• / 9
  • 下載費用:30 金幣  

维戈塞尔塔vs皇家马德里: 力墀秀肽及其在制備治療腫瘤藥物中的應用、制備方法.pdf

關 鍵 詞:
力墀秀肽 及其 制備 治療 腫瘤 藥物 中的 應用 方法
  專利查詢網所有資源均是用戶自行上傳分享,僅供網友學習交流,未經上傳用戶書面授權,請勿作他用。
摘要
申請專利號:

CN201210148541.X

申請日:

2012.05.15

公開號:

CN103421102B

公開日:

2015.01.07

當前法律狀態:

授權

有效性:

有權

法律詳情: 授權|||實質審查的生效IPC(主分類):C07K 14/415申請日:20120515|||公開
IPC分類號: C07K14/415; C12N15/29; C12N15/63; C12N15/81; A61K38/16; A61P35/00 主分類號: C07K14/415
申請人: 鄧立
發明人: 鄧立; 劉勇; 袁勝濤; 鄧韻蕾; 丁冠文; 孫立; 段作營; 陶冠軍; 張爽
地址: 214000 江蘇省無錫市瑞星家園142號1103室
優先權:
專利代理機構: 代理人:
PDF完整版下載: PDF下載
法律狀態
申請(專利)號:

CN201210148541.X

授權公告號:

103421102B||||||

法律狀態公告日:

2015.01.07|||2013.12.25|||2013.12.04

法律狀態類型:

授權|||實質審查的生效|||公開

摘要

本發明力墀秀肽及其在治療制備腫瘤藥物中的應用、制備方法涉及生物制藥技術領域。本發明的力墀秀肽具有Seq?ID?No.1所示的氨基酸序列,經小鼠肉瘤S180動物試驗驗證,其具有對小鼠肉瘤的明顯抑制作用;本發明還提供了基因工程方法制備該多肽的方案,能制備得到克級以上的多肽產物。本發明的肽在抗腫瘤方面的作用,使其能夠作為制備抗癌藥物的主要成分,應用于抗癌藥物中。

權利要求書

權利要求書
1.  力墀秀肽,其特征在于具有Seq ID No.1所示的氨基酸序列。

2.  以力墀秀肽為核心序列多肽的氨基酸序列。

3.  編碼權利要求1所述的力墀秀肽的基因。

4.  根據權利要求3所述的基因,其核苷酸序列如Seq ID No.2所示。

5.  含有權利要求3或4所述的基因的表達載體。

6.  根據權利要求5所述的表達載體,其骨架載體為pKLAC1或pKLAC2。

7.  權利要求1和2所述的肽的制備方法,其特征在于將權利要求5或6所述的表達載體轉入到酵母細胞中進行發酵培養。

8.  權利要求1和2所述的多肽在制備治療腫瘤藥物中的應用。

9.  根據權利要求8所述的應用,所述藥物指液態注射劑。

說明書

說明書力墀秀肽及其在制備治療腫瘤藥物中的應用、制備方法
第一部分:技術領域
本發明涉及生物制藥領域,特別是涉及一種基因工程多肽及其在制備治療腫瘤藥物中的應用和制備方法。
第二部分:背景技術
天然抗菌肽是生物體內經誘導產生的一種具有生物活性的小分子多肽,通常是由20~60個氨基酸殘基組成的堿性小分子多肽,水溶性好,分子量大約為4000道爾頓左右,多數具有2~4個二硫鍵,并含有α螺旋或β折疊結構。這類活性多肽多數具有強堿性、熱穩定性以及廣譜抗菌等特點,少數抗菌肽具有抗病毒或抗腫瘤的作用。多數抗菌肽的等電點大于7,表現出較強的陽離子特征。力墀秀肽是采用基因重組,工程菌表達得到的,具有抗腫瘤作用的一種抗菌肽。
從生物界分離到的抗菌肽可達750多種,它們分布極其廣泛,從病毒、細菌、植物、昆蟲、軟體動物、甲殼動物、兩棲動物、魚類、鳥類及哺乳動物等生物均有發現,不同來源的抗菌肽的作用范圍目前尚未有系統和深入的研究。近10年來,隨著動物及微生物抗菌肽理論與應用研究的逐漸深入,發現某些抗菌肽對部分真菌、原蟲、病毒及癌細胞等均具有強有力的殺傷作用,抗菌對正常哺乳動物細胞及昆蟲細胞無不良影響,但對癌細胞則有明顯殺傷作用。
植物源的抗菌肽在分離純化、抗菌特性、細胞毒性、理化性質以及轉基因等許多方面的研究進展也很快,發現了一大批理化性質和抗菌特性各異的植物抗菌肽。部分植物源的抗菌肽對G+菌、G-菌、真菌、酵母及哺乳動物細胞均有毒殺作用,尤其對植物病原具有良好活性,人們對于植物源的抗菌肽在藥物方面的應用寄予了深厚的期望和好奇,特別是在人類疾病,如癌癥的治療上。比如源自槲寄生的槲寄生毒素(VtB),氨基酸序列如Seq ID No.3所示,包括3個二硫鍵,其含有α螺旋和β折疊結構,具有抗腫瘤的作用。
由于抗菌肽分子小,天然資源有限,分離提純存在一定的困難,足量的天然抗菌肽很難得到;抗菌肽的活性取決于多肽的空間結構,而化學合成的多肽的空間結構存在不確定性,所以不能得到具有活性的產品;基因工程菌是最有希望經濟、足量獲得活性多肽的良好途徑,但是據報道高濃度的抗菌肽可殺滅絕大多數宿主細胞,同時在分泌表達過程中,抗菌肽容易被宿主菌的酶系統所降解,從而產生兩敗俱傷的情形,而無法真正獲得足量的表達產物。目前還沒有該類多肽的產業化生產技術報道,也未見到準確表達和獲得足量的該類多肽以供試驗用的報道,更未見到其在癌癥治療方面的應用報道。
第三部分發明內容
本發明根據上述領域的空白和需求,提供一種源自槲寄生毒素VtB的變構肽及其在制備治療腫瘤藥物中的應用與制備方法。
力墀秀肽,其特征在于具有Seq ID No.1所示的氨基酸序列。
編碼上述力墀秀肽的基因。
所述基因的核苷酸序列如Seq ID No.2所示。
含有上述基因的表達載體。
所述表達載體的骨架載體為pKLAC1。
上述力墀秀肽的制備方法,其特征在于將上述表達載體轉入到酵母感受態細胞中,發酵培養。
所述酵母感受態細胞為K.lactis YCT799。
上述力墀秀肽在制備治療腫瘤的藥物中的應用。
所述藥物為液態注射劑。
本發明根據源自槲寄生毒素VtB,對其氨基酸序列(Seq ID No.3槲寄生毒素VtB)進行變構,在其N端增加一個氨基酸殘基甘氨酸G,第八位氨基酸殘基蘇氨酸T變為亮氨酸L,第十九位和二十位的氨基酸殘基甘氨酸GG變為半胱氨酸CC,得到如Seq ID No.1所示的多肽,命名為力墀秀肽,由47個氨基酸組成,分子量為5000.8Da,等電點8.92,疏水比率34%,凈電荷+5,含有幾丁質結構域與類凝聚素結構域。通過變構,改變了多肽的二硫鍵位置和空間構象,使得分泌表達出的多肽非常穩定,不會在發酵、純化和保存過程中被迅速降解,以保證得到高表達量的產物。通過變構,增加了該多肽在動物體內的半衰期,可取得更有效的活性效果。本發明從氨基酸序列及易制造性和穩定性上改變了槲寄生毒素VtB。試驗證明,本發明采用基因工程發酵培養方法制備的力墀秀肽的產率達到1克/升;體內藥物試驗小鼠肉瘤S180表明,靜注20mg/kg力墀秀肽對小鼠黑色素瘤的抑制率在60%以上,此數據可重復驗證。
本發明根據上述Seq ID No.1所示的氨基酸序列,設計了編碼該氨基酸序列的基因序列,利用密碼子的兼并性,調整了核苷酸序列使其符合酵母表達系統對密碼子的偏好性而得到Seq ID No.2所示的核苷酸序列,有利于穩定高效表達目的多肽。
本發明還提供了含有上述基因的表達載體,所采用的骨架載體為pKLAC1或pKLAC2,pKLAC1的結構見說明書附圖1,通過pKLAC1或pKLAC2,其中的重組蛋白可在細胞內表達,也可分泌表達。有利于獲得高產量和高純度的目的多肽。
本發明還提供了力墀秀肽的制備方法,本發明將構建得到的表達載體轉入到酵母表達系統中,使其表達力墀秀肽,通過后續的分離純化干燥步驟,得到力墀秀肽白色固體結晶。本發明優選采用的酵母感受態細胞為K.lactis YCT799,非營養缺陷體,也沒有遺傳標記,適用于線性化pKLAC或pKLMF為基礎的表達載體的轉化。使用該表達系統,進一步確保分泌表達的力墀秀肽不會被降解。
本發明提供的力墀秀肽可以作為抗腫瘤藥物的主要成分,制備成各種劑型的藥物。本發明優先制備成注射劑。
第四部分附圖說明
圖1.骨架載體pKLAC1結構圖,New England Biolabs,Inc提供。
圖2.力墀秀肽基因克隆測序圖,北京諾賽基因組研究中心測定。
圖3力墀秀肽液相色譜圖,江南大學國家重點實驗室測定。
第五部分具體實施方式
實施例1.力墀秀肽的制備
步驟1.外源DNA合成
利用DNA化學合成儀制備外源基因,得到編碼力墀秀肽的外源DNA片段,如Sequence ID No.2所示。將酶切鑒定正確的克隆送至北京諾賽基因組研究中心進行序列測定,確定得到正確基因。測序結果見圖2.
步驟2.表達載體的構建
表達載體為K.lactis蛋白質表達試劑盒所提供的pKLAC1(購于New England Biolabs,Inc)在pKLAC1(9097bp)上,Lac4啟動子(PLAC4-PBI)的5′和3′端被編碼β-內酰胺酶的基因(ApR)和pMB1的復制原點所隔開。K.lactis α-結合因子分泌引導序列(α-MF)、多克隆位點(MCS)和Lac4轉錄終止子(TT)位于3′PLAC4-PBI的下游;酵母的PADH2調控乙酰胺酶標記基因(amdS)的表達。
用Sac II或Bst XI酶切載體pKLAC1使其線性化,將外源DNA片段Sequence ID No.2插入到酵母K.lactis基因組自身的Lac4啟動子位點,獲得重組載體。該重組載體中,目的基因被克隆到pKLAC1上的K.lactis α結合因子(αMating Factor,α-MF)的下游,在酵母K.lactis的細胞核中,編碼α-MF結構域和外源重組蛋白的DNA與酵母基因組整合,編碼的α-MF最終將在高爾基體上被剪切以使目的蛋白質分泌表達。
PLAC4-PBI啟動子調控表達:一旦融合蛋白質開始表達,位于α-MF上的信號肽就會指導融合蛋白質轉運到內質網(ER)膜上,在此信號肽酶(SP)將信號肽切除。分泌小泡(環形)將融合蛋白質轉運至高爾基體,Kex蛋白酶在此將α-MF結構域切除,釋放成熟的目的蛋白質。隨后,目的蛋白質通過分泌小泡運輸到質膜(PM),從質膜分泌到胞外.
步驟3.轉化
使用K.lactis YCT799(購于New England Biolabs,Inc)感受態細胞。
將步驟2構建得到的重組載體置于感受態細胞溶液中,使重組質粒吸附于感受態細胞的表面,冰浴一段時間,細胞膜處于收縮狀態。然后迅速將感受態細胞置于42℃,使細胞在熱環境中膜通道開放,重組質粒由膜外高濃度區向膜內擴散,經過45秒時間后,再將感受態細胞放回冰浴中,膜通道關閉,重組質粒轉入酵母菌。
酵母轉化子用乙酰胺進行篩選,將細胞轉化混合物(含有大量被pKLAC1轉化或未轉化的細胞)涂于含有5mM乙酰胺的酵母基本碳源(YCB)培養基上。YCB培養基含有K.lactis細胞生長所需的所有營養物質和碳源,但缺少氮源。只有當乙酰胺被乙酰胺酶(由pKLAC1上的amdS基因表達)降解為氨時,才能作為氮源而被利用。因此,只有轉化的細胞才能長成菌落。
驗證:
挑取菌落,用搖瓶培養,培養基為含38mM硫酸銨的YPGal培養基(1%酵母提取物,2%蛋白胨,2%半乳糖),28℃~30℃,培養時間70小時。離心3000rpm,取上清液,瓊脂糖凝膠電泳分析。
步驟4.轉化體的培養
YPGal培養基(3%酵母提取物,5%蛋白胨,12%半乳糖,1%硫酸銨),標準發酵罐深層通氣培養,120℃濕熱蒸汽滅菌30分鐘,冷卻到28℃,接種,培養時間60小時。
步驟5.力墀秀肽的分離純化
發酵液過濾分離掉菌體;離心分離去雜,轉速10000rpm,30min,取上清;Sephadex G-50層析,收集目標分子量洗脫液;C18反向制備色譜,收集目標分子量洗脫液;脫鹽、濃縮,凍干,產物純度為95%。
色譜分析結果見圖3力墀秀肽液相色譜圖
步驟6.配制成備用液
上步凍干的純化物,用稀鹽酸或乙酸溶解,制成10mg/ml的力墀秀肽,保存備用。
實施例2.力墀秀肽抗腫瘤小鼠肉瘤S180動物體內試驗.
動物:ICR小鼠,18-22g,SPF級,雌性,由江蘇揚州大學比較醫學中心提供,合格
證號:SCXK(蘇)2007--0001。
瘤種:小鼠肉瘤S180。
選用18-22g雌性ICR小鼠及生長良好的7-11天的小鼠肉瘤S180瘤種,接種于ICR小鼠右側腋部皮下,約4.5-5×106細胞/只,接種24小時后隨機分籠,力墀秀肽每天靜脈給藥一次,每次0.2ml,陽性藥SN-38每兩天腹腔給藥一次,每次0.2ml,陰性對照組給予給藥組等量的NS。第9天處死動物,稱體重、瘤重。計算各組平均瘤重,按下公式求出腫瘤抑制率并進行T檢驗。
腫瘤生長抑制率=(空白對照組平均瘤重-治療組平均瘤重)/空白對照組平均瘤重×100%
結果見下表
表.力墀秀肽對小鼠肉瘤S180的生長抑制作用

關于本文
本文標題:力墀秀肽及其在制備治療腫瘤藥物中的應用、制備方法.pdf
鏈接地址://www.vmyqew.com.cn/p-6419584.html
關于我們 - 網站聲明 - 網站地圖 - 資源地圖 - 友情鏈接 - 網站客服 - 聯系我們

[email protected] 2017-2018 www.vmyqew.com.cn網站版權所有
經營許可證編號:粵ICP備17046363號-1 
 


收起
展開
美团现在如何赚钱 福州适合卖什么东西赚钱 约拍赚钱方式怎么回事 东北13张麻将技巧 中国赚钱的城市和难赚钱的城市有哪些 西游记之齐天大圣捕鱼 在北京卖串串赚钱吗 答题赚钱的套路 靠谱的app试用赚钱 成都麻将技巧顺口溜 美人捕鱼技巧 新绝代双骄1怎么赚钱 二人麻将口诀和技巧 英雄联盟宇宙 玩棋牌游戏上庄能赚钱吗 谁有吉林市麻将群