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一種 幽門 螺桿 感染 動物 模型 建立 方法
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摘要
申請專利號:

CN201310415511.5

申請日:

2013.09.12

公開號:

CN103446576B

公開日:

2014.10.08

當前法律狀態:

授權

有效性:

有權

法律詳情: 授權|||實質審查的生效IPC(主分類):A61K 38/14申請日:20130912|||公開
IPC分類號: A61K38/14; A61K35/74; A61K31/7036(2006.01)N; A61K31/7048(2006.01)N 主分類號: A61K38/14
申請人: 光明乳業股份有限公司
發明人: 苗君蒞; 郭本恒; 劉振民; 吳正鈞; 于鵬
地址: 201103 上海市閔行區吳中路578號
優先權:
專利代理機構: 上海弼興律師事務所 31283 代理人: 薛琦
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法律狀態
申請(專利)號:

CN201310415511.5

授權公告號:

103446576B||||||

法律狀態公告日:

2014.10.08|||2014.01.15|||2013.12.18

法律狀態類型:

授權|||實質審查的生效|||公開

摘要

本發明公開了一種幽門螺桿菌感染動物模型的建立方法,其包括:1、以4周齡雌性C57BL/6小鼠為試驗動物,用混合抗生素灌胃3~7天;所述的混合抗生素為慶大霉素、萬古霉素和制霉菌素;2、將步驟1灌胃后的C57BL/6小鼠飼養6~8天;3、接種幽門螺桿菌:將步驟2得到的C57BL/6小鼠禁食,用幽門螺桿菌菌液灌胃,8~12小時后進食;所述的步驟3的接種頻率為:隔日1次,共2~4次;4、將經步驟3,2~4次接種后的小鼠進行飼養。本發明的建模方法實驗時間短、操作次數少、感染幽門螺桿菌數量級高、感染時間長久,模型能廣泛應用于相關研究的幽門螺桿菌感染動物的方法。

權利要求書

權利要求書
1.  一種幽門螺桿菌感染動物模型的建立方法,其包括以下步驟:
步驟1、以4周齡雌性C57BL/6小鼠為試驗動物,用混合抗生素灌胃3~7天;所述的混合抗生素為慶大霉素、萬古霉素和制霉菌素;
步驟2、將步驟1灌胃后的C57BL/6小鼠飼養6~8天;
步驟3、接種幽門螺桿菌:將步驟2得到的C57BL/6小鼠禁食,用幽門螺桿菌菌液灌胃,8~12小時后進食;
所述的步驟3的接種頻率為:隔日1次,共2~4次;
步驟4、將經步驟3,2~4次接種后的小鼠進行飼養。

2.  如權利要求1所述的幽門螺桿菌感染動物模型的建立方法,其特征在于:步驟1中,所述的混合抗生素中,慶大霉素0.058~0.062萬單位/只/天,萬古霉素1.2~1.7mg/只/天,制霉菌素0.72~0.77萬單位/只/天。

3.  如權利要求2所述的幽門螺桿菌感染動物模型的建立方法,其特征在于:步驟1中,所述的混合抗生素中,慶大霉素0.062萬單位/只/天,萬古霉素1.7mg/只/天,制霉菌素0.77萬單位/只/天。

4.  如權利要求1所述的幽門螺桿菌感染動物模型的建立方法,其特征在于:步驟3中,所述的禁食時間為12~24小時。

5.  如權利要求1所述的幽門螺桿菌感染動物模型的建立方法,其特征在于:步驟3中,所述的幽門螺桿菌為幽門螺桿菌悉尼菌株SS1(H.pylori Sydney strain SS1,Hp SS1)。

6.  如權利要求1所述的幽門螺桿菌感染動物模型的建立方法,其特征在于:步驟3中,所述的幽門螺桿菌菌液為將幽門螺桿菌菌體懸于其液體培養基中形成的菌液;所述的幽門螺桿菌菌液中,所述的液體培養基為BHI。

7.  如權利要求1所述的幽門螺桿菌感染動物模型的建立方法,其特征在于:步驟3中,所述的幽門螺桿菌菌液中,其細菌密度大于1×108cfu/mL,優選1×109cfu/mL。

8.  如權利要求1所述的幽門螺桿菌感染動物模型的建立方法,其特征 在于:步驟3中,所述的幽門螺桿菌菌液灌胃量為0.18~0.22mL/只/次,優選0.2mL/只/次。

9.  如權利要求1所述的幽門螺桿菌感染動物模型的建立方法,其特征在于:步驟4中,所述的飼養的時間為兩周。

10.  如權利要求1或9所述的幽門螺桿菌感染動物模型的建立方法,其特征在于:所述的飼養在SPF級環境中飼養;所述的SPF級環境為:溫度22±2℃,,濕度56±5%,1周換2-3次墊料,控制12h光照,12h黑暗;飼料:常規飼料;自由進食、進水。

說明書

說明書一種幽門螺桿菌感染動物模型的建立方法
技術領域
本發明涉及微生物學和實驗動物學領域,特別涉及一種幽門螺桿菌感染動物模型的建立方法。
背景技術
幽門螺桿菌(Helicobacter pylori,Hp)被公認為是胃炎、消化性潰瘍和胃癌的主要致病因子,人是幽門螺桿菌感染的唯一易感宿主。在發達國家,幽門螺桿菌感染率約為50%左右,而在發展中國家則達到60%以上。為此,國內外研究者正在通過建立幽門螺桿菌感染的動物模型,研究幽門螺桿菌致病機理、特異性防治以及一些藥物或微生態制劑的療效。
國內外關于幽門螺桿菌感染動物模型的報道中,以豚鼠、裸鼠作為實驗動物的,由于易死亡、自身的免疫缺陷等問題,使得建模成功率低于80%,且模型應用受到一定局限;以小鼠CD1、Ba1b/c A以及Ba1b/c等品種作為實驗動物的,則感染率不高,且模型不穩定。其他以猴子、沙鼠、小豬等動物為模型的,存在價格昂貴、數量少、飼養條件高、感染困難等限制因素。同時,所有報道中的建模實驗時間較長,連續灌胃且次數較多,大大增加了建模時動物的死亡率和并發癥的產生。因此,對于幽門螺桿菌機理、藥物應用等研究,一個穩定的、重現性好的動物模型進行臨床前的動物實驗是必要的,找到一種普通的、易于飼養的動物,建立一個建模時間短、操作次數少、感染幽門螺桿菌數量級高、建模致死率低的動物模型建立方法,為幽門螺桿菌感染的徹底攻克奠定了基礎。
發明內容
本發明所要解決的技術問題在于,為了克服現有技術中建立幽門螺桿菌感染的動物模型可控性差、不穩定,成功率不高,建模時間較長,操作復雜, 成本較高,一般實驗室中難于建立等缺陷,而提供了一種幽門螺桿菌感染動物模型的建立方法。本發明的建模方法實驗時間短、操作次數少、感染幽門螺桿菌數量級高、感染時間長久,模型能廣泛應用于相關研究的幽門螺桿菌感染動物的方法。
本發明通過下述技術方案解決上述技術問題:
本發明提供了一種幽門螺桿菌感染動物模型的建立方法,其包括以下步驟:
步驟1、以4周齡雌性C57BL/6小鼠為試驗動物,用混合抗生素灌胃3~7天;所述的混合抗生素為慶大霉素、萬古霉素和制霉菌素;
步驟2、將步驟1灌胃后的C57BL/6小鼠飼養6~8天;
步驟3、接種幽門螺桿菌:將步驟2得到的C57BL/6小鼠禁食,用幽門螺桿菌菌液灌胃,8~12小時后進食;
所述的步驟3的接種頻率為:隔日1次,共2~4次;
步驟4、將經步驟3,2~4次接種后的小鼠進行飼養。
步驟1中,用混合抗生素灌胃可以有效降低小鼠胃部原有菌群對幽門螺桿菌感染建立的影響。所述的灌胃的方法可參考本領域中常規的灌胃方法進行。所述的用混合抗生素灌胃的天數優選7天。
步驟1中,所述的4周齡雌性C57BL/6小鼠可為本領域常規的4周齡雌性C57BL/6小鼠,一般體重都在11g±1~2g。
步驟1中,所述的混合抗生素中,較佳地,慶大霉素0.058~0.062萬單位/只/天,萬古霉素1.2~1.7mg/只/天,制霉菌素0.72~0.77萬單位/只/天;更佳地,慶大霉素0.062萬單位/只/天,萬古霉素1.7mg/只/天,制霉菌素0.77萬單位/只/天。
步驟2中,所述的飼養可為本領域中常規的飼養方法,一般在SPF級環境中飼養。所述的SPF(specific-pathogen-free)級環境為:溫度22±2℃,,濕度56±5%,1周換2-3次墊料,控制12h光照,12h黑暗;飼料:常規飼料;自由進食、進水。
步驟2中,所述的飼養的時間優選為7天。
步驟3中,所述的禁食的時間優選12~24h,更優選24h。
步驟3中,所述的幽門螺桿菌菌液為將幽門螺桿菌菌體懸于其液體培養基中形成的菌液;所述的幽門螺桿菌菌液中,所述的液體培養基可為BHI(brain heart infusion)。
步驟3中,所述的幽門螺桿菌優選為幽門螺桿菌悉尼菌株SS1(H.pylori Sydney strain SS1,Hp SS1)。
步驟3中,所述的幽門螺桿菌菌液中,其細菌密度優選大于1×108cfu/mL,更優選為1×109cfu/mL。
步驟3中,所述的灌胃的方法可為本領域常規的灌胃方法。所述的灌胃的次數優選3次。
步驟3中,所述的幽門螺桿菌菌液灌胃量優選0.18~0.22mL/只/次,更優選0.2mL/只/次。
步驟3中,所述的接種頻率優選為:隔日1次,共3次。
步驟4中,所述的飼養的方法可為本領域常規的飼養方法,一般在SPF級環境中飼養。所述的SPF(specific-pathogen-free)級環境為:溫度22±2℃,,濕度56±5%,1周換2-3次墊料,控制12h光照,12h黑暗;飼料:常規飼料;自由進食、進水。所述的飼養的時間優選為兩周。
所述的幽門螺桿菌感染動物模型的建立方法后,還可通過抽檢確定步驟來確定是否將幽門螺桿菌定殖于胃部。
所述的抽檢確定步驟優選包括:將經過上述步驟1~步驟4處理的C57BL/6小鼠禁食24h后處死,取幽門端,通過尿素酶實驗、細菌培養和病理切片驗證幽門螺桿菌是否定殖于胃部。所述的抽檢確定步驟可參考文獻:“建立幽門螺桿菌感染BALB/c小鼠動物模型”,《使用臨床醫藥雜志》,2013年第17卷第1期,P27-P33。
本發明中,小鼠進食的飼料可為本領域中常規的飼養飼料。
在不違背本領域常識的基礎上,上述各優選條件,可任意組合,即得本 發明各較佳實例。
本發明中除所述的幽門螺桿菌菌株外,所用試劑和原料均市售可得。
本發明的積極進步效果在于:本發明的建模方法實驗時間短、操作次數少、感染幽門螺桿菌數量級高、感染時間長久,模型能廣泛應用于各項幽門螺桿菌相關研究。
附圖說明
圖1為陰性對照小鼠胃組織切片。
圖2為陽性對照小鼠胃組織切片。
具體實施方式
下面通過實施例的方式進一步說明本發明,但并不因此將本發明限制在所述的實施例范圍之中。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法,按照常規方法和條件,或按照商品說明書選擇。
下述實施例中涉及的飼養均是在SPF級環境下進行飼養,具體條件為:溫度22±2℃,,濕度56±5%,1周換2-3次墊料,控制12h光照,12h黑暗;飼料:常規飼料;自由進食、進水。
慶大霉素、萬古霉素、制霉菌素:上海閃晶生物公司。
幽門螺桿菌悉尼菌株SS1(H.pylori Sydney strain SS1,Hp SS1):仁濟醫院惠贈。所述的幽門螺桿菌悉尼菌株SS1在以下文獻中被報道:“幽門螺桿菌(SS1)感染及其胃炎的小鼠模型”,《中國微生態雜志》,2003年6月第15卷第3期。
BHI培養基:Oxoid公司。
實施例1:
4周齡雌性C57BL/6小鼠,48只,體重11g±1~2g,混合抗生素灌胃7天(方案:慶大霉素0.062萬單位/只/天,萬古霉素1.7mg/只/天,制霉菌素0.77萬單位/只/天)→正常飼養一周→接種幽門螺桿菌:小鼠禁食24h后, 0.18mL/只/次的幽門螺桿菌菌液灌胃,細菌密度1×109cfu/mL,8小時后進食。隔日1次,共3次→飼養兩周→抽檢確定。建模抽檢的接種成功率100%,建模成活率96%。
實施例2:
4周齡雌性C57BL/6小鼠,48只,體重11g±1~2g,混合抗生素灌胃7天(方案:慶大霉素0.058萬單位/只/天,萬古霉素1.2mg/只/天,制霉菌素0.72萬單位/只/天)→正常飼養6天→接種幽門螺桿菌:小鼠禁食24h后,0.2mL/只/次的幽門螺桿菌菌液灌胃,細菌密度1×109cfu/mL,8小時后進食。隔日1次,共3次→飼養兩周→抽檢確定。建模抽檢的接種成功率100%,建模成活率100%。
實施例3:
4周齡雌性C57BL/6小鼠,48只,體重11g±1~2g,混合抗生素灌胃3天(方案:慶大霉素0.062萬單位/只/天,萬古霉素1.5mg/只/天,制霉菌素0.77萬單位/只/天)→正常飼養6天→接種幽門螺桿菌:小鼠禁食24h后,0.22mL/只/次的幽門螺桿菌菌液灌胃,細菌密度1×109cfu/mL,12小時后進食。隔日1次,共2次→飼養兩周→抽檢確定。建模抽檢的接種成功率100%,建模成活率100%。
實施例4:
4周齡雌性C57BL/6小鼠,48只,體重11g±1~2g,混合抗生素灌胃7天(方案:慶大霉素0.062萬單位/只/天,萬古霉素1.7g/只/天,制霉菌素0.77萬單位/只/天)→正常飼養8天→接種幽門螺桿菌:小鼠禁食12h后,0.22mL/只/次的幽門螺桿菌菌液灌胃,細菌密度1×108cfu/mL,12小時后進食。隔日1次,共4次→飼養兩周→抽檢確定。建模抽檢的接種成功率100%,建模成活率94%。
效果實施例1
1、建模評估
1)尿素酶實驗:取小鼠近幽門端1/3的胃,立即置于尿素酶快速檢測卡 (珠海麗珠試劑有限公司)中,24h后觀察。
結論:抽檢小鼠尿素酶反應均為陽性。
2)細菌培養:將實施例1的小鼠胃組織幽門端的1/3與400μL BHI置于無菌的玻璃勻漿器內勻漿數次,分別取勻漿液的10倍和100倍的無菌生理鹽水(濃度0.75%,氯化鈉相對于溶液的質量百分數,經滅菌處理的生理鹽水)稀釋液各100μL(樣本I、樣本II、樣本III)涂板,培養后鏡檢菌落并進行菌落計數,結果如表1所示。
表1建模抽檢幽門螺桿菌菌落計數結果

3)病理學檢查:甲醛固定的胃組織,石蠟包埋,切成6μm厚的組織切片,做蘇木素-伊紅(HE)染色和Giemsa染色,出據病理檢查報告。
通過HE和Giemsa染色觀察可知,幽門螺桿菌主要定殖于胃小凹。圖1為陰性對照(HE染色,放大倍數,×400),未見炎癥細胞浸潤,胃小凹中未見幽門螺桿菌;圖2為陽性結果(Giemsa染色,放大倍數,×400),箭頭指向為胃小凹中的幽門螺桿菌,胃竇黏膜固有層見炎癥細胞浸潤。
報告顯示,出現炎癥的小鼠胃黏膜病理變化:胃黏膜炎癥主要發生在胃竇部。胃竇黏膜固有層(黏膜深層較明顯)見少量單核細胞浸潤,個別小鼠胃黏膜見少量中性粒細胞浸潤,部分表淺層少量淋巴細胞浸潤。未見萎縮和腸化。Giemsa染色可明顯看到幽門螺桿菌菌體。
根據尿素酶試驗、胃組織活菌計數的結果以及病理切片觀察,抽檢的C57BL/6小鼠均成功地被幽門螺桿菌感染,幽門螺桿菌在被感染小鼠胃內的定殖量為4~20×104cfu/g胃組織,表明所采用的建模方法建立幽門螺桿菌動物感染模型成功。
2、感染穩定性評估
上述實驗確定建模成功后,每隔2周、4周、6周、8周……分別隨機抽 取小鼠重復以上三步評估實驗,結果顯示,此感染模型可持續6~8個月,且感染數量級不低于104cfu/g胃組織。
對比例1:
4周齡雌性C57BL/6小鼠,48只,體重11g±1~2g,接種幽門螺桿菌:小鼠禁食24h后,0.22mL/只/次的幽門螺桿菌菌液灌胃,細菌密度1×109cfu/mL,24小時后進食。隔日1次,共3次→飼養兩周→抽檢確定。
建模評估:
1)尿素酶實驗:抽檢小鼠中尿素酶反應1只為弱陽性,其余均為陰性。
2)細菌培養:抽檢10只小鼠,其中3只胃組織樣本菌落數分別為60cfu/g胃組織、35cfu/g胃組織、20cfu/g胃組織,其余均為0cfu/g胃組織。
結論:建模未成功。
對比例2:
4周齡雌性C57BL/6小鼠,48只,體重11g±1~2g,混合抗生素灌胃3天(方案:慶大霉素0.062萬單位/只/天,萬古霉素1.5mg/只/天,制霉菌素0.77萬單位/只/天)→接種幽門螺桿菌:小鼠禁食24h后,0.22mL/只/次的幽門螺桿菌菌液灌胃,細菌密度1×109cfu/mL,12小時后進食。隔日1次,共2次→飼養兩周→抽檢確定。
建模評估:
1)尿素酶實驗:抽檢小鼠尿素酶反應均為陰性。
2)細菌培養:抽檢小鼠胃組織培養,均無幽門螺桿菌菌落生成。
結論:建模未成功。

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