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皇马VS维戈塞尔塔: 海洋芽孢桿菌B9987產脂肽類化合物及其制備和應用.pdf

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海洋 芽孢 桿菌 B9987 產脂肽類 化合物 及其 制備 應用
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摘要
申請專利號:

CN200910198737.8

申請日:

2009.11.13

公開號:

CN102060914B

公開日:

2014.09.17

當前法律狀態:

終止

有效性:

無權

法律詳情: 未繳年費專利權終止IPC(主分類):C07K 7/64申請日:20091113授權公告日:20140917終止日期:20151113|||授權|||實質審查的生效IPC(主分類):C07K 7/64申請日:20091113|||公開
IPC分類號: C07K7/64; C12P21/04; A01N63/02; A01P3/00; C12R1/07(2006.01)N 主分類號: C07K7/64
申請人: 華東理工大學; 上海澤元海洋生物技術有限公司
發明人: 李元廣; 張道敬; 劉榮峰; 魏鴻剛; 羅遠嬋; 李淑蘭; 陶黎明; 田黎; 沈國敏
地址: 200237 上海市梅隴路130號
優先權:
專利代理機構: 上海專利商標事務所有限公司 31100 代理人: 范征
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法律狀態
申請(專利)號:

CN200910198737.8

授權公告號:

|||102060914B||||||

法律狀態公告日:

2017.01.11|||2014.09.17|||2012.11.14|||2011.05.18

法律狀態類型:

專利權的終止|||授權|||實質審查的生效|||公開

摘要

本發明提供了一種新的海洋芽孢桿菌B-9987產脂肽類化合物。本發明還涉及所述化合物的制備方法以及該化合物作為農藥的應用。

權利要求書

1: 脂肽類化合物, 所述化合物具有以下結構 :
2: 一種制備權利要求 1 所述的化合物的方法, 其特征在于, 該方法包括以下步驟 : (1) 培養海洋芽孢桿菌 (Bacillus marinus)B-9987, 得到發酵液 ; (2) 用一種或多種選自有機溶劑萃取、 酸沉淀、 浸提或層析的方法從所述發酵液中分離 獲得所述化合物。
3: 如權利要求 2 所述的方法, 其特征在于, 所述步驟 (2) 包括以下一個或多個步驟 : (a) 從所述發酵液分離得到上清液, 用選自乙酸乙酯、 氯仿、 醋酸丁酯或正丁醇的溶劑 萃取, 然后用柱層析以氯仿 / 甲醇梯度洗脫, 收集氯仿 / 甲醇為 2 ∶ 1 至 0 ∶ 1 的洗脫部位, 用 Sephadex LH-20 和 / 或 HPLC 制備得到權利要求 1 所述的化合物 ; (b) 從所述發酵液分離得到上清液, 使上清液酸化沉淀, 用無水甲醇對酸化沉淀浸提, 浸提液用柱層析以氯仿 / 甲醇梯度洗脫, 收集氯仿 / 甲醇為 2 ∶ 1 至 0 ∶ 1 的洗脫部位, 用 SephadexLH-20 和 / 或 HPLC 制備得到權利要求 1 所述的化合物 ; (c) 從所述發酵液分離得到菌體, 用無水甲醇浸提, 浸提液用柱層析以氯仿 / 甲醇梯度 洗脫, 收集氯仿 / 甲醇為 2 ∶ 1 至 0 ∶ 1 的洗脫部位, 用 Sephadex LH-20 和 / 或 HPLC 制備 得到權利要求 1 所述的化合物。
4: 如權利要求 3 所述的方法, 其特征在于, 所述柱層析是硅膠柱層析。
5: 如權利要求 3 所述的方法, 其特征在于, 所述 HPLC 的制備條件均為 70%甲醇溶液。
6: 一種農藥組合物, 其特征在于, 所述組合物包含權利要求 1 所述的化合物作為活性 組分, 以及農藥學上可接受的載體。
7: 權利要求 1 所述的化合物在作為農藥中的應用。
8: 如權利要求 7 所述的應用, 其特征在于, 所述農藥用于抑制選自番茄早疫病菌 (A.solani)、 甜瓜果腐病菌 (F.oxysporum)、 棉花黃萎病菌 (V.alboatrum)、 小麥赤霉病菌 (F.graminearum)、 白術白絹病菌 (Sclerotium sp.)、 青霉病菌 (Penicillium sp.)、 黃瓜 灰霉病菌 (B.cinerea)、 番茄灰霉病菌 (B.cinerea)、 玉米小斑病菌 (D.turcica)、 水稻紋枯 病菌 (R.solani)、 瓜炭疽病菌 (Colletotrichum sp.)、 香蕉枯萎病菌 (F.oxysporum f.sp. cuberse) 的植物病原菌。
9: 一種防治植物病害的方法, 其特征在于, 將權利要求 1 所述的化合物或權利要求 6 所 述的農藥組合物施加到所述植物上。
10: 如權利要求 9 所述的方法, 其特征在于, 所述植物病害的病原菌選自番茄早疫病 菌 (A.solani)、 甜瓜果腐病菌 (F.oxysporum)、 棉花黃萎病菌 (V.alboatrum)、 小麥赤霉病 2 菌 (F.graminearum)、 白術白絹病菌 (Sclerotium sp.)、 青霉病菌 (Penicillium sp.)、 黃 瓜灰霉病菌 (B.cinerea)、 番茄灰霉病菌 (B.cinerea)、 玉米小斑病菌 (D.turcica)、 水稻 紋枯病菌 (R.solani)、 瓜炭疽病菌 (Colletotrichum sp.)、 香蕉枯萎病菌 (F.oxysporum f.sp.cuberse)、 番 茄 青 枯 病 菌 (R.solanacearum)、 白 菜 軟 腐 病 菌 (E.carotovora var. carotovora)。

說明書


海洋芽孢桿菌 B-9987 產脂肽類化合物及其制備和應用

    技術領域 本發明涉及源于渤海潮間帶植物鹽地堿蓬 (Suaeda salsa) 的海洋芽孢桿菌 (B.marinus)B-9987 產生的具有拮抗植物病原菌活性的新的環脂肽化合物 Marihysin A 及 其制備方法和在農藥方面的應用。
     背景技術 由 于 海 洋 環 境 的 特 殊 性, 海洋微生物具有不同于陸地微生物的一些獨特的 代 謝 途 徑, 因 而 能 產 生 大 量 的 結 構 新 穎 的 活 性 代 謝 產 物。 如 從 海 洋 真 菌 頂 頭 孢 霉 (Cephalosporiumacremonium) 中分離并成功上市的第一個海洋新抗生素——頭孢菌素, 開 創了開發海洋抗生素的先河。
     海洋芽孢桿菌能產生許多有價值的物質。Carisse 等 (2003 年 ) 從堆肥中 ( 包 括造紙廠淤泥、 植物殘體等成分 ) 分離出海洋芽孢桿菌, 平板拮抗實驗和盆栽試驗均表明 其對黃瓜猝倒病菌——終極腐霉 (Pythium ultimum) 的生長有較強抑制作用。張海龍等
     (2004 年 ) 從海洋芽孢桿菌中發現了 3 個新環脂肽化合物 Mixirin A-C, 它們具有細胞毒 作用。Ashish 等 (2006 年 ) 發現海洋芽孢桿菌產的纖維素酶在 pH 6 和 50℃時活性較好。 Noureddin 等 (2006 年 ) 發現海洋芽孢桿菌可以產葡萄糖 -6- 磷酸脫氫酶和 6- 磷酸葡萄 糖脫氫酶。田黎等 (2007 年 ) 報道了一株海洋芽孢桿菌 B.marinus B-9987 產生的 3 個新 的大環內酯類化合物 Macrolactin O、 P 和 Q, 研究發現, 這 3 個新化合物對交鏈孢和稻瘟霉 具有很好的抑制活性。此外還發現, 含有該類物質的海洋芽孢桿菌 B.marinus B-9987 發酵 濃縮液可有效抑制植物病原菌的生長。海洋芽孢桿菌因其具有抑菌作用強、 抗逆性強及易 于加工成劑型等諸多優勢, 十分適合于開發成微生物農藥。發明人所在課題組成功研發的 10 億 CFU/g 海洋芽孢桿菌可濕性粉劑作為農藥非常安全, 屬微毒類農藥, 初步的盆栽和田 間小區試驗結果表明該可濕性粉劑對灰霉病、 白粉病、 青枯病、 軟腐病、 早疫病、 霜霉病具有 較好的防治效果 ( 中國專利申請公開號 : CN101331881)。
     脂肽類物質主要來源于微生物的次級代謝產物, 由親水的肽鍵和親油的脂肪烴鏈 兩部分組成, 分為線性脂肽和環狀脂肽兩大類。由于其特殊的兩親分子結構造就了微生物 脂肽具有優良的表面活性, 在醫藥、 食品、 化妝品、 生物防治、 環境治理及微生物采油等領域 有重要的應用前景。
     環脂肽類化合物多數具有抗菌活性, 其中最為成功的例子是達托霉素, 它是第一 個應用于臨床的環脂肽類抗生素, 用于治療由革蘭陽性菌感染所致的并發性皮膚及皮膚結 構感染, 包括甲氧西林耐藥菌金葡菌及對萬古霉素抗性的糞腸球菌, 作用機制獨特。
     枯草芽孢桿菌 (Bacillus subtilis) 是一類重要的根際微生物, 能夠促進植物 抵抗病原菌的侵染, 因而被廣泛應用于植物病害的生物防治。B.subtilis 能夠產生幾十 種不同結構的抗生素, 其中非核糖體合成的脂肽類抗生素是其中最常見的一類, 主要包括 iturin、 surfactin 和 fengycin3 個家族。脂肽類抗生素由氨基酸鏈和脂肪酸側鏈組成, 穩定性好, 對人畜無害, 不污染環境, 是具有重要開發價值的新型生物源農藥。國外有報道iturin 成功應用于生物防治的例子 (Klich MA, 1994)。
     Catherine 等 (2001 年 ) 發現脂肽類生物表面活性劑能選擇性除去土壤中的 Pb、 Zn、 Cu 和 Cd 等金屬離子, 其中 Cu2+ 最易去除。
     黃現青等 (2006 年 ) 研究發現, 枯草芽孢桿菌 fmbJ 株產生的抗微生物脂肽可以直 接作用于體外抗偽狂犬病病毒 (Pseudorabies viru) 和豬細小病毒 (Porcine parvoviru) 南京株, 從而抑制其對豬腎 (Porcine Kidney) 細胞的感染作用。
     Kim 等 (2007 年 ) 研究發現, 環脂肽 Surfactin(MW 1036) 能夠抑制 Lovo 細胞的增 殖, 誘導細胞凋亡, 其作用機制可能為抑制細胞生存調節信號通路 ERK 和 PI3K/Akt。
     王 大 威 等 (2008 年 ) 研 究 發 現, 從大慶油田中分離到的一株枯草芽孢桿菌 (Bacillussubtilis)ZW-3 產生的脂肽類生物表面活性劑具有優良的乳化和降低油水界面 張力的能力, 并可以適應油藏中復雜的環境, 可提高采收率 9.2%, 在微生物采油中具有非 常好的應用前景。
     薛春美等 (2008 年 ) 報道從海洋芽孢桿菌中分離得到了 Macrolactin T 和 U 以及 已知結構 Macrolactin A、 B、 D、 O、 S, 其中 Macrolactin T、 B、 D 對稻瘟病菌、 番茄早疫病菌 及金黃色葡萄球菌具有拮抗作用。 發明內容
     本發明者經過研究發現, 由海洋芽孢桿菌 (B.marinus)B-9987 產生的 1 個新環 脂 肽 化 合 物 Marihysin A 對 茄 交 鏈 孢 (Alternaria solani) 和 尖 孢 鐮 刀 菌 (Fusarium oxysporum f.sp.cuberse) 等植物病原菌均具有很好的抑制活性, 因此可以用作農藥來防 治由這些病原菌引起的植物病害。
     本發明的目的在于提供來源于海洋芽孢桿菌 (B.marinus)B-9987 產生的一個新 的具有應用價值的環脂肽化合物及其制備方法和應用。具體地說, 本發明第一方面提供具 有新結構環脂肽化合物 Marihysin A, 所述化合物結構如下圖所示 :
     當用于本發明時, 術語″本發明的化合物″或類似術語的含義不僅包括了上述結 構式所定義的化合物, 還包括了它們的鹽。所述鹽可以是水溶、 脂溶或可分散產物的形式, 其可通過和無機酸或有機酸或堿反應形成。 這些酸加成鹽的例子包括乙酸鹽、 己二酸鹽、 藻 酸鹽、 苯甲酸鹽、 苯磺酸鹽、 硫酸氫鹽、 丁酸鹽、 檸檬酸鹽、 十二烷基磺酸鹽、 鹽酸鹽、 草酸鹽、 丙酸鹽、 琥珀酸鹽、 酒石酸鹽。 堿性鹽包括銨鹽, 堿金屬鹽, 如鈉鹽和鉀鹽, 堿土金屬鹽, 如鈣
     鹽和鎂鹽, 有機堿的鹽, 如二環己胺鹽等。
     本發明的化合物也可以其互變異構形式存在。 盡管未在這里描述的化合物中明確 指出這些形式, 但它們也包含在本發明的范圍之內。 除非另有說明, 這里所述化合物的化學 名包括所有可能的、 所述化合物可包含的立體化學異構形式的混合物。所述混合物可含有 所述化合物基礎分子結構的所有非對映異構體和 / 或對映異構體。本發明化合物所有的立 體化學異構形式可以是純化形式, 或者是相互混合的形式, 這都包含在本發明范圍之內。
     本發明第二方面提供了一種制備上述化合物的方法, 其特征在于, 該方法包括以 下步驟 :
     (1) 培養海洋芽孢桿菌 (Bacillus marinus)B-9987, 得到發酵液 ;
     (2) 用一種或多種選自有機溶劑萃取、 酸沉淀、 浸提或層析的方法從所述發酵液中 分離獲得所述化合物。
     本發明方法所涉及的菌株為海洋芽孢桿菌 (B.marinus)B-9987, 該菌株從渤海潮 間帶植物鹽地堿蓬中分離得到, 該菌株已于 2007 年 6 月 18 日保藏于中國微生物菌種保藏 管理委員會普通微生物中心 (CGMCC)( 北京市海淀區中關村北一條 13 號中國科學院微生物 研究所 ), 保藏號為 CGMCC No.2095, 并公開于中國專利申請 CN 101333206A 中。 本發明所用的術語 “發酵” 或 “培養” 具有本領域技術人員通常熟知且承認的含 義。所述 “發酵液” 或 “培養液” 可通過在適合生長的條件下培養本發明的海洋芽孢桿菌 B.marinusB-9987, 使其生長至一定的細菌濃度來獲得。
     用于培養本發明菌株的培養基中的營養源沒有特別的限制。 本領域技術人員可以 根據公知的技術來選擇合適的碳源、 氮源和其它營養源。例如, 碳源可以是淀粉、 糊精、 甘 油、 葡萄糖、 蔗糖、 肌醇、 甘露醇等。氮源可以是胨、 大豆粉、 蛋白粉、 肉膏、 米糖、 麥皮、 酵母 粉、 玉米漿、 銨鹽以及其它有機或無機含氮化合物。另外, 培養基中還可適當加入一些無機 鹽類, 如氯化鈉、 磷酸鹽 ( 如磷酸氫二鉀和磷酸二氫鉀等 )、 硫酸銨、 硫酸錳、 硫酸鎂、 碳酸鈣 等金屬鹽。通??剎捎酶髦忠閻某9媾嘌?, 如 LB 瓊脂培養基、 營養瓊脂培養基、 葡萄糖 酵母膏瓊脂培養基和牛肉浸汁瓊脂培養基等。在一個具體實施方案中, 用于培養本發明菌 株的培養基具有以下組成 (%表示質量 / 體積 ) : 葡萄糖 0.1%~ 1%、 蔗糖 0.1%~ 2%、 酵 母粉 0.01%~ 1.5%、 蛋白粉 0.1%~ 1%、 MgCl2 0.001%~ 0.1%、 KCl 0.01%~ 0.5%、 KH2PO4 0.01%~ 0.5%和 NaCl 0.1%~ 6%、 pH6.0 ~ 7.0。然而, 本領域技術人員應當理 解, 本發明并不局限于本文中列舉的這些具體培養基配方。
     培養本發明中的菌株的溫度、 pH、 氣液比、 罐壓、 轉速等條件沒有特別嚴格的限制, 只要該條件適合該菌的生長即可。
     在培養時可采用豆油、 泡敵等消泡劑進行消泡。在一些較佳的實施方案中, pH 宜 控制在 5.5 ~ 8.0 之間, 培養溫度宜在 20 ~ 35℃之間。培養時間通常在 12h ~ 200h 之間, 最終的菌濃度通??篩嘰?5×107cfu/ml ~ 1×1011cfu/ml。
     在本發明的一個較佳的實施方案中, 通過以下方法培養所述海洋芽孢桿菌來得到 發酵液 : 在含有碳源、 氮源、 無機鹽的培養基中, 在通氣量控制在氣液比為 0.2 ∶ 1 ~ 2 ∶ 1、 轉速在 100r/min 或以上, 培養所述海洋芽孢桿菌 24 小時以上, 其中所述碳源選自葡萄糖、 蔗糖、 淀粉和大米粉中的 1 種或幾種, 所述氮源選自蛋白粉、 酵母粉、 花生餅粉和大豆粉中 的 1 種或幾種, 所述無機鹽包括常規的無機鹽 ( 如 MgSO4、 (NH4)2SO4、 MgCl2、 KCl、 KH2PO4、 NaCl、
     K2HPO4 和 CaCO3)。
     上述列舉的這些參數只是實現本發明的較佳方案。因此, 本領域技術人員在上述 范圍以外選擇合適的培養條件也能獲得本發明的發酵液。
     在獲得了上述發酵液后, 用一種或多種選自有機溶劑萃取、 酸沉淀、 浸提或層析的 方法從發酵液中分離獲得目標化合物。 本發明的化合物可以從發酵液的發酵清液中分離得 到, 也可以從發酵液中的菌體分離得到。在優選的實施方案中, 也可分別從發酵清液 ( 也稱 上清液或發酵上清液 ) 和菌體中分離得到含本發明的化合物的粗品或浸提液, 混合后再進 行進一步的分離純化。
     因此, 作為本發明方法的一個優選方案, 首先從所述發酵液分離得到上清液, 用選 自乙酸乙酯、 氯仿、 醋酸丁酯或正丁醇的溶劑萃取, 然后用柱層析以氯仿 / 甲醇梯度洗脫, 收集氯仿 / 甲醇為 2 ∶ 1 至 0 ∶ 1 的洗脫部位, 用 HPLC 制備得到本發明所述的化合物。
     從發酵液來分離上清液可采用常規的分離手段如離心過濾等。然后, 在獲得上清 液后, 一種可行的方式是用有機溶劑 ( 例如, 乙酸乙酯、 氯仿、 醋酸丁酯或正丁醇 ) 進行萃 取。 優選的方案是采用有機溶劑的組合進行所述萃取, 例如, 依次采用乙酸乙酯和正丁醇萃 ??; 依次采用氯仿、 乙酸乙酯和正丁醇進行萃取 ; 依次采用醋酸丁酯和正丁醇進行萃取等。 另一個可行的方案是, 先如上所述獲得上清液, 然后使上清液酸化沉淀, 用無水甲 醇對酸化沉淀浸提。 具體地說, 在上清液中加入酸 ( 如鹽酸 ), 使溶液靜置, 然后離心得到酸 化沉淀和酸化上清液。在本申請的一個方案中, 采用 5N 鹽酸溶液進行酸化。本領域技術人 員也可以適當地調整鹽酸濃度同樣可以得到酸化沉淀。隨后, 將酸化沉淀的 pH 調至中性后 冷凍干燥, 用無水甲醇浸提一次或多次, 每次浸提時間為 6-12 小時。
     還有一種可行的方式是采用諸如離心分離等常規手段從發酵液分離得到菌體。 然 后, 用無水甲醇浸提所述菌體一次或多次, 每次浸提時間 6-12 小時。
     隨后, 用柱層析進行氯仿 / 甲醇梯度洗脫前述步驟得到的正丁醇萃取活性部位或 無水甲醇浸提液, 收集氯仿 / 甲醇為 2 ∶ 1 至 0 ∶ 1 的洗脫部位 ( 優選氯仿 / 甲醇 1 ∶ 1 的洗脫部位 )。所用的柱層析例如可以是硅膠柱層析。最后, 用 Sephadex LH-20 和 / 或 HPLC( 分析和制備條件均為 70%甲醇水溶液 ) 等制備獲得所述化合物。
     然而, 本領域技術人員應當理解, 完全能夠根據常規技術采用其它的分離手段、 溶 劑或洗脫劑來分離得到本發明的化合物。因此, 本發明方法的范圍并不局限于說明書實施 例中所用的具體方法。
     本發明另一方面提供了一種農藥組合物, 其特征在于, 所述組合物包含本發明 所述的化合物作為活性組分, 以及農藥學上可接受的載體。本發明的農藥組合物可用 于 抑 制 選 自 番 茄 早 疫 病 菌 (A.solani)、 甜 瓜 果 腐 病 菌 (F.oxysporum)、 棉花黃萎病菌 (V.alboatrum)、 小麥赤霉病菌 (F.graminearum)、 白術白絹病菌 (Sclerotium sp.)、 青霉病 菌 (Penicillium sp.)、 黃瓜灰霉病菌 (B.cinerea)、 番茄灰霉病菌 (B.cinerea)、 玉米小斑 病菌 (D.turcica)、 水稻紋枯病菌 (R.solani)、 瓜炭疽病菌 (Colletotrichum sp.)、 香蕉枯 萎病菌 (F.oxysporum f.sp.cuberse) 的植物病原菌。
     本發明的化合物或農業組合物可以直接以發酵液形式施用, 也可將其適當稀釋 ( 例如稀釋 10 倍、 100 倍、 1000 倍或更高 ) 以稀釋液形式施用。本發明的化合物或其組合物 可以施加到植物的根、 葉、 莖等部位上。施加方法是本領域中的常規技術, 例如可以是在播
     種時浸種, 移栽前將植物根部浸在發酵液或其稀釋液中, 或者直接將發酵液或稀釋液潑澆 在苗床上??啥ㄖ彩苯泄喔?, 也可在植物生長過程中灌根。如果所述農藥組合物是以載 體形式保存的, 則可在臨用前用水稀釋后再進行施加。 至于本發明的最適施藥劑量, 本領域 技術人員無需經過過多試驗即可確定。 具體實施方式
     實施例 1 利用酸沉淀法從海洋芽孢桿菌 (Bacillus marinus)B-9987 發酵液中分 離得到新環脂肽化合物 Marihysin A
     本實施例通過分離手段從海洋芽孢桿菌 B.marinus B-9987 的發酵液中獲得了新 的環脂肽化合物 Marihysin A。具體分離純化步驟如下 :
     (1) 將海洋芽孢桿菌 (B.marinus)B-9987 在合適的條件下培養得到 30L 發酵液。
     海洋芽孢桿菌 B-9987 菌種經平板活化后接種于一級種子搖瓶培養 12-24h 后作 為一級種子, 將該一級種子接種于二級種子搖瓶, 培養 12-24h 后接種于 50L 發酵罐中。在 28℃、 300rpm 下培養 20h 左右即可結束。
     (2)30L 發酵液 4000rpm 離心后得到發酵上清液和濕菌體。發酵上清液加 5N 鹽酸 溶液酸化并靜置沉淀后離心 (4000rpm) 得到酸化沉淀和酸化上清液。將酸化沉淀 pH 調至 7.0 后冷凍干燥, 得到凍干沉淀 174.8g, 用無水甲醇 (440mL, 220mL, 220mL) 依次浸提 3 次, 每次浸提時間 12 小時, 將浸提液合并減壓濃縮至干, 得到酸化沉淀浸提粗品共 10.2g。 將酸 化沉淀浸提粗品經硅膠柱層析以氯仿 / 甲醇 10 ∶ 1 → 0 ∶ 1 梯度洗脫 (500mL/ 流分 ), 對 洗脫的流分進行生物活性檢測, 指示菌為茄交鏈孢 (Alternaria solani), 結果顯示抑菌活 性物質主要集中在氯仿 / 甲醇 1 ∶ 1 和甲醇洗脫部位, 且以氯仿 / 甲醇 1 ∶ 1 洗脫部位活 性更強, 將上述活性流分經 TLC 檢測后合并。將合并后的活性流分經 Sephadex LH-20 柱層 析以甲醇洗脫, 對洗脫流分進行生物活性檢測, 指示菌為茄交鏈孢 (Alternaria solani), 生物活性檢測后的活性流分經 TLC 檢測后合并。將合并后的活性流分經 HPLC 分析并制備 ( 分析和制備條件均為 70%甲醇水溶液 ), 最終制備得到化合物 Marihysin A。
     實施例 2 利用有機溶劑提取法從海洋芽孢桿菌 (Bacillus marinus)B-9987 發酵 液中分離得到新環脂肽化合物 Marihysin A
     本實施例通過常規的分離手段從海洋芽孢桿菌 B.marinus B-9987 的發酵液中獲 得了新的環脂肽化合物 Marihysin A。具體分離純化步驟如下 :
     (1) 將海洋芽孢桿菌 (B.marinus)B-9987 在合適的條件下培養得到 30L 發酵液 ( 具體的培養條件和步驟同實施例 1)。
     (2)30L 發酵液 4000rpm 離心后得到發酵上清液和濕菌體。 濕菌體經過水洗離心后 冷凍干燥, 得到干菌體 92.0g, 用無水甲醇 (600mL, 300mL, 300mL) 依次浸提 3 次, 每次浸提時 間 12 小時, 將浸提液合并減壓濃縮至干得到菌體浸提粗品共 17.3g。將菌體浸提粗品經硅 膠柱層析以氯仿 / 甲醇 10 ∶ 1 → 0 ∶ 1 梯度洗脫 (500mL/ 流分 ), 對洗脫的流分進行生物 活性檢測, 指示菌為茄交鏈孢 (Alternaria solani), 結果顯示抑菌活性物質主要集中在氯 仿 / 甲醇 1 ∶ 1 和甲醇洗脫部位, 且以氯仿 / 甲醇 1 ∶ 1 洗脫部位活性更強, 將上述活性流 分經 TLC 檢測后合并。將合并后的活性流分經 Sephadex LH-20 柱層析以甲醇洗脫, 對洗脫 流分進行生物活性檢測, 指示菌為茄交鏈孢 (Alternariasolani), 生物活性檢測后的活性流分經 TLC 檢測后合并。將合并后的活性流分經 HPLC 分析并制備 ( 分析和制備條件均為 70%甲醇水溶液 ), 最終制備得到化合物 Marihysin A。
     實施例 3 有機溶劑萃取法從海洋芽孢桿菌 (Bacillus marinus)B-9987 發酵液中 分離得到新環脂肽化合物 Marihysin A
     本實施例通過常規的分離手段從海洋芽孢桿菌 B.marinus B-9987 的發酵液中獲 得了新的環脂肽化合物 Marihysin A。具體分離純化步驟如下 :
     (1) 將海洋芽孢桿菌 (B.marinus)B-9987 在合適的條件下培養得到 10L 發酵液。 海 洋芽孢桿菌 B-9987 菌種經平板活化后接種于一級種子搖瓶培養 12-24h 后作為一級種子, 將該一級種子接種于二級種子搖瓶, 培養 12-24h 后接種于 5L 發酵罐中。在 28℃、 300rpm 下培養 20h 左右即可結束。共發酵 3 個 5L 罐獲得 10L 發酵液。
     (2)10L 發酵液 4000rpm 離心后得到發酵上清液和濕菌體。發酵上清液用等體積 乙酸乙酯分別萃取 3 次, 每次萃取時間 12 小時, 將乙酸乙酯萃取相合并減壓濃縮至原發酵 液體積。再用等體積正丁醇對乙酸乙酯萃余相分別萃取 3 次, 每次萃取時間 12 小時, 將正 丁醇萃取相合并減壓濃縮至原發酵液體積。 對上述乙酸乙酯萃取相和正丁醇萃取相進行生 物活性檢測, 指示菌為茄交鏈孢 (Alternaria solani), 確定正丁醇部位為主要抑菌活性部 位。 將正丁醇萃取相合并減壓濃縮至干, 得到正丁醇萃取物粗品共 13.8g。 將正丁醇萃取物 粗品經硅膠柱層析以氯仿 / 甲醇 10 ∶ 1 → 0 ∶ 1 梯度洗脫 (500mL/ 流分 ), 對洗脫的流分 進行生物活性檢測, 指示菌為茄交鏈孢 (Alternariasolani), 結果顯示抑菌活性物質主要 集中在氯仿 / 甲醇 1 ∶ 1 和甲醇洗脫部位, 且以氯仿 / 甲醇 1 ∶ 1 洗脫部位活性更強, 將上 述活性流分經 TLC 檢測后合并。將合并后的活性流分經 Sephadex LH-20 柱層析以甲醇洗 脫, 對洗脫流分進行生物活性檢測, 指示菌為茄交鏈孢 (Alternaria solani), 生物活性檢 測后的活性流分經 TLC 檢測后合并。將合并后的活性流分經 HPLC 分析并制備 ( 分析和制 備條件均為 70%甲醇水溶液 ), 最終制備得到化合物 Marihysin A。
     實施例 4 新環脂肽化合物 Marihysin A 的結構鑒定和分析
     (1)Marihysin A 結構鑒定和分析
     將實施例 1、 2 或 3 獲得的新的環脂肽化合物 Marihysin A 進行分析和鑒定, 其結 果均為如下 :
     Marihysin A 化學結構如下
     其 為 無 色 固 體 粉 末, UV254nm 下 有 暗 斑, 碘 蒸 汽 顯 色 下 呈 黃 色。mp > 250 ℃ ;IR(KBr)νmax(cm-1) : 3333, 2929, 2864, 1659, 1545, 1449, 1423, 1247, 1128。HRFAB-MS m/ + 1 13 1 1 z1065.6308[M+Na] (calcd for C48H74N12O14)。 H、 C NMR 數據、 H- H COSY 及 HMBC, 見表 1。
     表 1 化合物 Marihysin A 的結構鑒定數據表 (DMSO-d6)
     實施例 5Marihysin A 對植物病原菌的抑制作用
     本實施例考察了實施例 1 獲得的化合物 Marihysin A 對植物病原菌的抑制作用。
     采用平板拮抗法考察 Marihysin A 對番茄早疫病菌 (A.solani)、 甜瓜果腐病菌 (F.oxysporum)、 棉花黃萎病菌 (V.alboatrum)、 小麥赤霉病菌 (F.graminearum)、 白術白絹 病菌 (Sclerotium sp.)、 青霉病菌 (Penicillium sp.)、 黃瓜灰霉病菌 (B.cinerea)、 番茄灰 霉病菌 (B.cinerea)、 玉米小斑病菌 (D.turcica)、 水稻紋枯病菌 (R.solani)、 瓜炭疽病菌 (Colletotrichumsp.)、 香蕉枯萎病菌 (F.oxysporum f.sp.cuberse) 等植物病原菌的抑制 作用。
     Marihysin A 對植物病原菌的 MIC 如下表 2。
     表 2Marihysin A 對植物病原菌的抑制作用
     從表 2 中可以看出 Marihysin A 對白術白絹病菌 (Sclerotium sp.)、 甜瓜果腐病 菌 (F.oxysporum)、 青霉病菌 (Penicillium sp.) 和瓜炭疽病菌 (Colletotrichum sp.) 等 植物病原菌具有較強的抑菌活性。
     實施例 6 含有 Marihysin A 的海洋芽孢桿菌 (Bacillus marinus)B-9987 發酵液 對植物病原菌的抑制活性
     本 實 施 例 考 察 了 含 有 本 發 明 所 述 的 化 合 物 Marihysin A 的 海 洋 芽 孢 桿 菌 (B.marinus)B-9987 發酵液可有效抑制植物病原菌的生長。
     本實施例采用平板拮抗法考察含有 Marihysin A 的海洋芽孢桿菌 (B.marinus) B-9987 發酵液對植物病原菌的抑制作用。
     病原真菌抑菌譜的測定 : 將于 4 ℃斜面中保存的的植物致病真菌接于 PDA 平板 在 28℃的條件下活化培養大約一周, 待真菌長滿整個平板后結束培養, 用已滅菌的直徑為 14.50mm 的打孔器在活化的病原真菌菌落外緣打一菌餅, 將菌餅正面向上放置于對峙培養 平板的一側, 靠近皿壁約 1cm, 用接種針取 1 環培養獲得的 B-9987 發酵液, 在對峙平板內平 行于菌塊劃一條菌線, 劃線距離視病原真菌的生長速度而定, 將對峙培養平板放入 28℃培 養 5d 后記錄抑菌帶寬度。
     病原細菌抑菌譜的測定 : 將培養 24h 的病原菌液混入相應半固體培養基中 ( 使含 菌平板達到 109cfu/mL), 然后倒在制備好的水瓊脂平板上, 冷卻后在半固體平板中央打直 徑為 14.00mm 的孔, 然后將 B-9987 發酵液加入孔中, 每孔 150μL, 30℃培養 24h 后記錄抑菌 圈大小。
     其結果如下表 3 所示。
     表 3 海洋芽孢桿菌 B-9987 發酵液對植物病原菌的抑制作用
     12102060914 A CN 102060919說明書抑菌帶 ( 圈 )/mm 11.00 12.00 6.50 6.40 6.30 5.67 5.60 3.10 3.06 23.0 18.810/10 頁病原菌 玉米小斑病菌 (C.lunata) 黃瓜灰霉病菌 (B.cinerea) 瓜炭疽病菌 (Colletotrichum sp.) 番茄早疫病菌 (Alternaria sp.) 煙草赤星病菌 (A.alternate) 稻瘟病菌 (P.grisea) 香蕉枯萎病菌 (F.oxysporum f.sp.cuberse) 甜瓜枯萎病菌 (F.oxysporum) 小麥赤霉病菌 (F.graminearum) 番茄青枯病菌 (R.solanacearum) 白菜軟腐病菌 (E.carotovora var.carotovora)
     由表 3 的抑制活性可知, 含有化合物 Marihysin A 的海洋芽孢桿菌 (B.marinus) B-9987 發酵液可有效地抑制植物病原菌的生長。
     盡管上面已經描述了本發明的具體例子, 但是有一點對于本領域技術人員來說是 明顯的, 即在不脫離本發明的精神和范圍的前提下可對本發明作各種變化和改動。 因此, 所 附權利要求覆蓋了所有這些在本發明范圍內的變動。13   內容來自專利網维戈塞尔塔vs皇家社会 www.vmyqew.com.cn轉載請標明出處

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