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维戈塞尔塔VS贝蒂斯: 雙離子交換層析分離純化眼鏡蛇神經毒蛋白的方法及制劑.pdf

摘要
申請專利號:

维戈塞尔塔vs皇家社会 www.vmyqew.com.cn CN201310320887.8

申請日:

2013.07.29

公開號:

CN103387610B

公開日:

2014.10.08

當前法律狀態:

授權

有效性:

有權

法律詳情: 授權|||實質審查的生效IPC(主分類):C07K 14/46申請日:20130729|||公開
IPC分類號: C07K14/46; C07K1/18; A61K38/17; A61P29/00 主分類號: C07K14/46
申請人: 奔馳生物科技(云南)有限公司
發明人: 呂秋敏; 石聰博
地址: 650000 云南省昆明市高新區西二環路625號5樓5502號
優先權:
專利代理機構: 昆明合眾智信知識產權事務所 53113 代理人: 朱玉丹
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法律狀態
申請(專利)號:

CN201310320887.8

授權公告號:

103387610B||||||

法律狀態公告日:

2014.10.08|||2013.12.04|||2013.11.13

法律狀態類型:

授權|||實質審查的生效|||公開

摘要

雙離子交換層析分離純化眼鏡蛇神經毒蛋白的方法,步驟如下:(1)第一次離子交換層析分離純化:a)眼鏡蛇粗毒的溶解:b)SP-Sephodex-C25凝膠柱分離純化。(2)第二次離子交換層析分離純化:a)SourceS(XK5030)柱:柱體積500ml,用A液1000毫升平衡柱子備用;b)SourceS(XK5030)柱純化,按標準純化圖譜收集二次純化的眼鏡蛇神經毒蛋白。本發明工藝科學合理,在生產中不使用有機試劑,不使用高濃度鹽,不使用任何蛋白修飾方法,最大限度地保存科博肽的生物學活性。本發明的工藝先進,操作簡單,可大大縮短生產周期,節約生產時間,降低生產成本,完全適合工業化生產線的應用。

權利要求書

權利要求書
1.  雙離子交換層析分離純化眼鏡蛇神經毒蛋白的方法,其特征在于,對蛇毒進行兩次離子交換層析純化,步驟如下: 
(1)第一次離子交換層析分離純化:
a)眼鏡蛇粗毒的溶解:
配制0.02M的磷酸鹽緩沖液為A液,
配制含0.8M NaCl的A液為B液;
稱取眼鏡蛇粗毒,用A液溶解,離心取上清液為蛇毒液,備用;
b)SP-Sephodex-C25凝膠柱分離純化:
將SP-Sephodex-C25凝膠用0.3N NaOH浸泡,用純水洗至中性,抽干取出置燒杯中加A液抽氣,取出裝于XK-5030柱中,用A液平衡,將上述離心好的蛇毒液加入SP-Sephodex-C25凝膠柱中,流速為8-12ml/分,用A液進行洗脫,再用15-35%梯度進行梯度洗脫,然后用100% B液洗脫,最后用A液600ml平衡柱子,按標準分離純化圖譜收集一次純化的眼鏡蛇神經毒蛋白,備用; 
(2)第二次離子交換層析分離純化:
a)Source S(XK5030)柱: 柱體積500ml,用A液1000毫升平衡柱子備用;
b)Source S(XK5030)柱純化: 將步驟(1)得到的神經毒蛋白用A液稀釋三倍,流速為10ml/分,直接加入Source S(XK5030)柱中,再用10-35%梯度的A液 B液3000ml進行梯度洗脫,然后用100% B液200ml洗脫,最后用A液600ml清洗柱子,按標準純化圖譜收集二次純化的眼鏡蛇神經毒蛋白。

2.   根據權利要求1所述的雙離子交換層析分離純化眼鏡蛇神經毒蛋白的方法,其特征在于,對蛇毒進行兩次離子交換層析純化,具體步驟如下:
(1)第一次離子交換層析分離純化:
a)眼鏡蛇粗毒的溶解:
配制0.02M的磷酸鹽緩沖液,并調pH 5.6—pH 6.8為A液;
配制含0.8M NaCl的A液為B液;
稱取眼鏡蛇粗毒20-30克,用A液50-100毫升溶解,3000轉/分轉速,離心8-12分鐘,取上清液為蛇毒液,備用;
b)SP-Sephodex-C25凝膠柱分離純化:
將600毫升SP-Sephodex-C25凝膠用500毫升0.3N NaOH浸泡10分鐘,用純水洗至中性,抽干取出置燒杯中加A液600毫升抽氣10分鐘,取出裝于XK-5030柱中,用A液2000ml平衡,將上述離心好的蛇毒液加入SP-Sephodex-C25凝膠柱中,流速為10ml/分,
用A液600ml進行洗脫,再用15-35%梯度 A液, B液3000ml進行梯度洗脫,然后用100% B液200ml洗脫,最后用A液600ml平衡柱子,按標準分離純化圖譜收集一次純化的眼鏡蛇神經毒蛋白,備用; 
(2)第二次離子交換層析分離純化:
a)Source S(XK5030)柱: 柱體積500ml,用A液1000毫升平衡柱子備用;
 b)Source S(XK5030)柱純化: 將步驟(1)得到的神經毒蛋白用A液稀釋三倍,流速為10ml/分,直接加入Source S(XK5030)柱中,再用10-35%梯度A液, B液 3000ml進行梯度洗脫,然后用100% B液200ml洗脫,最后用A液600ml清洗柱子,按標準純化圖譜收集二次純化的眼鏡蛇神經毒蛋白。

3.   根據權利要求1或2所述的雙離子交換層析分離純化眼鏡蛇神經毒蛋白的方法制備的制劑,其特征在于,用權利要求1或2得到的二次純化的眼鏡蛇神經毒蛋白與藥學上可接受的輔料,通過現有的常規制劑方法制備的單方制劑或復方制劑。

4.  根據權利要求3所述的雙離子交換層析分離純化眼鏡蛇神經毒蛋白的制劑,其特征在于,所述的單方制劑為:包括片劑、膠囊劑、溶液劑或顆粒劑的口服制劑、緩控釋劑、靶向制劑、乳膏劑、外用溶液劑、凍干粉注射劑或水針注射劑。

5.  根據權利要求3所述的雙離子交換層析分離純化眼鏡蛇神經毒蛋白的制劑,其特征在于,所述的復方制劑為:包括片劑、膠囊劑、溶液劑或顆粒劑的口服制劑、緩控釋劑、靶向制劑、乳膏劑、外用溶液劑、凍干粉注射劑或水針注射劑。

關 鍵 詞:
離子交換 層析 分離 純化 眼鏡蛇 神經 蛋白 方法 制劑
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