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维戈塞尔塔vs巴列卡诺: 一種含有生物堿類活性成分的海參提取物及其提取方法和應用.pdf

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一種 含有 生物堿 活性 成分 海參 提取物 及其 提取 方法 應用
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摘要
申請專利號:

CN201310201287.X

申請日:

2013.05.24

公開號:

CN103271934B

公開日:

2014.10.08

當前法律狀態:

授權

有效性:

有權

法律詳情: 授權|||實質審查的生效IPC(主分類):A61K 31/708申請日:20130524|||公開
IPC分類號: A61K31/708; A61P7/06; A61P17/02; A61P37/04; A61P1/02; A61P1/00; A61P11/00; A61P27/02; A23L1/30; C07H19/167; C07H19/067; C07H19/073; C07H1/08; A61K31/7076(2006.01)N; A61K31/7072(2006.01)N 主分類號: A61K31/708
申請人: 劉平
發明人: 劉平; 葛迎春
地址: 116013 遼寧省大連市中山區解放路321號
優先權:
專利代理機構: 大連東方專利代理有限責任公司 21212 代理人: 賈漢生;李馨
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法律狀態
申請(專利)號:

CN201310201287.X

授權公告號:

103271934B||||||

法律狀態公告日:

2014.10.08|||2013.10.09|||2013.09.04

法律狀態類型:

授權|||實質審查的生效|||公開

摘要

本發明公開了一種含有生物堿類活性成分的海參提取物及其提取方法和應用。該海參提取物由如下方法提取得到:取海參粉加56℃蒸餾水攪拌;浸出液經離心,棄沉渣;上清液過濾膜過濾,濾液經超濾膜超濾;超濾外液經納濾膜濃縮,得納濾濃縮內液;濃縮液經旋轉蒸發再濃縮;將其過大孔樹脂柱;蒸餾水洗脫,棄洗脫峰;再經30%乙醇洗脫,取洗脫峰;蒸發濃縮后,過DA25陰離子柱層析,取活性成分峰,冷凍干燥;得含有H2a、H2b、H2c、H2d、H2e五個生物堿類活性成分的凍干粉。實驗證明本發明的海參提取物及所含的生物堿類化合物有治療貧血、免疫功能低下、創傷及疲勞的恢復、放化療后的免疫修復等潛在用途。

權利要求書

權利要求書
1.   一種含有生物堿類活性成分的海參提取物,其特征在于,含有以下結構的化合物;
其中“*”所處的N?H、C?OH或N?C健為未定義的立體鍵。

2.   如權利要求1所述的含有生物堿類活性成分的海參提取物的提取方法,包括如下步驟:
(1)取海參粉,按1.25?5%(g/v)加蒸餾水,56℃攪拌4小時,置冰箱冷藏過夜,浸出液經6000rpm離心40分鐘,棄沉渣;
(2)浸出液上清過0.8~1.2μ濾膜過濾,濾液過3KD~10KD超濾膜超濾,超濾外液再過納濾膜納濾濃縮,得納濾濃縮內液;
(3)納濾濃縮液經56℃旋轉蒸發濃縮,得濃縮液;
(4)將步驟(3)的濃縮液過D101大孔樹脂柱層析,洗脫液為蒸餾水,棄洗脫峰,換30%乙醇洗脫,收集洗脫峰;56℃經旋轉蒸發濃縮,濃縮液經DEAE?葡聚糖凝膠A25陰離子柱層析,洗脫液為蒸餾水,收集洗脫峰;56℃經旋轉蒸發濃縮,冷凍干燥,得含有H2a、H2b、H2c、H2d和H2e的海參提取物凍干粉。

3.   根據權利要求2所述的海參提取物的提取方法,其特征在于,在所述步驟(2)中,浸出液上清過0.8μ濾膜過濾,濾液過10KD超濾膜超濾,超濾外液再過納濾膜納濾濃縮。

4.   權利要求1所述的海參提取物的應用,其特征在于,所述海參提取物在制備治療貧血、皮膚和粘膜的創傷及疲勞的恢復、免疫功能低下、放化療后的免疫修復藥物中的應用。

5.   根據權利要求5所述的應用,其特征在于,所述海參提取物有如下醫藥劑型:
(1)注射劑,0.075mg/只,敷料為注射用水,用于肌肉或靜脈注射;
(2)片劑,0.075mg/片,敷料為藥用淀粉,用于內服;
(3)膠囊劑,0.075mg/粒,用藥用膠囊裝入,用于內服;
(4)栓劑,0.050mg/枚,輔料為水溶性基質,用于肛門及陰道;
(5)氣霧劑,0.010mg/mL,輔料為拋射劑,用于呼吸道;
(6)滴眼劑,0.010mg/mL,輔料為緩沖液,用于眼部疾患的水劑和軟膏;
(7)微球,0.075mg/粒,輔料為包衣材料,用于消化道疾患;
(8)貼劑,0.020mg/片,輔料為沾合劑,用于口腔粘膜疾患。

說明書

說明書一種含有生物堿類活性成分的海參提取物及其提取方法和應用
技術領域
本發明涉及含有來源于動物體生物堿類活性成分的提取物,尤其涉及含有與肌苷、腺苷、鳥苷、尿苷和脫氧胸苷為立體異構體的生物活性物質的海參提取物及其提取方法和應用。同時,也涉及來源于動物體的有效成分為主的醫藥配制品。
背景技術
海參綱(Holothuroidea或Holothurioidea)是棘皮動物門(Echinodermata)中經濟意義最大的一綱。其中楯手目分3個科(辛那參科Synallatidae、海參科Holothuriidae、刺參科Stichopodidae),刺參科又分3個屬(仿刺參屬Apostichopus、刺參屬Stichopus、梅花參屬Thelenota)。仿刺參屬(刺參)Apostichopus japonicus在遼寧大連、旅順、海洋島及山東沿海地區有廣泛分布。我國自古以來將其作為佐膳珍品。中醫認為:“其性溫補,足敵人參,故曰海參”。海參味甘性溫,有補腎經。益精髓、消痰涎、壯陽療萎之功,是滋補、健身、治病、防老之佳品。現代藥理研究表明海參有抗凝血、抗血栓、降血脂、降低血粘度、抗腫瘤、免疫調節、抗菌及促細胞生長等多種藥理活性。
從海參的化學和活性的研究來看,有效成分研究多集中在粘多糖和蛋白多糖、海參皂甙(海參素)及海參多肽。其中海參粘多糖有抗凝、降血脂等作用[1,2]。海參皂甙有造血、抑瘤、抗真菌等活性[3,4,5]。海參多肽則有抗氧化等[6]。偶有研究報道了海參次生代謝物質的成分,提到了分離到尿嘧啶、胸腺嘧啶、胸腺嘧啶脫氧核苷、腺嘌呤核苷等物質,但并沒有與標準品在結構及活性方面比較研究的相關報道[7]。在諸多海參的化學成分中哪些成分可以作為海參的主要有效成分,這一問題目前仍在探討中。
海參產地和品種眾多,如何對海參質量進行評價?另外,以海參為原料的藥品及食品的質量如何評價?顯然,質量的評價應該以海參的活性成分的化學性質相關,以確保海參的質量和以海參為原料的藥品及食品的質量及安全。同時,海參制劑的制備方法各不相同。如果不清楚海參的主要有效成分,不知道這些有效成分的化學性質,在提取過程中將帶有極大的盲目性,有可能造成有效成分的損失及資源的浪費。目前,由于海參的主要活性成分及藥理活性仍在探討中,海參質量尚沒有相關的評價標準。在本發明中,從海參活性部分的總提取物中,分離到5種單體化合物H2a、H2b、H2c、H2d、H2e。經二維核磁共振譜分析,它們分別是肌苷、腺苷、鳥苷、尿苷和脫氧胸苷的立體異構體。經與標準品比較,提取物有廣泛的藥理活性,而標準品則無活性。這些提取物的化學性質及特征,可能成為海參質量的評價標準之一。
目前,在食品或醫藥制劑領域,已有很多海參產品,但在產品的制備中,海參有效成分的提取工藝及相關制劑多圍繞已有的研究成果和一些概念去研發。其中,海參的制劑以海參的全成分膠囊為主的較多[8,9]。海參多肽是以酶解的方法使蛋白水解成小肽,近年有關制劑的膠囊產品較多[10,11]。但未見有關活性海參多肽的單體分離,及氨基酸序列分析的報道。海參多糖是研究最多的活性成分之一,海參的多糖提取物作為制劑的專利也最多[12,13,14,15,16]。其他還有用海參皂甙提取工藝作為制劑的原料[17,18]。因尚不清楚海參的主要活性成分以及有效成分藥理作用的有效劑量范圍。因此,目前海參制劑的各種提取工藝及其制劑均存在問題,有可能造成浪費的資源,而且各種制劑的有效劑量也無法定量。這些問題給海參在藥品及食品的應用中帶來一定的盲目性。本發明在海參活性成分清楚的前提下,對其在提取物中的含量進行了定量,對有效劑量范圍進行實驗驗證。
參考文獻
[1]蔣鑫,徐靜,蘇秀榕,等.海參多糖對急性不完全性腦缺血的?;ぜ翱鼓饔玫難芯?中國應用生理學雜志,2012,28(2):170?173.
[2]武曉琳,王玉明,常耀光,等.不同性質海洋硫酸多糖的制備及其改善大鼠脂肪肝作用的比較研究.中國海洋藥物雜志2011;30(1):25?28.
[3]李冰,王靜鳳,安淼,等.革皮氏海參皂苷對環磷酰胺所致骨髓損傷模型小鼠造血作用的研究.營養學報2011;33(2):173?175.
[4]樊廷俊,袁文鵬,叢日山,等.仿刺參水溶性海參皂苷的分離純化及其抑瘤活性研究.藥學學報2009,44(1):25?31.
[5]叢日山,袁文鵬,樊廷俊,等.仿刺參水溶性海參皂苷的分離制備及抗真菌活性的研究.中國海洋大學學報2006;36(6):959?964.
[6]趙玲,殷邦忠,劉淇,等.4種海參多肽抗氧化活性的比較研究.中國海洋藥物雜志2012;31(2):19~21.
[7]傅天保,林建云.二色桌片參次生代謝產物的分離與結構測定.臺灣海峽2004;23(1):33?37.
[8]焦健,邵俊杰.一種復方海參膠囊及其制備方法.申請號:CN201110281916.5.
[9]郝家武,沈其東.一種海參口服液及其加工方法申請號:CN200910012805.7.
[10]劉亞楠.一種海參肽微丸及其制備方法.申請號:CN200810182803.8.
[11]紀建國,李國忠,黃世寬.一種海參活性多肽鈣、鋅蛋白的生產方法.申請號:CN200610069408.X.
[12]方華.海參多糖制劑.申請號:CN03112345.7.
[13]姜玉寶.利用海參煮汁提取海參多糖等多種活性成分的方法.申請號:CN200610146202.2.
[14]張登科.一種解聚海參糖胺聚糖組合物及其制備方法和用途.申請號:CN200710017839.6.
[15]方華,楊靜,李文超,王金玲.復方海參糖肽口服液申請號:CN200710114414.7.
[16]薛長湖,陳士國,尹利昂.一種海參及海參制品中海參多糖含量的測定方法.申請號:CN200810016622.8.
[17]易楊華,丁健,孫鵬,等.海參中皂苷類化合物echinoside A在制備腫瘤拓撲異構酶Ⅱ抑制劑中的應用.申請號:CN200810040314.9.
[18]巫軍,張佳佳,丁萍月,等.黑乳海參中具有抗腫瘤作用的總皂苷.申請號:CN200810163374.X.
發明內容
本發明提供一種含有生物堿類活性成分的海參提取物及其制備方法和其在醫藥制劑領域中的應用。本發明的海參提取物中含有與肌苷、腺苷、鳥苷、尿苷和脫氧胸苷為立體異構體的生物堿類活性物質,該生物堿類活性物質為首次由海參中分離出的化合物,具有抗疲勞,提高機體免疫機能等生物活性,在醫藥及保健品領域具有潛在的應用前景。
本發明的一種含有生物堿類活性成分的海參提取物,含有生物堿類化合物H2a、H2b、H2c、H2d和H2e;
所述海參提取物,按如下步驟提取得到:
(1)取海參粉,按1.25?5%(g/v)加蒸餾水,56℃攪拌4小時,置冰箱冷藏過夜,浸出液經6000rpm離心40分鐘,棄沉渣;
(2)浸出液上清過0.8?1.2μ的濾膜過濾,濾液過3KD?10KD超濾膜超濾,超濾外液再過納濾膜納濾濃縮,得納濾濃縮內液;
(3)納濾濃縮液經56℃旋轉蒸發濃縮,得濃縮液;
(4)將步驟(3)的濃縮液過D101大孔樹脂柱層析,洗脫液為蒸餾水,棄洗脫峰,換30%乙醇洗脫,收集洗脫峰,56℃經旋轉蒸發濃縮,濃縮液經DEAE?葡聚糖凝膠A25陰離子柱層析,洗脫液為蒸餾水,收集洗脫峰,56℃經旋轉蒸發濃縮,冷凍干燥,得含有H2a、H2b、H2c、H2d和H2e的海參提取物凍干粉。
本發明所述海參提取物凍干粉,再經液相制備色譜分離,分別得到H2a、H2b、H2c、H2d和H2e五個化合物。
在本發明優選技術方案中,所述的H2a、H2b、H2c、H2d和H2e分別占海參提取物總重量的2.5%、11.3%、3.8%、6.6%和1.3%。
在本發明的優選技術方案中,在步驟(2)中,浸出液上清過0.8μ濾膜過濾,濾液過10KD超濾膜超濾,超濾外液再過納濾膜納濾濃縮。
單體化合物H2a、H2b、H2c、H2d和H2e分別為已知化合物肌苷(Inosine)、腺苷(Adenosine)、鳥苷(Guanosine)、尿苷(Uridine)和脫氧胸苷(Thymidine)的立體異構體。經對單體化合物H2a、H2b、H2c、H2d、H2e的波譜分析,其化學結構式分別為:
①H2a分子式為C10H12N4O5;分子量=268.22;白色粉末,結構式為:

其中,“﹡”所處的N?H鍵為未定義立體鍵。
②H2b分子式為C10H13N5O4;分子量=267.24;白色粉末,結構式為:

其中“﹡”所處的C?OH鍵為未定義立體鍵。
③H2c分子式為C10H13N5O5;分子量=283,24;白色粉末,結構式為:

其中“﹡”所處的C?OH鍵為未定義立體鍵。
④H2d分子式為C9H12N2O6;分子量=244.20;白色粉末,結構式為:

其中“﹡”所處的N?H鍵和N?C鍵為未定義立體鍵。
⑤H2e分子式為C10H14N2O5;分子量=242.23;白色粉末,結構式為:

其中“﹡”所處的N?H鍵和C?OH鍵為未定義立體鍵。
H2a、H2b、H2c、H2d和H2e樣品與其標準品肌苷、腺苷、鳥苷、尿苷和脫氧胸苷波譜比較,其化合物結構在二維核磁共振譜上有差別,主要表現在結構上N?H、C?H鍵角有變化,從而造成結構上的差別。
H2a、H2b、H2c、H2d和H2e與其相應的化合物肌苷、腺苷、鳥苷、尿苷和脫氧胸苷的生物活性存在著顯著的差別。H2a、H2b、H2c、H2d和H2e可以表達海參藥理活性,其有效劑量范圍與相應的細胞刺激因子和生長因子相同。H2a、H2b、H2c、H2d和H2e對由5?氟尿嘧啶(5?FU)處理的小鼠骨髓間充質干細胞的增殖均有刺激作用,與巨噬細胞?粒細胞集落刺激因子(GM?CSF)相似,而肌苷、腺苷、鳥苷、尿苷和脫氧胸苷沒有活性。H2a、H2b、H2c、H2d和H2e可以刺激低氧/再給氧損傷的心肌細胞代謝活性,但肌苷、腺苷、鳥苷、尿苷和脫氧胸苷無活性。H2a、H2b、H2c、H2d可以活化小鼠腹腔巨噬細胞增殖,提高巨噬細胞的吞噬功能。H2a、H2b、H2c、H2d可以刺激小鼠脾細胞的增殖。H2a、H2b、H2d可以促進Mo7e(一種細胞因子依賴性細胞株)細胞的增殖。H2a、H2b、H2d樣品組對角膜緣干細胞增殖均有刺激作用,與成纖維細胞生長因子(FGF)作用相似??芍?,H2a、H2b、H2c、H2d和H2e對皮膚、粘膜的創傷及潰瘍、貧血及免疫功能低下、放化療后的免疫修復及疲勞的恢復等均有潛在用途。
本發明還提供用本發明的提取方法得到的含有生物堿類活性成分的海參提取物在制備治療貧血、創傷及疲勞的恢復、免疫功能低下和放、化療后的免疫修復的藥物中的應用。
所述海參提取物,可作為保健或功能食品及飲料的添加劑,可與相應藥用載體結合制備成各種劑型,包括如下醫藥劑型:
(1)注射劑,0.075mg/只,敷料為注射用水,用于肌肉或靜脈注射;
(2)片劑,0.075mg/片,敷料為藥用淀粉,用于內服;
(3)膠囊劑,0.075mg/粒,用藥用膠囊裝入,用于內服;
(4)栓劑,0.050mg/枚,輔料為水溶性基質,用于肛門及陰道;
(5)氣霧劑,0.010mg/mL,輔料為拋射劑,用于呼吸道;
(6)滴眼劑,0.010mg/mL,輔料為緩沖液,用于眼部疾患的水劑和軟膏;
(7)微球,0.075mg/粒,輔料為包衣材料,用于消化道疾患;
(8)貼劑,0.020mg/片,輔料為沾合劑,用于口腔粘膜疾患。
本發明的突出特點是:(1)發現了在海參中前人從未發現的、與已知化合物肌苷、腺苷、鳥苷、尿苷和脫氧胸苷為立體異構體的化合物H2a、H2b、H2c、H2d和H2e,并有效的提取和分離出來。(2)檢定了H2a、H2b、H2c、H2d和H2e與相對應的肌苷、腺苷、鳥苷、尿苷和脫氧胸苷在結構上的差異。(3)驗證了由于這種結構上的差異,導致其之間生物活性的顯著差異,以及有效劑量范圍。使得H2a、H2b、H2c、H2d和H2e在醫藥學上有著極為可觀的潛在用途。(4)在提取工藝上:(Ⅰ)采用膜分離技術提取和濃縮提取物,以保證化合物不受劇烈外界條件影響。(Ⅱ)使用純水作溶劑,不存在其他離子摻入的問題。(Ⅲ)使用離子交換層析技術脫色素,并純化活性成分,得到總提取物;本工藝可以最大限度的保留活性成分,減少有機溶劑的使用和殘留。
具體實施方式
實施例1含有生物堿類活性成分的海參提取物的制備
取海參粉30克加蒸餾水2400毫升,56℃攪拌4小時,置冰箱冷藏過夜。浸出液經6000rpm離心40分鐘,棄沉渣。浸出液上清過0.8μ濾膜過濾。濾液過10KD超濾膜超濾,得超濾外液。超濾外液過納濾膜納濾,得納濾濃縮內液。濃縮內液經56℃旋轉蒸發濃縮,得納濾濃縮液。納濾濃縮液過D101大孔樹脂柱,洗脫液為蒸餾水,棄洗脫峰,換30%乙醇繼續洗脫,收集洗脫峰,洗脫峰溶液經旋轉蒸發濃縮后,過DEAE?葡聚糖凝膠A25(DA25)陰離子柱,洗脫液為蒸餾水,收集洗脫峰Ⅱ、Ⅲ,經56℃旋轉蒸發濃縮,冷凍干燥,得含有生物堿類活性成分的海參提取物凍干粉(簡稱為海參提取物,HS)30mg。
HS用高效液相色譜儀分離(C18柱,流動相為甲醇:水:甲酸=7:93:0.1)得到含有生物堿類活性成分的各組分,各組分經旋轉蒸發濃縮,冷凍干燥后得到單體化合物H2a(0.76mg)、H2b(3.4mg)、H2c(1.14mg)、H2d(1.98mg)和H2e(0.39mg),共計7.67mg,占海參提取物(HS)重量的25%。
實施例2海參提取物及各單體化合物對5?氟尿嘧啶處理的模型小鼠骨髓間充質干細胞(MSCs)增殖的影響
實驗方法:取10只小鼠,尾靜脈注射5?氟尿嘧啶(5?FU)150mg/kg體重,48小時后取股骨骨髓細胞,培養得到小鼠骨髓間充質干細胞(MSCs),培養方法參考文獻。
細胞接種在96孔培養板中,細胞接種密度為1.0×104個細胞/孔100μl,細胞接種24小時后換成無血清培養液。對照組加等體積培養液,陽性藥物加入巨噬細胞?粒細胞集落刺激因子(GM?CSF),加藥組分別加入樣品海參提取物(HS)、H2a、H2b、H2c、H2d和H2e及相應的化合物標準品肌苷(Inosine)、腺苷(Adenosine)、鳥苷(Guanosine)、尿苷(Uridine)和脫氧胸苷(Thymidine),所有樣品的終濃度均為100、10、1.0ng/ml三個劑量組。5%CO2、37℃孵育24小時。在細胞培養結束前4h,每孔加入20μL MTT繼續培養,4h后棄培養液,加入100μL100%二甲基亞砜。經微量振蕩器振蕩后,用自動酶標光度計測定570nm處各孔的A值,結果見表1和表2。
表1.海參提取物及各單體對5?FU處理的小鼠MSCs增殖的影響


對照組0.188±0.006,與對照組比較*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001,其余P>0.05。
表1結果表明,與對照組相比較,樣品HS、H2a、H2b、H2c、H2d和H2e均有刺激模型小鼠MSCs細胞增殖的作用,在劑量范圍100.0?1.0ng/ml之間均有效,其作用與GM?CSF的作用相似。
表2.海參提取物中單體與相應標準品比較對5?FU處理的小鼠MSCs增殖的影響

對照組0.160±0.004,與對照組比較*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001,其余P>0.05。
表2結果表明,與對照組相比較,樣品H2a、H2b、H2c、H2d和H2e均有刺激模型小鼠MSCs細胞增殖的作用,在劑量范圍100.0?1.0ng/ml之間均有效;而其相對應的標準品對小鼠MSCs細胞的增殖無刺激作用。
實施例3海參提取物及各單體化合物對乳鼠心肌細胞缺氧/復氧損傷的?;ぷ饔?
實驗方法:乳鼠心肌細胞培養:無菌操作取出生3d的乳鼠心臟,去除心包膜,取心尖部心肌組織剪成1mm3小塊,用D?Hank’s液沖洗2遍,加入0.125%胰蛋白酶,37℃消化20min。將組織塊吹打制備成細胞懸液,離心10min棄上清。加入D?Hank’s液,離心10min棄上清洗滌兩遍。細胞懸液加入含15%胎牛血清的DMEM培養液,置25ml培養瓶。37℃培養60分鐘。取培養液中細胞,棄貼壁細胞。經差速貼壁純化后的心肌細胞再次制備成細胞懸液,接種至96孔培養板,置5%CO2培養箱37℃培養。
缺氧/復氧模型建立:原代培養的心肌細胞經胰酶消化,加入低糖培養液制成細胞懸液,接種在96孔培養板中,細胞數密度為3×105個細胞/孔,同時加入不同濃度的受試樣品。對照組加入等體積培養液,實驗組分別加入樣品海參提取物(HS)、H2a、H2b、H2d、H2e及其相應的化合物標準品肌苷(Inosine)、腺苷(Adenosine)、尿苷(Uridine)和脫氧胸苷(Thymidine)。所有樣品的終濃度均為100、10、1ng/ml三個劑量組。低氧條件為5%CO2、3%O2、92%N2,37℃培養,飽和濕度下,細胞與受試樣品共同孵育2h后,恢復常氧條件及5%CO2,37℃繼續孵育2h。終止培養,加入含5%MTT的培養液100μl,繼續孵育4h,棄培養液后,加入100μL 100%二甲基砜,經微量震蕩器震蕩后,用自動酶標光度計測定570nm處各孔的A570值,以A570值表示線粒體脫氫酶活性。結果見表3和表4。
表3.海參提取物及各單體對乳鼠心肌細胞缺氧/復氧損傷后線粒體脫氫酶活性的影響

對照組0.156±0.005,與對照組比較*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001,其余P>0.05。
表4.海參提取物中各單體與相應標準品比較對乳鼠心肌細胞缺氧/復氧損傷后線粒體脫氫酶活性的影響


對照組0.149±0.006,與對照組比較*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001,其余P>0.05.
表3和表4的結果表明,樣品HS、H2a、H2b、H2c、H2d和H2e,均能提高缺氧/復氧損傷后乳鼠心肌細胞的脫氫酶活性,對缺氧/復氧損傷后的乳鼠心肌細胞均有一定的?;ぷ饔?,在劑量范圍100.0?1.0ng/ml之間均有效,而其相對應的標準品則無影響。
實施例4海參提取物及各單體化合物對小鼠腹腔巨噬細胞(MΦ)增殖及吞噬功能的影響
實驗方法:巨噬細胞增殖活性實驗:昆明種小鼠(18~22g),抽取腹腔巨噬細胞。將細胞調整至2×106/ml,接種于96孔培養板中,100μL/孔。在5%CO2、37℃培養箱中培養。細胞培養液為Eagle MEM。培養24小時后,棄上清液,加入100μL/孔的無血清培養液。按實驗分組加入各組樣品,其中,加藥組分別加入樣品海參提取物(HS)、H2a、H2b、H2d,陽性藥物組加入巨噬細胞?粒細胞集落刺激因子(GM?CSF),每個樣品的終濃度均設100.0、10.0、1.0μg/mL三個劑量組,每個劑量設3個平行孔,對照組加入等體積的培養液。所述加藥組,和對照組均含有終濃度為10μg/mL細菌粘多糖(LPS)。分組加藥的巨噬細胞,在飽和濕度條件下,37℃、5%CO2孵育24h。在細胞培養結束前4h,每孔加入20μL MTT繼續培養,4h后中止反應,棄培養液,加入100μL 100%二甲基亞砜。經微量振蕩器振蕩后,用自動酶標光度計測定570nm處各孔的A570值,結果見表5。
巨噬細胞吞噬中性紅試驗:按上述方法分組加藥的巨噬細胞經37℃孵育24h后,每孔加入中性紅生理鹽水液,終濃度為1g/L,繼續培養20min。細胞經PBS洗滌3遍,每孔加入細胞溶解液(乙酸﹕無水乙醇=50﹕50)100μL,室溫放置2h。待細胞溶解后,用自動酶標光度計測各孔吸光度A540值,測量波長540nm,以A540值表示巨噬細胞吞噬功能的強弱,結果見表6和表7。
表5.海參提取物中各組分對小鼠腹腔巨噬細胞(MΦ)增殖的影響

對照組0.062±0.009。與對照組比較*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001,其余P>0.05。
表5結果表明,樣品H2a、H2b和H2d對小鼠巨噬細胞增殖均有刺激作用,其作用與GM?CSF相似,在劑量范圍100.0?1.0ng/ml之間均有效。
表6.海參提取物及各單體對小鼠巨噬細胞吞噬功能的影響

對照組0.084±0.005,與對照組比較*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001,其余P>0.05。
表6結果表明,樣品HS、GM?CSF和各單體化合物均提高小鼠巨噬細胞吞噬功能,劑量范圍100.0?1.0ng/ml之間均有顯著刺激作用。
表7.海參提取物及各單體的標準品對小鼠巨噬細胞吞噬功能的影響


對照組0.090±0.007,與對照組比較*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001,其余P>0.05.
表7結果表明,樣品HS、GM?CSF均提高小鼠巨噬細胞吞噬功能,但各單體化合物相應的標準品則無刺激活性。
實施例5海參提取物及各單體化合物對小鼠脾細胞增殖的影響
實驗方法:脾細胞懸液制備:昆明種小白鼠10只,無菌取脾,放置在無血清的PRMI-1640培養液中,去除包膜和結締組織,置青瓶中,將脾剪成1mm3小塊,用注射器芯研磨至單個細胞,過200目尼龍網,1000rpm,離心10min,雙蒸水每支試管加5mL,輕輕吹打,放置20秒,加2倍濃縮的生理鹽水混均,1000rpm,離心10min,Hank’s液沖洗重復兩次,再過一次200目尼龍網,制成脾細胞懸液,密度為1×108/mL備實驗用。
按實驗分組加入各組樣品,其中加藥組分別加入樣品海參提取物(HS)、H2a、H2b、H2d,陽性藥物組加入集落刺激因子(GM?CSF),對照組加入等體積培養液,每個樣品設終濃度為100.0、10.0、1.0μg/mL的三個劑量組,每個劑量設3個平行孔。5%CO2、37℃孵育24小時。在細胞培養結束前4h,每孔加入20μL MTT繼續培養。培養4h后棄培養液,加入100μL100%二甲基亞砜,經微量振蕩器振蕩后,用自動酶標光度計測定570nm處各孔的A570值,結果見表8。
表8.海參提取物及各單體對小鼠脾細胞增殖的影響

對照組0.098±0.007。與對照組比較*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001,其余P>0.05。
表8結果表明,與對照組相比較,樣品HS、H2a、H2b和H2d在100.0?1.0ng/mL范圍內對脾細胞增殖均有刺激作用,其作用與GM?CSF相似。
實施例6海參提取物及各單體化合物對Mo7e細胞增殖的影響
實驗方法:取生長狀態良好的Mo7e細胞株(人巨細胞白血病細胞株),制成細胞懸液,以1.0×104/孔100μl接種在96孔培養板中,按實驗分組加入各組樣品,加入量為20μL,其中加藥組分別加入樣品海參提取物(HS)、H2a、H2b和H2d,陽性對照組加入GM?CSF,對照組加入等體積培養液。每個樣品分別設終濃度為100.0、10.0、1.0μg/mL的三個劑量組,每個劑量設三個復孔。加藥處理后的細胞在含5%CO2,37℃飽和濕度下孵育24小時后,加入XTT/PMS(終濃度為0.2mg/mL XTT和25μmoL/LPMS)溶液25μL,繼續培養6小時后,酶標儀測定各孔光密度值(OD)。λ測量=450nm,λ參考=620nm。數據經“t”顯著性檢驗,結果見表9。
表9.海參提取物及各單體對Mo7e細胞增殖的影響

對照組0.028±0.006。與對照組比較*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001,其余P>0.05。
表9結果表明,與對照組相比較,樣品HS、H2a、H2b和H2d在100.0?1.0ng/mL范圍內均有刺激Mo7e細胞增殖的作用,其作用與GM?CSF的作用相似。
實施例7海參提取物中各單體化合物對角膜緣干細胞增殖的影響
實驗方法:角膜緣干細胞的分離培養:日本大耳白兔,無菌條件下取全眼球,沿角膜緣外1mm處環形剪下角膜,摘除晶狀體、虹膜、除去多余鞏膜組織,完整角膜片放入Hank’s液培養皿中液洗滌兩次,從角膜緣內側1mm處環形剪下角膜緣,除去內皮層和多余固有層,將角膜緣上皮組織盡量剪碎,再用0.25%胰蛋白酶和0.2%EDTA(1:1)消化,37℃消化30min,加入Hank’s液碎打,1000rpm/分鐘,離心5min,沖洗2次,用含15%胎牛血清、100U/mL青霉素、100U/mL鏈霉素的DMEM/F12培養液制備成細胞懸液,接種至培養瓶中,3天換培養液一次,等細胞鋪滿瓶底備實驗用。
細胞接種在96孔培養板中,細胞接種密度為1.0×104個細胞/孔100μL,細胞接種24小時后換成無血清培養液。對照組加等體積培養液,陽性對照組加入成纖維細胞生長因子(FGF),加藥組分別加入樣品H2a、H2b、H2d。每個加入樣品分別設終濃度為100、10、1ng/mL的3個劑量組,每個劑量組4個平行孔。5%CO2、37℃孵育24小時。在細胞培養結束前4h,每孔加入10μL MTT繼續培養,4h后棄培養液,加入100μL 100%二甲基亞砜。經微量振蕩器振蕩后,用自動酶標光度計測定570nm處各孔的A570值。結果見表10。
表10.海參提取物中各單體對角膜緣干細胞增殖的影響

對照組0.044±0.002。各組與對照組比較*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001其余P>0.05。
表10的結果表明,H2a、H2b、H2d樣品組劑量在10.0?1.0ng/mL范圍內對角膜緣干細胞增殖均有刺激作用,其作用與FGF作用相似。
實施例8含有海參提取物的制劑
以下含有海參提取物(HS)(含H2a、H2b、H2c、H2d和H2e成分)的制劑,可作為保健或功能食品及飲料的添加劑,可與相應藥用載體結合制備成各種劑型。應用于皮膚、粘膜的炎癥潰瘍,貧血及白細胞降低,免疫功能下降,運動后的體力恢復,放化療后的免疫修復。見表11。
表11.海參提取物藥物劑型品種、使用途徑
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