprodukte GmbH?und?Co.(Germany)。USP(United?States?Pharmacopeia)級甘油 獲自EM?Science(Darmstadt,Germany)。試劑級冰醋酸獲自J.T.Baker (Phillipsburg,NJ)。

革蘭氏陽性糞鏈球菌(Streptococcus?faecalis)ATCC?14508和革蘭氏 陰性大腸桿菌B型用作檢驗生物體?;褡許igma?Chem.Co.(St.Louis, MO)的凍干溶壁微球菌(Micrococcus?lysodeikticus)用于溶菌酶釋放 模式的測量。腦心浸液培養液(brain?heat?infusion)(BHI)、MRS肉湯 培養基和瓊脂購自Difcoof?Becton,Dickinson?and?Company(Sparks, MD)。

成膜溶液的制備

通過將脫乙??嵌嗵僑芤河肴芫溉芤夯旌隙票賦贍と芤?(FFS)。通過將2wt%脫乙??嵌嗵僑芙庥諤砑?5%甘油(w/w脫乙酰 殼多糖)的1wt%乙酸溶液中而制備脫乙??嵌嗵僑芤?。通過將10wt% 溶菌酶溶解于添加25%甘油(w/w溶菌酶)的蒸餾水中而制備溶菌酶 溶液。然后將溶菌酶溶液以0、20、60或100%的濃度(每脫乙??嵌?糖的溶菌酶干重百分比)混合入脫乙??嵌嗵僑芤褐?。將得到的混合 物于Model?PT10-35(Kinematica?AG,Switzerland)中以3,000rpm勻 化60秒。用5N的氫氧化鈉將FFS的pH調節至5.2。所有樣品溶液過 濾通過尼龍網以除去不溶殘渣并在真空下脫氣(Model?0211-P204,Gast Mfg.Corp.,Benton?Harbor,MI)。

成膜

將計算量的每份脫氣的FFS以260×260mm的面積澆鑄于水平的 Teflon-涂布的玻璃板上以獲得約70μm的均勻膜厚度。室內環境下 (24±2℃和40±5%的相對濕度)干燥2天后,從板上剝離干燥的膜并 且切成片用于分析。尺寸25×25mm的膜片段用于密度和水分含量的評 估。尺寸25×86mm的膜片段用于機械測試。尺寸70×70mm的膜片 段用于水蒸氣滲透率的測試。所有測量之前,膜片在設置為25℃和50% 相對濕度的環境室(Model?T10RS,Tenney?Environmental,Williamsport, PA)中調節至少2天。

膜厚度/密度和含水量的測量

在25℃和50%調節2天后,利用卡尺測微計Model?No.293-766-30 (Mytutoyo?Manufacturing?Co.Ltd.,Japan)在每個膜樣本的五個隨機 位置測量膜厚度。膜密度通過將膜重量除以膜體積進行計算。膜的含 水量通過在鼓風干燥箱(Precision?Scientific?Inc.,Chicago,IL)中105 ℃干燥膜樣本18小時的重量分析進行。含水量的百分比計算為濕重 (wet?base)。

溶菌酶釋放的測定

約0.03g的溶菌酶-脫乙??嵌嗵悄ぱ鏡難方胄∑恐?0ml 的0.15M磷酸鹽緩沖液(pH6.2)中,并利用振蕩器(New?Brunswick Scientific?Co.Inc.,New?Brunswick,NJ)室溫下在50rpm振蕩。凍干 溶壁微球菌的底物儲液制備于0.15M磷酸鹽緩沖液中(450nm處0.65 的吸光度)。以0、0.25、1、4、12、24和48小時的時間間隔取1μl 的混合物樣品。這些樣品與2.5ml溶壁微球菌底物在比色杯中混合并 且隨后立即在25℃用Shimadzu?UV-Vis?2100分光光度計(Shimadzu Co.,Japan)讀數40秒。溶菌酶的比活(activity?rate)通過測量450nm 處溶液吸光度的降低而確定,其反映了細胞壁底物的水解。光密度的 降低表示為每分鐘Mille-吸光度單位的變化(Mabs/min)?;钚緣ノ桓?據0.15M磷酸鹽緩沖液中標準化溶菌酶濃度的回歸線轉換成mg/l溶菌 酶,并且隨后轉換成每克干膜釋放的溶菌酶克數。

抗微生物活性

大腸桿菌和糞鏈球菌分別在腦心浸液培養液(BHI)和MRS肉湯 培養液中37℃過夜培養。1ml的這些微生物樣品用99ml相同的培養液 稀釋以獲得大約107CFU/ml的接種物。約0.03g的每個膜樣本置于培養 皿(petri?dish)(85mm直徑)中,隨后向其中倒入10ml接種物。未暴 露于膜的接種物用作對照。

培養皿在室溫下50RPM振蕩。在0、6、12和24小時時取樣, 用稀釋小瓶(Dilu-Lock?IITM?Butterfield′s緩沖液,Hardy?Diagnostics, Santa?Maria,CA)稀釋,并且一式兩份接種平皿。對于接種平皿而言, BHI和MRS瓊脂分別用于大腸桿菌和糞鏈球菌。每個平皿在菌落計數 前在37℃溫育48小時。

水蒸氣滲透率的測量

利用25℃和100/50%RH梯度的杯碟法(cup?method)按照ASTM E?96(ASTM?2000a)確定水蒸氣滲透率(WVP)。11ml蒸餾水置于有 機玻璃(Plexiglas)制成的57mm內徑以及15mm內部深度的每個檢 驗杯中。水和膜間的距離為10.7mm并且有效膜面積為25.5cm2。檢驗 杯組件置于控溫并控濕的室中(25℃以及50%RH)。每個杯組件利用電 子天平(0.0001g精度)在6小時中每小時進行稱重記錄隨時間水分的 損失。隨后利用WVP校正法(Gennadios及其它人1994)校正WVP 在膜和水表面之間滯流的空氣間隙的阻力。

機械性能

膜的機械性能利用紋理分析器(TA.XT2i,Texture?Technologies Corp.,Scarsdale,NY)測定。所有性能測量在從室取出膜樣本后立即 進行,從而把水分差異減到最低。ASTM?D882法(ASTM?2000b)用 于測量斷裂時的張力強度(TS)和伸長率(EL)。每個膜樣本安放在紋 理分析器的柄間(TA96)并且用50mm的初始柄間距和1mm/s的十字 頭速度進行檢驗。TS值以測量的最大負載(N)除以膜橫截面積(mm2) 得到的MPa單位報告。EL值通過記錄的斷裂伸長率除以樣本的初始長 度并且乘以100而獲得。

微觀結構

膜的表面和內部結構利用掃描電子顯微鏡術(AmRay?3300FE場發 射SEM,AmRay,Bedford,MA)進行評估。膜片安放于鋁短棒上并 利用濺射涂料器(Edwards?model?S150B?Sputter?Coater;BOC?Edwards Vacuum,Ltd,UK)涂布金-鈀合金。每個涂布的樣品利用直接垂直于 樣品的電子束的5kV電壓檢驗。

統計分析

所有實驗重復三次。每次重復中,兩個膜樣本用于溶菌酶釋放和 抗微生物活性測量;五個膜樣品用于密度、含水量和WVP測量;10 個膜樣品用于機械性能測量。利用SAS(Statistical?Analysis?System Institute?Inc.,Cary,NC),一般線性模型(GLM)方法用于檢驗不同 膜間的差異。對所有的處理進行用于方差分析(ANOVA)的PROC GLM。進行PROC?REG以找到用于所測量應答的合適的回歸模式。 Duncan′s多-范圍檢驗用于多種方法的比較。差異顯著性確定為p<0.05。

結果-成膜和基本的物理性能

當將溶菌酶摻入脫乙??嵌嗵僑芤褐惺?,任何FFS中均未觀察到 沉淀。此表明乙酸-溶解的脫乙??嵌嗵僑芤壕哂杏胨芐勻芫噶己?的相容性。所有干膜很容易從澆鑄板剝離。所有類型的膜的厚度通過 澆鑄計算量的FFS而小心控制在72±11μm的范圍內。此確保膜厚度中 觀察到無統計學差異(p<0.05)。

下表1顯示每個經檢驗的膜的密度和含水量(n=15)。純脫乙???多糖膜(L0)具有密度和含水量的最高值。所有膜當中密度無統計學 水平的差異。隨著溶菌酶濃度的提高含水量趨于降低。雖然不受任何 理論的束縛,此可能是因脫乙??嵌嗵嗆腿芫赴罅?OH和-NH2基團而發生。這些基團中氫鍵鍵合是主要的引力。溶菌酶分子添加入 脫乙??嵌嗵橇純賞ü岣咄巖陰?嵌嗵嗆腿芫阜腫蛹淶南嗷プ?用,如氫鍵鍵合和范德華力相互作用而改變脫乙??嵌嗵欠腫擁慕峁?構型。溶菌酶含有親水和疏水的氨基酸。成膜期間,隨著親水氨基酸 側鏈通過在折疊溶菌酶中起重要作用的相同的疏水相互作用而向水相 FFS伸出而形成溶菌酶疏水核(Proctor?and?Cunningham?1988)。膜基質 中的這些疏水側鏈可影響溶菌酶-脫乙??嵌嗵歉春夏さ暮?。

表1:溶菌酶-脫乙??嵌嗵歉春夏さ淖槌珊臀錮硇閱?

?膜類型1 ????????????????????組合物 ??密度 ??(g/ml) ??含水量 ??(%) ????溶菌酶 ????(%,w/w脫乙??嵌嗵? ????甘油 ????(%,w/w)2 ????L0 ????0% ????25 ??1.34±0.09 ??23.6±2.4 ????L20 ????20% ????25 ??1.30±0.05 ??21.7±3.0 ????L60 ????60% ????25 ??1.30±0.04 ??19.0±3.5 ????L100 ????100% ????25 ??1.31±0.06 ??18.8±2.8

1膜厚度=72.64±8.2μm;L0=0%溶菌酶(w/w脫乙??嵌嗵?; L20=20%溶菌酶(w/w脫乙??嵌嗵?;L60=60%溶菌酶(w/w脫乙酰 殼多糖);L100=100%溶菌酶(w/w脫乙??嵌嗵?

2基于FFS中脫乙??嵌嗵嗆腿芫傅淖苤亓亢偷母視橢亓堪俜?比

結果-溶菌酶的釋放

從膜基質釋放的溶菌酶的量顯示在圖1中。無溶菌酶(L0)的脫 乙??嵌嗵悄げ幌允徑遠掣扇鼙諼⑶蚓娜魏穩芙饣钚?,而這些活性 隨著摻入膜基質中的溶菌酶濃度的提高而成比例提高。當溶菌酶-脫乙 ??嵌嗵歉春夏ぶ糜諏姿嵫位撼逡褐惺?,膜因水分子擴散進入聚合膜 結構中而膨脹,引起摻入的溶菌酶從膜基質釋放進入水相環境。溶菌 酶隨時間從膜基質對數釋放。溶菌酶從膜基質的釋放與聚合基質中初 始溶菌酶濃度線性相關。48小時后來自每個膜樣本的溶菌酶釋放量的 百分比對L20、L60和L100膜而言分別為大約65%、79%和76%。24 小時后,來自每個膜樣本的溶菌酶釋放量百分比對L20、L60和L100 膜而言分別為大約48%、75%和71%。12小時后,來自每個膜樣本的 溶菌酶釋放量百分比對L20、L60和L100膜而言分別為大約43%、60% 和56%。1小時后,來自每個膜樣本的溶菌酶釋放量百分比對L20、L60 和L100膜而言分別為大約14%、26%和25%。

在半-濕食物中,微生物生長主要發生在食物表面上。因此,通過 控制和延緩擴散維持食物表面上所需要水平的抗微生物劑對延長食物 的貯存期限有利。這些結果表明摻入脫乙??嵌嗵悄さ娜芫縛梢鑰?制的方式從膜基質釋放并保持對細菌細胞壁基質的溶解活性。例如, 約24小時后高達約30%的溶菌酶未從膜釋放。約48小時后,高達約 20%的溶菌酶未從膜釋放。

結果-抗微生物活性

圖2A和2B顯示了大腸桿菌和糞鏈球菌在用溶菌酶-脫乙??嵌嗵?膜處理的肉湯培養基中的存活。除了用L100膜,溶菌酶-脫乙??嵌嗵?復合膜對大腸桿菌的抗微生物效力隨著溶菌酶濃度的提高而提高。溫 育24小時后,在具有L0、L20或L60膜的BHI肉湯培養液中細胞數 量分別降低約1.8、2.3和2.7log(循環)。同時,L100膜和對照使細胞 數量分別提高約0.1和2.3log(循環)。在回收細胞群后,L100膜抑 制生長高達6小時。

糞鏈球菌的生長沒有受到含有低濃度溶菌酶的溶菌酶-脫乙???多糖復合膜(L0和L20膜)的有效抑制。對于L0和L20膜而言,糞 鏈球菌群在暴露24小時期間稍有提高。相比之下,在含有L60和L100 膜的肉湯培養基中分別觀察到糞鏈球菌對數(log)水平減少3.3和3.8。 對照樣品中24小時后出現約1.1對數(log)(循環)的提高。隨著溶 菌酶濃度的提高,對革蘭氏陽性糞鏈球菌的抗微生物活性的提高可以 表明溶菌酶主要負責該作用。

脫乙??嵌嗵嵌源蟪Ω司目刮⑸锘钚砸延蒘hahidi(1999)綜 述。純脫乙??嵌嗵悄?L0)呈現對革蘭氏陰性大腸桿菌的殺菌作用, 但對革蘭氏陽性糞鏈球菌的生長幾乎沒有抑制作用。在L60膜中觀察 到對兩種細菌最穩定的抑制傾向。用L100膜回收大腸桿菌群值得懷疑, 并且可由溶菌酶-脫乙??嵌嗵竅嗷プ饔玫腦鑾拷薪饈?。從膜基質釋 放的脫乙??嵌嗵欠腫涌啥鴉諳赴礱婊蠐肴芫趕嗷プ饔枚緯?溶菌酶-脫乙??嵌嗵歉春銜?。當過量溶菌酶暴露于細胞懸液時,可提 高溶菌酶-脫乙??嵌嗵竅嗷プ饔玫目贍芐?。這些相互作用的提高可干 擾脫乙??嵌嗵嗆拖赴礱婕淶姆從?。

在含有最高溶菌酶濃度(L100)的脫乙??嵌嗵悄ぶ諧氏殖齠苑?鏈球菌最強的抗微生物活性,而對于大腸桿菌是在具有60%溶菌酶濃 度(w/w脫乙??嵌嗵?的膜中。這些結果表明脫乙??嵌嗵塹目刮?生物活性可通過將溶菌酶摻入脫乙??嵌嗵悄せ手卸靡蘊岣?。此 外,溶菌酶與脫乙??嵌嗵欠腫擁謀嚷飾跋烊芫?脫乙??嵌嗵歉?合膜抗微生物性能的重要因素。

結果-水蒸氣滲透率

膜的水蒸氣滲透率(WVP)在測試的濃度水平沒有受溶菌酶摻入 的顯著影響(p<0.05)(參見下表2)。雖然不受任何理論的束縛,該結 果可通過兩個對立因素的作用而解釋。脫乙??嵌嗵悄?,如許多其他 的蛋白質或多糖可食用膜一樣,由于其親水性而呈現相對低的防水特 性。脫乙??嵌嗵悄さ姆浪閱蕓賞ü砑郵杷牧先韁舅岫靡?改善。由于溶菌酶包含疏水氨基酸側鏈,溶菌酶-脫乙??嵌嗵歉春夏?的親水性可隨著溶菌酶的添加而降低。然而,脫乙??嵌嗵塹鬧旅芙?構,尤其其結晶部分可由溶菌酶分子破壞,引起通過膜基質的WVP的 提高。這兩個對立因素可隨著溶菌酶濃度的改變而抵消或把溶菌酶-脫 乙??嵌嗵歉春夏さ腤VP特性的改變降到最低。

表2:溶菌酶-脫乙??嵌嗵歉春夏さ乃羝嘎?

????膜類型1 ????厚度(μm) ????WVP(gmm/m2?dkPa) ????L0 ????72.5±13.4 ????177.2±47.4 ????L20 ????68.8±6.6 ????157.4±26.5 ????L60 ????70.9±4.4 ????160.0±23.9 ????L100 ????69.0±9.8 ????166.2±22.2

1L0=0%溶菌酶(w/w脫乙??嵌嗵?;L20=20%溶菌酶(w/w脫乙 ??嵌嗵?;L60=60%溶菌酶(w/w脫乙??嵌嗵?;L100=100%溶菌酶 (w/w脫乙??嵌嗵?

結果-機械性能

膜的張力強度(TS)和斷裂時的伸長率(EL)隨著溶菌酶的添加 而顯著降低(p>0.05)(參見下表3)。TS和EL隨著溶菌酶濃度提高的 降低可描述為由下列線性方程組:

TS=-0.10CI+16.70,R2=0.96

EL=-0.32CI+59.89,R2=0.99

其中CI為溶菌酶-脫乙??嵌嗵悄せ手腥芫傅陌俜直擾ǘ?%, w/w脫乙??嵌嗵?。此外,發現EL和TS間存在線性關系:

EL=3.07TS+8.30,R2=0.98。

在1∶1脫乙??嵌嗵嗆腿芫傅謀嚷?L100)時,TS和EL值分 別有43%和48%的降低。然而,所述降低對于防止使用膜食物?;ぜ?的應用并不十分顯著。

脫乙??嵌嗵俏哂懈招災髁唇峁溝撓帕嫉某贍は咝途酆銜?,而 溶菌酶為具有較低成膜能力的帶正電荷的酶。TS和EL的降低表明溶 菌酶的摻入削弱了膜的結構和完整性。溶菌酶分子引入脫乙??嵌嗵?膜基質中可能破壞晶體結構的形成并且削弱脫乙??嵌嗵欠腫蛹淶姆?子間氫鍵。膜基質中脫乙??嵌嗵嗆腿芫阜腫蛹湓鑾康南嗷プ饔每?能是溶菌酶-脫乙??嵌嗵歉春夏ぶ蠺S和EL變化的原因。降低的TS 和EL值還歸因于溶菌酶對脫乙??嵌嗵欠腫擁慕到?,所述溶菌酶為幾 丁質分解酶。由溶菌酶降解脫乙??嵌嗵欠腫涌賞ü酶叨熱ヒ陰?化的脫乙??嵌嗵?例如至少約95%的脫乙酰程度)而減少。此外, 溶菌酶-脫乙??嵌嗵歉春夏さ幕敵閱芎頭浪閱蕓賞ü媚せ?中的交聯劑,如戊二醛而得以改善。

表3:溶菌酶-脫乙??嵌嗵歉春夏さ幕敵閱?

??膜類型1 ????厚度(μm) ???張力強度(Mpa) ????伸長率(%) ????L0 ????74.9±15.5 ???17.4±4.6 ????60.3±16.2 ????L20 ????70.8±9.2 ???14.4±3.4 ????53.8±9.0 ????L60 ????73.0±8.9 ???9.5±2.3 ????39.3±11.7 ????L100 ????69.9±9.2 ???7.4±1.5 ????29.1±8.2

1L0=0%溶菌酶(w/w脫乙??嵌嗵?;L20=20%溶菌酶(w/w脫乙 ??嵌嗵?;L60=60%溶菌酶(w/w脫乙??嵌嗵?;L100=100%溶菌酶 (w/w脫乙??嵌嗵?。

結果-微觀結構

脫乙??嵌嗵嗆腿芫訃溆帕嫉納鏘噯菪砸約叭芫岡謖鐾?乙??嵌嗵腔手械木確植紀ü齋EM顯微照片得以證實。圖3A-3D 顯示了1000X放大倍數下成膜期間暴露于空氣的溶菌酶-脫乙??嵌嗵?復合膜的外表面。如SEM顯微照片所示,膜的表面結構致密并且均勻。 所有膜具有顯示連續結構而在基質中無任何孔或裂縫的均勻外觀。L60 (3C)和L100(3D)膜的顯微照片顯示膜表面上明亮的大理石狀紋。 這種大理石狀紋為均勻分布的并且隨著溶菌酶濃度的提高而增加。白 色區域代表脫乙??嵌嗵腔手腥芫肝?顆粒的沉積。

圖4A-4D顯示溶菌酶-脫乙??嵌嗵歉春夏ぶ瀉嶠孛嫻南暈⒄掌?。 通過用液氮冷凍膜并隨后將它們斷裂而獲得鋒利的邊緣。如圖4A-4D 所示,脫乙??嵌嗵嗆腿芫訃涿揮寫怪繃遜旎螄嚳擲?。除了一些平 行于表面的斷裂外截面結構為致密并連續的,可能在膜斷裂時已經形 成。溶菌酶在整個膜基質中的均勻分布通過具有高溶菌酶濃度的膜的 均勻外觀顯示(4C和4D)。L20膜的顯微照片(4B)顯示雜質可能在 干燥期間落于膜上。這類污染可能是溶劑蒸發成膜方法的缺點,尤其 是如果膜在露天環境中澆鑄和干燥的話。

預實施例2

選擇性的FFS可通過在65℃將2wt%脫乙??嵌嗵僑芙庥諤砑恿?50wt%十二烷酸,25wt%甘油和100wt%溶菌酶(w/w脫乙??嵌嗵? 的1wt%乙酸溶液中而進行制備。然后如實施例1所述制備膜。向成膜 溶液中添加脂肪酸(即,十二烷酸)可改善膜的防水性能,并且不明 顯影響其抗微生物活性。

實施例3

通過將脫乙??嵌嗵僑芤河肴芫溉芤夯旌隙票竿坎既芤?。通 過將3%脫乙??嵌嗵僑芙庥諤砑恿?5%甘油(w/w脫乙??嵌嗵?的 1%乙酸溶液中而制備脫乙??嵌嗵僑芤?。通過將10%的溶菌酶溶解于 添加25%甘油(w/w溶菌酶)的蒸餾水中制備溶菌酶溶液。溶菌酶溶 液混合到脫乙??嵌嗵僑芤褐兄?0%的濃度(每干重脫乙??嵌嗵塹?溶菌酶的干重百分比)。產生的混合物利用均質器(PT?10-35, Kinematica,Switzerland)在3,000rpm勻化60秒。單核細胞增多性 李氏菌ATCC?15313和植物乳桿菌用作測試微生物來評估食物表面上 涂布處理的抗微生物效力。單核細胞增多性李氏菌和植物乳桿菌分別 在腦心浸液培養液(BHI)和MRS肉湯培養基中37℃過夜培養。

獲得商業生產的牛柳(beef?franks)(Bun-Length,Oscar?Mayer Foods?Corp.,Madison,WI)并且在無菌條件下切成26mm長度(~ 10g)。將牛柳片浸入涂布溶液30秒并且在垂直層狀氣流工作臺 (100-plus,Envirco?Corp.,Albuquerque,New?Mexieo)中干燥30分 鐘。未-涂布的對照和涂布的樣品用100μl單核細胞增多性李氏菌或植 物乳桿菌(~2×103CFU/ml)接種,置于200mm×150mm真空塑料袋 中(FoodSaver?Rolls,Tilia,Inc.,San?Francisco,CA),并用熱封機 (FoodSaver?Vac?1075,Tilia,Inc.,SanFrancisco,CA)真空包裝。

在22.5±1℃貯藏4天后,將每一牛柳樣品置于無菌兜包袋中。真 空塑料袋用90ml的0.1%的蛋白胨水漂洗并且轉入同樣的兜包袋中。樣 品用兜包型粉碎機(Stomacher?400?Circulator,Seward,London,UK) 在230?RPM?maccrate2分鐘。一式兩份對懸浮液的微生物群計數。BHI 和MRS瓊脂分別用于單核細胞增多性李氏菌和植物乳桿菌。含有微生 物介質的塑料平皿在微生物菌落計數前在37℃溫育48小時。

涂布處理對接種于涂布的和未-涂布的牛柳表面上單核細胞增多 性李氏菌或植物乳桿菌生長的影響顯示在表4中。溶菌酶-脫乙??嵌?糖復合涂布處理導致牛柳表面上單核細胞增多性李氏菌的生長抑制。 然而同樣的條件下觀察到植物乳桿菌細胞數量的少量提高。

表4:涂布對用單核細胞增多性李氏菌或植物乳桿菌接種的牛柳的 微生物生長的影響

微生物 ??處理 ????Log?CFU/g牛柳 ????0天 ????4天 單核細胞增多性李氏菌 ??未涂布的 ????2.39 ????3.74 ??涂布的 ????2.39 ????0 植物乳桿菌 ??未涂布的 ????3.15 ????4.27 ??涂布的 ????3.15 ????4.24

實施例4

商業生產的培養基切達干酪(cheddar?cheese)(Tillamook?County Creamery?Association,Tillamook,OR)用作用于證實溶菌酶-脫乙???多糖復合物涂布應用的抗微生物性能的另一種食物系統。干酪塊無菌 切至60mm×26mm×5mm大小(~10g),并用實施例3中所述的涂布溶 液涂布。所有方法與實施例3的相同。如表5所示,干酪切片表面上 的單核細胞增多性李氏菌和植物乳桿菌的生長均受到抑制。

表5.涂布對用單核細胞增多性李氏菌或植物乳桿菌接種的切達干 酪片的微生物生長的影響

微生物 處理 ????Log?CFU/g干酪 ????0天 ????4天 單核細胞增多性李氏菌 未涂布的 ????4.99 ????4.35 涂布的 ????4.99 ????4.09 植物乳桿菌 未涂布的 ????5.06 ????4.60 涂布的 ????5.06 ????4.06

實施例5

根據實施例1中所述的方法制備溶菌酶脫乙??嵌嗵僑芤?,除了 用2%的脫乙??嵌嗵譴?%的脫乙??嵌嗵?。成膜溶液在具有260 mm×260mm面積的水平Teflon-涂布的玻璃板上澆鑄并在環境條件下干 燥(22.5±1℃和40±5%相對濕度{RH})2天。從板上取下干膜并且切 成65×30mm大小的切片。產生的膜的厚度為85±9μm。膜切片保存在 設置為25℃以及50%RH的環境室中(TIORS,Tenney?Environmental, Williamsport,PA)2天。

切達干酪(Tillamook?County?Creamery?Association,Tillamook, OR)無菌切成60mm×26mm×5mm的矩形大小并用100μl單核細胞增 多性李氏菌或植物乳桿菌(~2×103CFU/ml)接種。接種的每片干酪夾 在兩個同等處理的膜切片間?;竦蒙桃瞪吶A?Bun-Length,Oscar Mayer?Foods?corp.,Madison,WI)并在無菌條件下切成26mm長(~ 10g)且真空包裝于200mm×150mm的真空塑料袋中(FoodSaver?Rolls, Tilia,Inc.,San?Francisco,CA)。貯存條件和微生物計數與實施例3 所述方法相同。

如表6所示,溶菌酶-脫乙??嵌嗵歉春夏そ檔土爍衫冶礱嬪銜⑸?物的生長。植物乳桿菌比單核細胞增多性李氏菌對膜更敏感。與干酪 表面處理的例子相比,膜處理呈現比涂布處理更強的抗微生物活性。

表6.膜施用對用單核細胞增多性李氏菌或植物乳桿菌接種的切 達干酪片的微生物生長的影響

微生物 ??處理 ????Log?CFU/g干酪 ????0天 ????4天 單核細胞增多性李氏菌 ??未涂布的 ????4.99 ????4.35 ??涂布的 ????4.99 ????3.60 植物乳桿菌 ??未涂布的 ????5.06 ????4.60 ??涂布的 ????5.06 ????1.39

根據一些實施例舉例說明和描述了本發明所公開的方法、膜和食 品的原理,很顯然,這些方法、膜和食品可在不背離所述原理的條件 下進行詳細的改進。

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