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马竞维戈塞尔塔: 生物轉化高粱秸稈和油菜籽餅粕制備飼料用復合酶兼益生菌制劑的方法.pdf

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生物轉化 高粱 秸稈 油菜籽 制備 飼料 復合 酶兼益生菌 制劑 方法
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摘要
申請專利號:

CN201310232485.2

申請日:

2013.06.08

公開號:

CN103300216B

公開日:

2014.10.08

當前法律狀態:

授權

有效性:

有權

法律詳情: 授權|||實質審查的生效IPC(主分類):A23K 1/00申請日:20130608|||公開
IPC分類號: A23K1/00; A23K1/14 主分類號: A23K1/00
申請人: 浙江大學
發明人: 阮暉; 徐娟; 李青青; 于驊; 陳功; 諸文穎; 楊璐; 杜姍姍; 吳淵; 紀曉燚
地址: 310027 浙江省杭州市西湖區浙大路38號
優先權:
專利代理機構: 杭州天勤知識產權代理有限公司 33224 代理人: 胡紅娟
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法律狀態
申請(專利)號:

CN201310232485.2

授權公告號:

103300216B||||||

法律狀態公告日:

2014.10.08|||2013.10.23|||2013.09.18

法律狀態類型:

授權|||實質審查的生效|||公開

摘要

本發明公開了一種生物轉化高粱秸稈和油菜籽餅粕制備飼料用復合酶兼益生菌制劑的方法,包括:將經渥堆發酵的普洱熟茶、香菇菌棒、茶樹菇菌棒、第一高粱秸稈、第一油菜籽餅粕、第一麥麩、第一蘋果渣和第一水充分混合,經馴化培養后形成發酵劑;將發酵劑、第二高粱秸稈、第二油菜籽餅粕、第二麥麩、第二蘋果渣和第二水充分混合,經發酵后,得到飼料用復合酶兼益生菌制劑。本發明中,利用微生態穩定的食品級安全菌群來發酵高粱秸稈和油菜籽餅粕制備各項性能指標較好的飼料用復合酶兼益生菌制劑,實現高粱秸稈和油菜籽餅粕的低成本高效生物轉化。同時,本發明方法,微生物易生長,酶活力高,發酵過程粗放,易于工業化大規模生產。

權利要求書

權利要求書
1.   一種生物轉化高粱秸稈和油菜籽餅粕制備飼料用復合酶兼益生菌制劑的方法,其特征在于,包括以下步驟:
1)將經渥堆發酵的普洱熟茶、香菇菌棒、茶樹菇菌棒、第一高粱秸稈、第一油菜籽餅粕、第一麥麩、第一蘋果渣和第一水充分混合,經馴化培養后形成發酵劑;
2)將步驟1)中的發酵劑、第二高粱秸稈、第二油菜籽餅粕、第二麥麩、第二蘋果渣和第二水充分混合,經發酵后,得到飼料用復合酶兼益生菌制劑。

2.   根據權利要求1所述的生物轉化高粱秸稈和油菜籽餅粕制備飼料用復合酶兼益生菌制劑的方法,其特征在于,步驟1)中,所述的經渥堆發酵的普洱熟茶、香菇菌棒、茶樹菇菌棒、第一高粱秸稈、第一油菜籽餅粕、第一麥麩、第一蘋果渣和第一水的質量比為10:1~10:1~10:5~15:2~8:1~4:0.5~2:10~30。

3.   根據權利要求2所述的生物轉化高粱秸稈和油菜籽餅粕制備飼料用復合酶兼益生菌制劑的方法,其特征在于,所述的經渥堆發酵的普洱熟茶、香菇菌棒、茶樹菇菌棒、第一高粱秸稈、第一油菜籽餅粕、第一麥麩、第一蘋果渣和第一水的質量比為10:5:5:10:5:2:1:22~25。

4.   根據權利要求1所述的生物轉化高粱秸稈和油菜籽餅粕制備飼料用復合酶兼益生菌制劑的方法,其特征在于,步驟1)中,所述的馴化培養的條件為在30℃~45℃馴化培養24~60小時。

5.   根據權利要求4所述的生物轉化高粱秸稈和油菜籽餅粕制備飼料用復合酶兼益生菌制劑的方法,其特征在于,所述的馴化培養的條件為在35℃~40℃馴化培養36~48小時。

6.   根據權利要求1所述的生物轉化高粱秸稈和油菜籽餅粕制備飼料用復合酶兼益生菌制劑的方法,其特征在于,步驟2)中,所述的發酵劑、第二高粱秸稈、第二油菜籽餅粕、第二麥麩、第二蘋果渣和第二水的質量比為10:100~800:50~500:10~100:5~60:100~1500。

7.   根據權利要求6所述的生物轉化高粱秸稈和油菜籽餅粕制備飼料用復合酶兼益生菌制劑的方法,其特征在于,所述的發酵劑、第二高粱秸稈、第二油菜籽餅粕、第二麥麩、第二蘋果渣和第二水的質量比為10:300~600:150~300:30~60:15~30:400~1000。

8.   根據權利要求1所述的生物轉化高粱秸稈和油菜籽餅粕制備飼料用復合酶兼益生菌制劑的方法,其特征在于,步驟2)中,所述的發酵采用固態發酵。

9.   根據權利要求8所述的生物轉化高粱秸稈和油菜籽餅粕制備飼料用復合酶兼益生菌制劑的方法,其特征在于,所述的固態發酵的條件為:料厚度為5cm~20cm,自然通風,在30℃~45℃發酵2~7天。

10.   根據權利要求9所述的生物轉化高粱秸稈和油菜籽餅粕制備飼料用復合酶兼益生菌制劑的方法,其特征在于,所述的固態發酵的條件為:固態發酵的料厚度為10cm~15cm,自然通風,在35℃~40℃發酵4~5天。

說明書

說明書生物轉化高粱秸稈和油菜籽餅粕制備飼料用復合酶兼益生菌制劑的方法
技術領域
本發明屬于微生物發酵領域,具體涉及一種采用微生態穩定的食品級安全菌群發酵高粱秸稈和油菜籽餅粕,制備飼料用復合酶兼益生菌制劑的方法。
背景技術
我國是一個耕地極度緊張的人口大國,飼料原料特別是能量飼料和蛋白飼料的需求均存在巨大缺口。
木質纖維素是地球上最豐富、最廉價的可再生資源。農產品與食品的生產加工過程也產生大量木質纖維素類副產物。木質纖維素種類繁多,例如各種農作物秸稈、城市纖維質垃圾、農產品加工副產物如玉米芯、蔬菜莖葉、果蔬渣等,木質纖維素的成分主要包括纖維素、半纖維素、木質素和果膠等,因其大宗廉價而成為自然界中具有重大應用價值的復雜底物,但由于木質纖維素的組成與結構復雜,因而難以被單胃動物消化。實現木質纖維素等非糧物質高效低成本生物轉化,使其替代玉米等谷物作為能量飼料,將是飼料產業發展的重要增長點。
餅粕是一類富含蛋白質的大宗農業副產物。隨著養殖產業的快速發展,對蛋白資源需求量也越來越大,而且動物性優質蛋白資源(如魚粉)來源有限,價格近年來一直在快速上漲,因此,以餅粕為蛋白飼料,將大大緩解飼料蛋白資源緊張局面,且能夠降低飼料成本。餅粕種類繁多,包括大豆餅粕、棉籽(仁)餅粕、油菜籽餅粕、花生(仁)餅粕、向日葵(仁)餅粕、茶籽餅粕、芝麻餅粕等,但餅粕中含有非常多樣的毒性物質和抗營養物質。例如硫苷在有水情況下經芥子酶分解出異硫氰酸酯和腈等有毒物質,使動物甲狀腺腫大,新陳代謝紊亂,甚至造成皮下出血,還影響腎上腺皮質、腦垂體和肝等器官的功能??褂鎦蔭lpha?半乳糖苷化合物則使動物腸道脹氣從而影響消化功能。而且餅粕在富含蛋白質的同時也含相當高的植物纖維成分,單胃動物消化不易。如果能夠高效低成本地消除餅粕中的毒性和抗營養物質并進行生物轉化,則各類餅粕將被充分地開發為蛋白飼料原料并替代魚粉等高價動物性飼料蛋白,成為未來飼料產業發展的又一個重要增長點。
微生物發酵是實現木質纖維素和餅粕類農業副產物低成本高效生物轉化的有效途徑。木質纖維素基本上是碳水化合物,餅粕富含蛋白質,兩者組合可為微生物提供營養豐富、比例恰當的發酵基質,而系統生物學理論則為通過微生物發酵實現木質纖維素和餅粕的低成本高效生物轉化提供了新策略。根據系統生物學理論,微生物群落與其酶系以及其所處底物環境是一個不可分割的完整系統,其形成是長期自然進化和平衡的結果。在此系統中,不同微生物所產酶的種類和活力各有不同,只有共存于同一系統中并且共享系統所提供的環境因素,才能有效轉化底物。在自然界中普遍存在由諸多種屬不同微生物構成的微生態穩定平衡的野生微生物群落,例如瘤胃微生物群落、沼氣微生物群落、堆肥微生物群落、飼料青貯微生物群落、高等動物腸道微生物群落、植物內生菌群落、白腐真菌群落、食木性昆蟲腸道內生菌群落等。這些野生微生物群落在其所處特定野生環境中可進行穩定混合發酵,并且由于其所產酶系的多樣性,可以對復雜底物進行生物轉化。因此,根據系統生物學理論,通過在天然菌群的基礎上,構建一個產酶與發酵能力強大而又適合木質纖維素和餅粕基質環境的微生態穩定菌群,可望實現木質纖維素和餅粕類的低成本高效生物轉化。
普洱茶是一種發酵茶,其在渥堆發酵過程中形成了菌相復雜但微生態穩定的菌群,即普洱茶渥堆菌群,該菌群包括曲霉屬(Aspergiltus)、根霉屬(Rhizopus)、青霉屬(Penicillium)、木霉屬(Trichoderma)、近平滑假絲酵母(C.parapsilosis)、無名假絲酵母(C.famata)、西弗假絲酵母(C.cifferrii)、克魯費酵母(Saccharomyces kluyoerii)、羅倫隱球酵母(Cryptococcus laurentii)、擔子菌(Basidiomycetes)、乳桿菌屬(Lactobacillus)、芽孢桿菌屬(Bacillus)、短桿菌屬(Brevibaterium)、球菌屬(Staphylococcus)、線菌屬(Actinoplanes)、鏈霉菌屬(Streptomyces)等,其中包括絲狀真菌、酵母和細菌,既有產酶微生物又有益生菌,具備了豐富而強大的產酶能力、發酵轉化能力和益生功效,可望應用于木質纖維素和餅粕類農業副產物的生物轉化。
食用菌是一大類以木質纖維素為基質進行生長繁殖的食品級安全大型真菌,重要食用菌種類包括平菇(Pleurotus ostreatus)、扇形側耳(Pieurotus flabellatus)、肺形側耳(Pleurotus pulmonarius)、鳳尾菇(Pleurotus sajor?caju)、香菇(Lentinus edobes)、虎皮香菇(Lentinus tiginus)、金針菇(Flamulina velutipes)、靈芝(Gannodema lucidum)、裂褶菌(Schizophyllum commune)、脈射菌(Phlebia radiata)、云芝(Coriolus versicolor)、榆黃蘑(Plearotus citrinopileatus)、姬菇(Plearotus cornucopiae)、杏鮑菇(Pleurotus eryngii)、木耳(Auricularia auricular)、羊肚菌(Morchella esculenta)、茶樹菇(Agrocybe cylindracea)、黃傘(Pholiota adipose)、雙孢蘑菇(Agaricus bisporus)、斑玉蕈(Hypsizigus marmoreus)、猴頭菌(Hercicium erinaceum)、姬松茸(Agaricus blazei)、滑菇(Pholiota nameko)等。由于食用菌在生長繁殖過程中向基質中分泌大量木質纖維素酶類,故其基質對農業副產物特別是木質纖維素類農業副產物具有很強的生物轉化能力。
發明內容
本發明提供了一種生物轉化高粱秸稈和油菜籽餅粕制備飼料用復合酶兼益生菌制劑的方法,采用微生態穩定的食品級安全菌群來發酵高粱秸稈和油菜籽餅粕制備飼料用復合酶兼益生菌制劑,實現高粱秸稈和油菜籽餅粕的低成本高效生物轉化。
一種生物轉化高粱秸稈和油菜籽餅粕制備飼料用復合酶兼益生菌制劑的方法,包括以下步驟:
1)將經渥堆發酵的普洱熟茶、香菇菌棒、茶樹菇菌棒、第一高粱秸稈、第一油菜籽餅粕、第一麥麩、第一蘋果渣和第一水充分混合,經馴化培養后形成發酵劑;
2)將步驟1)中的發酵劑、第二高粱秸稈、第二油菜籽餅粕、第二麥麩、第二蘋果渣和第二水充分混合,經發酵后,得到飼料用復合酶兼益生菌制劑。
普洱茶是一種歷史悠久、公認安全的飲品,經渥堆發酵的普洱熟茶內形成的普洱茶渥堆菌群是食品級安全菌群,香菇和茶樹菇是日常食用的食品級安全大型真菌,其菌棒中含有豐富的木質纖維素酶類。高粱秸稈和油菜籽餅粕是兩種大宗農業副產物。將經渥堆發酵的普洱熟茶、香菇菌棒、茶樹菇菌棒與第一高粱秸稈、第一油菜籽餅粕、第一麥麩、第一蘋果渣和第一水等基質混合后,通過馴化培養,使普洱茶渥堆菌群與基質中的天然菌群融合形成微生態穩定的食品級安全菌群,該菌群既擁有普洱茶渥堆菌群的豐富而強大的產酶能力、發酵轉化能力和益生功效,又適應基質環境,同時,基質環境中含有豐富的來源于香菇菌棒和茶樹菇菌棒的木質纖維素酶類,可對高粱秸稈(即第一高粱秸稈和第二高粱秸稈)和油菜籽餅粕(即第一油菜籽餅粕和第二油菜籽餅粕)進行低成本高效生物轉化。因此,得到的發酵劑性能較好。
用發酵劑內微生態穩定的食品級安全菌群對高粱秸稈和油菜籽餅粕進行發酵,將高粱秸稈和油菜籽餅粕轉化為飼料用復合酶兼益生菌制劑,得到的飼料用復合酶兼益生菌制劑的各項性能指標較好。
在發酵劑制備與發酵過程中,高粱秸稈作為主要碳源,油菜籽餅粕作為主要氮源,構成了發酵基質中的基本成分。麥麩(即第一麥麩和第二麥麩)富含維生素和礦質元素,蘋果渣(即第一蘋果渣和第二蘋果渣)富含維生素和微生物可快速利用的可發酵性糖,添加麥麩和蘋果渣可為微生物發酵過程提供充分的生長因子(如有關酶的輔助因子)和快速利用碳源。
步驟1)中,作為優選,所述的經渥堆發酵的普洱熟茶、香菇菌棒、茶樹菇菌棒、第一高粱秸稈、第一油菜籽餅粕、第一麥麩、第一蘋果渣和第一水的質量比為10:1~10:1~10:5~15:2~8:1~4:0.5~2:10~30,在上述質量比的原料下,有利于普洱茶渥堆菌群與天然菌群融合形成微生態穩定的食品級安全菌群,得到發酵性能更好的發酵劑。進一步優選,所述的經渥堆發酵的普洱熟茶、香菇菌棒、茶樹菇菌棒、第一高粱秸稈、第一油菜籽餅粕、第一麥麩、第一蘋果渣和第一水的質量比為10:5:5:10:5:2:1:22~25,該質量比的原料下制成的發酵劑,其發酵性能最優異。
作為優選,所述的馴化培養的條件為在30℃~45℃馴化培養24~60小時,該馴化培養的條件有利于普洱茶渥堆菌群與基質中的天然菌群融合形成微生態穩定的食品級安全菌群,制備發酵性能更好的發酵劑。進一步優選,所述的馴化培養的條件為在35℃~40℃馴化培養36~48小時,該馴化培養的條件能夠制備發酵性能最優異的發酵劑。
步驟2)中,作為優選,所述的發酵劑、第二高粱秸稈、第二油菜籽餅粕、第二麥麩、第二蘋果渣和第二水的質量比為10:100~800:50~500:10~100:5~60:100~1500,上述質量比的原料下,經發酵后,有利于得到各項性能指標更好的飼料用復合酶兼益生菌制劑。進一步優選,所述的發酵劑、第二高粱秸稈、第二油菜籽餅粕、第二麥麩、第二蘋果渣和第二水的質量比為10:300~600:150~300:30~60:15~30:400~1000,有利于得到各項性能指標最好的飼料用復合酶兼益生菌制劑。
作為優選,所述的發酵采用固態發酵,微生物易生長,酶活力高,并且制備簡單,有利于工業化推廣利用。更進一步優選,所述的固態發酵的條件為:料厚度為5cm~20cm,自然通風,在30℃~45℃發酵2~7天。該固態發酵條件有利于得到各項性能指標更為優異的飼料用復合酶兼益生菌制劑。進一步優選,所述的固態發酵的條件為:固態發酵的料厚度為10cm~15cm,自然通風,在35℃~40℃發酵4~5天,該固態發酵條件有利于得到各項性能指標最優異的飼料用復合酶兼益生菌制劑。
飼料中的營養成分按照化學組成劃分主要是碳水化合物(如淀粉、纖維素、半纖維素、果膠質)、蛋白質、雜環類及非典型糖等化合物(如木質素、alpha?糖苷類、植酸、單寧等)。在飼料中添加對這些化合物進行預消化或轉化的酶,對于提高畜禽生產性能具有顯著效應。目前,纖維素酶、半纖維素酶如木聚糖酶、淀粉酶、蛋白酶、alpha?半乳糖苷酶、植酸酶等都作為飼料用酶制劑在飼料生產中廣泛使用,并且在使用中通常組合多種酶成為復合酶制劑進行添加。復合酶制劑中所包含的酶種越多,對飼料進行預消化或轉化的效力越高。本發明采用的菌群為普洱茶渥堆菌群與發酵基質中的天然菌群融合形成的微生態穩定的食品級安全菌群,微生物種類豐富,能夠發酵生產出種類非常豐富的飼料用復合酶,對其功效的評價通過對各有關酶活力的測定進行。
益生菌通過調理腸道功能對提升動物健康水平具有顯著功效。乳酸菌是最主要的益生菌。本發明采用的菌群中,最主要的來源是普洱茶渥堆菌群,其中含有大量乳酸菌,這些乳酸菌經過固態發酵大量增殖,成為益生菌制劑,對其功效的評價通過對乳酸菌數量的測定進行。
通過各有關酶活力的測定結果和乳酸菌數量的測定結果,可知,本發明制備的產物非常適合作為飼料用復合酶兼益生菌制劑。
與現有技術相比,本發明具有如下優點:
本發明中,生物轉化高粱秸稈和油菜籽餅粕制備飼料用復合酶兼益生菌制劑的方法,將經渥堆發酵的普洱熟茶、香菇菌棒、茶樹菇菌棒與第一高粱秸稈、第一油菜籽餅粕、第一麥麩、第一蘋果渣和第一水等基質混合后,通過馴化培養,使經渥堆發酵的普洱熟茶中的普洱茶渥堆菌群與基質中的天然菌群融合形成微生態穩定的食品級安全菌群,該微生態穩定的食品級安全菌群既擁有普洱茶渥堆菌群的豐富而強大的產酶能力、發酵轉化能力和益生功效,又適應基質環境,同時,基質環境中含有豐富的來源于香菇菌棒和茶樹菇菌棒的木質纖維素酶類,可對高粱秸稈和油菜籽餅粕進行低成本高效生物轉化。用發酵劑內微生態穩定的食品級安全菌群對高粱秸稈和油菜籽餅粕進行發酵,將高粱秸稈和油菜籽餅粕轉化為飼料用復合酶兼益生菌制劑,得到的飼料用復合酶兼益生菌制劑的各項性能指標較好。
本發明中,生物轉化高粱秸稈和油菜籽餅粕制備飼料用復合酶兼益生菌制劑的方法,在發酵劑內微生態穩定的食品級安全菌群作用下,發酵可采用固態發酵,微生物易生長,酶活力高,發酵過程粗放,不需嚴格無菌條件,后處理簡便,無廢水排放,設備構造簡單、投資少、能耗低、易操作,易于工業化大規模生產,具有良好的經濟效益和廣闊的應用前景。
具體實施方式
實施例中的香菇菌棒和茶樹菇菌棒均采用浙江天泉莫干山菇業有限公司生產的市售產品,高粱秸稈從種植地自行采集,油菜籽餅粕采用確山縣三里河張氏餅粕貿易部的市售產品,麥麩采用大豐市金麥緣麥仁廠生產的市售產品,蘋果渣采用萬榮縣雙榮生態農牧有限公司生產的市售產品。
實施例1
1)將10kg經渥堆發酵的普洱熟茶、5kg香菇菌棒、5kg茶樹菇菌棒與10kg高粱秸稈、5kg油菜籽餅粕、2kg麥麩、1kg蘋果渣、22kg水充分混合,在35℃馴化培養48小時后,形成發酵劑;
2)將步驟1)中的發酵劑20kg與600kg高粱秸稈、300kg油菜籽餅粕、60kg麥麩、30kg蘋果渣、800kg水充分混合,采用固態發酵,料厚度為15cm,自然通風,在40℃發酵4天,得到飼料用復合酶兼益生菌制劑。
經測定,本實施例的飼料用復合酶兼益生菌制劑的性能指標為:羧甲基纖維素酶活力達到77.23IU/g;總纖維素酶活力達到6.88IU/g;beta?葡萄糖苷酶活力達到15.56IU/g;葡聚糖內切酶活力達到55.90IU/g;木聚糖酶活力達到58.57IU/g;beta?木糖苷酶活力達到5.64IU/g;聚半乳糖醛酸酶活力達到77.74IU/g;果膠酸酯裂解酶活力達到75.52IU/g;漆酶活力達到80.61IU/g;甘露聚糖酶活力達到38.16IU/g;alpha?半乳糖苷酶活力達到14.23IU/g;alpha淀粉酶活力達到150.53IU/g;蛋白酶活力達到188465IU/g;植酸酶活力達到114.64IU/g;單寧酶活力達到1435IU/g;乳酸菌密度達到3.86×108CFU/g。
實施例2
1)將10kg經渥堆發酵的普洱熟茶、5kg香菇菌棒、5kg茶樹菇菌棒與10kg高粱秸稈、5kg油菜籽餅粕、2kg麥麩、1kg蘋果渣、25kg水充分混合,在35℃馴化培養48小時后,形成發酵劑;
2)將步驟1)中的發酵劑20kg與600kg高粱秸稈、300kg油菜籽餅粕、60kg麥麩、30kg蘋果渣、800kg水充分混合,采用固態發酵,料厚度為15cm,自然通風,在40℃發酵4天,得到飼料用復合酶兼益生菌制劑。
經測定,本實施例的飼料用復合酶兼益生菌制劑的性能指標為:羧甲基纖維素酶活力達到76.78IU/g;總纖維素酶活力達到6.96IU/g;beta?葡萄糖苷酶活力達到15.42IU/g;葡聚糖內切酶活力達到55.46IU/g;木聚糖酶活力達到58.35IU/g;beta?木糖苷酶活力達到5.36IU/g;聚半乳糖醛酸酶活力達到77.48IU/g;果膠酸酯裂解酶活力達到75.48IU/g;漆酶活力達到80.46IU/g;甘露聚糖酶活力達到37.86IU/g;alpha?半乳糖苷酶活力達到14.11IU/g;alpha淀粉酶活力達到151.13IU/g;蛋白酶活力達到189775IU/g;植酸酶活力達到113.56IU/g;單寧酶活力達到1428IU/g;乳酸菌密度達到3.84×108CFU/g。
實施例3
1)將10kg經渥堆發酵的普洱熟茶、5kg香菇菌棒、5kg茶樹菇菌棒與10kg高粱秸稈、5kg油菜籽餅粕、2kg麥麩、1kg蘋果渣、25kg水充分混合,在40℃馴化培養36小時后,形成發酵劑;
2)將步驟1)中的發酵劑10kg與600kg高粱秸稈、300kg油菜籽餅粕、60kg麥麩、30kg蘋果渣、1000kg水充分混合,采用固態發酵,料厚度為10cm,自然通風,35℃發酵5天,得到飼料用復合酶兼益生菌制劑。
經測定,本實施例的飼料用復合酶兼益生菌制劑的性能指標為:羧甲基纖維素酶活力達到74.92IU/g;總纖維素酶活力達到6.14IU/g;beta?葡萄糖苷酶活力達到15.51IU/g;葡聚糖內切酶活力達到52.35IU/g;木聚糖酶活力達到59.66IU/g;beta?木糖苷酶活力達到5.88IU/g;聚半乳糖醛酸酶活力達到78.57IU/g;果膠酸酯裂解酶活力達到76.69IU/g;漆酶活力達到82.22IU/g;甘露聚糖酶活力達到39.23IU/g;alpha?半乳糖苷酶活力達到13.89IU/g;alpha淀粉酶活力達到154.64IU/g;蛋白酶活力達到190036IU/g;植酸酶活力達到115.48IU/g;單寧酶活力達到1397IU/g;乳酸菌密度達到3.79×108CFU/g。
實施例4
1)將10kg經渥堆發酵的普洱熟茶、1kg香菇菌棒、1kg茶樹菇菌棒與5kg高粱秸稈、2kg油菜籽餅粕、1kg麥麩、0.5kg蘋果渣、10kg水充分混合,在45℃馴化培養24小時后,形成發酵劑;
2)將步驟1)中的發酵劑20kg與200kg高粱秸稈、100kg油菜籽餅粕、20kg麥麩、10kg蘋果渣、200kg水充分混合,采用固態發酵,料厚度為5cm,自然通風,在45℃發酵2天,得到飼料用復合酶兼益生菌制劑。
經測定,本實施例的飼料用復合酶兼益生菌制劑的性能指標為:羧甲基纖維素酶活力達到68.86IU/g;總纖維素酶活力達到5.66IU/g;beta?葡萄糖苷酶活力達到14.11IU/g;葡聚糖內切酶活力達到47.28IU/g;木聚糖酶活力達到54.87IU/g;beta?木糖苷酶活力達到5.35IU/g;聚半乳糖醛酸酶活力達到71.27IU/g;果膠酸酯裂解酶活力達到70.12IU/g;漆酶活力達到74.35IU/g;甘露聚糖酶活力達到35.12IU/g;alpha?半乳糖苷酶活力達到12.57IU/g;alpha淀粉酶活力達到141.45IU/g;蛋白酶活力達到173028IU/g;植酸酶活力達到104.24IU/g;單寧酶活力達到1278IU/g;乳酸菌密度達到3.48×108CFU/g。
實施例5
1)將10kg經渥堆發酵的普洱熟茶、10kg香菇菌棒、10kg茶樹菇菌棒與15kg高粱秸稈、8kg油菜籽餅粕、4kg麥麩、2kg蘋果渣、30kg水充分混合,在30℃馴化培養60小時后,形成發酵劑;
2)將步驟1)中的發酵劑10kg與800kg高粱秸稈、500kg油菜籽餅粕、100kg麥麩、60kg蘋果渣、1500kg水充分混合,采用固態發酵,料厚度為20cm,自然通風,30℃發酵7天,得到飼料用復合酶兼益生菌制劑。
經測定,本實施例的飼料用復合酶兼益生菌制劑的性能指標為:羧甲基纖維素酶活力達到67.86IU/g;總纖維素酶活力達到5.72IU/g;beta?葡萄糖苷酶活力達到14.24IU/g;葡聚糖內切酶活力達到47.56IU/g;木聚糖酶活力達到54.36IU/g;beta?木糖苷酶活力達到5.57IU/g;聚半乳糖醛酸酶活力達到71.52IU/g;果膠酸酯裂解酶活力達到71.09IU/g;漆酶活力達到74.13IU/g;甘露聚糖酶活力達到34.92IU/g;alpha?半乳糖苷酶活力達到12.64IU/g;alpha淀粉酶活力達到141.43IU/g;蛋白酶活力達到174828IU/g;植酸酶活力達到105.35IU/g;單寧酶活力達到1236IU/g;乳酸菌密度達到3.47×108CFU/g。
各種酶活力及乳酸菌密度測定方法如下:
一、羧甲基纖維素酶、總纖維素酶和beta?葡萄糖苷酶的酶活力的測定
總纖維素酶(即濾紙纖維素酶(FPase)、羧甲基纖維素酶(CMCase)、beta葡萄糖苷酶活力的測定按照國際純化學與應用化學聯合會(International Union of Pure and Applied Chemistry)的規定程序進行(詳見“Ghose TK,1987.Measurements of cellulase activities.Pure Appl Chem,59,257?268.”)。
濾紙纖維素酶(FPase)活力單位:以Whatman No.1濾紙(1.0×6.0cm=50.0mg)為底物,50℃下,50mM檸檬酸鈉緩沖液(pH=4.8)中反應60min,以每分鐘釋放1μmol還原糖為一個酶活力國際單位(IU),表示為IU/g干重。
羧甲基纖維素酶(CMCase)活力單位:以2%(w/v)羧甲基纖維素為底物,50℃下,50mM檸檬酸鈉緩沖液(pH=5.5)中反應30min,以每分鐘釋放1μmol還原糖為一個酶活力國際單位(IU),表示為IU/g干重。
beta葡萄糖苷酶活力單位:2mL醋酸鹽緩沖液中加入1mL對硝基酚?β?葡萄糖苷(p?nitrophenyl glucopyranoside,pNPG)(1mM)作為底物,50℃下反應30min,430nm比色測定,以每分鐘釋放1μmol對硝基酚(p?nitrophenol)(pNP)為一個酶活力國際單位(IU),表示為IU/g干重。
二、葡聚糖內切酶、木聚糖酶、beta?木糖苷酶、聚半乳糖醛酸酶和果膠酸酯裂解酶的酶活力的測定
葡聚糖內切酶、木聚糖酶、聚半乳糖醛酸酶和果膠酸酯裂解酶活力測定分別以羧甲基纖維素、樺木木聚糖酶、聚半乳糖醛酸和果膠酸為底物,具體按照有關文獻(Cheilas T,Stoupis T,Christakopoulos P,Katapodis P,Mamma D,Hatzinikolaou DG,Kekos D,Macris BJ,2000.Hemicellulolytic activity of Fusarium oxysporum grown on sugar beet pulp.Production of extracellular arabinanase.Process Biochem,35,557?561;Jayani RS,Saxena S,Gupta R,2005.Microbial pectinolytic enzymes:a review.Process Biochem,40,2931?2944.)。每分鐘釋放1μmol還原糖為一個酶活力國際單位(IU),表示為IU/g干重。
beta?木糖苷酶活力測定以硝苯基糖苷(p?nitrophenyl glycoside)為底物,具體按照有關文獻(Mamma D,Koullas D,Fountoukidis G,Kekos D,Macris BJ,Koukios E,1996.Bioethanol from sweet sorghum:Simultaneous saccharification and fermentation of carbohydrates by a mixed microbial culture.Process Biochem,31,377?381.)。每分鐘釋放1μmol p?nitrophenol為一個酶活力國際單位(IU),表示為IU/g干重。
三、漆酶的酶活力的測定
漆酶活力通過對ABTS(2,2’?azino?bis?3?ethylbenzthiazoline?6?sulfonic acid)的氧化而測定,反應體系為檸檬酸鈉緩沖液(pH=3.0)中加入100μL的20mM ABTS再用檸檬酸鈉緩沖液(pH=3.0)定容至1mL,ABTS氧化率通過420nm吸收值而確定,具體按照有關文獻(Susan Grace Karp,Vincenza Faraco,Antonella Amore,Leila Birolo,Chiara Giangrande,Vanete Thomaz Soccol,Ashok Pandey,Carlos Ricardo Soccol.Characterization of laccase isoforms produced by Pleurotus ostreatus in solid state fermentation of sugarcane bagasse.Bioresource Technology,2012,114,735?739.)。每分鐘氧化1μmol ABTS為一個酶活力國際單位(IU),表示為IU/g干重。
四、甘露聚糖酶的酶活力的測定
甘露聚糖酶的活力測定以角豆膠為底物,1g酶粉于40℃、pH5.0條件下,1min水解角豆膠生成相當于1μmol甘露糖還原物質,即為1個酶活力單位,表示為IU/g干重。
五、alpha?半乳糖苷酶的酶活力的測定
alpha?半乳糖苷酶活力測定體系為“0.1mL酶液+0.8mL0.2M醋酸鹽緩沖液(pH4.8)+0.1mL2mM pNPG”,50℃反應15min后,加3mL0.2M Na2CO3終止反應,405nm處測吸收值,具體按照有關文獻(Dey PM,Pridham JB,1972.Biochemistry of alpha?galactosidase.Adv Enzymol,36,911?930.)。每分鐘釋放1μmol對硝基酚(paranitrophenol)為一個酶活力國際單位(IU),表示為IU/g干重。
六、alpha?淀粉酶的酶活力的測定
alpha?淀粉酶活力測定體系為“150μL酶液+200μL0.2%可溶性淀粉,以0.1M Tris?HCl緩沖液(pH=7.0)為溶液體系”,37℃反應30min后,加400μl3,5?dinitro salicylic acid終止反應并沸水浴保持5min,冷卻至室溫25℃后加8mL蒸餾水稀釋,489nm處測吸收值,具體按照有關文獻(Bernfeld P(1955)Amylases,alpha and beta.In:Colowick SP,Kaplan NO(eds)Methods in enzymology,Vol1.Academic,New York,pp149?154.)。每分鐘釋放1μmol還原糖為一個酶活力國際單位(IU),表示為IU/g干重。
七、蛋白酶的酶活力的測定
蛋白酶活力測定以氨苯磺胺偶氮酪蛋白(sulphanilamide azocasein)為底物,反應體系為250μL0.1M磷酸緩沖液(pH8.5)中含0.5%偶氮酪蛋白(azocasein)(w/v),再加150μL酶液,37℃反應30min后,加1.2mL三氯乙酸溶液(trichloroacetic acid solution)(10%,w/v)滅酶,再加800μL of1.8N NaOH中和,420nm處測吸收值,具體按照有關文獻(Leighton TJ,Doi RH,Warren RAJ,Kelln RA(1973)The relationship of serine protease activity to RNA polymerase modification and sporulation in Bacillus subtilis.J Mol Biol,76:103?122.).每分鐘釋放1μg偶氮酪蛋白(azocasein)為一個酶活力國際單位(IU),表示為IU/g干重。
八、植酸酶和單寧酶的酶活力的測定
植酸酶活力測定以對硝基苯磷酸鹽(p?nitrophenylphosphate)為底物,具體按照有關文獻(Stockmann C,Losen M,Dahlems U,Knocke C,Gellissen G,Buchs J(2003).Effect of oxygen supply on passaging,stabilizing and screening of recombinant Hansenula polymorpha production strains in test tube cultures.FEMS Yeast Res,4(2):195?205.)。每分鐘釋放1μmol對硝基苯酚(p?nitrophenol)為一個酶活力國際單位(IU),表示為IU/g干重。
單寧酶活力測定以單寧酸為底物,具體按照有關文獻(Mondal KC,Banerjee D,Jana M,Pati BR(2001).Colorimetric assay method for determination of the tannin acyl hydrolase(EC3.1.1.20)activity.Anal Biochem,295(2):168?171.)。每分鐘轉化1μmol單寧酸為一個酶活力國際單位(IU),表示為IU/g干重。
九、乳酸菌密度的測定
Man Rogosa Sharpe(MRS)培養基為乳酸菌選擇培養基,測定Man Rogosa Sharpe(MRS)培養基上的菌落總數,即可換算為乳酸菌密度。菌落總數測定按照有關文獻進行(Song Y,Luo Y,You J,Shen H,&Hu S.(2012).Biochemical,sensory and microbiological attributes of bream(Megalobrama amblycephala)during partial freezing and chilled storage.J Sci Food Agric,92(1),197?202.)。

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