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埃瓦尔vS维戈塞尔塔: 一株具有熒蒽降解能力的耐鹽堿產吲哚乙酸菌及其應用.pdf

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具有 降解 能力 鹽堿 吲哚 乙酸 及其 應用
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摘要
申請專利號:

CN201310200180.3

申請日:

2013.05.24

公開號:

CN103243055B

公開日:

2014.10.08

當前法律狀態:

授權

有效性:

有權

法律詳情: 授權|||實質審查的生效IPC(主分類):C12N 1/20申請日:20130524|||公開
IPC分類號: C12N1/20; A62D3/02(2007.01)I; C05G3/00; C12R1/085(2006.01)N; A62D101/20(2007.01)N 主分類號: C12N1/20
申請人: 南京農業大學
發明人: 李輝信; 張振; 徐莉; 陳雄; 李偉明; 李方卉; 焦加國; 劉滿強; 陳小云; 胡鋒
地址: 211225 江蘇省南京市溧水區白馬鎮國家農業科技園南京農業大學基地
優先權:
專利代理機構: 南京天華專利代理有限責任公司 32218 代理人: 徐冬濤;傅婷婷
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法律狀態
申請(專利)號:

CN201310200180.3

授權公告號:

103243055B||||||

法律狀態公告日:

2014.10.08|||2013.09.11|||2013.08.14

法律狀態類型:

授權|||實質審查的生效|||公開

摘要

本發明公開了一株具有熒蒽降解能力的耐鹽堿產吲哚乙酸菌及其應用,屬于微生物領域,該蠟狀芽孢桿菌(Bacillus?Cereus?ZZ13),于2013年3月15日在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏,分類名為蠟狀芽孢桿菌(Bacillus?Cereus),保藏號CGMCC?No.7322。該菌株能高產吲哚乙酸并能耐鹽堿生長且能利用難溶性磷酸鹽為磷源進行生長,并對多環芳烴熒蒽具有一定的降解效果。

權利要求書

權利要求書
1.   一株具有熒蒽降解能力的耐鹽堿蠟狀芽孢桿菌(Bacillus Cereus)ZZ13,于2013年3月15日在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏,保藏號CGMCC No.7322。

2.   權利要求1所述的蠟狀芽孢桿菌(Bacillus Cereus)ZZ13在降解多環芳烴熒蒽中的應用。

3.   權利要求1所述的蠟狀芽孢桿菌(Bacillus Cereus)ZZ13在制備生物肥料中的應用。

說明書

說明書一株具有熒蒽降解能力的耐鹽堿產吲哚乙酸菌及其應用
技術領域
本發明涉及一種微生物,說涉及一株具有熒蒽降解能力的耐鹽堿產吲哚乙酸菌及其應用。
背景技術
在土壤中許多微生物能夠溶解難溶態磷,促進植物對磷的吸收,增加作物產量和改善作物品質,將解磷微生物作為生物肥料,不但可以提高土壤中磷的利用效率,節肥增產,而且可改善土壤結構,提高土壤有機質含量。植物促生菌(Plant Growth Promoting Bacteria,簡稱PGPB)被界定為在一定條件下有利于植物生長的自由生活在土壤、根際、根表、葉際的細菌。這些細菌能夠固氮、溶磷、溶鐵,并產生植物激素,如生長素、赤霉素、細胞分裂素和乙烯。此外,它們還能提高植物的抗逆性,包括干旱、高鹽堿、重金屬和有機污染物毒害。但現在大部分植物促生菌還未被馴化成能有效提高植物各種抗逆性的菌株,因此從植物根際土中分離得到能有效提高植物各種抗逆性的植物促生菌成為熱點。
發明內容
本發明的目的是針對現有技術的上述不足,提供一種蠟狀芽孢桿菌,能高效產吲哚乙酸并能在高鹽堿條件生長且能利用難溶性磷酸鹽為磷源進行生長,并對多環芳烴熒蒽具有一定的降解效果。
本發明的目的可通過如下技術方案實現;
本發明的一種蠟狀芽孢桿菌(Bacillus Cereus ZZ13),于2013年3月15日在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏,分類名為蠟狀芽孢桿菌(Bacillus Cereus),保藏號CGMCC No.7322。
所述蠟狀芽孢桿菌菌落較小為淡黃色、隆起,邊緣整齊,表面光滑濕潤,不透明,不規則桿狀排列,產芽孢。
所述蠟狀芽孢桿菌的生理生化特性是:革蘭氏陽性,嚴格好氧,化能異養,接觸酶陽性,M.R和VP試驗陰性,淀粉水解陽性,明膠水解陽性,硝酸鹽還原陽性,檸檬酸鹽利用陰性。
本發明所述的蠟狀芽孢桿菌培養時使用的主要氮源包括但不限于蛋白胨、酵母粉、硝酸鉀、硝酸銨、硫酸銨、谷氨酸;使用的主要碳源包括但不限于蔗糖、木糖、甘露醇、麥芽糖、乳糖、果糖、葡萄糖;使用的無機組分包括但不限于氯化鉀、氯化鈉、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鉀、磷酸三鈣、二水氯化鈣、七水合硫酸鎂、七水合硫酸亞鐵。本發明的蠟狀芽孢桿菌發酵可在20~35℃,pH6~10的環境下進行。
本發明所述的蠟狀芽孢桿菌分泌吲哚乙酸(IAA)的能力強,在30℃、180r/min搖床培養條件下24h其轉化IAA能力達46.67μg.mL‐1。吲哚乙酸是植物激素的一種,能夠促進根的發育。產吲哚乙酸的菌種,往往附著在植物根系或葉表面,利用植物代謝產生分泌物的同時產生IAA和少量GA3等植物激素來影響植物的生理過程和形態變化。表現為直接促進根的伸長,從而增大了與土壤中營養物質的接觸的機會;可提高植物體內源IAA的含量;誘導植物防衛基因的表達,提高植物體抗病,抗旱等抗逆性。作為本發明的優化方案,所述蠟狀芽孢桿菌的發酵在溫度為28℃、pH6~10下進行,該環境下產IAA量最高。
作為本發明的進一步優化,所述蠟狀芽孢桿菌采用的碳源為甘露醇,采用的氮源為酵母粉或蛋白胨或兩者的組合。利用上述碳源和氮源制得的培養基,培育出的蠟狀芽孢桿菌產IAA的量最高。
本發明所述的蠟狀芽孢桿菌可以在高鹽堿度條件下進行生長并產IAA。在實驗室搖瓶條件下,所述蠟狀芽孢桿菌可以在pH為10.5的條件下生長且產IAA,并可以在LB培養基含鹽度為7%的條件下生長,在含鹽度為4%時可產IAA。
本發明所述的蠟樣芽孢桿菌以難溶性磷酸鹽為磷源進行生長,并將其轉化為可溶性磷酸鹽。在實驗室搖瓶條件下,所述蠟狀芽孢桿菌對磷酸三鈣的轉化量達148.09mg.L‐1。相對于空白對照的結果,所述蠟狀芽孢桿菌對磷酸三鈣的轉化量比空白對照高出110.66mg.L‐1。
本發明所述的蠟樣芽孢桿菌多環芳烴熒蒽具有一定的降解效果。在實驗室搖瓶條件下,所述蠟狀芽孢桿菌在熒蒽初始濃度為50mg.L‐1的無機鹽培養基條件下培養7d后降解率為18.89%,有一定的降解效果。
有益效果:本發明的一種蠟狀芽孢桿菌能能高產吲哚乙酸并能耐鹽堿生長且能利用難溶性磷酸鹽為磷源進行生長,并對多環芳烴熒蒽具有一定的降解效果,可用于制備生物肥料。
附圖說明
圖1是本發明菌株ZZ13的菌落圖
圖2表示ZZ13菌株對難溶性磷的利用情況
圖3表示不同裝液量對菌株ZZ13產IAA的影響
圖4表示不同初始pH對ZZ13菌株產IAA的影響
圖5表示不同碳源對菌株ZZ13產IAA的影響
圖6表示不同氮源對ZZ13菌株產IAA的影響
圖7表示不同含鹽度對ZZ13菌株產IAA的影響
圖8表示ZZ13菌株對多環芳烴熒蒽的降解效果
生物材料保藏信息
蠟狀芽孢桿菌ZZ13,分類命名為蠟狀芽孢桿菌Bacillus Cereus,保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心,保藏日期為2013年3月15日,保藏地址為北京市朝陽區北辰西路1號院3號,中國科學院微生物研究所,保藏號CGMCC No.7322。
具體實施方式
下面結合附圖對本發明作更進一步的說明。
實施例1
首先準備以下三種培養基。
LB培養基:蛋白胨10g,酵母提取物5g,氯化鈉10g,瓊脂20g,蒸餾水1000ml,pH7.0‐7.2,121℃滅菌,20min。
LB液體培養基:不加瓊脂,其它條件同上。
無機磷細菌培養基(PKO培養基):磷酸三鈣5g,葡萄糖10g,硫酸銨0.5g,氯化鈉0.3g,七水合硫酸鎂0.3g,氯化鉀0.3g,硫酸錳0.03g,七水合硫酸亞鐵0.03g,pH7.0瓊脂20g,蒸餾水1000ml,pH7.0~7.2。121℃滅菌,20min。
無機鹽培養基:硫酸銨2.0g;磷酸二氫鈉0.5g;磷酸氫二鉀0.5g;七水硫酸鎂0.2g;二水氯化鈣0.1g,蒸餾水1000mL,pH7.0,121℃滅菌,20min。
將從南京紫金山腳采取的植物根際土挑根過篩后稱取10g置于盛有100ml滅菌水的250ml的三角瓶中,在搖床中,30℃,150r.min‐1振蕩20min,靜置10min,得到土壤懸浮液。該土壤懸浮液中含有若干種促生菌,采用稀釋法稀釋后涂于LB培養基,將平板倒置,于30℃,恒溫箱中培養24h后,挑取不同類型典型單個菌落,經平板純化后,4℃保存在LB斜面待用。
下面再通過定性測定和定量測定篩選出可分泌吲哚乙酸的細菌。
定性測定:將分離純化后的細菌接種于含有L‐色氨酸(200mg/L)的LB液體培養基,30℃,180r.min‐1搖床培養1d。取50μL菌懸液滴于白色陶瓷板上,同時加50μL Salkowski比色液(50mL35%HClO4+1mL0.5M FeCl3)。將加入50μL50mg/L吲哚乙酸的比色液作為陽性對照。白色陶瓷板于室溫避光放置30min后觀察,顏色變紅者表示能夠分泌吲哚乙酸。
定量測定:對初篩獲得的分泌IAA的細菌進行定量測定,培養條件同上。首先用分光光度法測定菌懸液的OD600值,然后將菌懸液以10000r.min‐1離心10min取上清液加入等體積Salkowski比色液,避光靜置30min,測定其OD530值。計算菌濃度OD600值為1時,單位體積發酵液中吲哚乙酸的含量。標準曲線的繪制采用分析純的吲哚乙酸梯度稀釋制備。
把得到的產IAA菌進行溶磷情況的篩選測定,將供試菌株接種于盛有30mL無機磷細菌液體培養基的150mL三角瓶,30℃,180r.min‐1培養4d后,將培養液裝入離心管4℃下10000r.min‐1離心,15min。取上清液用鉬藍比色法測定有效磷含量。
通過以上測定即篩選出一株高產吲哚乙酸且溶磷能力強的菌株,如圖1所示,該菌株形成的菌落為較小淡黃色、隆起,邊緣整齊,表面光滑濕潤,不透明,不規則桿狀排列,產芽孢,株型命名為ZZ13。該菌株在實驗室搖瓶條件下,所述蠟狀芽孢桿菌對磷酸三鈣的轉化量達148.09mg·L‐1。相對于空白對照的結果,所述蠟狀芽孢桿菌對磷酸三鈣的轉化量比空白對照高出110.66mg.L‐1(圖2)。
將上述方法篩選分離出的菌株,經上海英俊生物工程有限公司測序,根據16SrDNA的測序結果,在//www.ncbi.nlm.nih.gov在線查詢分析,利用Blast軟件在GenBank中與其它的16S rDNA序列進行同源性比較,選擇相近的序列與ZZ13的序列用MEGA version3軟件構建ZZ13的16SrDNA系統進化樹。根據該菌株的生理生化特征,鑒定為蠟狀芽孢桿菌(Bacillus Cereus),同源性為99%。將該菌株于2013年3月15日在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏,保藏號CGMCC No.7322。
實施例2
好氧性試驗
把滅過菌的LB培養基倒入3個已滅菌的試管中,大約在2/3處,在無菌操作臺上,用接種針挑取斜面培養的菌ZZ13(CGMCC No.7322),穿刺接種到上述培養基中(必須穿刺到管底)。30℃培養,分別在3天至7天觀察結果。在瓊脂柱表面上生長者為好氧菌,如沿穿刺線生長者為厭氧菌或兼性厭氧菌。
過氧化氫酶的測定
在干凈載玻片上滴1滴3%H2O2,取18~24h的LB斜面培養物1環,在H2O2中涂抹,若有氣泡產生則為陽性,否則為陰性。
甲基紅試驗(M.R試驗)
a.培養基及試劑:蛋白胨5g,葡萄糖5g,氯化鈉5g,蒸餾水1000mL,調節pH7.0~7.2,分裝試管,每管裝4~5mL,121℃滅菌20min。試劑:甲基紅0.1g,95%酒精300mL,蒸餾水200mL。
b.菌種培養及結果觀察接種菌株于上述培養液中,30℃培養l~2天。在培養液中加入幾滴甲基紅試劑,如培養液呈現紅色,為甲基紅陽性,黃色為陰性(甲基紅變色范圍4.4紅色~6.0黃色)。
乙酞甲基甲醇試驗(VP試驗)
a.培養基培養基同甲基紅試驗。
b.菌種培養及結果觀察接種與培養同甲基紅試驗。做VP試驗時,取培養液(約2mL)和等量的40%NaOH相混合,加少量肌酸,充分振蕩2~5min后,如培養液出現紅色,即為VP陽性。
淀粉水解試驗
a.培養基及試劑在肉湯蛋白胨瓊脂中添加0.2%的可溶性淀粉,分裝三角瓶,121℃滅菌20min備用。路哥氏碘液:碘片1g,碘化鉀2g,先用少量(3~5mL)蒸餾水溶解碘化鉀,現加入碘片,待碘完全溶解后,加水稀釋至300mL。
b.菌種培養及結果觀察取菌種點接于平板上,30℃培養2~4天,形成菌落后,在平板上滴加路哥氏碘液,以鋪滿菌落周圍為度,平板呈藍色,而菌落周圍如有無色透明圈出現,說明淀粉已被水解。透明圈的大小一般說明水解淀粉能力的大小。
明膠水解試驗
a.培養基及試劑蛋白胨5g,明膠120g,蒸餾水1000mL。調節pH7.2~7.4,分裝試管,培養基高度約為4~5cm,121℃滅菌20min。
b.菌種培養及結果觀察用穿刺法接種在試管中央。在30℃溫箱中培養一個月,觀察明膠是否液化。
硝酸鹽還原試驗
a.培養基及試劑蛋白胨10g,KNO31g,蒸餾水1000mL,pH7.0~7.4。格里斯氏(Gries)試劑:A液:對氨基苯磺酸0.5g,稀醋酸(10%左右)150mL;B液:蔡胺0.1g,蒸餾水20mL,稀醋酸(10%左右)150mL。二苯胺試劑:二苯胺0.5g溶于l00mL濃硫酸中,用20mL蒸餾水稀釋。
b.菌種培養及結果觀察將試驗菌接種于硝酸鹽液體培養基中,30℃培養1、3、5天。在白色瓷盤小孔中倒入少許培養液,然后在其中分別滴1滴試劑A和B液,當培養液變為粉紅色、玫瑰紅色、橙色或棕色等時,表示有亞硝酸鹽存在,為硝酸鹽還原陽性,否則為陰性。
檸檬酸鹽的利用
a.培養基及試劑檸檬酸鈉2g,NaCl5g,MgSO4.7H2O0.2g,(NH4)2.HPO41g,1%澳百里香酚藍水溶液10mL,瓊脂20g,蒸餾水1000mL,pH6.8‐7.0,121℃滅菌20min。
b.菌種培養及結果觀察取幼齡菌種接種于斜面上,30℃培養3‐7天,培養基呈堿性(藍色)者為陽性反應,不變者則為陰性。
表1蠟狀芽孢桿菌ZZ13(CGMCC No.7322)生理生化特征

+:陽性反應positivereaction;‐:陰性反應negativereaction
實施例3
為了進一步驗證實施例1得到的蠟狀芽孢桿菌ZZ13(CGMCC No.7322)產吲哚乙酸的能力和最適條件,下面針對不同pH、裝液量、不同碳源、不同氮源探索對吲哚乙酸產量的影響。
將含有L‐色氨酸(200mg/L)LB液體培養基按15ml,30ml,45ml,60ml,75ml,90ml裝于150mL的三角瓶中,按1%(v/v)接種量接種處于對數生長期的ZZ13后,置于30℃,180r.min‐1搖床培養24h,按定量測定的方法測定產IAA的量。結果如圖2所示,由于菌株ZZ13是好氧代謝,通氣量影響菌株產IAA的效率,15mL裝液量時,菌株產IAA量最多,之后隨著裝液量增大,產量越少。
將含有L‐色氨酸(200mg/L)的LB培養基分別調節到不同的pH(4、5、6、7、8、9、10),取30mL裝于150mL的三角瓶中,按1%(v/v)接種量接種處于對數生長期的ZZ13后,置于30℃,180r.min‐1搖床培養24h,按定量測定的方法測定產IAA的量,結果如圖3所示,表明pH為4和5時不產IAA,在強酸環境中,菌體無法進行生長代謝,在pH為6~9時有較強產IAA能力,在pH為10時也能穩定IAA,有較強的耐堿能力。該菌種高產IAA的最適pH為6~10。
在含有L‐色氨酸(200mg/L)無機鹽培養基中分別加入1%(w/v)的碳源,碳源有葡萄糖、木糖、蔗糖、果糖、甘露醇、乳糖、麥芽糖等,取30ml裝于150ml的三角瓶中,按1%(v/v)接種量接種處于對數生長期的ZZ13后,置于30℃,180r.min‐1搖床培養24h,按定量測定的方法測定產IAA的量。結果如圖4所示,該菌株在供給甘露醇時,產IAA的能力最強,其次是蔗糖,麥芽糖的利用率最低,幾乎不產IAA。
在含有L‐色氨酸(200mg/L)無機鹽培養基(不包括硫酸銨)中分別加入0.1%(w/v)的氮源,氮源包括硝酸銨、硫酸銨、硝酸鉀、蛋白胨、酵母粉、谷氨酸等,取30ml裝于150ml的三角瓶中按1%(v/v)接種量接種處于對數生長期的ZZ13后,置于30℃,180r.min‐1搖床培養24h,按定量測定的方法測定產IAA的量。結果如圖5所示,說明取酵母粉為氮源時,產IAA的量最多。
將含有L‐色氨酸(200mg/L)LB液體培養基(不含NaCl)分別調節到不同的含鹽度(1%、2%、3%、4%、5%、7%、9%),取30mL裝于150mL的三角瓶中,按1%(v/v)接種量接種處于對數生長期的ZZ13后,置于30℃,180r.min‐1搖床培養24h,按定量測定的方法測定產IAA的量,結果如圖6所示,表明ZZ13生長狀況都隨著含鹽度的增加而變差,至含鹽度為9%時幾乎不能生長,其產IAA含量的區間為1%~4%,產量變化不大。該菌株有較強的耐鹽能力。
為了進一步驗證得到的蠟狀芽孢桿菌ZZ13對強堿條件的適應,在更強的堿性條件下培養菌株,通過其生長狀況和產IAA能力來探索該菌的耐強堿能力。將含有L‐色氨酸(200mg/L)LB液體培養基分別調節到不同的pH(10、10.5、11、11.5、12),取30mL裝于150mL的三角瓶中,按1%(v/v)接種量接種處于對數生長期的ZZ13后,置于30℃,180r.min‐1搖床培養24h,按定量測定的方法測定產IAA的量,得到表2。如表2所示,ZZ13在pH為10.5時生長良好并能穩定產IAA,至pH為11時幾乎不能生長也不能產IAA,之后更不能生長也不能產IAA。
表2

實施例4
本發明對多環芳烴具有一定的降解效果,下面通過實驗室搖瓶實驗進行說明。
準備以下培養基:
LB培養基:蛋白胨10g,酵母提取物5g,氯化鈉10g,蒸餾水1000ml,pH7.0‐7.2,121℃滅菌,20min。
無機鹽培養基:硫酸銨2.0g;磷酸二氫鈉0.5g;磷酸氫二鉀0.5g;七水硫酸鎂0.2g;二水氯化鈣0.1g,蒸餾水1000mL,pH7.0,121℃滅菌,20min。
將ZZ13(CGMCC No.7322)菌株接種于LB液體培養基,在30℃、180r/min條件下培養24h獲得種子液,從種子液中接種1%制成發酵液,發酵液在相同條件下培養24h后收集菌液在10000r/min、10min、30℃條件下離心,并用pH=7.0、0.05mol/L磷酸緩沖液洗滌三次后轉入以熒蒽為唯一碳源的無機鹽培養基中,熒蒽的初始濃度為50mg/L,在30℃、180r/min的條件中培養7d。再將所得培養液用等體積的乙酸乙酯萃取3次,取上層有機相旋轉蒸發,用甲醇定容后采用HPLC定量測量結果。
通過以上測定,該菌株在實驗室搖瓶條件下,ZZ13(CGMCC No.7322)對熒蒽的降解量為11.67mg/L,相對于空白對照的結果,所述蠟狀芽孢桿菌對熒蒽的降解率為18.89%,有一定的降解效果(圖8)。

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