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维戈塞尔塔对比利亚雷的比分预测: 新的半乳凝素9突變體蛋白質及其用途.pdf

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半乳凝素 突變體 蛋白質 及其 用途
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摘要
申請專利號:

CN200580010446.1

申請日:

2005.03.29

公開號:

CN1957082B

公開日:

2014.09.17

當前法律狀態:

授權

有效性:

有權

法律詳情: 授權|||實質審查的生效|||公開
IPC分類號: C12N15/09; A61K31/7088; A61K35/12; A61K35/74; A61K35/76; A61K38/00; A61K48/00; A61P3/10; A61P7/06; A61P11/06; A61P13/12; A61P17/00; A61P17/04; A61P19/02; A61P19/04; A61P21/00; A61P21/02; A61P21/04; A61P25/00; A61P29/00; A61P35/00; A61P35/02; A61P37/02; A61P37/08(2006... 主分類號: C12N15/09
申請人: 株式會社嘉爾藥物
發明人: 西望; 平島光臣; 山內清明; 伊藤愛子
地址: 日本香川縣
優先權: 2004.03.29 JP 094401/2004; 2004.09.30 JP 287005/2004; 2005.02.18 JP 043156/2005
專利代理機構: 中國國際貿易促進委員會專利商標事務所 11038 代理人: 陳昕
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法律狀態
申請(專利)號:

CN200580010446.1

授權公告號:

1957082B||||||

法律狀態公告日:

2014.09.17|||2007.06.27|||2007.05.02

法律狀態類型:

授權|||實質審查的生效|||公開

摘要

以大腸桿菌作為宿主生產的重組體半乳凝素9表明通過對腫瘤細胞的直接作用(誘導腫瘤細胞的細胞間粘附與凋亡的活性)和借助于免疫系的作用,具有抑制癌的轉移和誘導萎縮,而且對非活化淋巴細胞沒有作用,誘導活化T細胞、特別是成為過剩免疫反應原因的CD4陽性T細胞的凋亡,以及對與風濕病中關節的變形等有關的滑膜細胞具有很強的誘導凋亡能力,重組體半乳凝素9由于連接兩個CRD的連接區對蛋白水解酶的敏感性提高,所以非常容易被酶消化,喪失上述活性,為了進一步研究需要更穩定型的分子。通過改變連接半乳凝素9的兩個CRD的連接區,可得到避免對上述活性造成惡影響,而且穩定性提高的改變分子。

權利要求書

權利要求書
1.  蛋白質或其鹽,其特征是半乳凝素9或基本上具有與半乳凝素9同等活性的蛋白質的連接肽或其附近區域被改變。

2.  權利要求1所述的蛋白質或其鹽,其特征是:改變由在半乳凝素9或基本上具有與半乳凝素9同等活性的蛋白質的連接肽或其附近區域的氨基酸序列中缺失、取代或添加的1個或1個以上的氨基酸的氨基酸序列形成,與半乳凝素9比較,至少對于連接肽的分解敏感性被改變。

3.  權利要求1或2所述的蛋白質或其鹽,其特征是:基本上具有與半乳凝素9同等活性的蛋白質與半乳凝素9的氨基酸序列至少具有70%以上同源性。

4.  權利要求1~3中任一項所述的蛋白質或其鹽,其特征是:(1)和(2)借助于(3)連接,其中(1)為具有半乳凝素9的N末端側的糖鏈識別區域(NCRD)或與該區域具有基本上同等活性的多肽;(2)為具有半乳凝素9的C末端側的糖鏈識別區域(CCRD)或基本上與該區域具有同等活性的多肽;(3)為在半乳凝素9的連接肽的氨基酸序列中缺失、取代或添加的1個或1個以上的氨基酸的氨基酸序列構成的改變連接肽。

5.  權利要求1~4任一項所述的蛋白質或其鹽,其特征是:(1)和(2)借助于(3)連接,其中(1)為具有序列3所示的氨基酸序列的多肽或基本上與它具有同等活性、且具有與序列3所示的氨基酸序列至少70%以上同源性的氨基酸序列的多肽,或具有在序列3所示的氨基酸序列中至少缺失、取代或添加1~8個氨基酸殘基的氨基酸序列的多肽;(2)為具有序列4所示的氨基酸序列的多肽或基本上與它具有同等活性、且具有與序列4所示的氨基酸序列至少70%以上同源性的氨基酸序列的多肽,或具有在序列3所示的氨基酸序列中至少缺失、取代或添加1~21個氨基酸殘基的氨基酸序列的多肽;(3)為在序列7~9中任一個序列表示的氨基酸序列中缺失(不過,序列7中的1~32以及1~44的缺失、和序列8中1~12的缺失除外)、取代或添加1個或1個以上的氨基酸的氨基酸序列構成的改變連接肽。

6.  一種核酸,其特征是具有編碼權利要求1~5任一項所述的蛋白質的堿基序列。

7.  權利要求6所述的核酸,其特征是聚核苷酸。

8.  權利要求6或7所述的核酸,其特征是DNA或RNA。

9.  一種重組載體,其特征是含有權利要求6~8任一項所述的核酸。

10.  權利要求9所述的重組載體,其特征是除了含有權利要求6~8任一項所述的核酸外,還含有編碼標記蛋白質和/或肽的堿基序列。

11.  一種轉化體,其特征是含有權利要求6~8任一項所述的核酸或權利要求9或10所述的重組載體。

12.  權利要求11所述的轉化體,其特征是:轉化體宿主細胞是原核細胞或真核細胞。

13.  一種藥物,其特征是:作為有效成分含有從權利要求1~5中任一項所述的蛋白質、權利要求6~8中任一項所述的核酸、權利要求9或10所述的重組載體和權利要求11或12所述的轉化體中選擇的成分。

14.  權利要求13所述的藥物,其特征是免疫調節劑。

15.  權利要求13所述的藥物,其特征是抗腫瘤藥。

16.  權利要求15所述的藥物,其特征是抗來自于包含腦腫瘤(多形形惡性膠質瘤等)、脊髓腫瘤、上顎洞癌、胰液腺癌、齒肉癌、舌癌、口唇癌、上咽癌、中咽癌、下咽癌、喉頭癌、甲狀腺癌、甲狀旁腺癌、肺癌、胸膜腫瘤、癌性腹膜炎、癌性胸膜炎、食道癌、胃癌、大腸癌、膽管癌、膽囊癌、胰臟癌、肝癌、腎臟癌、膀胱癌、前列腺癌、陰莖癌、精巢腫瘤、腎上腺癌、子宮頸癌、子宮體癌、陰道癌、外陰癌、卵巢癌、纖毛上皮瘤、惡性骨腫瘤、軟部肉瘤、乳癌、皮膚癌、惡性黑色素瘤、基底細胞瘤、白血病、伴隨骨髓化性的骨髓纖維癥、惡性淋巴瘤、惡性淋巴肉芽腫病、漿細胞瘤、神經膠質瘤等癌和肉瘤的腫瘤的抗腫瘤藥。

17.  權利要求13所述的藥物,其特征是該藥物是針對下面疾患或疾病、或病的癥狀的藥物:
(A)炎癥性疾患,來自于在各臟器中發生的各種急性和慢性炎癥、變態性和自身免疫性炎癥、感染癥等中的疾??;
(B)急性和慢性疾患,來自于包括支氣管炎、支氣管肺炎、間質性肺炎、肺炎、細支氣管炎、急性縱隔炎的肺的疾患、包括心外膜炎、心內膜炎、心肌炎、口內炎、口角炎、扁桃炎、咽炎、喉頭炎、食道炎、腹膜炎、急性胃炎、慢性胃炎、急性腸炎、蟲垂炎、缺血性大腸炎、藥物性大腸炎、直腸炎在內的肺以外的其它臟器的疾患、包括A型肝炎、B型肝炎、C型肝炎、重癥肝炎、急性和慢性肝炎以及肝硬變、膽囊炎、急性胰腺炎、慢性胰腺炎、急性和慢性腎炎、膜性腎炎、絲球體腎炎、IgA腎癥、各種膀胱炎、腦髓炎、乳腺炎、皮炎、表層角膜炎、干性角結膜炎、中耳炎和鼻炎、副鼻腔炎和鼻茸、牙肉炎、牙周炎、牙周圍炎在內的炎癥等疾??;
(C)來自于神經性炎癥(例如、神經性胃炎、神經性膀胱炎等)、癌或伴隨炎癥疼痛的疾??;
(D)變態性炎癥疾患,全身性過敏性、支氣管哮喘、過敏性肺炎、花粉癥、變態性鼻炎、變態性結膜炎、免疫復合體引起的變態性疾患、血管神經性浮腫等在內的疾??;
(E)自身免疫性的炎癥(自身免疫疾患),來自于全身性(慢性關節風濕病、全身性紅斑狼瘡、結節性多發性動脈炎、強皮癥、多發性肌炎·皮膚肌炎、肖格倫綜合征、貝切特病等)、神經系(多發性硬化癥、重癥肌無力癥、HAM(HTLV-1脊髓癥)、肌萎縮性側索硬化癥等)、內分泌性(巴澤多病、橋本病、1型糖尿病等)、血液(特發性血小板減少性紫斑病、自身免疫性溶血性貧血、再生不良性貧血等)、呼吸器(結節病、肺纖維癥等)、消化管(潰瘍性大腸炎、克羅恩病等)、肝臟(自身免疫性肝炎、原發性膽汁性肝硬變、原發性硬化性膽管炎、自身免疫性膽管炎等)、腎·尿路系(抗嗜中性白細胞細胞質抗體相關腎炎、血管炎、肺腎綜合征(Goodpasture)、抗絲球體基底膜抗體病等)等疾??;
(F)感染癥,由于病原體傷害生物體的細胞·組織·臟器產生的疾患、或起因于給人帶來感染癥的病原體的疾患,病原體來自于1)細菌(包括螺旋體、衣原體、立克次體)、2)病毒、3)真菌、4)植物(藻類)、5)原蟲、6)寄生蟲(吸蟲、條蟲、線蟲)、7)節足動物,包括細菌性感染癥(霍亂、瘟疫、大腸桿菌感染癥等)、螺旋體感染癥(鉤端螺旋體病等)、衣原體感染癥(鸚鵡病等)、立克次體感染癥(斑疹傷寒、破傷風等)、病毒性感染癥(帶狀皰疹、病毒性出血熱、狂犬病等)、真菌癥(念珠菌病、隱球菌病、曲霉菌病等)、原蟲性疾患(阿米巴性痢疾、瘧疾、弓形體病等)、寄生蟲(吸蟲癥、線蟲癥等)、此外還包括支原體感染癥(支原體肺炎等)、分支桿菌感染癥(結核、非定型抗酸菌癥等)疾??;
(G)皮膚科領域的疾患,i)皮膚感染癥、包括變態性炎癥和自身免疫性炎癥等在內的皮炎癥,干癬、水皰癥、膿皰癥、角化、角化異常癥等具有特有炎癥的皮膚疾患、ii)來自于由于美容皮膚科相關的損傷或老化,與a)黑色素代謝調節(美白)、b)毛發成長(生發)的調節、c)膠原產生調節有關的皮膚科領域的疾患(包括老化);
(H)生活習慣病,來自于包括高脂血癥、動脈硬化癥、高血壓、糖尿病等在內的疾??;
(I)有關正常細菌叢的維持的異常;
(J)來自于包括淀粉樣變性、阿爾茨海默病、骨質疏松癥、骨折等在內的疾??;
(K)腦、神經領域中的炎癥反應,例如伴隨著腦梗塞、心肌梗塞等缺血性病變的進展出現的炎癥、綜合失調癥;
(L)痛風;
(M)骨質疏松癥;或
(N)間質性肺炎。

18.  分析或檢查試劑,特征是作為有效成分含有選自于權利要求1~5中任一項所述的蛋白質、權利要求6~8中任一項所述的核酸、權利要求9或10所述的重組載體以及權利要求11或12所述的轉化體的成分。

說明書

說明書新的半乳凝素9突變體蛋白質及其用途
技術領域
本發明涉及到新型半乳凝素9突變體(突變體)蛋白質及其用途。本發明特別涉及到連接區域被改變的半乳凝素9以及利用該半乳凝素9的生物化學、臨床檢查、醫療以及藥物應用技術。
背景技術
特定的糖鏈和與之結合的蛋白質表現出在哺乳動物的生物體內伴隨生理現象以及進化·成長的現象,以及在各種各樣疾病等中起到多種多樣作用和功能的證據正在被人們發現。人們發現在生物體中存在著特異識別帶有β-半乳糖苷結構的糖鏈的動物凝集素,作為這樣的凝集素類的半乳凝素,目前至少有14種基因被鑒定。半乳凝素家族根據其結構分為三個亞類、即原型(prototype)、嵌合型(chimera)、以及串聯重復型(tandem repeat)、它們在生物體內的功能幾乎不清楚。特別是有關具有兩個糖鏈識別結構域的串聯重復型半乳凝素,由于研究的歷史短,作為它的靶的生物體內糖鏈(受體)還不清楚,所以其功能沒有闡明??墑?,根據對識別細胞表面的復雜的糖鏈的蛋白質進行探索發現等的經過,預想半乳凝素具有與細胞的粘附、細胞間的信息傳遞、細胞的活化等有關的功能,而引人注目。另外除了這樣的功能之外,預想還具有其它重要的各種各樣功能的那樣的研究成果也正在獲得。
作為串聯重復型半乳凝素之一的半乳凝素9在人中,最初是作為霍奇金病患者的自身抗原(autoantigen)被鑒定的(非專利文獻1和2),人們想像它是否在免疫細胞間的相互作用中起著重要的作用。小鼠的半乳凝素9可以通過使用以被認為在半乳凝素類的糖鏈識別結構域中保守性高的序列為基礎設計的簡并引物的5′-RACE PCR,從小鼠腎臟的cDNA文庫克隆(非專利文獻3)。人們發現用抗原刺激的人T細胞在體內和體外產生作為嗜酸性細胞趨化因子的ecalectin,而且該ecalectin與目前已知的其它嗜酸性細胞趨化因子類雖然結構上不同,但也可以歸屬于半乳凝素家族,具有對帶有β-半乳糖苷結構的糖鏈的結合親和性。從來自于人T細胞的白血病細胞株得到的mRNA成功地克隆了ecalectin,結果確認ecalectin是半乳凝素9的變異體之一,半乳凝素9與ecalectin是同一物質(非專利文獻4)。
作為野生型半乳凝素9,現在已報告了L型半乳凝素9(galectin-9long isoform or long type galectin-9:Gal-9L)、M型半乳凝素9(galectin-9 medium isoform or medium type galectin-9:Gal-9M)以及S型半乳凝素9(galectin-9 short isoform or short typegalectin-9:Gal-9S)。無論那一種半乳凝素9都由兩個糖鏈識別部位(糖識別結構域,carbohydrate recognition domain:CRD)和連接兩個部位的連接肽區構成,已知L型半乳凝素9含有最長的連接肽區,通過該連接肽區,N端結構域(NCRD)和C端結構域(CCRD)被連接在一起,而S型半乳凝素9含有最短的連接肽區,M型半乳凝素9含有介于兩者之間長度的連接肽區,發現通常存在于比前二者更廣的生物體內組織或細胞中。另外在由人細胞或組織克隆的半乳凝素9基因之間也可以看到表示遺傳多態現象的存在的證據。
野生型半乳凝素9由二個糖識別部位(CRD)和連接兩個部位的連接區構成,以大腸桿菌作為宿主生產的重組體半乳凝素9表明通過對腫瘤細胞的直接作用(誘導腫瘤細胞的細胞間粘附和凋亡的活性)和借助于免疫系統的作用,抑制癌轉移和誘導萎縮。另外半乳凝素9不作用于非活化淋巴細胞,而誘導活化T細胞、特別是誘導成為過度免疫反應原因的CD4陽性T細胞的凋亡也已闡明。另外也闡明了對與風濕病中關節變形等有關的滑膜細胞具有很強的誘導凋亡能力。
【非專利文獻1】Sahin,U.et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,92,11810-11813(1995)
【非專利文獻2】Tureci,O.et al.,J.Biol.Chem.,272(10),6416-6422(1997)
【非專利文獻3】Wada,J.et al.,J.Biol.Chem.,272(9),6078-6086(1997)
【非專利文獻4】Matsumoto,R.et al.,J.Biol.Chem.,273(27),16976-16984(1998)
發明內容
通過利用這樣的半乳凝素9的多方面的作用,預期可治療癌、難治的自身免疫疾患(包括風濕病)、變態性疾患等。然而重組體半乳凝素9由于連接兩個CRD的連接區對蛋白水解酶敏感性高,非常容易被酶消化,喪失上述活性。
本發明者等進行了專心研究,結果通過對一方面保持半乳凝素9具有的糖鏈識別活性,一方面對蛋白水解酶表現出更穩定的分子結構進行探索,改變半乳凝素9的連接兩個CRD的連接區,成功地獲得了避免對上述那樣的活性帶來壞影響,穩定性提高的改變分子,完成了本發明。
本發明提供以下內容。
(1)蛋白質或其鹽,其特征是半乳凝素9或與其具有基本上同等活性的蛋白質的連接肽或其附近的區域被改變。
(2)上述(1)所述的蛋白質或其鹽,其特征是:由在半乳凝素9或基本上具有與半乳凝素9同等活性的蛋白質的連接肽或其附近區域的氨基酸序列中缺失、取代或添加了1個或1個以上的氨基酸的氨基酸序列構成,與半乳凝素9比較,至少對于連接肽的分解敏感性被改變。
(3)上述(1)或(2)所述的蛋白質或其鹽,其特征是:基本上具有與半乳凝素9同等活性的蛋白質與半乳凝素9的氨基酸序列至少具有70%以上同源性。
(4)上述(1)~(3)中任一項所述的蛋白質或其鹽,其特征是:(1)具有半乳凝素9的N末端側的糖鏈識別區域(NCRD)或與該區域具有基本上同等活性的多肽與(2)具有半乳凝素9的C末端側的糖鏈識別區域(CCRD)或與該區域具有基本上同等活性的多肽借助于(3)在半乳凝素9的連接肽的氨基酸序列中缺失、取代或添加的1個或1個以上的氨基酸的氨基酸序列構成的改變連接肽連接。
(5)上述(1)~(4)任一項所述的蛋白質或其鹽,其特征是:(1)具有序列3所示的氨基酸序列的多肽或與它具有基本上同等活性,且具有與序列3所示的氨基酸序列至少70%以上同源性的氨基酸序列的多肽或具有在序列3所示的氨基酸序列中至少缺失、取代或添加1~8個氨基酸殘基的氨基酸序列的多肽和(2)具有序列4所示的氨基酸序列的多肽或與它具有基本上同等活性,且具有與序列4所示的氨基酸序列至少70%以上同源性的氨基酸序列的多肽或具有在序列3所示的氨基酸序列中至少缺失、取代或添加1~21個氨基酸殘基的氨基酸序列的多肽借助于(3)在序列7~9中任一個序列表示的氨基酸序列中缺失(但是,序列7中的1~32以及1~44的缺失、和序列8中1~12的缺失除外)、取代或添加1個或1個以上的氨基酸的氨基酸序列構成的改變連接肽連接。
(6)一種核酸,其特征是具有編碼上述(1)~(5)任一項所述的蛋白質的堿基序列。
(7)上述(6)所述的核酸,其特征是聚核苷酸。
(8)上述(6)或(7)所述的核酸,其特征是DNA或RNA。
(9)一種重組載體,其特征是含有上述(6)~(8)任一項所述的核酸。
(10)上述(9)所述的重組載體,其特征是除了含有上述(6)~(8)任一項所述的核酸外,還含有編碼標記蛋白質和/或肽的堿基序列。
(11)一種轉化體,其特征是含有上述(6)~(8)任一項所述的核酸或上述(9)或(10)所述的重組載體。
(12)上述(11)所述的轉化體,其特征是:轉化體宿主細胞是原核細胞或真核細胞。
(13)一種藥物,其特征是:作為有效成分含有從上述(1)~(5)中任一項所述的蛋白質、上述(6)~(8)中任一項所述的核酸、上述(9)或(10)所述的重組載體和上述(11)或12所述的轉化體中選擇的成分。
(14)上述(13)所述的藥物,其特征是免疫調節劑。
(15)上述(13)所述的藥物,其特征是抗腫瘤藥。
(16)上述(15)所述的藥物,其特征是抗來自于包含腦腫瘤(多形性惡性膠質瘤等)、脊髓腫瘤、上顎洞癌、胰液腺癌、齒肉癌、舌癌、口唇癌、上咽癌、中咽癌、下咽癌、喉頭癌、甲狀腺癌、甲狀旁腺癌、肺癌、胸膜腫瘤、癌性腹膜炎、癌性胸膜炎、食道癌、胃癌、大腸癌、膽管癌、膽囊癌、胰臟癌、肝癌、腎臟癌、膀胱癌、前列腺癌、陰莖癌、精巢腫瘤、腎上腺癌、子宮頸癌、子宮體癌、陰道癌、外陰癌、卵巢癌、纖毛上皮瘤、惡性骨腫瘤、軟部肉瘤、乳癌、皮膚癌、惡性黑色素瘤、基底細胞瘤、白血病、伴隨骨髓化性的骨髓纖維癥、惡性淋巴瘤、惡性淋巴肉芽腫病、漿細胞瘤、神經膠質瘤等癌和肉瘤的腫瘤的抗腫瘤藥。
(17)上述(13)所述的藥物,其特征是該藥物是針對下面疾患或疾病、或病的癥狀的藥物:
(A)炎癥性疾患,來自于在各臟器中發生的各種急性和慢性炎癥、變態性和自身免疫性炎癥、感染癥等中的疾??;
(B)急性和慢性疾患,來自于包括支氣管炎、支氣管肺炎、間質性肺炎、肺炎、細支氣管炎、急性縱隔炎的肺的疾患、包括心外膜炎、心內膜炎、心肌炎、口內炎、口角炎、扁桃炎、咽炎、喉頭炎、食道炎、腹膜炎、急性胃炎、慢性胃炎、急性腸炎、蟲垂炎、缺血性大腸炎、藥物性大腸炎、直腸炎在內的肺以外的其它臟器的疾患、包括A型肝炎、B型肝炎、C型肝炎、重癥肝炎、急性和慢性肝炎以及肝硬變、膽囊炎、急性胰腺炎、慢性胰腺炎、急性和慢性腎炎、膜性腎炎、絲球體腎炎、IgA腎癥、各種膀胱炎、腦髓炎、乳腺炎、皮炎、表層角膜炎、干性角結膜炎、中耳炎和鼻炎、副鼻腔炎和鼻茸、牙肉炎、牙周炎、牙周圍炎在內的炎癥等疾??;
(C)來自于神經性炎癥(例如、神經性胃炎、神經性膀胱炎等)、癌或伴隨炎癥疼痛的疾??;
(D)變態性炎癥疾患,全身性過敏性、支氣管哮喘、過敏性肺炎、花粉癥、變態性鼻炎、變態性結膜炎、免疫復合體引起的變態性疾患、血管神經性浮腫等在內的疾??;
(E)自身免疫性的炎癥(自身免疫疾患),來自于全身性(慢性關節風濕病、全身性紅斑狼瘡、結節性多發性動脈炎、強皮癥、多發性肌炎·皮膚肌炎、肖格倫綜合征(Sjogren syndrome)、貝切特病(Behcet’s syndrome)等)、神經系(多發性硬化癥、重癥肌無力癥、HAM(HTLV-1脊髓癥)、肌萎縮性側索硬化癥等)、內分泌性(巴澤多病、橋本病、1型糖尿病等)、血液(特發性血小板減少性紫斑病、自身免疫性溶血性貧血、再生不良性貧血等)、呼吸器(結節病、肺纖維癥等)、消化管(潰瘍性大腸炎、克羅恩病等)、肝臟(自身免疫性肝炎、原發性膽汁性肝硬變、原發性硬化性膽管炎、自身免疫性膽管炎等)、腎·尿路系(抗嗜中性白細胞細胞質抗體相關腎炎、血管炎、肺腎綜合征(Goodpasture)、抗絲球體基底膜抗體病等)等疾??;
(F)感染癥,由于病原體傷害生物體的細胞·組織·臟器產生的疾患、或起因于給人帶來感染癥的病原體的疾患,病原體來自于1)細菌(包括螺旋體、衣原體、立克次體)、2)病毒、3)真菌、4)植物(藻類)、5)原蟲、6)寄生蟲(吸蟲、條蟲、線蟲)、7)節足動物,包括細菌性感染癥(霍亂、瘟疫、大腸桿菌感染癥等)、螺旋體感染癥(鉤端螺旋體病等)、衣原體感染癥(鸚鵡病等)、立克次體感染癥(斑疹傷寒、破傷風等)、病毒性感染癥(帶狀皰疹、病毒性出血熱、狂犬病等)、真菌癥(念珠菌病、隱球菌病、曲霉菌病等)、原蟲性疾患(阿米巴性痢疾、瘧疾、弓形體病等)、寄生蟲(吸蟲癥、線蟲癥等)、此外還包括支原體感染癥(支原體肺炎等)、分支桿菌感染癥(結核、非定型抗酸菌癥等)疾??;
(G)皮膚科領域的疾患,i)皮膚感染癥、包括變態性炎癥和自身免疫性炎癥等在內的皮炎癥,干癬、水皰癥、膿皰癥、角化、角化異常癥等具有特有炎癥的皮膚疾患、ii)來自于由于美容皮膚科相關的損傷或老化,與a)黑色素代謝調節(美白)、b)毛發成長(生發)的調節、c)膠原產生調節有關的皮膚科領域的疾患(包括老化);
(H)生活習慣病,來自于包括高脂血癥、動脈硬化癥、高血壓、糖尿病等在內的疾??;
(I)有關正常細菌叢的維持的異常;
(J)來自于包括淀粉樣變性、阿爾茨海默病、骨質疏松癥、骨折等在內的疾??;
(K)腦、神經領域中的炎癥反應,例如伴隨著腦梗塞、心肌梗塞等缺血性病變的進展出現的炎癥、綜合失調癥;
(L)痛風;
(M)骨質疏松癥;或
(N)間質性肺炎。
(18)分析或檢查試劑,特征是作為有效成分含有選自于上述(1)~(5)中任一項所述的蛋白質、上述(6)~(8)中任一項所述的核酸、上述(9)或(10)所述的重組載體以及上述(11)或(12)所述的轉化體的成分。
發明的效果
就半乳凝素9得到的半乳凝素9突變體由于與野生型比較對蛋白水解酶穩定,可在半乳凝素9具有的生物體內功能的闡明中利用,可在對半乳凝素9在腫瘤化細胞的調控、免疫調節、以及變態性和炎癥的控制等各種各樣的生物體反應的調控·調節中起到的功能·活性進行的研究中使用。另外,該半乳凝素9突變體及其相關物質有望用作臨床應用、分子生物學應用、生物化學應用、醫學應用中的試藥和活性劑。
本發明的另外的目的、特征、優點以及其它觀點通過以下敘述同行人就都明白了。然而,包括以下的記載以及具體的實施例等記載在內的本件說明書的記載是表示本發明的理想方式,希望理解為只是為了說明給出的。在本說明書公布的本發明的意圖以及范圍內進行的各種變化和/或改變(或修飾)通過以下記載以及本說明書的其它部分的知識對于業內人士容易明白。本說明書中引用的所有專利文獻和參考文獻是為了說明的目的引用,這些文獻作為本說明書的一部分,其內容應當解釋為包括在說明書中。
附圖說明
圖1表示半乳凝素9突變體(G9NC(null))表達載體的構建方法。
圖2表示半乳凝素9突變體(G9NC(null))表達物以及純化處理物的電泳照片。
圖3表示比較野生型半乳凝素9(G9(M))和半乳凝素9突變體(G9NC(null))之間對蛋白水解酶的耐性的結果。對于純化標準品,存在的大腸桿菌蛋白水解酶的耐性進行了研究。圖表示電泳照片。
圖4表示比較野生型半乳凝素9(G9(S))和半乳凝素9突變體(G9NC(null))之間對蛋白水解酶的耐性的結果。研究了對基質金屬蛋白水解酶-3(MMP-3)的耐性。圖表示電泳照片。
圖5表示比較野生型半乳凝素9(G9(S))和半乳凝素9突變體(G9NC(null))之間對蛋白水解酶的耐性的結果。研究了對彈性蛋白酶(彈性蛋白酶)的耐性。圖表示電泳照片。
圖6表示在野生型半乳凝素9(G9(S))和半乳凝素9突變體(G9NC(null))之間對生物活性進行比較的結果。研究了對MOLT-4細胞的凋亡誘導活性(DNA梯形成)。圖表示電泳照片。
圖7表示在野生型半乳凝素9(G9(S))和半乳凝素9突變體(G9NC(null))之間對生物活性進行比較的結果。研究了對外周血嗜酸細胞的ECA活性。
圖8表示對半乳凝素9EST克隆進行BLAST序列檢索,對來自不同源的各克隆序列進行比較的結果。通過檢索,各克隆表現出97-99%的同源性(同一性)。在5,88,135,238,281位置表現出變異。
圖9表示酵母多糖誘發胸膜炎,但就單獨半乳凝素9突變體(h-gal9NC(null))來說,不誘發炎癥。
圖10表示對半乳凝素9突變體(h-gal9NC(null))在酵母多糖誘導胸膜炎模型中的效果進行研究的結果。
圖11表示對半乳凝素9突變體(Gal-9=G9NC(null))在PMA誘導皮炎(類固醇敏感性模型)中的效果進行研究的結果。
圖12表示對半乳凝素9突變體(Gal-9=G9NC(null))在花生四烯酸誘導皮炎(類固醇非敏感性模型)中的效果進行研究的結果。
圖13表示對半乳凝素9突變體(Gal-9=G9NC(null))在辣椒辣素誘導皮炎模型中的效果進行研究的結果。
圖14表示對半乳凝素9突變體(Gal-9=G9NC(null))在DNFB誘導接觸皮炎模型中的效果進行研究的結果。
圖15表示對半乳凝素9突變體(Gal-9=G9NC(null))在DNFB誘導接觸皮炎模型中的效果進行研究的結果。
圖16表示對半乳凝素9突變體(Gal-9=G9NC(null))在FITC誘導特應性皮炎模型中的效果進行研究的結果。
圖17表示對半乳凝素9突變體(Gal-9=G9NC(null))對于蕁麻疹模型的效果進行研究的結果。
圖18表示對半乳凝素9突變體(Gal-9=G9NC(null))對于蕁麻疹模型的效果進行研究的結果。
圖19表示對半乳凝素9突變體(h-gal9NC(null))對于關節炎模型的效果進行研究的結果。
圖20表示半乳凝素9突變體在皮下移植模型中的抑制腫瘤細胞增殖效果、即表示抗腫瘤活性(抗癌效果)測定的結果。上段為對照組,下段為半乳凝素9突變體注入組(直至5周什么樣的腫瘤都沒可見)。
圖21是半乳凝素9突變體在皮下移植模型中的抑制腫瘤細胞增殖效果、即表示抗腫瘤活性(抗癌效果)測定的結果,給出了組織病理解析的組織照片。表示給予LLC+半乳凝素9突變體(Gal9)(下段)時5周的皮膚。肉眼看為白色調。
圖22表示半乳凝素9突變體(穩定化半乳凝素9)在培養腫瘤細胞(Meth A細胞,24h)中誘導凋亡(細胞損傷活性)的結果。
圖23表示半乳凝素9突變體(穩定化半乳凝素9)在培養腫瘤細胞(B16/F10細胞,24h)中誘導凋亡(細胞損傷活性)的結果。
圖24是動物的存活曲線,表示在由Meth A細胞引起的癌性腹膜炎模型中,半乳凝素9突變體具有抗腫瘤效果。
圖25表示在由Meth A細胞引起的癌性腹膜炎模型中,未給予半乳凝素9突變體(Gal9)組(上段)給予組(下段)中小鼠的狀態的照片。
圖26為動物的生存曲線,表示在由B16/F10細胞引起的癌性腹膜炎模型中半乳凝素9突變體具有抗腫瘤效果。
圖27對比半乳凝素9突變體(Gal-9)給予組と非給予組中由B16/F10細胞(黑素瘤)引起的癌性腹膜炎模型小鼠的狀態,內臟組織(第14天)的照片。
圖28表示研究半乳凝素9突變體(穩定化半乳凝素9)影響免疫細胞的結果。是B16/F10腹腔內浸潤細胞(24h)的解析結果。
圖29表示使用半乳凝素9突變體(穩定化半乳凝素9)進行的抑制粘附實驗的結果。是B16/F10細胞(1h)的解析結果。圖中、Collagentype I表示I型膠原、Collagen type IV表示IV型膠原、Laminin表示層粘連蛋白、Fibronectin表示纖連蛋白、Vitronectin表示玻連蛋白。
圖30表示對半乳凝素9突變體(Gal-9)和地塞米松(Dex.)在壁虱抗原誘發哮喘模型中的作用效果進行測定的結果。
圖31表示對半乳凝素9突變體(Gal-9)和地塞米松(Dex.)在壁虱抗原誘發哮喘模型中的作用效果進行測定的結果。給出了存在于BALF中的各細胞數。
圖32表示對半乳凝素9突變體(Gal-9)在壁虱抗原誘發哮喘模型中的作用效果進行測定的結果(支氣管周圍組織的照片)。
圖33表示對半乳凝素9突變體(Gal-9)和地塞米松(Dex.)在OVA誘發哮喘模型(小鼠)中的作用效果進行測定的結果。
圖34表示對半乳凝素9突變體(Gal-9)和地塞米松(Dex.)在OVA誘發哮喘模型(小鼠)中的作用效果進行測定的結果。給出了存在于BALF中的各細胞數。
圖35表示對半乳凝素9突變體(Gal-9)影響OVA誘發哮喘模型(豚鼠)中的即時型哮喘(IAR)·延遲型哮喘(LAR)的作用。
圖36表示對半乳凝素9突變體(Gal-9)在OVA誘發哮喘模型(豚鼠)中的作用效果進行測定的結果。給出了存在于BALF中的各細胞數。。
圖37表示對半乳凝素9突變體(Gal-9)在自身免疫性溶血性貧血模型(小鼠)中的作用效果進行測定的結果(血細胞比容(%))。
圖38表示對半乳凝素9突變體(Gal-9)和地塞米松(Dex.)在阿蒂斯(Arthus)反應(血管炎)模型(小鼠)中的作用效果進行測定的結果。
圖39表示對半乳凝素9突變體(Gal-9)和地塞米松(Dex.)在ARDS模型(小鼠)中的作用效果進行測定的結果。
圖40表示對半乳凝素9突變體(Gal-9)和地塞米松(Dex.)在ARDS模型(小鼠)中的作用效果進行測定的結果。給出了存在于BALF中的各細胞數。
圖41表示對半乳凝素9突變體(Gal-9)在辣椒辣素誘導炎癥模型中的作用效果進行測定的結果。
圖42表示對半乳凝素9突變體(Gal-9)影響破骨細胞形成的效果進行試驗的結果。表明有抑制效果。
圖43表示對通過半乳凝素9突變體(gal-9)刺激產生的單細胞的凋亡誘導(M-CSF存在下)進行試驗的結果。
圖44表示對通過半乳凝素9突變體(gal-9)刺激對人成骨細胞增殖影響的效果進行試驗的結果。
圖45表示對通過半乳凝素9突變體(Galectin-9)刺激(8hr)影響人成骨細胞分化標志的表達的效果進行試驗的結果。
圖46表示存活率,對半乳凝素9突變體對間質性肺炎模型的作用進行試驗的結果。
圖47表示對半乳凝素9突變體對間質性肺炎模型的作用進行試驗的結果。給出了存活14天例的肺組織(HE染色、照片)。
圖48是動物的生存曲線,表示在LLC細胞(凋亡(+))導致的癌性腹膜炎模型中,半乳凝素9突變體具有抗腫瘤效果。
圖49表示使用B16/F10細胞,研究半乳凝素9突變體對癌轉移模型的作用的結果(模型動物的肺外觀)。
圖50表示使用B16/F10細胞,研究半乳凝素9突變體(G9NC(null))對癌轉移模型的作用的結果(對肺的結節數進行計數的結果)。
圖51表示對半乳凝素9突變體(gal-9)(靜脈內(i.v.)注射)在角叉菜膠誘發炎癥模型中的作用效果進行測定的結果。
圖52為了比較給出了對作為陽性對照的地塞米松(Dex.)在角叉菜膠誘發炎癥模型中的作用效果進行測定的結果。
圖53表示使用免疫組織染色對半乳凝素在風濕病(RA)關節滑膜中的表達進行研究的結果。
圖54表示對半乳凝素對風濕病(RA)滑膜細胞凋亡的誘導活性進行研究的光學顯微鏡觀察的結果。
圖55表示用PI法對半乳凝素對風濕病(RA)滑膜細胞凋亡的誘導活性進行研究的結果。
圖56表示對半乳凝素對風濕病(RA)滑膜細胞凋亡的誘導活性進行研究的結果。
圖57表示對半乳凝素對風濕病(RA)滑膜細胞增殖的抑制活性進行研究的結果。
圖58表示對半乳凝素-9突變體在佐劑性關節炎模型中的作用(抑制由于機械刺激引起的疼痛)進行研究的結果。
圖59為了比較給出了在佐劑性關節炎模型中的作用(抑制由于機械刺激引起的疼痛)進行研究的結果(作為陽性對照的吲哚美辛的作用)。
圖60表示對半乳凝素-9突變體在角叉菜膠誘發急性炎癥模型中的作用(抑制機械刺激產生的疼痛)進行研究的結果。
圖61為了比較給出了在角叉菜膠誘發急性炎癥模型中的作用(抑制由于機械刺激引起的疼痛)進行研究的結果(作為陽性對照的地塞米松的作用)。
圖62表示對半乳凝素-9突變體在人關節液中的穩定性進行研究的結果(SDS-PAGE)。
圖63表示對半乳凝素-9突變體(穩定化半乳凝素-9)在關節炎模型(抗體混合物引起的模型)中的作用進行研究的結果(i.v.注入)。
圖64表示半乳凝素-9突變體(穩定化半乳凝素-9)在關節炎模型(膠原關節炎模型)中的作用進行研究的結果(i.p.注入)。
圖65表示半乳凝素-9突變體(穩定化半乳凝素-9)在關節炎模型(膠原關節炎模型)中的作用進行研究的結果(i.v.注入)。
圖66表示半乳凝素-9突變體(穩定化半乳凝素-9)在關節炎模型中的作用進行研究的結果(i.v.注入)。
圖67為了比較給出了對在佐劑性關節炎模型中的作用進行研究的結果(陽性對照的吲哚美辛的作用)。
圖68表示對半乳凝素-9突變體在大鼠CIA(膠原致敏)模型中的作用進行研究的結果(i.v.注入)。
具體實施方式
參考到目前為止公開發表的研究和相關的專利申請,其內容都包括在本說明書的內容中。
所謂「半乳凝素9突變體」指的是提供對半乳凝素9的糖鏈識別部位含有的特定糖鏈特異結合的活性或與此類似的活性(本活性中包括定性的活性和/或定量的活性)的物質。半乳凝素9對特定細胞具有凋亡誘導活性,而本半乳凝素9突變體可以是具有野生型半乳凝素9具有的凋亡誘導活性或具有與它類似的活性的突變體,也可以是半乳凝素9具有的生物活性被改變或修飾的突變體,對于某些場合更理想。所謂本發明中特別理想的半乳凝素9突變體指的是作為具有生物活性的試藥,在臨床檢查領域、分析領域、或醫學或藥物等領域中,表現出比野生型半乳凝素9更好的性質。
半乳凝素9突變體,例如可以是半乳凝素9或基本上具有與半乳凝素9同等活性的蛋白質的連接肽或其附近區域被改變的蛋白質或其鹽、由在半乳凝素9或基本上具有與半乳凝素9同等活性的蛋白質的連接肽或其附近區域的氨基酸序列中缺失、取代或添加1個或1個以上的氨基酸的氨基酸序列構成,與半乳凝素9比較,實施了至少對于連接肽的分解敏感性被改變的改變的蛋白質或其鹽、可以是基本上具有與半乳凝素9同等活性的蛋白質,而且與半乳凝素9的氨基酸序列具有至少70%以上的同源性、或至少75%以上的同源性、或至少80%以上的同源性、或至少85%以上的同源性、或至少90%以上的同源性、或至少95%以上的同源性的蛋白質或其鹽、也可以是(1)半乳凝素9的N末端側的糖鏈識別領域(NCRD)或與其具有基本上同等活性的多肽與(2)具有半乳凝素9的C末端側的糖鏈識別區域(CCRD)或與該區域具有基本上同等活性的多肽借助于(3)半在乳凝集素9的連接肽的氨基酸序列中缺失、取代或添加的1個或1個以上的氨基酸的氨基酸序列構成的改變連接肽連接的蛋白質或其鹽等。
可是,半乳凝素9是在J.Biol.Chem.,272(10):pp.6416-6422(1997)報告中在由惡性淋巴肉芽腫病患者的脾臟制備的cDNA中發現了新的半乳凝素,將該半乳凝素取名為半乳凝素9,同時為了避開惡性淋巴肉芽腫病腫瘤中的序列變異,通過正常人的外周血調制的cDNA進行了序列的再確認,最終決定了半乳凝素9的序列,該序列表示在該文獻的第6418頁的FIG.1。另外關于半乳凝素9進一步在J.Biol.Chem.,273(27):pp.16976-16984(1998)中報道了從由生產嗜酸性細胞趨化因子的T細胞株、STO-2制備的cDNA分離了趨化因子Ecalectin(ecalectin),該因子雖然與先前報告的上述半乳凝素9的同源性高,可是在氨基酸序列位置中看到第5,88,135,238,281位的氨基酸不同,ecalectin序列記載在該文獻的第16983頁的Fig.8,而且進一步推測ecalectin為半乳凝素9的變異體。
另外在J.Biol.Chem.,275(12):pp.8355-8360(2000)中報道了從由Jurkat T-cell制備的cDNA分離半乳凝素9,制作重組(重組)蛋白質,由于該半乳凝素9重組蛋白質表現出嗜酸性細胞趨化活性,所以平島等人決定將帶有來自于Jurkat T-cell的序列的半乳凝素9在今后研究中使用,其中在氨基酸序列位置中的第5,88,135,238,281位的氨基酸分別適用Gly,Lys,Ser,Pro,Glu,上述的松本等人(J.Biol.Chem.,273(27):pp.16976-16984(1998))報告的ecalectin雖然第5位的氨基酸在Ser和Gly這一點上不同,但在嗜酸性細胞趨化活性上沒有差異,另外,即使對17個登錄在EST數據庫的半乳凝素9的序列(包括部分序列)進行查詢,認為對于第5,88,135,238,281位的氨基酸分別適用Gly,Lys,Ser,Pro,Glu妥當,半乳凝素9的變異被記載在該文獻的第8359頁的Table II(參照圖8)。圖8中,Gly(G),Lys(K),Ser(S),Pro(P),Glu(E)。
在J.Biol.Chem.,272(9):pp.6078-6086(1997)(非專利文獻3)中根據氨基酸序列的類似性決定了2個糖識別部位(CRD)和連接它們的連接區的26個氨基酸(對于半乳凝素9M型)(參照同文獻的Fig.1)。即從序列5所示的氨基酸序列看,確定C端側的糖鏈識別域(CCRD)從Met175開始。然后基于此結果,人半乳凝素9的CRD和連接區被登錄在NCBI數據庫的Accession Number NP_033665。另外在J.Biol.Chem.,273(5):pp.2954-2960(1998)中給出了半乳凝素4和6的報告,其中與CRD的連接區的設定根據氨基酸序列、基因序列決定,這些序列如同文獻的第2956頁的Fig.2所示,但在將該設定反映在半乳凝素9中時,所謂前者(J.Biol.Chem.,272(9):pp.6079-6086(1997))的設定在連接區和C端側的CRD中是不同的。即從序列5所示的氨基酸序列看,CCRD應當從Phe195開始。
本發明者等研究組根據非專利文獻3中的設定在將由外顯子形成的剪接邊界存在于象處于Gln148-Pro149間、Ile160-Thr161間、Ser177-Thr178間那樣的3個氨基酸區間C端側考慮在內的同時,將有關C端側CRD的結合糖能力的研究,即在序列5所示的氨基酸序列看到,使從Thr178開始的全長CCRD表達時有結合乳糖能力,即使再削除6個氨基酸(從序列Met184開始的CCRD片段)、削除12氨基酸(從Ala190開始的CCRD片段),仍有結合乳糖能力,如果消除22氨基酸(從Leu200開始的CCRD片段),由于不能在大腸桿菌中表達,從序列5所示的氨基酸序列看,能夠考察到CCRD從Phe195開始的設定更嚴謹也一并考慮在內,作為C端側的CRD定為序列5所示的氨基酸序列Thr178~Thr323的序列。有關半乳凝素9的N端側CRD(NCRD),在序列5所示的氨基酸序列看到,使直至Gln148的全長NCRD表達時有結合乳糖能力,如果消除9個氨基酸(序列Met1~Ser139的NCRD片段),雖然蛋白質能表達,但由于結合乳糖能力消失,所以作為N端側的CRD定為序列5所示氨基酸序列中的Met1~Gln148序列。
在理想的方式中,半乳凝素9突變體是例如(1)具有在作為半乳凝素9的NCRD如序列2所示的氨基酸序列或其序列中缺失、取代或添加1個或1個以上的氨基酸的序列、或對序列2所示的氨基酸序列具有至少70%以上的同源性、或至少75%以上的同源性、或至少80%以上的同源性、或至少85%以上的同源性、或至少90%以上的同源性、或至少95%以上的同源性的氨基酸序列,而且具有結合乳糖能力的突變體、(2)具有作為半乳凝素9的CCRD入序列3所示的氨基酸序列或在序列中缺失、取代或添加1個或1個以上氨基酸的突變體、或對序列3所示的氨基酸序列具有至少70%以上的同源性、或至少75%以上的同源性、或至少80%以上的同源性、或至少85%以上的同源性、或至少90%以上的同源性、或至少95%以上的同源性的氨基酸序列,且具有結合乳糖能力的突變體、(3)具有作為結合上述(1)和(2)的連接區如序列9所示的氨基酸序列或在該序列中缺失、取代或添加1個或1個以上氨基酸的突變體、優選對于基質金屬蛋白水解酶等蛋白質分解酶比天然的半乳凝素9穩定的突變體。作為該連接區(3),包括序列9所示的氨基酸序列中的氨基酸殘基缺失1個以上(例如、1~2個、優選3~4個、更優選5~6個、更優選7~8個、特別優選1~9個等)的缺失類似體、該氨基酸殘基的1個以上(例如、1~9個、優選1~8個、更優選1~6個、更優選1~4個、特別優選1~2個等)被其它殘基置換的置換類似體、附加1個以上(例如、1~60個、優選1~40個、更優選1~20個、更優選1~10個、特別優選1~5個等)的氨基酸殘基(但是,序列7和8所示的氨基酸序列中除去了序列9所示氨基酸序列后的部分表示的序列除外)的付加類似體。作為代表性的該連接區(3),如序列9所示的氨基酸序列被HM,RIP,或任意的2氨基酸序列置換的連接區等。氨基酸的置換、缺失、或插入可以是不使多肽的生理特性或化學特性發生大變化的改變,有時可以給出理想的變化。作為該氨基酸序列中的氨基酸的置換體,可以從該氨基酸所屬的類中的其它氨基酸類選擇。例如、作為非極性(疏水性)氨基酸,如丙氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、脯氨酸、色氨酸、蛋氨酸等、作為極性(中性)氨基酸,如甘氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺等,作為帶有正電荷的氨基酸(堿性氨基酸),如精氨酸、賴氨酸、組氨酸等,作為帶有負電荷的氨基酸(酸性氨基酸),如天冬氨酸、谷氨酸等。
而作為該連接區(3),如對序列7或8所示的氨基酸序列除去序列9所示的氨基酸序列部分,用HM,RIP,或任意的2氨基酸序列置換的序列,在序列7或8所示的氨基酸序列中除去序列9所示氨基酸序列部分,剩下其中的6氨基酸,將其它的殘基削除后的序列等。另外作為該連接區(3),也包括序列7或8所示的氨基酸序列中的氨基酸殘基(但是,除去例如序列9所示的氨基酸序列部分,或序列7的場合可以除去序列8所示的氨基酸序列部分)缺失1個以上(例如1~5個、優選3~10個、更優選5~15個、更優選7~20個、特別優選1~32個等)的缺失類似體、1個以上的該氨基酸殘基(例如1~9個、優選1~8個、更優選1~6個、更優選1~4個、特別優選1~2個等)被其它殘基置換的置換類似體、附加1個以上(例如1~60個、優選1~40個、更優選1~20個、更優選1~10個、特別優選1~5個等)的氨基酸殘基(但是,序列7和8所示的氨基酸序列中除去了序列9所示氨基酸序列后的部分表示的序列除外)的付加類似體。
如果能維持作為天然的人半乳凝素9蛋白質的特征的結構域結構或糖結合能力,上述那樣的變異體都包含在本發明中。另外認為本發明的肽或多肽也可以包含具有與天然人半乳凝素9蛋白質基本上同等的一級結構構象或其一部分肽或多肽,而且還可以包含具有與天然的基本上同等生物學活性的肽或多肽?;箍梢允翹烊徊囊恢直湟焯?。本發明的來自人的蛋白質(或肽或多肽)例如與選自WO 02/37114 A1的序列表中SEQ ID NO:1~3的氨基酸序列有60%、由于場合不同,可以具有70%更高的同源性蛋白質,更優選具有80%或90%以上的相同氨基酸序列的蛋白質。所謂本發明的來自人的蛋白質的一部分是來自該人的蛋白質的一部分的肽(即該蛋白質的部分肽),只要是與本發明的半乳凝素9蛋白質具有基本上同等活性的蛋白質,可以為任一種蛋白質。例如、該本發明的蛋白質的部分肽具有該人半乳凝素9的構成氨基酸序列中至少5個以上、優選20個以上、更優選50個以上、更優選70個以上、最好優選100個以上、有時200個以上氨基酸殘基的氨基酸序列的肽,最好是這些肽是對應于連續的氨基酸殘基的肽,或例如就相對于該WO 02/37114 A1的序列表SEQ ID NO:1~3中任一項表示的氨基酸序列中對應的區域的同源性來說,具有與上述同樣的同源性的肽。
在本說明書中所謂「基本上同等」指的是蛋白質的活性、例如、所定的傷害細胞活性、誘發凋亡活性、抗炎癥活性、抗變態性活性、免疫調節活性、糖鏈結合活性、生理活性、生物學活性基本上相同。另外該用語的意思中可以包括具有基本上同質的活性的場合,作為基本上同質的活性,如結合活性、傷害細胞活性、誘發凋亡活性等。所謂基本上同質的活性表示它們的活性從性質上講是同質,例如在生理上、藥理學上、或生物學上同質。例如、結合活性、傷害細胞活性、誘發凋亡活性等活性雖然最好是同等(例如、約0.001~約1000倍、優選約0.01~約100倍、更優選約0.1~約20倍、更優選約0.5~約2倍),但這些活性的程度、蛋白質的分子量等量的要素也可以不同。
所謂「半乳凝素9突變體多肽」包括野生型半乳凝素9的天然序列的突變體、其衍生物、類似體(類似物)、片段、嵌合體、以及變異體。該多肽包括意圖能夠在宿主細胞表達,且通過設計成能夠編碼特定的半乳凝素9突變體多肽的重組產生的聚核苷酸序列編碼的多肽。
所謂「半乳凝素9突變體治療劑」指的是來自編碼半乳凝素9突變體的聚核苷酸(半乳凝素9突變體聚核苷酸)或半乳凝素9突變體多肽序列的分子、包含這樣的半乳凝素9突變體的聚核苷酸或多肽的突變體、變異體、類似體、嵌合體、片段等中的至少一個。所謂作為聚核苷酸的半乳凝素9突變體治療劑,一般來說是編碼半乳凝素9突變體多肽的序列,而且包括在宿主細胞中通過重組技術可表達的。另外,半乳凝素9突變體治療劑可以是半乳凝素9活性的激動劑。其它的半乳凝素9突變體治療劑,可以包括供給半乳凝素9突變體的治療劑,具有半乳凝素9突變體有的活性,而且產生對與半乳凝素9活性缺乏或不足有關的疾患·疾病·異常癥狀有予防和/或治療效果的半乳凝素9活性的調節劑。作為半乳凝素9活性的調節劑,例如聚核苷酸、多肽、或低分子。
本說明書中使用的用語「診斷劑」指的是在本發明的診斷使用一種或一種以上的對該診斷行為有用的那樣的任意藥劑。這些藥劑在診斷中的使用可以包括用于決定半乳凝素9產生細胞的存在的方法或用于決定提示半乳凝素9結合性物質的細胞的存在的方法的使用。作為診斷劑,例如含有選自編碼半乳凝素9突變體突變蛋白質的DNA、穩定化半乳凝素9突變體突變蛋白質、以及含有該穩定化半乳凝素9突變體突變蛋白質的細胞或細胞勻漿液中的成分。
本說明書中使用的用語「治療劑」可以是在本發明的治療中使用的一種或一種以上的達到或對達到其治療行為有用的任意藥劑。例如、治療劑是被設計為能夠表達半乳凝素9突變體多肽的聚核苷酸,該藥劑是在給予哺乳動物后,然后能夠在細胞中表達的聚核苷酸。此時藥劑的活性形式是被表達的多肽。
半乳凝素9突變體治療劑是具有半乳凝素9突變體生物活性的治療劑、或比天然的半乳凝素9突變體更長,對特定糖鏈具有結合的活性的多肽、編碼對基質金屬蛋白水解酶等蛋白質分解酶比天然的半乳凝素9更穩定的半乳凝素9突變體多肽的聚核苷酸那樣的來自半乳凝素9突變體的治療劑。該治療劑單獨、或與其它藥劑(例如、與半乳凝素9突變體的給予一起使用的,且對特定的腫瘤或自身免疫等的在其它眾所周知的治療法中使用的那樣藥物、或在哺乳動物中容易進行半乳凝素9突變體的表達那樣的基因遞送載體等)配合達到其治療目的。例如、該治療劑可以是包括為其它目的開發的半乳凝素9突變體治療劑,以及半乳凝素9的激動劑、對半乳凝素9活性進行修飾或調節的藥物,例如有機低分子化合物或物質、肽、肽樣化合物或物質、編碼半乳凝素9突變體多肽的聚核苷酸、半乳凝素9突變體多肽、表達對蛋白水解酶比天然的半乳凝素9更穩定的半乳凝素9突變體的嵌合體或變異體等,且被轉化的細胞。
本說明書中所謂的「配合治療劑」指的是一起給予時,產生它們各自效果的含有幾個成分或幾個藥劑的治療組成物,配合治療劑也指為了治療疾患等一起給予時產生相乗效果那樣的制劑。最好是通過配合治療劑中的幾個成分或幾個藥劑的各自作用得到的其它各種作用效果,為了能夠獲得更大的治療效果、例如腫瘤的消失或正?;?、從自身免疫疾患回復和獲得長期生存,可以使這些成分組合。作為給予配合治療劑后得到的效果的例子,如在短期的癥狀回復和長期給予后得到的癥狀的回復的組合,或使對患者中的特定型的各個細胞的自身免疫應答減少那樣的效果的組合。作為本發明的配合治療劑的例子,如用于給予含有編碼半乳凝素9突變體的聚核苷酸與編碼IFN類,IL-2等細胞因子類中的至少一個的聚核苷酸的基因遞送載體的配合治療劑等。其它的例子也可以使用2個基因遞送載體,例如、一個表達半乳凝素9突變體,另一個用于表達細胞因子類中至少一個。另外,為了預測給予半乳凝素9突變體在靶細胞中誘導凋亡,進行正調節,也可以給予表達IFN類,IL-2等、或IFN-γ等的基因遞送載體。各種治療劑也可以同時供給,例如、為了提高治療效率,根據需要,可以重復給予各個藥劑中的1個或全部,也可以加入到同一藥學上容許的載體中給予。
「基因遞送載體」指的是能夠使用于多肽在細胞中表達的編碼序列遞送給細胞變得容易進行那樣的成分。該細胞為了能夠適于體內基因治療也可以存在于哺乳動物的體內,為了能夠適于體外基因治療進行轉染處理,也可以暫時從哺乳動物中取出,使得多肽表達后再返回到哺乳動物?;虻菟馱靨蹇梢允悄芄煌瓿上螄赴菟突蚰茄娜我獬煞只蛟靨?,例如、可以是脂質體、粒子、載體等。作為基因遞送載體,重組載體(例如、重組病毒載體)、核酸載體(例如、質粒)、裸核酸分子(例如、基因)、和作為中和核酸分子上的負電荷,且將核酸分子折疊的分子能夠凝集那樣的多陽離子分子復合體化的核酸分子、與脂質體結合的核酸(美國專利第5,166,320號說明書;第5,547,932號說明書;Wang et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,84:7851,1987)等。該基因遞送載體可以包括象生產細胞那樣的特定的真核生物細胞,這些載體是能夠向宿主細胞遞送具有生物學的1個以上所期望的特性的核酸分子的載體。所期望的特性就像以下議論的那樣,例如、可以包括表達蛋白質、酶、或抗體等那樣的所期望物質的能力和/或提供生物學活性的能力。即、通過基因遞送載體轉運的核酸分子不需要表達所期望的物質,其本身就是活性的藥劑。這樣的生物學活性的一個例子是可在基因治療中看到的例子。就基因治療來說,是對某種基因進行鈍化,阻斷該基因指示的產物的生產,整合到被遞送的核酸分子能夠特異表達的基因中?;虻菟馱靨逯傅氖俏聳溝?個或多個目的序列或基因表達能夠進行指示的集合體(組件)。
基因遞送載體一般來說包含啟動子成份,而且可以包含指示多聚腺苷化的信號。另外,基因遞送載體還可以與在轉錄時能夠運作那樣與1個或多個目的序列或基因連接,含有作為翻譯起始序列起作用的序列。另外基因遞送載體還可以含有Neo、SV2Neo、TK、潮霉素、博萊霉素(腐草霉素)、螺旋霉素、組氨醇、DHFR等那樣可選擇標志、1個以上的制限酶部位和翻譯終止序列。在本發明中能夠使用的場合,基因遞送載體可以包括病毒載體(Jolly,Cancer Gen.Therapy,1:51-64,1994)、核酸載體、裸DNA、脂質體DNA、粘粒、細菌、特定的真核生物細胞(包含生產細胞;參照美國專利第6,333,195號說明書)那樣的重組載體。
所謂「生物學的活性」在表示保持特異活性的分子場合下使用。例如、具有生物活性的半乳凝素9突變體多肽對含有半乳凝素9的糖鏈識別部位的特定糖鏈特異結合的活性或與它具有基本上同等性質的活性,且對基質金屬蛋白水解酶等蛋白質分解酶比天然的半乳凝素9定性和/或定量保持穩定的能力,例如表現出對導致半乳凝素9含有的抗腫瘤活性或凋亡的凋亡途徑進行活化的活性。
本說明書中使用的用語「核酸分子」或「聚核苷酸」指的是編碼特定氨基酸序列或編碼其互補鏈的RNA或DNA、以及DNA:RNA雜交體等分子。本說明書中使用的「編碼序列」指的是編碼特定氨基酸序列或編碼其互補鏈的RNA或DNA、以及DNA:RNA雜交體等中的任一種。聚核苷酸例如可以包括反義寡核苷酸、或核酶,另外也可以包括基因的3′或5′非翻譯區那樣的序列、基因的內含子、不構成基因的編碼區域的基因的其它區域。DNA或RNA可以是單鏈或雙鏈。在合成核酸或合成聚核苷酸中,也包括含有化學合成核酸序列的序列,以及為了賦予分子對變性的抵抗性預先從化學上進行的部分改變。聚核苷酸可以通過例如聚合酶鏈式反應(PCR)擴增、使用互補的DNA或RNA的重組表達等制造,或通過化學合成生成。
本說明書中用語「表達調控序列」或「調節序列」指的是包括影響編碼多肽的基因的表達,包括影響用于轉錄和翻譯的信號表達的那樣一個或一個以上的成分,且在該領域可使用的序列。適于本發明的多肽表達的表達調控序列因可表達多肽的宿主系不同而有所不同。
作為本發明的「多肽」,只要是包含半乳凝素9突變體多肽,可以是任何多肽,如含有成熟蛋白質的半乳凝素9突變體蛋白質的任意部分,以及其縮短型、突變體、對立基因體、類似物、衍生物等。作為突變體,可以是由與關聯蛋白質同一基因表達的剪接后突變體衍生的。另外只要沒有特別指示,這樣的多肽例如可以是具有對特定糖鏈具有特異結合的親和結合性或對特異對象的結合活性等該半乳凝素9蛋白質具有的生物活性中的一個或一個以上生物活性的多肽。本「多肽」用語并不限定于特定長度的基因產物。不管是來自人的或來自人以外的供給源的,至于半乳凝素9的N末端側糖鏈識別部位(NCRD)以及C末端側糖鏈識別部位(CCRD)與靶蛋白質或成熟蛋白質同一的,或至少具有60%、優選70%、更優選80%、和最好優選90%、進一步優選95%的同源性的多肽都包括在本多肽的這個定義內。因此可以包括基于對立基因的突變體、以及包括氨基酸的置換、缺失、或插入在內的基因產物的突變體。氨基酸的置換可以是氨基酸的保守性置換、或對糖基化部位、磷酸化部位、乙?;課壞冉懈謀淠茄陌被嶂沒?、對功能不需要的半胱氨酸殘基的位置進行改變后,改變了折疊形式的置換、以及除去非必需氨基酸殘基那樣的置換。作為氨基酸的保守性置換一般來說是保存電荷、疏水性/親水性、和/或被置換的氨基酸的立體尺寸(大小)那樣的置換,例如、Gly/Ala、Val/Ile/Leu、Asp/Glu、Lys/Arg、Asn/GIn、Ser/Cys/Thr、和Phe/Trp/Tyr等組的成員之間的置換是保守性的置換。
所謂類似物是具有靶蛋白質樣活性的物質,作為肽樣物質如含有一個或一個以上被廣泛了解的肽模仿物質的肽等。在本定義中,包括例如含有一個或一個以上氨基酸的類似物(例如、含有非天然型氨基酸等)的多肽、含有被置換的連結部的多肽、天然存在的那樣的變異和天然不存在的那樣變異的該技術領域中眾所周知的那樣的其它改變·修飾。
本說明書中用語「多肽」是多肽表達后被改變的多肽,例如進行了糖基化、乙?;?、磷酸化、肉豆蔻?;?。
本說明書中用語「裸DNA」指的是為了在哺乳動物中表達給予哺乳動物的聚核苷酸DNA。作為聚核苷酸,例如可以是編碼序列,聚核苷酸DNA一旦DNA進入細胞內,為了使編碼序列容易表達可以直接或間接地與表達調控序列的序列結合。所謂間接結合目的是使DNA在哺乳動物細胞中容易表達,為了使調節領域和編碼序列進行結合,或使整合其它序列容易,借助于接頭或間隔片段將兩個聚核苷酸領域結合在一起。
本說明書中的「載體」指的是可以指示1或多個目的序列或基因表達的集合體(組件)。載體必須任意含有轉錄啟動子/增強子、規定1或多個基因座的成份、以及控制對可變剪接、核RNA輸送、信使翻譯后進行的修飾、或蛋白質的轉錄后進行的修飾等過程進行指示或調控的其它基因表達的其它成份。
另外載體必須在被轉錄時,含有與一個或一個以上的目的序列或基因可操作連接、而且作為翻譯起始序列起作用的那樣序列。根據需要,載體可以含有指示多聚腺苷化的信號、Neo、TK、潮霉素、博萊霉素(腐草霉素)、組氨醇、DHFR等那樣的選擇標志、一個或一個以上的限制性部位和翻譯終止序列。另外當載體配置在逆病毒中時,載體必須含有包裝信號、長末端反復序列(LTR)、而如果沒有這些序列,必須含有適合使用的逆病毒的正鏈和負鏈的引物結合部位。
所謂「組織特異的啟動子」指的是在被限定的一些組織型或細胞型中具有優先活性那樣的啟動子,規定轉錄啟動子/增強子或基因座的成份、或象上述那樣控制基因表達的其它成份。作為這樣的組織特異的啟動子的代表例,例如PEPCK啟動子、HER2/neu啟動子、酪蛋白啟動子、IgG啟動子、絨毛性胚抗原啟動子、彈性蛋白酶啟動子、膽色素原脫氨基酶啟動子、胰島素啟動子、成長激素因子啟動子、酪氨酸羥化酶啟動子、白蛋白啟動子、α胎球蛋白啟動子、乙酰膽堿受體啟動子、醇脫氫酶啟動子、α或β珠蛋白啟動子、T細胞受體啟動子、骨鈣素啟動子等。
所謂「事件特異的啟動子」指的是是規定轉錄啟動子/增強子或基因座的成份、或象上述那樣控制基因表達的其它成份,而且它們的轉錄活性指的是當對細胞性刺激應答時進行變化那樣的活性。作為這樣的事象特異的啟動子的代表例,如胸腺嘧啶脫氧核苷激酶或胸苷酸合成酶啟動子、α或β干擾素啟動子、以及對于激素(天然激素、合成激素、或來自其它非宿主生物的任一種激素,例如昆蟲激素等)的存在進行應答的啟動子等。
用語「融合蛋白質」或「融合多肽」指的是使用能夠發生一個以上的蛋白質或含有一個以上的蛋白質部分的1個多肽表達那樣的載體表達產生的,而且使載體或連續的結合中的一個以上的異種編碼序列重組表達后得到的蛋白質或多肽。融合蛋白質最好是帶有保持來自構建它使用的蛋白質或多肽具有的至少一個生物學活性的多肽單位,最好是包括通過使不同蛋白質的部分組合,形成信號多肽,使相乗改良的生物學活性產生的融合蛋白或融合多肽。作為生成的融合蛋白質,如有表達時具有功能的多肽,有表達時沒有功能的肽。作為表達時沒有功能的肽,最好是如為了表達具有活性的多肽時起作用的肽。作為本發明中有用的融合蛋白質的例子,如從用于治療或用于檢測或測定,以及用于進一步分析或分離和純化的利用觀點考慮具有幾個優點的經基因操作的任意半乳凝素9突變體融合多肽。
用語「嵌合」或「嵌合蛋白質」可以認為含有與融合蛋白質或融合多肽等價的意思?!蓋逗戲腫印箍梢允僑諍隙嚯?、或編碼融合多肽的聚核苷酸融合分子。嵌合由可連結的DNA編碼序列構建,然后通過細胞系表達,或通過載體給予,在動物中可以進行體內表達。例如、含有半乳凝素9突變體的嵌合或融合蛋白質可以在體內或體外通過基因治療程序給予。
本說明書中所謂「患者」指的是在活的生物中可進行任意治療或予防治療的個體,包括真核生物或原核生物,并不限定于這些。例如、作為患者的真核生物可以是脊椎動物或無脊椎動物。因此,例如、患者可以是魚、鳥、蠕蟲、昆蟲、哺乳動物、爬蟲類、兩棲類、菌類、植物,優選哺乳動物。作為哺乳動物,例如人。
以下對本發明的半乳凝素9突變體治療劑和/或診斷劑的一般的制造和使用法進行說明。在1種方式中,本發明提供對起因于半乳凝素9含有的生理活性或生物活性不足或欠缺的疾患·疾病·異常狀態進行治療的技術。作為該治療技術,例如提供半乳凝素9突變體治療劑的工程和/或給予有該疾患等的哺乳動物有效量的半乳凝素9突變體治療劑的工程等。半乳凝素9突變體由于能夠發揮對惡性腫瘤細胞的傷害細胞活性、對惡性腫瘤細胞的凋亡誘導活性、對惡性腫瘤細胞的抗腫瘤活性(抗癌活性)、活化T細胞的凋亡誘導活性、特別是CD4陽性T細胞的凋亡誘導活性、免疫調節活性、抗炎癥作用、抗變態性作用,所以預期可以作為抗腫瘤劑(抗癌劑)、抗變態性劑、免疫調節劑、自身免疫疾患用劑、抗炎癥劑和腎上腺皮質類固醇激素替代用劑。該治療技術包括對活化T細胞顯著的自身免疫疾患進行治療的方法。所謂「自身免疫疾患」和「自身免疫」都指的是哺乳動物中的由于自身免疫導致的特征性的損傷(這是對自身成分的免疫系的應答)。自身免疫應答是進展到表現出臨床征兆的癥狀的現象。嚴格來說,移植排斥并不是自身免疫反應,而是患者有時接受對有癥狀的細胞、組織、或器官進行置換或移植的外科手術時,接受同種移植的生物體對外來移植發生免疫學反應的現象。在由來自種的一個成員向其它種的細胞、組織、或器官的同種移植中,在受體(recipient)中當為了排斥被移植的細胞、組織、或器官發生充分的免疫應答時,發生「移植排斥」。
作為通過本發明的方法和治療劑能夠治療的「腫瘤」的例子,包括惡性腫瘤,例如進行轉移的腫瘤為惡性腫瘤,一般將惡性腫瘤分為上皮性和非上皮性的腫瘤,有時也區分為癌、肉瘤、白血病等來考慮,單稱為「癌」時,一般人大多指惡性腫瘤。在本說明書中所謂「癌」可以按照廣泛意思解釋,并不單解釋為上皮性的惡性腫瘤。在本說明書中所謂「癌」可以包含上皮性惡性腫瘤和非上皮性惡性腫瘤(既包含腫瘤形成性的腫瘤,也包含非形成性的腫瘤),如皮膚癌(也包含黑素瘤)、乳腺癌、卵巢癌、子宮癌、睪丸惡性腫瘤、前列腺癌、膀胱癌、腎癌、甲狀腺癌、咽·喉頭癌、舌癌、上顎癌、食道癌、胃癌、大腸·直腸癌、肺·支氣管癌、肝癌(包括肝細胞癌、肝內膽管癌)、肝外膽管·膽囊癌、胰贓癌、白血病、惡性淋巴瘤、漿細胞瘤、骨肉瘤、軟骨肉瘤、平滑肌肉瘤、橫紋肌肉瘤、脂肪肉瘤、纖維肉瘤、惡性血管瘤、惡性血管內皮瘤、腦腫瘤(包括腦膜瘤、神經膠質瘤、星形細胞瘤等)等,并不限定于這些,應當理解為通過使用本發明的半乳凝素9突變體獲得理想結果的腫瘤,還包括該半乳凝素9突變體參與后可獲得某種生理或生物學上應答的腫瘤。
作為通過本發明的方法和治療劑能夠治療的「自身免疫疾患」的例子,如多發性硬化癥、橋本甲狀腺炎、全身性紅斑狼瘡(SLE)、肺腎綜合征(Goodpasture)、天皰瘡、受體自身免疫、自身免疫溶血性貧血、自身免疫血小板減少性紫斑病、變形性關節癥、慢性關節炎風濕病、抗膠原抗體和強皮癥(schleroderma)、復合化結合組織病、多發性肌炎、惡性貧血、特發性艾迪生病、自發性不孕癥、絲球體腎炎、水皰性類天庖瘡、腎上腺素作用性藥物耐性、慢性活性肝炎、原發性膽汁性肝硬變、自身免疫基底的內分泌腺不全、白斑、脈管炎、心肌梗塞后遺癥(post-myocardial infarction)、心臟穿孔癥候群、蕁麻疹、特應性皮炎、自身免疫基底的哮喘、自身免疫基底的炎癥性反應、肉芽腫癥損傷、強直性(alkylizing)脊椎炎、鏈球菌感染后(poststreptococcal)的絲球體腎炎、自身免疫溶血性貧血、腦炎、對淋巴瘤的二次自身免疫反應、變性損傷、萎縮性損傷等。作為表示受體自身免疫的自身免疫疾患,例如格雷夫斯病、重癥肌無力癥、胰島素耐性癥等。作為腎上腺素性藥物耐性的自身免疫疾患,例如哮喘和囊胞性纖維癥等。
作為本發明中的其它自身免疫疾患,例如動物模型存在的疾患,例如肖格倫綜合征(自身免疫淚腺炎(dacryodentis)或免疫媒介唾液腺炎)、自身免疫心肌炎、原發性膽汁性肝硬變(PBC)、炎癥性心臟病、水銀誘導性腎自身免疫、胰島素依賴性糖尿病(I型糖尿病或IDD)、胸腺切除術后自身免疫、中樞神經系(CNS)脫髓鞘障礙、CNS狼瘡、睡眠發作、免疫媒介PNS障礙、變形性關節癥、慢性關節炎風濕病、葡萄膜炎、髓質囊胞性纖維癥、自身免疫溶血性疾患、自身免疫脈管炎、卵巢自身免疫疾患、強皮癥(scheroderma)等。作為由于中樞神經系(CNS)脫髓障害導致特征性自身免疫疾患,例如多發性硬化癥(MS)等。末梢神經系(PNS)自身免疫疾患例如格林-巴利綜合征(GBS)。
作為半乳凝素9突變體治療劑,如多肽、聚核苷酸、低分子有機化合物、肽、或肽樣化合物或物質等。而半乳凝素9突變體治療劑也包括編碼半乳凝素9突變體多肽、半乳凝素9突變體多肽的聚核苷酸、含有該半乳凝素9突變體多肽一部分的融合多肽、編碼含有該半乳凝素9突變體多肽一部分的融合多肽的聚核苷酸、半乳凝素9突變體多肽的生物活性肽衍生物、來自于半乳凝素9突變體多肽的生物活性肽樣化合物或物質、或具有半乳凝素9突變體活性,且模仿半乳凝素9突變體結構的低分子有機化合物(例如、激動劑)等。半乳凝素9突變體多肽可以是半乳凝素9突變體多肽突變體、半乳凝素9突變體多肽衍生物、變異的半乳凝素9突變體多肽、或縮短型半乳凝素9突變體多肽那樣的生物活性的半乳凝素9突變體多肽。編碼半乳凝素9突變體多肽的聚核苷酸也可以是編碼帶有半乳凝素9N端側CRD全長以及C端側CRD全長的突變體多肽的聚核苷酸序列、編碼半乳凝素9突變體多肽的生物活性部分的序列、編碼來自于半乳凝素9突變體多肽的生物活性肽的序列、編碼可溶性半乳凝素9突變體多肽的序列等。本發明另外實施方式是含有可以表達編碼半乳凝素9突變體多肽的聚核苷酸序列的基因遞送載體的組成物。
本發明中利用「基因重組技術」,構建和獲得所定核酸(聚核苷酸)或所定肽(多肽),另外可進行分離·序列決定,制作重組體。作為本說明書中可使用的基因重組技術(包括重組DNA技術),如該領域已知的技術,例如可以通過J.Sambrook,E.F.Fritsch & T.Maniatis,″Molecular Cloning:A Laboratory Manual(2nd edition)″,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NewYork(1989);D.M.Glover et al.ed.,″DNA Cloning″,2nd ed.,Vol.1 to 4,(The Practical Approach Series),IRL Press,OxfordUniversity Press(1995);日本生化學會編、「續生化學實驗講座1、基因研究法II」、東京化學同人(1986);日本生化學會編、「新生化學實驗講座2、核酸III(重組DNA技術)」、東京化學同人(1992);M.J.Gait(Ed),Oligonucleotide Synthesis,IRL Press(1984);B.D.Hames and S.J.Higgins(Ed),Nucleic Acid Hybridization,A Practical Approach,IRL Press Ltd.,Oxford,UK(1985);B.D.Hames and S.J.Higgins(Ed),Transcription and Translation:A Practical Approach(Practical Approach Series),IRL PressLtd.,Oxford,UK(1984);B.Perbal,A Practical Guide toMolecular Cloning(2nd Edition),John Wiley & Sons,New York(1988);J.H.Miller and M.P.Calos(Ed),Gene Transfer Vectorsfor Mammalian Cells,Cold Spring Harbor Laboratory,Cold SpringHarbor,New York(1987);R.J.Mayer and J.H.Walker(Ed),Immunochemical Methods in Cell and Molecular Biology,AcademicPress,(1987);R.K.Scopes et al.(Ed),Protein Purification:Principles and Practice(2nd Edition,1987 & 3rd Edition,1993),Springer-Verlag、N.Y.;D.M.Weir and C.C.Blackwell(Ed),Handbook of Experimental Immunology,Vol.1,2,3 and 4,Blackwell Scientific Publications,Oxford,(1986);L.A.Herzenberg et al.(Ed),Weir′s Handbook of ExperimentalImmunology,Vol.1,2,3 and 4,Blackwell Science Ltd.(1997);R.W.Ellis(Ed),Vaccines new approaches to immunologicalproblems,Butterworth-Heinemann,London(1992);R.Wu ed.,″Methods in Enzymology″,Vol.68(Recombinant DNA),AcademicPress,New York(1980);R.Wu et al.ed.,″Methods in Enzymology″,Vol.100(Recombinant DNA,Part B)& 101(Recombinant DNA,PartC),Academic Press,New York(1983);R.Wu et al.ed.,″Methodsin Enzymology″,Vol.153(Recombinant DNA,Part D),154(Recombinant DNA,Part E)& 155(Recombinant DNA,Part F),Academic Press,New York(1987);J.H.Miller ed.,″Methods inEnzymology″,Vol.204,Academic Press,New York(1991);R.Wuet al.ed.,″Methods in Enzymology″,Vol.218,Academic Press,New York(1993);S.Weissman(ed.),″Methods in Enzymology″,Vol.303,Academic Press,New York(1999);J.C.Glorioso etal.(ed.),″Methods in Enzymology″,Vol.306,Academic Press,New York(1999)等所述的方法或其中引用的文獻所述的方法或與它們基本上同樣的方法或改變法進行(這些方法中的記載由于參照也包括在本說明書的內容中)〔以下、將這些方法都稱之為「基因重組技術」)。
本說明書中,所謂「同源性」意味著在多肽序列(或氨基酸序列)或聚核苷酸序列(或堿基序列)中的2條鏈之間,構成該鏈的各個氨基酸殘基之間或各堿基之間的相互適合關系中能夠決定是同一那樣的氨基酸或堿基的量(數),指的是兩個聚核苷酸或多肽序列之間的序列相關性的程度。同源性可以容易算出。測定兩個聚核苷酸或多肽序列之間的同源性的方法已知有很多種,「同源性」(也稱為「同一性」)的用語對于同行眾所周知(例如、Lesk,A.M.(ed.),ComputationalMolecular Biologly,Oxford University Press,New York,(1988);Smith,D.W.(ed.),Biocomputing:Informatics and Genome Projects,Academic Press,New York(1993);rifin,M.& Grifin,H.G.ed.)omputer Analysis of Sequence Data:Part Ii,Human Press,NewJersey,(1994);von Heinje,G.,Sequence Analysis In MolecularBiology,Academic Press,New York,(1987);Gribskov,M.&Devereux,J.(Ed.),Sequence Analysis Primer,M-StocktonPress,New York,(1991)等)。測定兩個序列的同源性使用的一般方法如Martin,J.Bishop(Ed.),Guide to Huge Computers,AcademicPress,San Diego,(1994);Carillo,H.& Lipman,D.,SIAM J.AppliedMath.,48:1073(1988)等公布的方法,但并不限定于這些方法。作為用于測定同源性的理想方法,如為了獲得進行試驗的兩個序列間的最大的適合關系部分而設計的方法。這樣的方法如作為計算機程序建立的方法。作為測定兩個序列間同源性的理想的計算機程序法如GCG程序包(Devereux,J.et al.,Nucleic AcidsResearch,12(1):387(1984)0/BLASTP/BLASTN(Atschul,S.F.et al.,J.Mol.Biol,215:403(1990))等,但并不限定于這些方法,可以使用該領域中眾所周知的方法。
在本說明書中,所謂「聚合酶鏈式反應(polymerase chainreaction)」或「PCR」一般指的是美國專利第4,683,195號說明書等所述的那樣方法,例如指用于在體外通過酶對所期望的核苷酸序列進行擴增的方法。一般來說,PCR法是包括使用能夠優先與模板核酸進行雜交的2個寡核苷酸引物,反復進行引物延伸合成那樣的循環的方法。對于典型的PCR法中使用的引物可以使用對于模板內部應當可擴增的核苷酸序列互補的引物,例如,優選使用在與應當擴增的核苷酸序列的兩端互補、或與應當被擴增的核苷酸序列鄰接的引物。作為5’端的引物要按照至少含有起始密碼子、或包含該起始密碼子、可擴增那樣選擇,而作為3’端側的引物最好是能夠至少含有終止密碼子、或含有該終止密碼子能夠擴增那樣地進行選擇。引物優選由5個以上的堿基,更優選10個以上堿基構成的寡核苷酸、更優選由18~25個堿基構成的寡核苷酸。
PCR反應可以按照該領域眾所周知的方法或與這些方法基本上同樣的方法或改變法進行,例如可以根據R.Saiki,etal.,Science,230:1350,1985;R.Saiki,et al.,Science,39:487,988;.A.Erilich ed.,PCR Technology,Stockton Press,989;.M.Glover et al.ed.,“DNA Clonig”,2nd ed.,Vol.1,(ThePractical Approach Series),RL Press,Oxford UniversityPress(1995);M.A.Innis et al.ed.,“PCR  Protocols:a guide tomethods and applocations”,Academic Prss,New AYork1990);M.J.McPherson,.Quirk and G.R.Tayloy(Ed.,),CR:apract9ical approach,RL Press,Oxford(1991);M.A.Frohman etal.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,85,8998-9002(1988)等所述的方法或對這些方法進行修飾、改變的方法進行。另外,PCR法也可以使用適用的市售的試劑盒進行,根據試劑盒制造者或試劑盒銷售者指明的程序實施。
PCR反應對于代表性的實驗是將例如模板(例如,以mRNA為模板合成的DNA;1st strand DNA)和根據該基因設計的引物與10×反應緩沖液(Taq DNA聚合酶附帶的)、dNTP(脫氧核苷三磷酸dATP,dGTP,dCTP dTTP的混合物)、Taq DNA聚合酶以及去離子蒸餾水混合。對于該混合物使用例如GeneAmp 2400 PCR system,erkin-Elmer/Cetus公司等自動熱循環儀在一般的PCR循環條件下反復該循環25~60次,用于擴增的循環數可以根據相應目的設為合適的次數。作為PCR循環的條件,例如變性90~95℃5~100秒、退火40~60℃5~150秒、延伸65~75℃30~300秒的循環,優選變性94℃15秒、退火58℃15秒、延伸72℃45秒的循環,退火的反應溫度以及時間可以根據相應實驗選擇適當的值,變性反應和延伸反應的時間也可以根據預想的PCR產物的鏈長選擇適當的值。退火的反應溫度最好是根據通常引物與模板DNA的雜交的Tm值改變。延伸反應的時間通常大約每1000bp的鏈長1分鐘程度那樣的尺度,根據場合不同也可以選擇更短的時間。
在本說明書中,所謂「寡核苷酸」可以是比較短的單鏈或雙鏈的聚核苷酸,優選聚脫氧核苷酸,可以通過Angew.Cem.nt.Ed.Engl.,Vol.28,p.716-734(1989)所述的那樣已知方法、磷酸三酯法、磷酸二酯法、磷酸法、磷酸酰胺法、磷酸法等方法化學合成。已知通常合成可以很便利地在被修飾的固體支持體上合成,該儀器有銷售。該核苷酸可以含有一個或一個以上的修飾堿基,例如可以含有次黃苷等天然而不是普通的堿基或三甲基化的堿基等,根據場合不同也可以含有帶有標記的堿基。
為了對所定核酸進行鑒定,可以利用雜交技術。該雜交可以根據上述公布的「基因重組技術」的文獻所述的方法或基本上與它同樣的方法或改變法進行。例如,雜交可以使含有DNA等核酸的樣品轉移到含有尼龍膜等膜載體上,根據需要實施變性處理、固定化處理、清洗處理等后,使轉移到上述載體(例如膜等)的核酸根據需要,使變性的標記探針DNA片段在雜交用緩沖液中進行反應。
雜交處理通常于約35~約80℃進行、于約50~約65℃下更合適,進行約15分鐘~約36小時,約1~約24小時更合適,可以選擇最適條件進行。例如,雜交處理在約55℃下進行約18小時。作為雜交用緩沖液,可以使用選自該領域中通常使用的緩沖液,例如可以使用Rapid hybridization buffer(Amersham公司)等。作為轉移的載體(例如,膜等)的變性處理,通常通過于約40~約100℃、于約70~約90℃下更合適,進行約15分鐘~約24小時焙烤,進行約1~約4小時焙烤更合適,可以選擇最適合條件進行。例如,對膜等載體通過于80℃下進行約2小時焙烤進行固定化。作為轉移的載體(例如膜等)的清洗處理,可以通過用在該領域中通常使用的清洗液、例如含有1MNaCl、1mMEDTA和0.1%十二烷基硫酸鈉(SDS)的50mM Tris-HCl緩沖液,pH 8.0等進行清洗。作為含有尼龍等膜的載體,可以使用從該領域通常使用的載體中選擇的載體。
作為上述堿性變性液、中和液、緩沖液,可以使用從該領域中通常使用的緩沖液中選出來的緩沖液,作為堿性變性液,例如可以使用含有0.5MNaCl和1.5MNaCl的0.5M Tris-HCl緩沖液,pH 8.0等,作為緩沖液例如2×SSPE(0.36MNaCl、20mMNaH2PO4和2mMEDTA)等。另外在雜交處理之前,為了防止非特異性雜交反應,根據需要,進行了轉移的載體(例如膜等)最好是進行預雜交處理。該預雜交處理可以通過例如浸入到預雜交溶液[50%formamide、5×Denhardt溶液(0.2%牛血清白蛋白、0.2%polyvinyl pyrrolidone)、5×SSPE、0.1%SDS、100μg/ml熱變性鮭精子DNA]等中,于約35~約50℃,優選42℃下進行約4~約24小時,優選約6~約8小時反應,該條件同行可以通過反復進行適當實驗,確定更理想的條件。在雜交中使用的標記探針DNA片段的變性可以于約70~約100℃下、優選約100℃下,進行約1~約60分鐘、優選約50分鐘加熱等進行。而雜交可以利用其眾所周知的方法或根據這些方法的方法進行,在本說明書中,所謂嚴格的條件指的是例如,關于鈉濃度,約15~約50mM、優選約19~約40mM、更優選約19~約20mM,關于溫度約35~約85℃、優選約50~約70℃、更優選約60~約65℃的條件。
雜交完了后,對膜等載體進行充分清洗處理,在將進行特異雜交反應的標記探針DNA片段以外的標記探針等除去后,可以進行檢測處理。膜等載體的清洗處理可以使用從該領域通常使用的方法選出的方法進行,例如可以通過用含有0.1%SDS0.5×SSC(0.15MNaCl、15mM檸檬酸)溶液等進行清洗。
進行雜交的核酸可以通過代表性的自動放射自顯影進行檢測,在檢測中也可以適當選用該領域中使用的方法。將進行檢測的相當于信號的核酸帶懸浮于適當的緩沖液、例如SM溶液(含有100mMNaCl和10mM MgSO4的50mM Tris-HCl緩沖液,pH7.5)等,然后對該懸浮液進行適度稀釋,對所定核酸進行分離。純化,然后再進行擴增處理。在本說明書中,所謂「高同源性」是因該對象序列的長度不同而不同,例如可以是50%以上、甚至60%以上、優選70%以上、更優選80%以上,而對于特定場合也可以為95%以上,97%以上特別好。所謂「同效的堿基序列」例如在嚴格條件下與含有問題序列的核酸可進行雜交的堿基序列,例如與該堿基序列中連續的5個以上的堿基序列、優選10個以上的堿基序列、更優選15個以上的堿基序列、更優選20個以上的堿基序列進行雜交,編碼與該多肽基本上同等的氨基酸序列的堿基序列。核酸也可以通過化學合成獲得。這種情況下,化學合成片段,然后通過酶將合成的片段結合起來。
通過雜交處理對從含有基因文庫或cDNA文庫等的核酸樣品中進行篩選目的核酸的處理可以反復進行??梢允褂帽豢寺〉睦醋勻說腸DNA文庫、例如各種來自人的組織或培養細胞(特別是人的腎臟、腦、松果體、下垂體后葉、神經細胞、網膜、網膜血管細胞、網膜神經細胞、胸腺、血管、內皮細胞、血管平滑肌細胞、血液細胞、巨噬細胞、淋巴細胞、精巢、卵巢、子宮、腸、心臟、肝臟、小腸、大腸、齒肉關連細胞、皮膚關連細胞、線球體細胞、尿細管細胞、結合組織細胞等組織。細胞、以及各種腫瘤組織、癌細胞等)cDNA文庫。另外用作模板等的cDNA文庫也可以直接使用市售的來自各種組織的cDNA文庫,例如可以使用由Stratagen公司、Invitrogen公司、Clontech公司等銷售的cDNA文庫。作為典型的例子,可以使用由人組織。細胞制備的基因文庫、例如人P1 artificial chromosome基因組文庫(HumanGenome Mapping Resource Center)、人組織cDNA文庫(例如,可從Clontech公司等獲得)。使用探針可以對由各種人組織或培養細胞等構建的人基因組DNA文庫或來自人的cDNA文庫進行篩選。為了用放射性同位素等對探針等進行標記,可以使用市售的標記試劑盒、例如隨機引物DNA標記試劑盒(Boehringer Mannheim公司)等進行。例如使用隨機引發(random-priming)試劑盒(Pharmacia LKB公司,Uppsala)等,用[α-32P]dCTP(Amersham公司)等對探針用DNA進行標記,可以獲得帶有放射活性的探針。
含有所定核酸的噬菌體粒子、重組質粒、重組載體等可以通過該領域中通常使用的方法對所定核酸進行純化分離,例如可以通過甘油梯度超離心分離法(Molecular Cloning,a Laboratory Manual,ed.T.Maniatis,Cold Spring Harobor Laboratory,2nd ed.78,1989)、電泳法等進行純化。使用在該領域中通常使用的方法可以從噬菌體粒子等純化分離DNA,例如,將得到的噬菌體等懸浮于TM溶液(含有100mMMgSO4的50mM Tris-HCl緩沖液,pH7.8)等,用DNase I和RNase A等處理后,加20mM EDTA、50μg/ml蛋白酶K以及0.5%SDS混合液等,于約65℃,保溫約1小時后,對該溶液進行酚提取、二乙基乙醚提取后,通過乙醇沉淀使DNA沉淀,然后將得到的DNA用70%乙醇洗凈后干燥,溶解于TE溶液(含有10mM EDTA的10mM Tris-HCl緩沖液,pH8.0)等后得到。另外作為目的DNA通過亞克隆等大量獲得也是可能的,例如亞克隆作為宿主可以使用大腸桿菌,用質粒載體等進行。通過這樣亞克隆得到的DNA也與上述同樣,通過離心分離、酚提取、乙醇沉淀等方法純化分離。
在本說明書中,得到的PCR產物等核酸(包括DNA)通常進行1~2%瓊脂糖凝膠電泳,作為特異的帶從凝膠中切出,例如,使用geneclean kit(Bio 101)等市場銷售的提取試劑盒進行提取。提取的DNA用適當的限制酶切,根據需要進行純化處理,或根據需要,對5’末端用T4聚核苷酸激酶等進行磷酸化后,與pUC18等pUC系載體等適當的質粒載體連接,轉化適當的感受態細胞。被克隆的PCR產物可以解析其堿基序列。對于PCR產物的克隆,可以使用例如p-Direct(Clontech),pCR-ScriptTMSK(+)(Stratagene公司)、pGEM-T(Promega公司),pAmpTM(Gibco-BRL公司)等市場銷售的質粒載體。為了進行宿主細胞的轉化,例如可以使用噬菌體載體,使用鈣法、銣/鈣法、鈣/錳法、TFB高效率法、FSB冷凍感受態細胞法、迅速克隆法、電穿孔等該領域已知的方法或基本上與該方法同樣的方法進行(D.hanahan,J.Mol.Biol.,166:557,1983等)。為了分離目的DNA,可以運用逆轉錄PCR(polymerase chain reaction coupled reversetranscription;RT-PCR)、RACE(rapid amplification of cDNA ends)。RACE可以根據例如M.A.Innis et al.ed.,“PCR Protocols”(M.A.Frohman,“a guide to methods and applications”),pp.28-38,Academic Press,New York(1990)等所述的方法進行。
DNA,可以根據需要克隆,例如可以利用質粒、λ噬菌體、粘粒、P1噬菌體、F因子、YAC等。最好是來自λ噬菌體的載體,例如可以利用Charon 4A、Charon 21A、λgt10、λgt11、λDASHII、λFIXII、λEMBL3、λZAPIITM(Stratagene公司)等。另外可以將得到的DNA整合到下面詳細說明那樣的適當載體、例如質粒pEX、pMAMneo、pKG5等載體,用下面詳細說明那樣的適當的宿主細胞、例如大腸桿菌、酵母、CHO細胞、COS細胞等表達。另外該DNA片段直接或作為附加了適當調控序列的DNA片段整合到適當的載體、然后導入動物后,可以做成表達所定基因的轉基因動物。作為動物如哺乳動物,例如小鼠、大鼠、兔、土撥鼠、牛等。最好是將該DNA片段導入小鼠等動物的受精卵,可以做成轉基因動物。對于所定的基因產物的確認可以使用轉化該外源基因的293T細胞、COS-1細胞等適于該基因的動物細胞等進行。
作為將外源基因導入哺乳動物等動物細胞的方法,可以通過該領域已知的方法或基本上與該方法同樣的方法進行,例如磷酸鈣法(例如,F.L.Graham et al.,Virology,52:456,1973等)、DEAE-葡聚糖法(例如,D.warde et al.,J.Gen.Virol.,3:371,1968等)、電穿孔法(例如,E.Neumann et al.,EMBO J l.:841,1982等)、微注射法、脂質體法、病毒感染法、噬菌體粒子法等。這樣一來,轉染了所定的基因的動物細胞產生的基因產物也可以進行基因解析。
作為整合所定基因等(本發明中得到的DNA等)的質粒,只要是在基因工程中常用的宿主細胞(例如,大腸桿菌、枯草桿菌等原核細胞宿主、酵母、293T細胞、CHO細胞、COS細胞等真核細胞宿主、Sf21等昆蟲細胞宿主)中能夠表達的質粒,什么樣的質粒都可以。當然也可以選用市售的試劑盒或試劑附帶的質粒。在這樣的序列內,也可以含有例如為了在選擇的宿主中表達而進行適當修飾的密碼子,或設計限制酶部位,也可以含有為了使目的基因表達容易的調控序列、促進序列等、在結合目的基因中起作用的接頭、適配器等、以及調控抗生素抗性等、調控代謝、對篩選有用的序列(也可以含有編碼雜化蛋白或融合蛋白質的序列)等。最好是使用適當的啟動子、例如在以大腸桿菌作為宿主的質粒中,如使用色氨酸啟動子(trp)、乳糖啟動子(lac)、色氨酸。乳糖啟動子(lac)、脂蛋白啟動子(lpp)、λ噬菌體PL啟動子等,在以動物細胞作為宿主的質粒中,可以使用SV40晚期啟動子、MMTV LTR啟動子、RSV LTR啟動子、CMV啟動子、SRα啟動子等,在以酵母作為宿主的質粒中可以使用GAL1、GAL10啟動子等。另外也可以使用CYC1、HIS3、ADH1、PGK、PHO5、GAPDH、ADC1、TRP、URA3LEU2、ENO、TP1、AOX1等調控系。
為了促進編碼所期望多肽的DNA的轉錄,可以在載體中插入增強子,作為這樣的增強子,如作用于啟動子、具有促進轉錄的作用,通常約10~100bp的具有cis作用的序列(元件)。很多增強子是從珠蛋白、彈性蛋白酶、白蛋白、α-轉鐵蛋白、胰島素等哺乳動物基因了解到的。作為代表性的,使用從真核細胞感染性病毒得到的增強子合適,例如位于復制起點的晚期區的SV40增強子(100-270bp)、巨細胞病毒的初期啟動子的增強子、位于多糖類的復制起點的晚期區的增強子、腺病毒的增強子等。另外根據需要,也可以附加宿主中存在的信號序列,這些可以使用同行都非常了解的。
作為以大腸桿菌作為宿主的質粒,例如pBR322、pUC18、pUC19、pUC118、pUC119、pSP64、pSP65、pTZ-18R/-18U、pTZ-19R/-19U、pGEM-4、pGEM-3Z、pGEM-4Z、pGEM-5Zf(-)、pBluescript KSTM(Stratagene公司)等。作為適于在大腸桿菌中表達的質粒載體,如pAS、pKK223(Pharmacia公司)、pMC1403、pMC931、pKC30、pRSET-B(Invitrogen公司)等。作為以動物細胞為宿主的質粒,例如SV40載體、多糖類。病毒載體、牛痘病毒載體、逆轉錄病毒載體等,具體來說,如pcD、pcD-SRα、CDM8、pCEV4、pME18S、pBC12B1、pSG5(Stratagene公司)等。作為以酵母為宿主的質粒,如Yip型載體、Yep型載體、YCp型載體等,例如pGPD-2等。作為宿主細胞,當宿主細胞為大腸桿菌時,如來自大腸桿菌K12株的,例如作為來自NM533、XL1Blue、C600、DH1、DH5、DH11S、DH5α、DH10B、HB101、MC1061、JM109、STBL2、B834株的,如BL21(DE3)pLysS等。宿主細胞為酵母時,例如Saccharomyces cerevisiae,Schizosaccharomycesprombe,Pichia pastoris,Kluveromyces株,Candida Trichodermareesia,以及其他酵母株等。作為在酵母中的表達系,例如可以參照Hinnen et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1978)75:1929;Itoet al.,J.Bacteriol.(1983)153:163;Kurtz et al.,Mol.Cell.Biol.(1986)6:142;Kunze et al.,J.Basic Microbiol.(1985)25:141;Gleeson et al.,J.Gen.Microbiol.(1986)132:3459;Roggenkamp et al.,Mol.Gen.Genet(1986)202:302;Das et al.,J.Bacteriol.(1984)158:1165;De Louvencourt et al.,J.Bacteriol.(1983)154:737;Van den Berg et al.,Bio/Technology(1990)8:135;Kunze et al.,J.Basic Micr Biol.(1985)25:141;Cregg et al.,Mol.Cell.Biol.(1985)5:3376;美國專利第4,837,148號說明書,同第4,929,555號說明書;Beach and Nurse,Nature(1981)300:706;Davidow et al.,Curr.Genet.(1985)10:380;Gaillardin et al.,Curr.Genet.(1985)10:49;Ballanceet al.,Biochem.Biophys.Res.Commun.(1983)112:284-289;Tilburn et al.,Gene(1983)26:205-221;Yalton et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1984)81:1470-1474;Kelly and Hynes,EMBO J.,(1985)4:475479;EP 244,234;WO 91/00357等所述的表達系。
宿主細胞為動物細胞時,如來自非洲中部猴成纖維細胞的COS-7細胞、COS-1細胞、CV-1細胞、來自人腎細胞的293細胞、來自人表皮細胞的A431xb、來自人大腸的205細胞、來自小鼠成纖維細胞的COP細胞、MOP細胞、WOP細胞、來自中國倉鼠細胞的CHO細胞、CHO DHFR細胞、人HeLa細胞、來自小鼠細胞的C127細胞、來自小鼠細胞的NIH 3T3細胞、小鼠L細胞、9BHK、HL60、U937、HaK、Jurkat細胞、其他被轉化后得到的細胞系、通常的二倍體、由體外一次培養組織誘導的細胞株等。哺乳動物表達,例如可以參照Dijkema et al.,EMBOJ.(1985)4:761;Gorman et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1982b)79:6777;Boshart et al.,Cell(1985)41:521;美國專利第4,399,216號說明書;Ham and Wallace,Methods inEnzymology(1979)58:44;Barnes and Sato,Anal.Biochem.(1980)102:255;美國專利第4,767,704號說明書;同第4,657,866號說明書;同第4,927,762號說明書;同第4,560,655號說明書;WO90/103430;WO 87/00195;美國專利第RE 30,985號說明書等記載的細胞。作為昆蟲細胞,以蠶核多角體病毒(Bombyx mori nuclearpolyhedrosis virus)、來自該病毒的病毒或其他合適的病毒作為載體,可以使用Spodoptera frugiperda(caterpillar),Aedesaegypti(mosquito),Aedes albopictus(mosquito),Drosophilamelangaster(fruitfly),蠶幼蟲或蠶培養細胞、例如BM-N細胞等(例如,Luckow et al.,Bio/Technology,6,47-5(1988);Setlow,J.K.etal.(end,),Genetic Engineering,Vol.8,pp.277-279,PlenumPublishing,1986;Maeda et al.,Nature,315,pp.592-594(1985))。有關異種基因在昆蟲中的表達例如可以參照美國專利第4,745,051號說明書;Friesen et al.(1986),″The Regulation of BaculovirusGene Expression″,The Molecular Biology of Baculoviruses(W.Doerfler(Ed));EP 127,839;EP 155,476;Vlak et al.,J.Gen.Virol.,(1988)69:765-776;Miller et al.,Ann.Rev.Microbiol.(1988)42:177;Carbonell et al.,Gene(1988)73:409;Maedaet al.,Nature,(1985)315:592-594;Lebacq-Verheyden et al.,Mol.Cell.Biol.(1988)8:3129;Smith et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,(1985)82:8404;Miyajima et al.,Gene(1987)58:273;Martin et al.,DNA(1988)7:99等報道。另外關于多數的桿狀病毒株和突變體以及來自宿主的對應的容許昆蟲宿主細胞,例如可以參照Luckow et al.,Bio/Technology(1988)6:47-55;Miller et al.,Generic Engeneering(Serlow,J.K.et al.(Ed))Vol.8(PlenumPublishing,1986)pp.277-279;Maeda et al.,Nature(1985)315:592-594等報道。
利用Agrobacterium tumefaciens等,可以將植物細胞作為宿主細胞使用,與適合它的載體一起,這些在該領域都是廣泛了解的。在本發明的基因工程手法中,可以使用在該領域已知或廣泛運用的限制酶、逆轉錄酶、作為用于對適于將DNA片段克隆化的結構進行修飾或進行變換的酶的DNA修飾。分解酶、DNA聚合酶、末端核苷酸基轉移酶、DNA連接酶等。作為限制酶,例如R.J.Roberts,Nucleic AcidsRes.,13:r165,1985;S.Linn et al.ed.Nucleases,p.109,ColdSpring Harbor Lab.,Cold Spring Harbor,New York,1982;R.J.Roberts,D.Macelis,Nucleic Acids Res.,19:Suppl.2077,1991等報道的酶。
根據本發明,用含有編碼多肽(或蛋白質)的核酸的表達載體轉化的轉化體根據需要使用適當的選擇標志,通過反復克隆,可以很多具有穩定高表達能力的細胞株。例如,在作為宿主細胞使用動物細胞的轉化體中,作為選擇標志利用dhfr基因時,通過慢慢提高MTX濃度進行培養,選擇抗性株,使編碼本發明的多肽的DNA擴增,可以獲得能更高表達的細胞株。本發明的轉化體可以在可表達編碼本發明的多肽的核酸的條件下進行培養,使目的物生成、蓄積。該轉化體可以在該領域中廣泛使用的培養基中進行培養。例如大腸桿菌、枯草桿菌等原核細胞宿主、酵母等作為宿主的轉化體最好使用液體培養基。在培養基中可以含有生育需要的碳源、氮源、無機物等。作為碳源,如葡萄糖、葡聚糖、可溶性淀粉、蔗糖等、作為氮源,如銨鹽類、硝酸鹽類、玉米漿、胨、酪蛋白、肉提取物、麥芽提取物、大豆粕、馬鈴薯提取液等無機或有機物質、作為無機物,例如氯化鈣、磷酸二氫鈉、氯化鎂、碳酸鈣等。另外也可以添加酵母、維生素類、酪蛋白水解物、生長促進因子等。另外根據需要為了更有效地使啟動子起作用,可以添加例如3β-吲哚丙烯酸那樣的藥劑。培養基的pH希望約5~約8。
培養例如對于大腸桿菌通常于約15~約45℃下進行約3~約75小時,根據需要,也可以加通氣或攪拌。對宿主為動物細胞的轉化體進行培養時,作為培養基可以使用例如含有約5~約20%的胎牛血清的MEM培養基、PRM1604培養基、DMEM培養基等。pH優選約6~8。培養通常于約30~約40℃下進行約15~約72小時,根據需要,也可以加通氣或攪拌。表達所定基因產物的轉化體可以直接利用,也可以做成該細胞勻漿液利用,也可以將所定基因的產物分離后使用。當從上述培養細胞提取時,培養后可以適當運用用眾所周知的方法收集菌體或細胞,將它們懸浮于適當的緩沖液中,通過超聲波、溶菌酶和/或凍融等破壞菌體或細胞后,通過離心分離或過濾獲得粗提取液的方法等。在緩沖液中也可以加尿素或鹽酸胍等蛋白質變性劑、TritonX-100(商品名)、吐溫-20(商品名)等表面活性劑。對于目的生成物向培養液中分泌的場合,培養結束后,通過這方面眾所周知的方法將菌體或細胞與上清分離開,收集上清。
上述那樣得到的培養上清、或提取液中含有的目的生成物可以將以往眾所周知的分離純化法適當組合對其進行純化,例如通過硫酸銨沉淀法等鹽析、通過交聯葡聚糖等凝膠過濾法、使用帶有例如二乙基氨乙基或羧甲基等的載體的離子交換層析法、例如,使用帶有丁基、辛基、苯基等疏水性基團的載體等的疏水性層析法、色素凝膠層析法、電泳法、透析、超濾、親和層析法、高效液相層析法等進行純化獲得。理想的是可以通過聚丙烯凝膠電泳、固定了配體等的親和層析等進行純化分離處理。例如作為配位體,如包括進行特異識別的單克隆抗體的抗體或其片段、凝集素、糖、結合對的一方等。例如免疫親和層析、明膠-瓊脂糖親和層析、肝素-瓊脂糖層析等。
得到的本發明的多肽(或蛋白質)可以再通過化學的手法對其含有的氨基酸殘基進行修飾,或使用肽酶,例如胃蛋白酶、糜蛋白酶、木瓜蛋白酶、菠蘿蛋白酶、肽鏈內切酶、肽鏈外切酶等酶進行修飾,或進行部分分解后做成其衍生物等。本發明的多肽,C末端可以是羧基(COOH)或羧化物(COO-),也可以是酰胺(-CONH2)或酯(COOR)。其中作為酯中的R,除了可以使用甲基、乙基、n-丙基、異丙基或n-丁基等C3-8烷基、例如環戊基、環己基等C1-6環烷基、例如苯、α-萘等C6-12芳香基、例如芐基、苯乙基等苯-C1-2烷基或α-萘甲基等α-萘-C1-2烷基等C7-14芳烷基之外,還可以使用作為口服用酯廣泛使用的三甲基乙酰氧甲基等。當本發明的蛋白質C末端以外含有羧基(或羧化物)時,羧基被酰胺化或酯化后的產物也包括在本發明的多肽中。作為此時的酯,例如可以使用上述的C末端的酯等。
另外,對于本發明的多肽(或蛋白質),也包括在上述的多肽中,N末端的蛋氨酸殘基的氨基被?;せ?例如,甲?;?、乙?;菴1-5烷-羰基等C1-6?;??;さ牟?,N端側在生物體內被切斷生成的谷?;薪構勸濱;牟?、分子內氨基酸的側鏈上的取代基(例如,-OH、-COOH、氨基、咪唑基、吲哚基、胍基等)用適當的?;せ?例如,甲?;?、乙?;菴1-6?;??;さ牟?、或結合了糖鏈的所謂糖蛋白等復合蛋白質等。
另外,通過使用以本發明涉及到的基因的堿基序列作為基礎的基因工程常用的方法,例如在所定的多肽的氨基酸序列中適當地置換、缺失、插入、轉移或附加1個或多個以上氨基酸,可以制造導入了變異的適合的多肽。作為這樣的變異。變換。修飾法,例如日本生化學會編、「續生化學實驗講座1、基因研究法II」、p105(廣瀨進)、東京化學同人(1986);日本生化學會編、「新生化學實驗講座2、核酸III(重組DNA技術)」、p233(廣瀨進)、東京化學同人(1992);R.Wu,L.Grossman,ed.,“Methods in Enzymology”,Vol.154,p.350&p.367,Academic Press,New York(1987);R.Wu,L.Grossman,ed.,“Methods in Enzymology”,Vol.100,p.457 & p.468,AcademicPress,New York(1983);J.A.Wells et al.,Gene,34:315,1985;T.Grundstroem et al.,Nucleic Acids Res.,13:3305,1985;J.Tayloret al.,Nucleic Acids Res.,13:8765,1985;R.Wu ed.,“Methodsin Enzymology”,Vol.155,p.568,Academic Press,New York(1987);A.R.Oliphant et al.,Gene,44:177,1986等所述的方法。例如,利用合成寡核苷酸等的指定位置導入法(部位特異的突變導入法)(Zolleret al.,Nucleic Acids Res.,10:6487,1987;Carter et al.,NucleicAcids Res.,13:4331,1986)、盒(序列)突變導入法(cassettemutagenesis:Wells et al.,Gene,34:315,1985),限制部位選擇突變導入法(restriction selection mutagenesis:Wells et al.,Philos.Trans.R.Soc.London Ser A,317:415,1986),丙氨酸。掃描法(Cunningham & Wells,Science,244:1081-1085,1989),PCR突變導入法,Kunkel法,dNTP[αS]法(Eckstein),使用亞硫酸或亞硝酸等的指導區域突變導入法等方法。
另外,當用基因重組法進行制造時,以融合多肽(融合蛋白質)使其表達,在生物體內或生物體外,也可以變換。加工為基本上與所期望的多肽具有同等生物學活性的多肽??梢允褂沒蜆こ壇S玫娜諍喜?,這樣融合的多肽利用其融合部,通過親和層析等也可以進行純化。作為這樣融合多肽,如可以與組氨酸盒融合的融合多肽,或與β-半乳糖苷酶(β-gal)、麥芽糖結合蛋白質(MBP)、谷胱甘肽-S-轉移酶(GST)、硫氧還蛋白(TRX)或Cre Recombinase融合的融合多肽。同樣,多肽可以附加異種的抗原表位的盒,通過使用與該抗原表位特異結合的抗體的免疫親和層析也可以進行純化。在更適合的實施方式中,如聚組氨酸(poly-His)或聚組氨酸-甘氨酸(poly-His-Gly)盒,而作為抗原表位盒,例如AU5,c-Myc,CruzTag09,CruzTag22,CrzTag 41,Glu-Glu,HA,Ha.11,KT3,FLAG(registeredtrademark,Sigma-Aldrich),Omni-prbe,S-probe,T7,Lex A,V5,VP16,GAL4,VSV-G等(Field et al.,Molecular and Cellular Biology,8:pp.2159-2165(1988);Evan et al.,Molecular and CellularBiology,5:pp.3610-3616(1985);Paborsky et al.,ProteinEngineering,3(6):pp.547-553(1990);Hopp et al.,BioTechnology,6:pp.1204-1210(1988);Martin et al.,Scence,255:pp.192-194(1992);Skinner et al.,J.Bio.Chem.,266:pp.15163-15166(1991);Lutz-Freyermuth et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,87:pp.6393-6397(1990)等)。也可以利用使用酵母雙雜交法。
另外作為融合多肽,也可以是附加了變成可檢測蛋白質那樣的標志的融合多肽。在更合適的實施方式中,該可檢測標志可以是生物素/鏈抗生物素蛋白系的Biotin Avi Tag、發熒光的物質等。作為發該熒光的物質,如來自オワン水母(Aequerea victorea)等發光水母的綠色熒光蛋白(green fluorescent protein:GFP)、對其進行改變后的變異體(GFP變異體)、例如EGFP(Enhance-humanized GFP)、rsGFP(red-shift GFP),黃色熒光蛋白(yellow fluorescentprotein:YFP),綠色熒光蛋白(green fluorescent protein:GFP)、藍色熒光蛋白(cyan fluorescent protein:CFP),青色熒光蛋白(bluefluorescent protein:BFP),來自ウミシイタケ(Renillareniformis)的GFP等(宮脅敦史編、實驗醫學另冊后基因組時代的實驗講座3-GFP和Bioimaging、羊土公司(2000年))。也可以使用特異識別上述融合蛋白的抗體(包括單克隆抗體和其片段)進行檢測。這樣的融合多肽的表達和純化也可以使用適用于表達和純化的試劑盒,按照試劑盒制造者給出的程序實施。
得到的蛋白質(可以包括肽和多肽),通過酶免疫測定法等已知手法使它結合于適當的載體或固相,可以進行固定化。固相化蛋白質、固相化肽可很便利地用于結合分析或物質的篩選。
多肽或蛋白質的結構的修飾·改變等可以參考例如日本生化學會編「新生化學實驗講座I、蛋白質VII、蛋白質工程」東京化學同人(1993),根據該文獻所述的方法或其引用的文獻所述的方法、或與其基本上同樣的方法進行。在如下面所述的那樣的生物學活性中,也可以包括免疫方面活性、例如抗原性。在該修飾·改變中,可以是脫氨基化、羥基化、羧基化、磷酸化、硫酸化、甲基化等烷基化、乙?;弱;?、酯化、酰胺化、開環、閉環、糖基化、向含糖鏈種類不同方面改變、將含糖鏈數增減、脂質結合、對D-型氨基酸殘基的置換等。這些方法都是在該領域已知的方法(例如、T.E.Creighton,Proteins:structure and molecular Properties,pp.79-86 W.H.Freeman & Co.,San Francisco,USA(1983)等)。
利用本發明的半乳凝素9突變體,可以篩選對該半乳凝素9的所定生物學活性等功能(例如,細胞損傷活性、凋亡誘導活性、與糖皮質激素類似的活性、抑制惡性細胞轉移的活性等)促進的化合物(激動劑)或抑制的化合物(拮抗劑)或它們的鹽。這也意味著可以提供該篩選試劑。因此,也可以提供有關利用在本發明中闡明的該半乳凝素9蛋白質等多肽、其一部分肽或它們的鹽表現出的活性的各種各樣的物質,對本發明中該半乳凝素9蛋白質、其一部分肽或它們的鹽等表現出的活性等所定功能促進的化合物(激動劑)或抑制的化合物(拮抗劑)或它們的鹽的篩選方法。
在該篩選中,例如(i)使適當的試驗樣品與半乳凝素9突變體蛋白質、其一部分肽或它們的鹽(也包括表達該蛋白質的轉化體)等接觸的場合與(ii)在本發明的蛋白質、其一部分肽或它們的鹽等中不存在問題的試驗樣品場合進行比較。具體來說,在上述篩選中,測定、比較該生物學活性(例如,與各個半乳凝素9蛋白質和生物體成分之間的相互作用有關的活性等)。
在該篩選系中也可以存在為了便于測定的適當的檢測用底物。作為該底物,只要是在測定中可有效利用的,無論什么樣的都可以。例如,選用已知的眾所周知的底物,最好是使用合成的化合物等。底物可以直接使用,但最好是使用用熒光素等熒光、酶或放射性物質標記的底物。
作為試驗樣品,例如蛋白質、肽、非肽性化合物、合成化合物、發酵產物、植物提取物、動物等組織提取物、細胞提取物等。在試驗樣品中使用的試驗化合物的例子中最好含有抗凝集素抗體、酶抑制劑、細胞因子、各種具有抑制活性的化合物、特別是合成化合物等。這些化合物可以是新的化合物,也可以是眾所周知的化合物。該篩選可以根據通常的結合活性或酶活性的測定法實施,例如可以參考該領域中眾所周知的方法等進行。另外,可以使用各種標記、緩沖液系以及其它適當的試劑,可以按照在此說明的操作進行。使用的肽等可以用活化劑進行處理,也可以預先將其前體或潛在型的前體變換為活性型的前體。測定通常在Tris-HCl緩沖液、磷酸鹽緩沖液等對反應沒有壞影響的那樣緩沖液等中,例如在pH約4~約10(優選pH約6~約8)中進行。當分別進行篩選時,在各個方法中的通常條件、操作法中除了考慮同行通常技術外,可以構建與本發明的該半乳凝素9蛋白質或與其基本上具有同等活性的多肽或肽有關的測定系。有關這些一般的技術手段的詳細敘述可以參照綜述、出版的書等[例如、Methods inEnzymology Academic Press公司(USA)發行等]。另外,凋亡誘導活性測定法等可以參考田沼靖一監修、「細胞工程另冊:實驗程序系列、凋亡實驗程序」株式會社秀潤社、1995年1月20日(第1版第2次印刷)等,也可以使用市售測定試劑盒。
使用本發明的篩選方法或篩選試劑盒得到的化合物或其鹽是從上述的試驗化合物,例如肽、蛋白質、非肽性化合物、合成化合物、發酵產物、細胞提取物、植物提取物、動物組織提取物等選擇的化合物,是促進或抑制本發明的蛋白質等的功能的化合物。作為該化合物的鹽,如藥學上容許的鹽等。例如,與無機堿基的鹽、與有機堿基的鹽、與無機酸的鹽、與有機酸的鹽、與堿性或酸性氨基酸的鹽等。作為與無機堿基的鹽的合適例子,如鈉鹽、鉀鹽等堿金屬鹽、鈣鹽、鎂鹽等堿土金屬鹽、以及鋁鹽、銨鹽等。作為與有機堿基的鹽的合適例子,如與三甲基胺、三乙基胺、吡啶、甲基吡啶、2,6-二堿基吡啶、乙醇胺、二乙醇胺、三乙醇胺、環己基胺、二環己基胺、N,N’-二芐基乙二胺等的鹽。作為與無機酸的鹽的合適例子,如與鹽酸、溴氫酸、硫酸、磷酸等的鹽。作為與有機酸的鹽的合適的例子,例如與甲酸、醋酸、丙酸、延胡索酸、草酸、酒石酸、馬來酸、檸檬酸、琥珀酸、蘋果酸、甲磺酸、苯磺酸、苯甲酸等的鹽。而作為與堿性氨基酸的鹽的合適例子,如與精氨酸、賴氨酸、組氨酸等的鹽,作為與酸性氨基酸的鹽的合適的例子,如與天冬氨酸、谷氨酸等的鹽。
當將本發明的活性成分[例如(a)該半乳凝素9突變體多肽、其一部分的肽或它們的鹽、與其相關的肽等、(b)編碼該半乳凝素突變體9或相關多肽的DNA等的核酸等、(c)控制該半乳凝素9的問題活性的化合物(該半乳凝素9蛋白質的毒害細胞活性、凋亡誘導活性、對正常細胞沒有壞的影響,促進或抑制·阻礙起著所定功效的活性等現象、或促進或抑制·阻礙組織或蛋白質的變質·過剩生產或分解現象達到生物學活性的化合物)或其鹽、(d)使用本發明發現的活性物質等]作為藥物使用時,通??梢緣ザ闌蠐胍├砩先菪淼母髦種萍糧ㄖ粱旌蝦?,作為藥物組成物或藥物制備物等給予。最好是以適合經口給藥、局部給藥、或非經口給藥等使用的制劑制備物的形態給藥,根據目的也可以通過任一種給藥方式(也包括吸入法、或直腸給藥)給藥。
另外,本發明的活性成分也可以配合各種藥物、例如抗腫瘤劑(抗癌劑)、腫瘤轉移抑制劑、血栓形成抑制劑、關節破壞治療劑、鎮痛劑、消炎劑和/或免疫抑制劑使用,這些制劑只要是具有有利的作用可以無限制地使用,例如可以從該領域中已知的制劑中選擇。
而作為非經口給藥方式,可以包括局部、經皮、靜脈內、肌肉內、皮下、皮內或腹腔內給藥,也可以直接向患部給藥,對于某些場合也適合。理想的是向包括人在內的哺乳動物經口、或非經口(例如,細胞內、組織內、靜脈內、肌肉內、皮下、皮內、腹腔內、胸腔內、脊髓腔內、點滴法、注腸、經直腸、點耳、點眼或點鼻、齒、向皮膚或粘膜涂布等)給藥。作為具體的制劑制備物的形態,如溶液制劑、分散制劑、半固體制劑、粉粒體制劑、成型制劑、浸出制劑等,例如片劑、包被片劑、加糖衣制劑、丸劑、口含片、硬膠囊劑、軟膠囊劑、微膠囊劑、埋入劑、粉末劑、散劑、顆粒劑、細粒劑、注射劑、液劑、酏劑、乳劑、灌注劑、糖漿、水劑、乳劑、懸濁劑、擦劑、洗劑、氣霧劑、噴霧劑、吸入劑、噴霧劑、軟膏制劑、硬膏制劑、貼附劑、浴劑、濕潤劑、膏劑、油劑、栓劑(例如直腸栓劑)、酊劑、皮膚用水劑、點眼劑、點鼻劑、點耳劑、涂布劑、輸液劑、用于注射用液劑等的粉末劑、冷凍干燥制劑、凝膠制備品等。
藥物用的組成物可以根據通常的方法進行制劑化。例如,根據適當的需要,可以單獨或組合使用生理學上認可的載體,作為藥物容許的載體、佐劑、賦形劑、輔形劑、稀釋劑、香味劑、香料、甜味劑、媒介物、防腐劑、穩定劑、結合劑、pH調節劑、緩沖劑、表面活性劑、基劑、溶劑、填充劑、增量劑、溶解輔助劑、可溶化劑、等滲劑、乳化劑、懸濁化劑、分散劑、增粘劑、凝膠化劑、硬化劑、吸收劑、粘接劑、彈性劑、可塑劑、崩解劑、噴射劑、保存劑、抗氧化劑、遮光劑、保濕劑、緩和劑、防止帶電劑、無痛化劑等,通過將它們一起與本發明的蛋白質混合,可以制造成一般認可的制劑實施中要求的單位用量形態。
作為適于非經口使用的制劑,活性成分與水或其它的藥學上容許的溶劑的無菌溶液、或懸濁液劑等、例如注射劑等。一般來說,水、鹽水、葡萄糖水溶液、其它相關的糖的溶液、乙醇、丙二醇、聚乙二醇等乙二醇類可作為理想的注射劑用的液體載體。制備注射劑時,使用蒸餾水、林格液、生理鹽水那樣的載體、適當的分散劑或濕化劑和懸濁化液等,用該領域已知的方法制備成象溶液、懸濁液、乳劑那樣可以注射的形式。
作為注射用的水性液,如包括生理鹽水、葡萄糖或其它的輔助藥(例如,D-山梨糖醇、D-甘露糖醇、氯化鈉等)等滲液等,也可以與藥理上容許的適當溶解輔助劑、例如醇(例如乙醇等)、聚醇(例如,丙二醇、聚乙二醇等)、非離子性表面活性劑(例如,聚山梨酯80TM,HCO-50等)并用。作為油性液,如芝麻油、大豆油等,也可以與作為溶解輔助劑的苯甲酸芐酯、芐酯醇等并用。另外,也可以與緩沖劑(例如,磷酸鹽緩沖液、醋酸鈉緩沖液等)或用于浸透壓調節的試劑、無痛化劑(例如,殺藻胺、鹽酸普魯卡因等)、穩定劑(例如,人血清白蛋白、聚乙二醇等)、保存劑(例如,芐醇、酚等)、抗壞血酸等抗氧化劑、吸收促進劑等配合。制備的注射液通常被填充到適當的安瓿瓶中。
對于非經口給藥,可以加或不加表面活性劑以及其它藥學上容許的助劑,做成水、乙醇或油那樣的無菌的藥學上容許的液體中的溶液或懸濁液形式的制劑。作為制劑中使用的油性載色劑或溶劑,如天然的、合成的或半合成的單、或雙、或三甘油酯類、天然的、合成的或半合成的油脂類或脂肪酸類,例如,花生油、玉米油、大豆油、芝麻油等植物油。例如,該注射劑可以按照含有0.1~10重量%程度的本發明化合物那樣制備。
作為適用于局部、例如口腔或直腸使用的制劑,例如洗口劑、磨齒劑、口腔噴霧劑、吸入劑、軟膏劑、牙科填充劑、牙科包被劑、牙科膏劑、栓劑等。作為洗口劑、其它牙科用劑,可以使用藥理上容許的載體,通過慣用的方法制備。作為口腔噴霧劑、吸入劑,使本發明化合物本身或與藥理上容許的非活性載體一起溶解于濕霧劑或噴霧器用的溶液,或做成吸入用微粉末給予牙齒等。軟膏劑,可以添加通常使用的基劑、例如軟膏基劑(白色凡士林、石蠟、橄欖油、聚乙烯二醇400、聚乙烯二醇軟膏等)等,通過慣用的方法制備。
向牙、皮膚局部涂布用的藥品可以在適當滅菌的水或非水賦形劑的溶液或懸濁液中配制、作為添加劑,如亞硫酸氫鈉或乙二胺四乙酸二鈉那樣的緩沖劑;含有醋酸或硝酸苯汞、氯化烷基二甲基芐基銨或雙氯苯雙胍己烷那樣的滅菌和抗真菌劑的防腐劑和羥丙基甲基纖維素(ヒプロメルロ-ズ)那樣的增稠劑。
栓劑使用在該領域中眾所周知的載體、最好是非刺激性的適當的輔形劑、例如聚乙二醇類、羊毛脂、可可脂、脂肪酸甘油三酯等載體,最好是在常溫下雖然是固體,但在腸道的溫度下為液體,在直腸內放出融解的藥物的載體等,通過慣用的方法制備,通常按照含有0.1~95重量%程度的本發明化合物那樣制備。由于使用的賦形劑和濃度不同,藥品可以懸浮于或溶解于賦形劑中。象局部麻醉劑、防腐劑以及緩沖劑那樣的輔助藥可以溶解于賦形劑中。適于作為經口使用的制劑,如片劑、丸劑、膠囊、粉末劑、顆粒劑、口含片那樣的固形組成物,或液劑、糖漿、懸濁劑那樣的液狀組成物等。制備制劑時,使用在該領域中已知的制劑輔助劑等。片劑和丸劑還可制造成被糖衣包被。調劑單位方式為膠囊時,可以在上述類型的材料中再含有油脂那樣的液狀載體。
另外,活性成分為蛋白質或多肽時,由于聚乙二醇(PEG)在哺乳動物中毒性極低,所有與它結合特別有用。而與PEG結合,有時可以有效地減少異種性化合物的免疫原性以及抗原性。該化合物也可以加入到微膠囊裝置中給予。象PEG那樣的聚合物可以簡單地附著于在氨基末端的氨基酸的α-氨基、賴氨酸側鏈的ε-氨基、天冬氨酸或谷氨酸的側鏈的羧基、羧基末端的氨基酸的α-羧基、或某種天冬酰胺、絲氨酸或蘇氨酸殘基的糖基鏈被活化的衍生物上。
已知有很多適于與蛋白質直接反應的活化形式的PEG。作為對與蛋白質的氨基反應有用的PEG試劑,如羧酸、碳酸衍生物的活性酯、特別是解離基為N-羥基琥珀酰亞胺、p-硝基苯酚、咪唑、或1-羥基-2-硝基苯-4-硫酸。同樣,含有氨基肼或酰肼基的PEG在通過蛋白質中的過碘化酸氧化生成的醛反應中有用。
本發明的診斷和治療為了能夠適于也許哺乳動物表現出的特定的自身免疫等疾患·疾病、包括癌等惡性腫瘤在內的腫瘤、變態性疾患、炎癥等,通過對該哺乳動物進行診斷開始實施的。為了監測治療進行以及例如為了判斷是否要對正在進行的治療中的給予量或給予次數那樣的參數進行改變,作為治療程序診斷可以在治療期間繼續進行。作為有助于決定有關半乳凝素9突變體治療藥給予的適當性那樣的診斷手法,如哺乳動物中半乳凝素9表達水平的分析、和從自身免疫的部位分離的淋巴細胞等細胞與靠近自身免疫部位的淋巴細胞等細胞之間的這些細胞水平的比較等。要治療的哺乳動物的自身免疫疾患等疾患·疾病、包括癌等惡性腫瘤在內的腫瘤、變態性疾患、炎癥等通過檢測細胞內的半乳凝素9抗原可以進行監測。這樣的監測包括使來自哺乳動物的樣品與半乳凝素9特異的抗體接觸,然后檢測與樣品結合的抗體。
基因治療用載體是用于遞送為了在哺乳動物中表達要被遞送到哺乳動物的本發明的治療藥的包括編碼序列(例如、半乳凝素9突變體編碼序列)在內的構建物(construct)的載體,或用于遞送半乳凝素9突變體的全部或部分,也包括用于遞送的核酸序列的該構建物的載體,可以通過局部或全身的任一種方法給予。這些構建物可以在體內或體外,利用通過病毒載體的途徑或非病毒載體形式的途徑遞送。為了表達這樣的編碼序列,可以通過使用內源性的哺乳動物啟動子或異種啟動子誘導來進行。編碼序列在體內的表達可以是構建形式表達,或可調節地進行的任一種表達方式。當半乳凝素9突變體在哺乳動物被表達時,可以以可溶性的半乳凝素9突變體表達,有時也可以以前體型半乳凝素9突變體形式表達。在這兩種表達形式中或其中的任一種形式中,它們可以是例如整個的半乳凝素9突變體、或半乳凝素9突變體的生物學的活性部分、變異體、衍生物、或融合體等。
本發明提供可以表達所要的半乳凝素9突變體的核酸序列的基因遞送載體。作為基因遞送載體,優選病毒載體,更優選逆病毒、腺病毒、腺隨伴病毒(AAV)、皰疹病毒、或甲病毒等病毒載體等。作為病毒載體,如星狀病毒、冠狀病毒、正粘病毒、乳多泡病毒、副粘病毒、細小病毒、細小核糖核酸病毒、痘病毒、披膜病毒等病毒載體。關于該基因遞送載體,一般可參照D.Jolly,Cancer Gene Therapy,1(1):51-64(1994);O.Kimura et al.,Human Gene Therapy,5:845-852(1994);S.Connelly et al.,Human Gene Therapy,6:185-193(1995);M.G.Kaplitt et al.,Nature Genetics,8:148-153(1994)等。
逆病毒載體在該領域都熟知的,例如、包括B型、C型、和D型逆病毒、xenotropic逆病毒(例如、NZB-X1,NZB-X2,NZB9.1(R.R.O′Neill,J.Virol.,53:100-106(1985)參照)等)、polytropic逆病毒(例如、MCF,MCF-MLV(M.Kelly,J.Virol.,45:291-298(1983)參照)等)、泡沫病毒、慢病毒等(參照R.L.Weiss et al.(Eds.),RNA Tumor Viruses,Second Edition,Cold Spring HarborLaboratory,Cold Spring Harbor,1985)在內的任意逆病毒基因治療載體在本發明中都可以使用。
基因治療逆病毒載體的一部分可以是來自不同逆病毒的部分。例如、逆載體的LTR可以是來自大白鼠肉瘤病毒的,tRNA結合部位可以是來自羅斯肉瘤病毒的,包裝信號可以是來自大白鼠白血病病毒的,第二鏈合成起源可以是來自鳥白血癥病毒的。這些重組逆病毒載體通過將它們導入適當的包裝細胞株,可用于能形成可轉化的逆病毒載體粒子(參照美國專利第5,591,624號說明書)。逆病毒載體可以通過逆病毒粒子內帶有的稱之為整合酶的具有的將目的DNA部位特異地整合到宿主細胞的DNA中的能力的重組酶進行構建。作為重組病毒載體,最好是復制能力缺損重組病毒。
作為適合使用上述逆病毒載體的包裝細胞株,如該領域熟知的細胞株,而且容易制備(參照美國專利第6,013,517號說明書,WO92/05266)。該包裝細胞株可以在用于產生重組載體粒子的生產細胞株(載體細胞株,vector cell line:VCL)中使用。包裝細胞株最好是能夠在人血清中不進行活化,由人的親細胞(例如、HT1080細胞)或水貂的親細胞株制作。
作為逆病毒基因治療載體構建中理想的逆病毒,如鳥白血癥病毒、牛白血病病毒、大白鼠白血病病毒、水貂細胞灶形成病毒、大白鼠肉瘤病毒、網狀細胞內皮癥病毒、羅斯肉瘤病毒等。作為大白鼠白血病病毒特別優選的,例如、4070A和1504A(Hartley & Rowe,J.Virol0.,19:19-25(1976))、Abelson(ATCC No.VR-999)、Friend(ATCC No.VR-245)、Graffi,Gross(ATCC No.VR-590)、Kirsten、Harvey肉瘤病毒和Rauscher(ATCC No.VR-998)、以及莫洛尼小鼠白血病病毒(ATCC No.VR-190)等。
這樣的逆病毒可以從美國典型培養物保藏所(ATCC,Rockville,Maryland,USA)那樣的保藏機構或保存機構獲得,或使用通??衫玫募際跤梢閻墓└捶擲?。
作為在本發明可使用的眾所周知的逆病毒基因治療載體的例子,如GB 2200651,EP 0415731,EP 00345242,WO 89/02468,WO 89/05349,WO 89/09271,WO 90/02806,WO 90/07936,WO 94/03662,WO 93/25698,WO 93/25234,WO 93/11230,WO 93/10218,WO 93/10218,WO 91/02805、美國專利第5,219,740號說明書、同第4,405,712號說明書、同第4,861,719號說明書、同第4,980,289號說明書、同第4,777,127號說明書、同第5,591,624號說明書、Vile,Cancer Res,53:3860-3864(1993),Vile,Cancer Res,53:962-967(1993),Ra,Cancer Res,53:83-88(1993),Takamiya,J Neurosci Res,33:493-503(1992),Baba,J Neurosurg,79:729-735(1993),Mann,Cell 33:153(1983),Cane,Proc Natl Acad Sci USA,81:6349(1984),Miller,HumanGene Therapy,1:5-14(1990)等記載的例子。
人的腺病毒基因治療載體在該領域中也是眾所周知的,可在本發明中使用,例如可以參照Berkne,Biotechniques,6:616(1988);Rosenfeld,Science,252:431(1991);WO 93/07283;WO 93/06223;WO 93/07282等。作為可在本發明中使用的已知的腺病毒基因治療載體例子,如上述參考文獻所述的,例如、WO 94/12649;WO 93/03769;WO 93/19191;WO 94/28938;WO 95/11984;WO 95/00655;WO 95/27071;WO 95/29993;WO 95/34671;WO 96/05320;WO 94/08026;WO 94/11506;WO 93/06223;WO 94/24299;WO 95/14102;WO 95/24297;WO 95/02697;WO 94/28152;WO 94/24299;WO 95/09241;WO 95/25807;WO 95/05835;WO 94/18922;WO 95/09654等所述的例子。另外,就像Curiel,HumanGene Therapy,3:147-154(1992)所述那樣,也可以給予連接在滅活的腺病毒的DNA。
另外作為本發明的基因遞送載體,如腺病毒隨伴病毒(AAV)載體。這樣的載體中用于本發明的理想例子,如象WO 93/09239公布的那樣源于AAV-2的載體。作為最理想的AAV載體,是含有2個AAV的逆末端反復序列的載體。該載體天然的D序列由于核苷酸置換被改變,其結果應當至少還維持著5個天然型核苷酸和直至18個天然型核苷酸(優選至少10個天然型核苷酸和直至18個天然型核苷酸、最優選10個天然型核苷酸),D序列剩下的核苷酸缺失,或被非天然型的核苷酸置換。AAV逆末端反復領域的天然型D序列是在各AAV逆末端反復序列中含有20個連續核苷酸的序列(即在各末端存在一個序列),該序列與HP形成無關。非天然型置換的核苷酸可以是與在同一部位天然型的D序列中發現的核苷酸不同的任意的核苷酸。作為其它的可使用的AAV載體的例子,如pWP-19、pWN-1等(Nahreini,Gene,124:257-262(1993))。作為這樣的AAV載體的其它例子,如psub201等(Samulski,J.Virol.,61:3096(1987))。作為其它的AAV載體例子,如Double-D ITR載體等。制作Double-D ITR的方法如美國專利第5,478,745號說明書公布的方法。此外,AAV載體如美國專利第4,797,368號說明書、同第5,139,941號說明書、同第5,474,935號說明書、WO 94/288157號等公布的載體。作為可在本發明利用的另外的AAV載體例子,如SSV9AFABTKneo,該載體含有AFP0增強子和白蛋白啟動子,而且傾向于在肝臟中優先表達。其結構和制作方法如Su,Human Gene Therapy,7:463-470(1996)公布的方法。作為其它的AAV基因治療載體,如美國專利第5,354,678號說明書、同第5,173,414號說明書、同第5,139,941號說明書、同第5,252,479號說明書等記載的載體。
本發明的基因治療載體可以是皰疹載體。作為主要的皰疹載體的理想例子,如含有編碼胸腺嘧啶脫氧核苷激酶多肽序列的單純皰疹病毒載體(例如、美國專利第5,288,641號說明書和EP 0176170公布的載體)。作為單純皰疹病毒載體的例子如WO 95/04139等公布的HFEM/ICP6-LacZ,Geller,Sclence,241:1667-1669(1988)、WO90/09441、WO 92/07945等記載的pHSVlac,Fink,Human Gene Therapy,3:11-19(1992)記載的HSV Us3::pgC-lacZ、EP 0453242 A記載的HSV7134,2RH 105和GAL4、以保藏號ATCC VR-977和ATCC VR-260寄托于ATCC的載體等。
在本發明中也可以使用甲病毒基因治療載體。作為理想的甲病毒載體,如新培斯病毒載體、披膜病毒、Semliki Forest病毒(ATCCVR-607;ATCC VR-1247)、Middleberg病毒(ATCC VR-370)、Ross River病毒(ATCC VR-373;ATCC VR-1246)、委內瑞拉馬腦炎病毒(ATCC VR 923;ATCC VR-1250;ATCC VR-1249;ATCC VR-532)、美國專利第5,091,309號、同第5,217,879號、和WO 92/10578記載的載體等。另外作為可使用的甲病毒載體,如美國專利第5,091,309號說明書、同第5,217,879號說明書、同第5,843,723號說明書、同第6,376,236號說明書、WO 94/21792、WO 92/10578、WO 95/07994等記載的載體。這樣的甲病毒可以從ATCC(Rockville,Maryland,USA)那樣的保藏機構或保存機構獲得,或使用通??衫玫募際醮右閻墓└捶擲?。最好是能夠使用細胞傷害性可降低的甲病毒載體(參照美國專利第6,391,632號說明書)。
DNA載體系(例如、真核生物級聯式表達系(eukarytic layeredexpression system)等)在用于表達本發明的半乳凝素9突變體的核酸中是有用的。有關真核生物級聯式表達系的詳細情況可以參照WO95/07994。作為本發明的真核生物級聯式表達系最好是來自甲病毒載體的,優選來自新培斯病毒載體的表達系。
作為適合本發明使用的其它病毒載體,如來自脊髓灰質炎病毒(例如、ATCC VR-58,Evans,Nature,339:385(1989),Sabin,J.Biol.Standardization,1:115(1973)等記載的病毒等);鼻病毒(例如、ATCC VR-1110和Arnold,J.Cell Biochem,L401-405(1990)記載的病毒等);痘病毒(例如、金絲雀痘病毒等)或痘苗病毒(例如、ATCC VR-111,ATCC VR-2010等、Fisher-Hoch,Proc Natl Acad SciUSA,86:317(1989),Flexner,Ann NY Acad Sci,569:86(1989),Flexner,Vaccine,8:17(1990)、美國專利第4,603,112號說明書以及同第4,769,330號說明書、和WO 89/01973中記載的病痘毒等);SV40病毒(例如、ATCC VR-305和Mulligan,Nature,277:108(1979)和Madzak,J.Gen.Vir,73:1533(1992)中記載的病毒等);流感病毒(例如、ATCC VR-797等)、使用美國專利第5,166,057號說明書、Enami,Proc Natl Acad Sci USA,87:3802-3805(1990),Enami &Palese,J Virol,65:2711-2713(1991),Luytjes,Cell,59:110(1989),McMicheal.,N E J Med,309:13(1983),Yap,Nature,273:238(1978)、以及Nature,277:108(1979)等中記載的那樣的逆遺傳學技術制作的重組流感病毒;EP 0386882、Ruchschacher,J.Vir.,66:2731(1992)等記載的人免疫不全癥病毒;麻疹病毒(例如、ATCCVR-67,VR-1247以及EP 0440219記載的病毒等);奧拉病毒(例如、ATCC VR-368等);Bebaru病毒(例如、ATCC VR-600和ATCC VR-1240等);Cabassou病毒(例如、ATCC VR-922等);奇昆貢亞病毒(例如、ATCC VR-64,ATCC VR-1241等);Fort Morgan病毒(例如、ATCCVR-924等);Getah病毒(例如、ATCC VR-369,ATCC VR-1243等);Kyzylagach病毒(例如、ATCC VR-927等);馬亞羅病毒(例如、ATCCVR-66等);穆茨布病毒(例如、ATCC VR-580,ATCC VR-1244等);恩杜姆病毒(例如、ATCC VR-371等);Pixuna病毒(例如、ATCC VR-372,ATCC VR-1245等);Tonate病毒(例如、ATCCVR-925等);Triniti病毒(例如、ATCC VR-469等);Una病毒(例如、ATCC VR-374等);Whataroa病毒(例如、ATCC VR-926等);Y-62-33病毒(例如、ATCC VR-375等);O′Nyong病毒、東部腦炎病毒(例如、ATCC VR-65,ATCC VR-1242等);西部腦炎病毒(例如、ATCC VR-70,ATCC VR-125L,ATCC VR-622,ATCC VR-1252等);冠狀病毒(例如、ATCC VR-740,Hamre,Proc Soc Exp Biol Med,121:190(1966)記載的病毒)的載體等。
將本發明的組成物向細胞遞送不限定于上述的病毒載體。也可以使用其它的遞送方法和媒體,作為這樣的方法和媒體,例如核酸表達載體、只與滅活的腺病毒連結的多陽離子性復合體DNA(例如參照Curiel,Hum Gene Ther,3:147-154(1992))、配位體連結DNA(例如參照Wu,J Biol Chem,64:16985-16987(1989))、真核生物細胞遞送載體細胞(例如、參照美國專利第6,013,517號說明書、同第6,015,686號說明書等)、光聚合的水凝膠物質沉淀物、象美國專利第5,149,655號說明書記載的那樣的攜帶型基因導入粒子槍、WO92/11033記載的電離放射線法、核電荷中和法、或與細胞膜的融合法等。另外作為手法如Philip,Mol Cell Biol,14:2411-2418(1994),Woffendin,Proc Na0000tl Acad Sci USA,91:1581-585(1994)記載的方法等。
也可以使用粒子媒介基因轉移技術,序列被插入到用于高水平表達的含有慣用的調控序列的通常載體,然后與被連接在合成基因轉移分子(例如、細胞靶配位體(例如、Wu et al.,J.Biol.Chem.,262:4429-4432(1987)記載的那樣的脫唾液酸類黏蛋白、Hucked,BiochemPharmacol,40:253-263(1990)記載那樣的胰島素、Plank,Bioconjugate Chem,3:533-539(1992)記載的那樣的半乳糖、乳糖、或鐵傳遞蛋白等)的聚賴氨酸、魚精蛋白、和白蛋白那樣的聚合性DNA結合陽離子溫育。
也可以使用裸DNA,例如、作為裸DNA的導入方法如WO 90/11092和美國專利第5,580,859號說明書記載的方法等。收率使用生物降解性乳膠珠可以改善。DNA包被乳膠珠,該珠被胞飲后可有效地輸送到細胞內。該方法使疏水性增大,由此通過使包裹小泡破裂和使DNA釋放到細胞質那樣的珠處理可以進一步改善。
作為基因遞送載體可以起作用的那樣脂質體如美國專利第5,422,120號說明書、WO 95/13796,WO 94/23697,WO 91/144445和EP 524,968記載的。在非病毒的遞送法中,編碼半乳凝素9突變體多肽的核酸序列可以被插入到用于高水平表達的通常含有調控序列的慣用的載體,然后與合成基因導入分子溫育。作為該合成基因導入分子,例如與細胞靶的配位體(例如、脫唾液酸血清類粘蛋白、胰島素、半乳糖、乳糖、鐵傳遞蛋白等)連接的聚合性DNA結合陽離子。作為聚合性DNA結合陽離子,例如、聚賴氨酸、魚精蛋白、白蛋白等。作為其它的遞送系,例如可以使用用于將含有多種組織特異的或普遍活性的啟動子調控下的基因的DNA膠囊化的脂質體。作為適合使用的非病毒的遞送法,如機械遞送系(例如、Woffendin et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,91(24):11581-11585(1994)記載的手法)。
另外編碼序列和這樣的表達產物可以通過光聚合的水凝膠物質的沉淀遞送。作為可用于遞送編碼序列的基因遞送的其它方法,例如、使用美國專利第5,149,655號00說明書記載的攜帶型基因導入粒子槍的方法、WO 92/11033記載那樣的為了對導入的基因進行活化使用電離放射線的方法等。
作為脂質體和多陽離子性基因遞送載體的例子,如美國專利第5,422,120號說明書和同第4,762,915說明書、WO 95/13796,WO94/23697,WO 91/14445,EP 0524968,Stryer,Biochemistry,236-240(1975),W.H.Freeman et al.,Biochem Biophys Acta,600:1(1980),Bayer,Biochem Biophys Acta,550:464(1979),Rivnay,Meth Enzymol,149:119(1987),Wang,Proc Natl Acad Sci USA,84:7851(1987),Plant,Anal 0Biochem,176:420(1989)等記載的載體。
本發明公布了對陷于包含包括癌等惡性腫瘤在內的腫瘤、變態性疾患、炎癥、免疫異常、活化淋巴細胞(特別是活化T細胞,也可包括活化B細胞)的自身免疫疾患等疾患和疾病的哺乳動物通過給予半乳凝素9突變體或來自半乳凝素9突變體的治療劑(例如、作為治療活性成分含有半乳凝素9突變體多肽或用于在哺乳動物中表達的編碼半乳凝素9突變體多肽的聚核苷酸等的組成物)進行治療的方法。作為可以通過本發明的方法和組成物治療的自身免疫疾患,如任意的自身免疫疾患或移植排斥(例如、包括本說明書中列舉的自身免疫疾患,但不限定于這些)。
半乳凝素9突變體例如可以以通過重組技術表達的多肽、或半乳凝素9突變體多肽的突變體、其衍生物、或它的融合蛋白質形式給予,可以通過局部或全身任一種方式遞送給哺乳動物。編碼半乳凝素9突變體、半乳凝素9突變體的衍生物或突變體、或半乳凝素9突變體融合體的核酸(DNA、RNA等)在基因治療程序中可以以包含用于在哺乳動物中表達的調節區的裸質粒DNA形式,或通過用于在哺乳動物中表達的病毒載體給予。用于表達的半乳凝素9突變體多肽的遞送可以使用使遞送變得容易的那樣的藥學上容許的載體完成。對有自身免疫疾患的哺乳動物用來自半乳凝素9突變體的治療劑進行治療后,可以使自身免疫疾患改善或緩解,或使起因于自身免疫的臨床癥狀消失。
本發明不受本發明公開的治療劑怎樣起作用的理論限定,而是應當由引起自己識別,然后傷害自身免疫的活化T細胞等決定。通過表達半乳凝素9突變體,或是使半乳凝素9突變體表達,或給予來自半乳凝素9突變體治療劑,有問題的活化淋巴細胞受到可利用的半乳凝素9突變體的影響,優先成為靶子,進行凋亡。半乳凝素9突變體多肽或來自半乳凝素9突變體治療劑可以投到表現出自身免疫的區域(例如、進行治療的表現出特定自身免疫疾患特征那樣的局部區域)。由此,給予的半乳凝素9突變體以及其它治療劑與在該區域的細胞表達的具有靶標的活化T細胞等之間的接觸被最適化。因此,該區域的細胞成了借助于基因遞送載體的幫助被投到該區域的編碼半乳凝素9突變體多肽的聚核苷酸表達時的良好的候補。由此對本發明進行各種變更、運用,按照能夠使半乳凝素9突變體多肽表達那樣進行操作,可以在處于被活化T細胞等攻擊下的細胞中進行表達。對于移植排斥的場合,例如與能夠結合很多細胞型的在細胞表面上遍在表達的蛋白質的分子結合部融合的半乳凝素9突變體多肽。該結合部分,例如可以是肝素,而結合的細胞表面上的分子也可以是葡糖胺聚糖。另外該結合部分也可以是對任意選擇的細胞表面抗原特異的單鏈抗體的結合結構域。
關于本發明,對于包括癌等惡性腫瘤細胞在內的腫瘤細胞獲得細胞傷害作用,或獲得抗變態性作用,或獲得抗炎癥作用,或使免疫異常正?;?,對于活化淋巴細胞(特別是也可以包括活化T細胞)誘導凋亡的場合都應當與上述自身免疫的場合同樣理解。
本說明書中使用的「給藥」或「進行給藥」指的是將治療劑或治療劑的配合物遞送到哺乳動物的過程。給藥過程可以因治療劑(單個或多個的治療劑)和所期望的效果不同進行改變。給藥可以通過例如非經口的遞送或經口的遞送等適合治療劑的任意手段完成。作為非經口的遞送,例如向皮下、靜脈內、肌肉內、動脈內遞送、向器官組織的注射、通過粘膜、肺、局部的或通過導管遞送等。經口的手段是經由口給藥的手段,例如、可以使用片劑或其它經由胃腸的遞送手段(包括可飲用的液體)等進行。作為經由粘膜的遞送,例如鼻腔內遞送等。作為經由肺的遞送,可以使藥劑吸入。給藥一般來說也可以通過使用藥學上容許的載體(例如、緩沖液、多肽、肽、云芝多糖綴合物、脂質體、脂等)遞送進行?;蛑瘟瞥絳虬ㄗ魑瘟萍寥銜梢愿柙誆溉槎鏌宰嘉锘蚨嚯男問獎澩鍤蹦芄淮锏街瘟頗康木酆塑賬岬某『?,也可適用于非經口的遞送手段和經口的遞送手段中任一種手段。這樣的給藥手段可以按照適合治療的疾患情況進行選擇。例如,疾患為器官基底的場合,遞送可以是局部遞送,例如,疾患為全身的場合,遞送可以是全身的。所謂聯合用藥指的是在對某患者的治療中再給予一種或一種以上的治療劑。治療劑可以使用同樣的藥學的載體給予,或也可以使用不同的載體給予。這些載體可以通過同樣的或不同的給予手段給予。藥劑可以是同型的藥劑,或不同型的藥劑,例如、作為不同型,如聚核苷酸、多肽、或低分子的藥劑。給藥時間可以是恰好同一時間,1種治療劑也可以在另外的藥劑之前或之后給藥。因此聯合用藥可以同時,也可以連續進行。用于將治療劑做成所定的組合的正確程序可以在考慮藥劑和按照其它考慮已治療的狀態后決定。
所謂用語「體內給藥」指的是為了在哺乳動物中表達,將編碼多肽的聚核苷酸投給患者(例如、哺乳動物)。特別是作為直接的體內給藥,如細胞不從哺乳動物取出,而是通過編碼序列轉染哺乳動物細胞。因此作為直接的體內給藥,為了在患者細胞中發生表達,可以直接將編碼目的多肽的DNA直接注射到陷于自身免疫疾患煩惱的區域。
用語「體外給藥」指的是將細胞從患者(例如、哺乳動物)中取出后,對細胞(例如、來自于處于自身免疫攻擊下的細胞集団的細胞)進行轉染處理。轉染后,細胞被返回到哺乳動物。體外給藥是將細胞從哺乳動物取出,根據需要,選擇要轉化的細胞(即受到自身免疫機構攻擊下的細胞),要將被選擇的細胞做成不能復制,將選擇的細胞用編碼要表達的基因(即半乳凝素9突變體)的聚核苷酸(為了使表達容易進行也可含有調節區域)進行轉化,為了使半乳凝素9突變體表達,通過將被轉化的細胞返回到患者達到。
作為治療的有效量,指的是產生所期望的治療結果那樣的量。例如、當所期望的治療效果是自身免疫治愈時,所謂的治療的有效量指的是容易達到治愈的那樣的量。所謂治療上有用的量可以是例如、在包括數日或數周間給藥那樣的投藥程序中投給的那樣的量。治療效果,例如在自身免疫疾患的癥狀出現期間,可以使哺乳動物的自身免疫應答的影響降低時在哺乳動物中用于獲得這樣效果的藥劑的有效量指的是造成自身免疫的癥狀減少那樣的量。
用語「藥學上容許的載體」指的是用于給予治療劑(例如、多肽、聚核苷酸、低分子、肽性物質、肽等)載體,載體本身不誘導接受組成物的個體產生有害的抗體,而且不能產生有問題那樣的毒性,可以給予的那樣的任意的藥學上容許的載體。在本發明的另外方式中,提供與藥學上容許的載體或稀釋劑組合,含有上述那樣的重組病毒載體的藥學的組成物。這樣的藥學的組成物可以是液體溶液形式的組成物,或制備成在給予前可懸浮于溶液的固體形式(例如、冷凍干燥的產品)。另外,該組成物也可以使用適合于給予表面,或注射,或經口給予,或經直腸給予的載體或稀釋劑進行制備。作為藥學上容許的載體或稀釋劑,在使用的給予量和濃度下對接受者(recipient)基本上是無毒的。作為用于可注射的溶液的載體或稀釋劑的代表例子,如水、等滲生理食鹽水溶液(理想的是在生理pH下具有緩沖的溶液、例如、磷酸緩沖生理鹽水、Tris緩沖生理鹽水等)、甘露醇、葡萄糖、甘油糖、乙醇、多肽或蛋白質(例如、人血清白蛋白)等。載體或重組病毒可以加入到含有10mg/ml甘露醇、1mg/ml HSA、20mM Tris(pH7.2)、和150mM NaCl的藥學的組成物后進行遞送。此時重組載體約為1g物質,高分子物質不到1%,總物質量(包括水)在1/100,000以下。該組成物至少了在20℃下穩定6個月間。
本發明的藥學的組成物可以含有刺激細胞分裂的因子,因此可以含有整合重組逆病毒載體,刺激組合的因子。重組病毒的保存法可以參照美國專利第5,792,643號說明書記載的保存法。
用于實施本發明提供的治療法的所有治療劑可以加入到含有治療藥用的藥學上容許的載體的適當的藥學組成物。用于治療藥的藥學載體可以是同樣的,也可以因各個治療藥不同而不一樣。作為合適的載體,可以是大的、而且代謝緩慢的巨大分子(例如、蛋白質、多糖、聚乳酸、聚乙醇酸、聚合氨基酸、氨基酸共聚物、粒子中的不活性病毒等)。這樣的載體對于同行眾所周知。
作為藥學上容許的鹽,例如無機酸鹽(例如鹽酸鹽、溴氫酸鹽、磷酸鹽、硫酸鹽等);有機酸鹽(例如醋酸鹽、丙酸鹽、丙二酸鹽、苯甲酸鹽等)),這些鹽可以加入到該組成物后使用。有關藥學上容許的賦形劑可以參照例如Remington′s Pharmaceutical Sciences(Mack Pub.Co.,N.J.,USA,1991)。作為治療組成物中的藥學上容許的載體,例如水、生理鹽水、甘油糖、乙醇等液體。作為助劑,例如濕潤劑、乳化劑等,也可以將pH緩沖物質等加入到這樣的載體中。代表性的治療組成物可以制備成可以注射的任一種液體溶液或懸浮物;在注射前制備成可以使用液體載體適合做成液體或懸浮物的固體形態載體。在藥學上容許的載體的定義內也包含脂質體。
還可以提供與藥學上容許的載體或稀釋劑組合,包含有重組逆病毒或一個上述的載體構建物的病毒的藥學組成物。該組成物可以制備成液體溶液或在給予前可懸浮于溶液的固體形式(例如、冷凍干燥的產品)中任一種。另外,該組成物也可以使用適合于給予表面,或注射,或經口給予,或經直腸給予的載體或稀釋劑進行制備。
作為藥學上容許的載體或稀釋劑,在使用的給予量和濃度下對接受者(recipient)基本上是無毒的。作為用于可注射的溶液的載體或稀釋劑的代表例子,如水、等滲生理食鹽水溶液(理想的是在生理pH下有緩沖作用的溶液、例如、磷酸緩沖生理鹽水、Tris緩沖生理鹽水等)、甘露醇、葡萄糖、甘油糖、乙醇、多肽或蛋白質(例如人血清白蛋白)等。載體或重組病毒可以加入到含有10mg/ml甘露醇、1mg/mlHSA、20mM Tris(pH7.2)、和150mM NaCl的藥學組成物后進行遞送。此時重組載體約為1g物質,高分子物質不到1%,總物質量(包括水)在1/100,000以下。該組成物至少了在20℃下穩定6個月間。
藥學上容許的載體或稀釋劑為了能夠做成液體溶液或給藥前能夠懸浮于溶液的固體方式(例如、冷凍干燥的方式)中的任一種方式的組成物,可以與基因遞送載體組合。2個以上的基因遞送載體可以借助于代表性的傳統的直接途徑例如頰/舌下、直腸、經口、經鼻、局部(例如、經皮和眼等)、陰道、肺、動脈內、肌肉內、腹腔內、皮下、眼內、鼻腔內、或靜脈內),或間接給藥。
本發明的治療藥可以任意地含有例如用于在哺乳動物中表達的聚核苷酸,該治療藥可以根據該領域中眾所周知的方法,制作成腸溶性片劑和膠囊劑等制劑。這些可以參照以下的專利:例如、美國專利第4,853,230號說明書、EP 225,189、AU 9,224,296、AU 9,230,801、和WO 92144,52等。這樣的膠囊可以經口給予,以腸為靶。經口給藥后1~4日,通過使用抗該蛋白質的抗體等測定血漿和血液決定例如多肽的表達是否在進行,或例如是否發生由核酶或反義寡核苷酸引起的表達被抑制。
基因遞送載體可以象例如美國專利第4,411,648號說明書、同第5,222,936號說明書、同第5,286,254號說明書、WO 94/05369等記載的那樣,通過例如注射、粒子槍、局部給藥、非經口給藥、吸入、或離子導入遞送等導入哺乳動物。
治療組成物或治療劑也可以與能夠改善包括癌等惡性腫瘤在內的腫瘤、變態性癥、炎癥、免疫異常、自身免疫疾患那樣的其它治療劑、或能夠增強給予半乳凝素9突變體治療劑獲得的治療上利益那樣的其它治療劑一起給予。例如、在為了治療變態性反應給予時,為了能夠在存在于粘膜、鼻、支氣管、肺等組織的細胞中表達,可以給予半乳凝素9突變體聚核苷酸的氣霧,為了更有利,例如在變態性反應平息之前的期間,每日數次、通過鼻用噴霧或氣霧噴霧反復給藥。
基因遞送載體可以直接給到哺乳動物的單一部位或多個部位,例如可以通過直接注射給予?;虻菟馱靨逡部梢允褂猛ü逋庾既氳陌邢赴?。本發明還提供適合基因遞送載體給予的藥學組成物(包括例如各種賦形劑)。
可以將半乳凝素9突變體多肽、其突變體、衍生物、類似物、變異體、或指示嵌合表達的載體構建物直接給予包括癌等惡性腫瘤在內的腫瘤部位、表現出變態性的部位、炎癥部位、表現出免疫異常的部位、表現出自身免疫的部位(例如、胰臟、腎臟、肝臟、關節、腦、脊髓液、皮膚、或身體其它區域或器官)。為了直接給予載體構建物,在本發明的范圍內可以使用各種各樣的方法。例如、如果已鑒定有在某區域起作用的動脈的話,為了直接將載體遞送到該部位,可以注射到這樣的動脈中。同樣通過使用例如含有載體構建物的局所用藥劑組成物,可以將載體構建物直接給到皮膚表面。
在直接給藥中,可以將半乳凝素9突變體治療劑和含有其它的抗自身免疫藥劑的配合治療劑一起給予。聯合用藥可以同時進行,例如,通過在同一載體中放置編碼藥劑的聚核苷酸,不管是聚核苷酸、多肽、其它的藥物,將藥劑加入到同一藥劑組成物中,或可以在幾乎同一時間,幾乎同一位置將藥劑加入到可以注射的其它的藥劑組成物中然后給予可以完成聯合用藥。不同時進行聯合用藥時(例如,給予藥物前體激活劑后,給予藥物前體那樣的場合)、第2個藥劑為了適合治療目的,可以通過直接注射給藥。因此,象例如給予藥物前體那樣的場合,藥物前體應當給到與藥物前體激活劑同一部位。因此作為聯合用藥程序,可以含有用于達到治療目的的給藥組合。另外,聯合用藥根據需要,可以包括之后給藥(例如,反復進行體內直接注射給予半乳凝素9突變體治療那樣的方式)。
本發明中,取出的細胞應當理解為能夠返回到同一動物或另外的同種異系的動物或哺乳動物的細胞。這樣的場合,一般來說,組織適合性最好是符合該動物(并非限定于此,例如參照Yamamoto et al.,AIDS Research and Human Retroviruses,7:911-922(1991);Yamamoto et al.,Journal of Virology,67:601-605(1993))。
可以從患者的各個部位取出細胞。另外在本發明的其它的實施方式中,可以將載體構建物導入到例如來自皮膚的細胞(皮膚成纖維細胞等)或來自血液的細胞(例如、外周血白細胞等)??梢源友禾匾烊〕鏊諭?、細胞的特定級分(例如、T細胞部分集合或干細胞等)(參照例如、WO 91/16116)。然后利用任意的上述技術使取出細胞與載體構建物接觸,然后將該細胞返回到溫血動物(最好是表現出自身免疫的區域付近或付近內)。
例如一旦對哺乳動物等患者進行診斷,進行包括給予半乳凝素9突變體治療劑,或按照適于治療的特定疾患·疾病(例如、腫瘤、變態性、自身免疫疾患等)的手法和用量將該治療劑給予哺乳動物,以及為了決定有無必要連續給予治療劑或修正給予進行監測哺乳動物等在內的本發明的實施。本發明中所謂實施包括對治療的疾患進行鑒定,決定可適用于靶基因治療的有希望細胞型或身體區域。構建半乳凝素9突變體聚核苷酸(含有用于在哺乳動物中表達的調節區域的質粒、或含有用于表達的病毒載體),取出一些哺乳動物細胞,再用編碼半乳凝素9突變體的聚核苷酸進行轉染處理,然后為了使半乳凝素9突變體表達,加入到哺乳動物中?;蛘?,聚核苷酸例如為了在疾患清楚的區域中進行表達可以投給哺乳動物。
因此,例如對于惡性腫瘤細胞的場合,通過在體內或體外使用半乳凝素9突變體可以對患部組織或臟器等腫瘤細胞進行轉染處理。另外,例如對于慢性關節炎風濕病的場合,可以在體外使用半乳凝素9突變體對由關節液得到的細胞進行轉染。
例如在多發性硬化癥治療中,可以向受到影響的腦區域注射半乳凝素9突變體,也可以使半乳凝素9突變體在處于自身免疫反應型的活化T細胞等攻擊的細胞中容易表達。另外一個例子,對于多發性硬化癥的場合,半乳凝素9突變體DNA可以局部注射于哺乳動物腦中,也可以取出來自脊髓液的細胞,將它用半乳凝素9突變體DNA進行轉染處理,返回到脊髓區域。作為另外的例子,為了治療具有肖格倫綜合征的哺乳動物,作為該疾病的靶器官,也可以選擇適于通過注射給予半乳凝素9突變體多肽的方式。另外對于患有肖格倫綜合征的哺乳動物,也可以對罹患器官(例如、腎臟等)進行鑒定,直接將半乳凝素9突變體DNA給到該器官,也可以取出來自器官的細胞,進行轉染處理,然后返回到身體使半乳凝素9突變體在哺乳動物的這些細胞中表達。
例如予防移植排斥時,接受移植的動物由于象對外來細胞、外來組織、或外來器官進行攻擊那樣捕殺活化患者細胞,所以可以局部或全身給予半乳凝素9突變體治療劑,為了能夠暫時對患者身體內器官進行?;?,在移植開始前也可以使半乳凝素9突變體多肽在器官外表面上的細胞中進行表達。接受移植的人的免疫系在順應外來細胞、外來組織、或外來器官之前期間,連續給予半乳凝素9突變體治療劑大概是很有必要的。
預期半乳凝素9突變體治療劑具有類似于天然半乳凝素9的作用。為了引起凋亡反應可以使用半乳凝素9突變體治療劑。因此,在臨床醫療中,為了達到凋亡,應當可以從化學計量上知道需要表達或給予哺乳動物的半乳凝素9突變體量。就本發明的其它方式來說,本說明書中公開的載體構建物當然也可以指示來自非載體的基因的表達。例如,與適于與半乳凝素9突變體一起給予的藥物前體系可以起到用于基因治療的安全機構的作用,也可以用作并用治療劑。
也可以使藥物前體激活劑與半乳凝素9突變體一起在載體中表達,確保安全機構。如果決定該活化系應當被停止,給予藥物前體,使該藥物前體激活劑活化。通過這樣治療,可以賦予臨床醫治基因治療期間的調控手段。藥物前體激活劑/藥物前體系可用于哺乳動物(例如、自身免疫由于半乳凝素9突變體表達惡化的那樣場合)中轉染細胞的鈍化。藥物前體激活劑/藥物前體系為了能夠使用通過該系提供的藥物前體活化的細胞傷害作用,可以進行組合治療,或在治療劑中并用給予使用。
包括與藥物前體激活劑和藥物前體一起給予編碼半乳凝素9突變體多肽的聚核苷酸的治療可以是免疫調節性的治療。所謂免疫調節性指的是引起性質或效力與因子不存在下發生的免疫應答不同的免疫應答的因子的使用,該因子可以是與免疫應答有關的一個以上細胞制造的,也可以外源添加到細胞的因子。應答的性質或效力可以通過同行眾所周知的各種分析(例如、測定細胞增殖(例如、3H胸腺嘧啶脫氧核苷的攙入)的體外分析和體外細胞傷害分析(包括例如測定51Cr的釋放))進行測定(參照Warner et al.,AIDS Res.and HumanRetroviruses,7:645-655(1991))。作為免疫調節因子,是在體內和體外都具有活性的因子。這樣的因子的代表例如細胞因子(例如、白介素2,4,6,12和15)、α干擾素、β干擾素、γ干擾素、GM-CSF、G-CSF、和腫瘤壞死因子(TNF)等。作為其它的免疫調節因子,例如CD3,ICAM-1,ICAM-2,LFA-1,LFA-3,MHC類I分子,MHC類II分子、β2-巨球蛋白、伴侶、其類似物等。而且當基因遞送載體不表達作為細胞因子的免疫調節輔因子時,該細胞因子可以包含在上述的組成物中,與上述的組成物同時或延后給予。需要時,在這樣的實施方式中,免疫調節補因子最好是根據該領域中已知的標準的程序和給藥量給予。例如、α干擾素在2~4個月間可以按照100~500萬單位/日給藥量給予,而IL-2可以在2~12周間,按照1~3次/日、10,000~100,000單位/kg體重的給藥量給予。γ干擾素例如為了通過給予半乳凝素9突變體達到更有效的治療,為了在活化T細胞中對問題基因的表達進行正調節,可以按照2~12周間、2~3次/周、150,000~1,500,000單位的給藥量給予。
在并用治療劑中,藥物前體激活劑也可以由該激活劑的載體表達,也可以由與半乳凝素9突變體多肽同樣的載體進行表達??梢越我恢衷靨逑?單一載體或2個載體)通過體內或體外手段給予。在自身免疫治療中,例如,藥物前體激活劑的添加可以更進一步促進支持由半乳凝素9突變體達到的效果的免疫調節效果,而藥物前體添加可以對轉染細胞的殺傷再進行活化。
伴侶分子可以在聚核苷酸治療藥給予前、給予同時,或給予后給予,而伴侶分子可以是例如熱休克蛋白質(例如、hsp70)。在哺乳動物中表達的聚核苷酸可以再與例如用于確實只在所期望靶細胞進行聚核苷酸表達目的的誘導啟動子(例如、組織特異的啟動子)連接。為了將聚核苷酸有效地遞送到組織的目的,聚核苷酸可以與適合于向該組織的細胞基因組整合的核苷酸序列鄰接。
對于本發明的這一方式和許多方式,對人進行治療的有效性最初可以在所定的自身免疫疾患動物模型中進行試驗。作為這樣的現存動物模型,包括例如肖格倫綜合征(自身免疫淚腺炎或免疫媒介唾液腺炎)、自身免疫心肌炎、原發性膽汁性肝硬變(PBC)、炎癥性心疾患、水銀誘導性腎臟自身免疫、胰島素依賴性糖尿病(I型糖尿病或IDD)、胸腺摘出后自身免疫、中樞神經系(CNS)脫髓損傷、CNS狼瘡、發作性睡眠、重癥肌無力癥(MG)、突眼性甲狀腺腫、免疫媒介PNS損傷、變形性關節癥、慢性關節風濕病、葡萄膜炎、髓質囊胞性纖維癥、自身免疫溶血性疾患、自身免疫脈管炎、卵巢自身免疫疾患、和人強皮癥(schleroderma)等在內的自身免疫疾患動物模型。
可以將多個基因遞送載體給予動物或植物。在理想的實施方式中,動物為溫血動物,最好是從小鼠、雞、牛、豬、寵物(例如、貓和狗)、馬、和人中選擇。至于多肽治療藥(例如、半乳凝素9突變體或其它細胞因子),給藥量可以是約5~50μg/kg哺乳動物體重、或約50μg/kg~約5mg/kg、或約100~500μg/kg哺乳動物體重和約200~約250μg/kg的范圍。
關于多肽治療藥(例如編碼天然或變異體的半乳凝素9突變體多肽的聚核苷酸等)在以組織為靶的給藥中,根據聚核苷酸在患者(例如、哺乳動物)中的表達,可以象下面那樣給予含有編碼序列或非編碼序列的可表達構建物的載體:在局部給藥的基因治療程序中,可以在約100ng~約200mg DNA、或約500ng~約50mg DNA、或約1μg~約2mg DNA、或約5μg DNA~約500μg DNA范圍內給藥,而在基因治療程序中的局部給藥中間,可以在約20μg~約100μg范圍給藥,例如每次注射或給藥,按照約500μg的用量給藥。期望更多表達時,遍及組織的更廣的區域,按照連續給藥程序再給予更多的量的DNA或同樣量的DNA,例如可以向腫瘤部位附近不同的或緊連的組織部分給予一些,這樣給藥對于帶來陽性的治療結果很有必要。
有關低分子治療藥的給予,可以根據低分子的效力改變給藥量。如果是非常強的抑制劑,其給藥量如用哺乳動物每公斤的量表示的話,例如、在約1μg/kg~約500mg/kg、或約100μg/kg~約5mg/kg、或約1μg/kg~約50μg/kg、或例如約10μg/kg的范圍非常充分。就肽和類肽的給藥來說,效力因給藥量而有所變化,可以是約1μg/kg~約500mg/kg哺乳動物體重、和約100μg/kg~約5mg/kg、和約1μg/kg~約50μg/kg的范圍。而通常的用量可以是約10μg/kg。
本發明的活性成分可以在很寬范圍選擇該成分的給藥量給藥,該給藥量和給藥次數等可以根據治療患者的性別、年齡、體重、一般的健康狀態、飲食、給藥時間、給藥方法、排泄速度、藥物的組合、患者此時進行治療的病狀的程度考慮這些因素或其它要因之后決定。
在進行藥物品制造時,其添加劑等和制備法等可以參考例如日本藥局方解說書編集委員會編、第十四改正日本藥局方解說書、平成13年6月27日發行、株式會社廣川書店;一番ケ瀬尚他編醫藥品的開發12卷(制劑素劑〔I〕)、平成2年10月15日發行、株式會社廣川書店;同、醫藥品的開發12卷(制劑素材〔II〕)平成2年10月28日發行、株式會社廣川書店等記載,從這些記載中根據需要適當選擇運用。
本發明的活性成分包括本說明書中說明的(a)半乳凝素9突變體以及與其具有基本上均等的生物活性的多肽等、(b)編碼半乳凝素9突變體以及與其具有基本上均等的生物活性的多肽的聚核苷酸、(c)利用半乳凝素9突變體技術發現的因子等、(d)半乳凝素9突變體以及與其具有基本上均等的生物活性的多肽基因遞送載體等,這些成分在利用人半乳凝素9對正常細胞不表現出傷害活性,而對腫瘤細胞表現傷害細胞活性的性狀、對腫瘤細胞誘導凋亡,但對正常細胞不誘導凋亡的性狀、抑制惡性細胞的轉移性的性狀、誘導被活化的免疫細胞、特別是活化的CD4陽性T細胞的凋亡的活性(與此相反,靜息T細胞、特別是CD4陽性T細胞(協助者T細胞)的凋亡誘導稱之為不誘導凋亡的性狀)等上是有用的,有望作為利用與抗腫瘤劑、抗變態性劑、免疫調節劑、自身免疫疾患用劑、抗炎癥劑、腎上腺皮質類固醇激素同樣活性的藥劑。
根據使用本發明的活性成分、例如半乳凝素9突變體(特別是G9NC(null))確認的生物活性效果,認為半乳凝素9以及半乳凝素9突變體(特別是G9NC(null))對于如下給出的那樣病的癥狀和疾患表現出有用的生物活性。
在炎癥性疾患中有各臟器中發生的各種急性和慢性炎癥、變態性和自身免疫性的炎癥、感染癥等。
作為急性和慢性疾患,包括例如肺炎中支氣管炎、支氣管肺炎、間質性肺炎、肺臟炎、細支氣管炎和急性縱隔炎等,以及其它的的臟器的炎癥,例如心外膜炎、心內膜炎、心肌炎、口內炎、口角炎、扁桃炎、咽炎、喉頭炎、食道炎、腹膜炎、急性胃炎、慢性胃炎、急性腸炎、蟲垂炎、缺血性大腸炎、藥物性大腸炎、直腸炎、A型肝炎、B型肝炎、C型肝炎、重癥肝炎、慢性肝炎等各種急性和慢性肝炎和肝硬變、膽囊炎、急性胰炎、慢性胰炎、還有急性和慢性腎炎、膜性腎炎、絲球體腎炎、IgA腎癥等和各種各樣的膀胱炎、腦髓炎、乳腺炎、皮炎、表層角膜炎、干性角結膜炎、各種中耳炎和鼻炎、副鼻腔炎和鼻茸等、牙肉炎、牙周炎、牙周圍炎等各種各樣的炎癥。
另外,在神經性炎癥(例如神經性胃炎、神經性膀胱炎等)中也看到了效果。例如,通過實施例8確認,半乳凝素9在辣椒辣素誘導神經性皮炎癥模型中對模型的炎癥反應具有強的抑制效果。辣椒辣素是通過刺激末梢神經引起神經性炎癥和疼痛的物質。辣椒辣素具有刺激儲藏在作為知覺神經C纖維末端的神經肽的物質P釋放的作用。物質P具有使組胺從肥大細胞釋放的作用,結果血管被擴張,出現浮腫。另外,由于釋放的組胺作用,知覺神經受到刺激,物質P由C纖維末端釋放,作用于其周圍的肥大細胞,出現再使組胺釋放的增強循環。半乳凝素具有抑制該病態形成的作用。
再者辣椒辣素與感覺神經末梢的疼痛受容傳感器的辣椒辣素受體(香草素受體)結合,引起疼痛。疼痛是由于化學刺激(酸等)、熱刺激(開水等)或過度的機械刺激(創傷等)感覺神經末梢被活化引起的,辣椒辣素受體也參與由于這樣的刺激引起的疼痛。這表明半乳凝素9抑制由辣椒辣素受體導致的神經末梢的活化,預期有可能具有使伴隨癌或炎癥引起的疼痛減輕等鎮痛作用。
變態性炎癥疾患如全身性過敏性、支氣管哮喘、過敏性肺炎、花粉癥、變態性鼻炎、變態性結膜炎、免疫復合體引起的變態性疾患、血管神經性浮腫等。
另外自身免疫性的炎癥(自身免疫疾患)中有全身性(慢性關節風濕病、全身性紅斑狼瘡、結節性多發性動脈炎、強皮癥、多發性肌炎·皮膚肌炎、肖格倫綜合征、貝切特病等)、神經系(多發性硬化癥、重癥肌無力癥、HAM(HTLV-1脊髓癥)、肌萎縮性側索硬化癥等)、內分泌性(巴澤多病、橋本病、1型糖尿病等)、血液(特發性血小板減少性紫斑病、自身免疫性溶血性貧血、再生不良性貧血等)、呼吸器(結節病、肺纖維癥等)、消化管(潰瘍性大腸炎、克羅恩病等)、肝臟(自身免疫性肝炎、原發性膽汁性肝硬變、原發性硬化性膽管炎、自身免疫性膽管炎等)、腎·尿路系(抗嗜中性白細胞細胞質抗體關聯腎炎、血管炎、Goodpasture綜合征、抗絲球體基底膜抗體病等)等。
感染癥是病原體由于生物體的細胞·組織·臟器產生的疾患的總稱。關于感染癥可以參考監修:町并陸生、編集:秦順一、坂本穆彥、「標準病理學(第2版)」、醫學書院、2002年3月15日發行。引起人感染癥的病原體有1)細菌(包括螺旋體、衣原體、立克次體)、2)病毒、3)真菌、4)植物(藻類)、5)原蟲、6)寄生蟲(吸蟲、條蟲、線蟲)、7)節足動物。各病原體引起的主要的疾患如細菌性感染癥(霍亂、瘟疫、大腸桿菌感染癥等)、螺旋體感染癥(鉤端螺旋體病等)、衣原體感染癥(鸚鵡病等)、立克次體感染癥(斑疹傷寒、破傷風等)、病毒性感染癥(帶狀皰疹、病毒性出血熱、狂犬病等)、真菌癥(念珠菌病、隱球菌病、曲霉菌病等)、原蟲性疾患(阿米巴性痢疾、瘧疾、弓形體病等)、寄生蟲(吸蟲癥、線蟲癥等)、以及支原體感染癥(支原體肺炎等)、分支桿菌感染癥(結核、非定型抗酸菌癥等)。
至于癌和肉瘤,如腦腫瘤(多形形惡性膠質腫等)、脊髓腫瘤、上顎洞癌、胰液腺癌、齒肉癌、舌癌、口唇癌、上咽癌、中咽癌、下咽癌、喉頭癌、甲狀腺癌、甲狀旁腺癌、肺癌、胸膜腫瘤、癌性腹膜炎、癌性胸膜炎、食道癌、胃癌、大腸癌、膽管癌、膽囊癌、胰臟癌、肝癌、腎臟癌、膀胱癌、前立腺癌、陰莖癌、精巢腫瘤、腎上腺癌、子宮頸癌、子宮體癌、陰道癌、外陰癌、卵巢癌、纖毛上皮腫、惡性骨腫瘤、軟部肉瘤、乳癌、皮膚癌、惡性黑色素瘤、基底細胞瘤、白血病、伴隨骨髓化性的骨髓纖維癥、惡性淋巴瘤、惡性淋巴肉芽腫病、漿細胞瘤、神經膠質瘤等。
也適用皮膚科領域,例如1)在皮膚疾患中存在著包括感染癥、變態性炎癥和自身免疫性炎癥在內的炎癥和干癬、水皰癥、膿皰癥、角化、角化異常癥等特有的炎癥。另外2)與美容皮膚科關系,
a)黑色素代謝調節(美白)···半乳凝素9基因導入黑素瘤細胞,由黑色調向白色變化。皮膚基底細胞層有半乳凝素9陽性細胞。
b)毛發成長(生發)的調節···毛根部有半乳凝素9表達,隨時期而變。半乳凝素9基因導入小鼠的毛發的成長與突變體半乳凝素9基因導入小鼠相比非常好。
c)膠原產生調節等···成纖維細胞通過各種刺激有半乳凝素9表達、纖維結締組織有半乳凝素9陽性的部分。
至于生活習慣病如高脂血癥、動脈硬化癥、高血壓、糖尿病等。已闡明與生活習慣病動脈硬化癥的病態形成有關的細胞之一泡沫細胞中存在著gal9陽性細胞和陰性細胞。因此,表明gal9與動脈硬化癥的病態有關,不可否認通過控制它,治療或予防成為可能。至于高血壓,在動物實驗模型高血壓發癥時由于半乳凝素9在尿細管或絲球體中的表達增強,所以有時對半乳凝素9表達進行控制,通過給予半乳凝素9能夠治療的可能性增大。
另外,也適用于正常細菌叢的維持,例如、gal9在腸管上皮正常強烈表達,另外對于給予惡玉細菌叢時,半乳凝素9在腸管上皮和巨噬細胞等炎癥細胞中的表達增強。由此明顯表示出半乳凝素9與消化管中正常細菌叢的維持有關。
另外,在可適用于淀粉樣變性,例如在確認淀粉樣變性的部分的巨噬細胞中,有表現出半乳凝素9表達的巨噬細胞存在。存在著通過半乳凝素9可以控制淀粉樣沉積的可能性。
認為對阿爾茨海默病、骨質疏松癥、骨折等也有用,例如、在阿爾茨海默病患者的腦中變性的神經細胞表現出半乳凝素9陽性特征。因此存在可用于治療和診斷的可能性。另外在骨質疏松癥中,認為半乳凝素9有抑制骨吸收,促進骨形成的可能性。這樣的作用從骨代謝方面考慮,認為是理想的藥劑。
另外在腦、神經領域中也有用,例如、腦梗塞、心肌梗塞等缺血性病變的進展伴隨著炎癥細胞的濕潤,引起超氧化物產生等進一步惡化。預期半乳凝素9和半乳凝素9突變體可控制這樣的炎癥。作為炎癥、免疫系的變化為原因的脫骨髓性疾患,例如多發性硬化癥等。作為變性疾患,如肌萎縮性側索硬化癥、帕金森病等。另外綜合失調癥可以說原因是某種炎癥性的變化。即EPA(二十碳五烯酸)可用于腦中炎癥反應的控制和神經細胞膜的形成。在綜合失調癥患者中,有細胞膜中的EPA和其它的必需脂肪酸表現出枯竭的研究例。
預期半乳凝素9和半乳凝素9突變體對痛風也有用。預期半乳凝素9和半乳凝素9突變體對于對尿酸結晶的組織沉著的疼痛的強急性炎癥也能進行控制。
哮喘是引起可逆性呼吸道阻塞(哮喘發作)的呼吸器疾患,指的是對抗原特異的(變態原)或非特異的(感染、冷氣等)刺激,呼吸道反應性亢進的狀態。近年證明對于哮喘的呼吸道在不發作的穩定期存在以嗜酸性細胞、T淋巴細胞、和肥大細胞為主體的炎癥,現在,認為是哮喘本身慢性的支氣管炎。另外、很多的小兒哮喘與特應性起因(IgE產生)的關聯雖然強(特應型哮喘)、在成人哮喘中約半數被確認不能證明與IgE有關(非特應型哮喘)。哮喘予防·管理指導原則(1998年厚生省研究班)已出臺,哮喘治療可以分為急性發作和慢性呼吸道炎癥兩種。作為發作治療藥,支氣管擴張藥(β2刺激藥、氨茶堿)可用作第一選擇藥,在中等癥以上的發作中用這些藥劑不充分,要進行類固醇藥的大量全身給藥。類固醇藥副作用大、特別是消化性潰瘍、高血壓、高血糖、精神癥狀等重大,如果長期使用,感染癥、腎上腺抑制、骨質疏松癥等逐漸成為問題。另外伴隨著合併癥的場合類固醇的使用伴隨著危險。期盼副作用少、具有與類固醇同等效果的藥劑的開發。作為長期的管理藥,在慢性呼吸道炎癥的治療中抗炎癥藥為主體,其中推薦吸入類固醇藥的使用。長期大量使用該類固醇藥時,腎上腺抑制、骨質疏松癥、呼吸道感染等副作用出現的可能性不能否定。另外、吸入藥要求正確吸入手技,與內服藥比較,在順應性這點差。就中等癥以上的哮喘來說,除了吸入類固醇藥之外,推薦吸入β2刺激藥、白三烯拮抗藥或并用緩釋性茶堿藥。如果是重癥例,不得已只能全身給予類固醇。期盼開發取代這樣藥劑的藥劑。
已知在哮喘的病態形成中,對T淋巴細胞、嗜酸性細胞的肺組織以及呼吸道的浸潤起著重要的作用。另外半乳凝素9具有誘導細胞凋亡的功能,誘導活化T細胞和嗜酸性細胞的凋亡。按照這樣的思路,根據本發明中使用半乳凝素9突變體等的研究,顯然半乳凝素9和半乳凝素9突變體具有改善(抑制)哮喘中呼吸道炎癥的活性。
而半乳凝素9和半乳凝素9突變體具有增強成骨細胞增殖和分化以及抑制破骨細胞分化的活性,認為對于骨質疏松癥的予防和/或治療、類固醇長期給藥中成為問題的副作用之一骨生長抑制也有效。
半乳凝素9和半乳凝素9突變體在對淋巴細胞的作用中與類固醇不同,表現出活化淋巴細胞特異的抑制作用,與類固醇相比,預期副作用、例如、免疫抑制少。另外,還具有抑制類固醇中不存在的粘附分子的功能以及抑制神經性炎癥的作用,有望作為哮喘治療、例如發作治療藥。另外認為可減輕類固醇的副作用。
實施例
以下給出實施例,對本發明進行具體說明,該實施例只是為了對本發明進行說明,用于其具體方式的參考提供的。這些實施例是為了說明本發明的特定的具體方式的例子,并不表示限定或限制本申請書公開的發明范圍。本發明應當理解為源于本說明書的思想的各種各樣的可實施方式。
所有的實施例除了另外詳細記載的以外,使用的標準的技術實施的或可以實施的例子,這些對于同行眾所周知、慣用的技術。而在以下的實施例中,沒有特別指出時,具體的操作和處理條件等,DNA克隆根據J.Sambrook,E.F.Fritsch & T.Maniatis,″MolecularCloning″,2nd ed.,Cold Spring Harbor Laboratory,Cold SpringHarbor,N.Y.(1989)和D.M.Glover et al.ed.,″DNA Cloning″,2nd ed.,Vol.1 to 4,(The Practical Approach Series),IRL Press,Oxford University Press(1995);使用PCR法を時根據H.A.Erliched.,PCR Technology,Stockton Press,1989;D.M.Glover et al.ed.,″DNA Cloninh″,2nd ed.,Vol.1,(The Practical ApproachSeries),IRL Press,Oxford University Press(1995)和M.A.Innis et al.ed.,″PCR Protocols″,Academic Press,New York(1990)所述的方法進行,而使用市售的試劑或試劑盒時使用附帶的指示書(protocols)和添付的藥品等。
實施例1
(A)半乳凝素9突變體表達載的構建
在制作表達載體時,使用
(1)由Jurkat細胞的poly(A)+RNA級分制備的cDNA
(2)pET-11a載體(STRATAGENE)
(3)PCR用引物:
G9NCRD1:CGTCCTCATATGGCCTTCAGCGGTTCCCAG序列10
G9NCRD6:CGACCGCATATGCTGGAAGCTGATGTAGGACAG序列11
G9CCRD5:CGTCCTCATATGACTCCCGCCATCCCACCTATG序列12
G9CCRD6:CGACCGGGATCCCTATGTCTGCACATGGGTCAG序列13
Jurkat細胞(來自T細胞的細胞)由美國模式培養物保藏所(ATCC)獲得。細胞系于添加了10%FCS的RPMI-1640培養基(Sigma、圣路易斯、美國)中在5%CO2的條件下維持在37℃。從Jurkat細胞提取總RNA象下面那樣進行。即將使用含有10%FBS的RPMI-1640培養基培養的Jurkat細胞進行離心、收集。用10mlPBS將細胞清洗2次。向清洗后的細胞沉淀按照每2×108個細胞加15mlISOGEN(商品名:日本人),按照指南(日本人)提取總RNA。從總RNA純化poly(A)+RNA和cDNA合成象下面那樣進行。即,將從Jurkat細胞提取的總RNA按照終濃度為1mg/ml濃度那樣溶解于DEPC處理水中。使用PolyATtract mRNA Isolation System(商品名:Promega),根據指南從總RNA純化poly(A)+RNA。將純化的poly(A)+RNA按照終濃度為5μg/20μl溶解于DEPC處理水中。
使用First-Strand cDNA合成試劑盒(商品名:AmershamBiosciences),按照指南由5μg的poly(A)+RNA合成cDNA(對于引物使用Not I-d(T)18)。
接下來,按照圖1所示順序,在pET-11a載體NdeI-BamHI位點插入半乳凝素9的N-末端側糖鏈結合結構域(N-terminalcarbohydrate recognition domain,NCRD)和C-末端側糖鏈結合結構域(CCRD),制作缺少連接肽的改變型半乳凝素9(G9NC(null))的表達載體。首先從半乳凝素9cDNA分別取得(1)對應于人半乳凝素9的C-末端側CRD的cDNA和(2)對應于人半乳凝素9的N-末端側CRD的cDNA。即使用PCR用引物:G9CCRD5+G9CCRD6從cDNA擴增對應于人半乳凝素9的C-末端側CRD的cDNA(G9CCRD)。將G9CCRD用制限酶(NdeI+BamHI)切后,插入到用同樣制限酶處理的pET-11a載體,得到pET-G9CCRD。PCR使用KOD DNA聚合酶試劑盒(TOYOBO CodeNo.KOD-101)進行。使PCR反應混合物(dNTP mix,25mM MgCl2,10×Buffer,KOD DNA聚合酶(0.05u),引物和模板cDNA)在以下那樣的PCR的循環條件下進行反應:94℃處理2分鐘后,進行25次循環(98℃下15秒、然后65℃下2秒、而后74℃下處理30秒),最后于4℃下停止反應。被PCR擴增的片段向載體的插入使用Ligation highkit(TOYOBO Code No.LGK-101)進行。反應按照插入片段:載體的摩爾比為約5∶1進行混合,加其總DNA溶液(體積)量的1/2(體積)量的試劑Ligation high混合后進行。通過于16℃反應16小時(O/N)進行插入。
另外使用PCR用引物:G9NCRD1+G9NCRD6從該半乳凝素9cDNA擴增對應于人半乳凝素9的N-末端側CRD的cDNA(G9NCRD)。將G9NCRD用制限酶(NdeI)切斷后,將得到的片段用同樣的制限酶(NdeI)處理,再插入到脫磷酸化的pET-G9CCRD中得到pET-G9NC(null)。PCR擴增以及向載體的整合與上述同樣進行。pET-G9NC(null)編碼具有將人的M型半乳凝素9的第149位Pro開始至第177位Ser的29個氨基酸序列置換為His-Met序列的氨基酸序列的多肽。即是具有序列1所示的堿基序列,編碼具有序列2所示的氨基酸序列的多肽。
(B)半乳凝素9突變體重組蛋白質的表達和純化
將上述工程(A)得到的表達用質粒載體pET-G9NC(null)導入大腸桿菌(BL21(DE3))。導入通過電穿孔法進行。即將感受態BL21(DE3)和質粒載體水溶液混合,通過使用1.8kV電壓的電穿孔法進行轉染。
重組蛋白質的表達通過將大腸桿菌于含有2%(w/v)葡萄糖和100μg/ml氨芐青霉素的2×YT培養基中培養,當600nm的吸光度達到0.7時,添加0.1M異丙基硫代-β-D-半乳糖苷(最終濃度0.1mM),誘導重組蛋白質的表達來進行。于20℃培養18小時后,通過離心收集菌體,懸浮于10mM Tris-HCl(pH 7.5),0.5M NaCl,1mM DTT,1mM PMSF中。將懸浮液進行10分鐘超聲波處理后,加10%(w/v)Triton X-100(最終濃度1%),于4℃下攪拌30分鐘。于15,000×g下離心30分鐘,將得到的上清液中的重組蛋白質通過使用乳糖-瓊脂糖的親和層析進行純化。
結果純度高的標準品以比較高的收率獲得。得到的重組蛋白質的電泳結果如圖2所示。SDS-PAGE條件如下:Gel,Acrylamide-BIS(12%gel),電泳用緩沖液,25mM Tris-192mM甘氨酸-0.1%SDS,泳動條件,180V,45min.,染色,CBB,60℃/30min.電泳樣品吸附于Strata CleanTM Resin(Stratagene),用1×樣品緩沖液(62.5mMTris-HCl,Ph6.8,2%(w/v)SDS,5%(W/V)2-ME,Glycerol)調整到0.2mg/ml,98℃/3min.熱處理后以每條帶約2μg的蛋白質量進行電泳。
純化的G9NC(null)于4℃下可以穩定保存90天以上。而野生型的半乳凝素9(M-type、G9(M))在同一保存條件下在2周以內大部分被分解(參照圖3)。該分解被認為是由于純化半乳凝素標準品中含有來自大腸桿菌的蛋白水解酶引起的。
實施例2
比較野生型的半乳凝素9(S-type、G9(S):帶有最短連接肽的同種型)和G9NC(null)對存在于人組織中的蛋白水解酶的敏感性。向溶解于PBS的半乳凝素中加1/100(重量比)的基質金屬蛋白酶-3(MMP-3)或彈性蛋白酶,于37℃下保溫。任一場合下G9(S)大部分都在1~2小時被分解,而相反G9NC(null)在2小時后還完全沒有被分解(參照圖4和5)。
實施例3
為了研究寄予半乳凝素9生物活性的變異導入的效果,研究了對MOLT-4細胞(來自人Tcell leukemia的細胞株)的凋亡誘導活性和對外周血嗜酸性細胞的趨化活性(eosinophil chemoattractantactivity、ECA activity)。
(a)細胞培養物
MOLT-4(T細胞)由ATCC獲得。所有細胞系都在添加了10%FCS的RPMI-1640培養基(Sigma、圣路易斯、美國)中維持在5%CO2的條件、37℃下。為了抑制Gal-9的活性,在培養用培養基中添加30mM的乳糖。作為對照使用同濃度的蔗糖。
(b)凋亡分析
(1)利用PI進行細胞周期(apoptosis)解析(PI法)
將被凋亡誘導處理的細胞于4℃、1000rpm下進行5分鐘離心處理后,將細胞團再懸浮于PBS(300μl),一邊渦旋、一邊向細胞懸浮液慢慢添加100%冷乙醇(700μl),使終濃度變為70%乙醇。于4℃下進行30分鐘溫育處理,對細胞進行固定,然后加PBS(1ml),于4℃、1000rpm下進行5分鐘離心處理后,將細胞團再懸浮于PBS(440μl)。將細胞與2.5mg/ml的核酸酶A(10μl,終濃度50μg/ml,Sigma,圣路易斯、密蘇里州、美國)一起于37℃下進行30分鐘溫育處理,然后與2.5mg/ml的碘化丙錠(4μl;PI,終濃度20μg/ml,Sigma)一起于4℃、暗中進行10分鐘溫育處理。通過尼龍篩除去變成集塊的細胞后,于PBS中對細胞進行計數,通過流式細胞儀(Sandstrom,aK.etal.,J Immunol Methods,240:55(2000)以及Zhang L.et al.,CancerLett,142:129(1999))對染色細胞進行解析。
(2)TUNEL(TdT-mediated標記dUTP nick end labeling)法
對于通過DNA的片段化產生的末端,用在DNA末端附加核苷酸的酶(TdT:末端脫氧核苷酸轉移酶)整合標記的核苷酸(dUTP-biotin或FITC-dUTP等)后,對作為凋亡的顯著特征的細胞核DNA的片段進行檢測。在實驗中,使用MEBSTAIN Apoptosis Kit Direct(MBL、名古屋、日本)。根據試劑盒銷售商的指示,象下述那樣進行實驗。即,將進行了凋亡誘導的細胞(約2×105個/樣品)用含有0.2%FSA的PBS洗,然后加4%多聚甲醛(0.1MnaH2PL4,pH7.4中),于4℃下進行30分鐘固定化后,用含有0.2%FSA的PBS洗。向細胞團加70%冷乙醇后于-20℃下進行30分鐘溫育處理,使透過性亢進。用含有0.2%FSA的PBS洗后,向細胞團加TdT反應液(TdT、FITC-dUTP以及TdT緩沖液的混合物),攪拌后,于37℃下進行1小時溫育處理,用含有0.2%FSA的PBS洗后,再懸浮于含有0.2%FSA的PBS中,對染色細胞通過流式細胞儀進行解析。
(c)T細胞解析
用按照各個孔每孔3μg/ml的抗CD3抗體(Immunotech,Marseille、法國)的TBS液(pH8.0)對24孔板于4℃下溫育過夜處理后,除去抗CD3抗體,用PBS洗滌孔,得到用抗CD3抗體包被的孔板。
使用HISTOPAQUE(登錄商標、SIGMA)從加肝素的血液中分離單核白細胞細胞。然后,使用C4陽性分離試劑盒(Cd4-positiveisolation kit;DYNAL,Oslo,挪威)以及Dynabeads(登錄商標)M-450 CD8(DYNAL,Oslo,挪威),按照試劑盒制造銷售商所述那樣分別分離CD4陽性T細胞以及CD8陽性T細胞。為了對T細胞進行活化,將CD4陽性T細胞或CD8陽性T細胞于含有10%FCS的RPMI-1640中調整為1×106個/ml的細胞,在37℃下在用抗CD3抗體包被的板上于5%CO2培養箱中溫育處理20~24小時,然后與重組體半乳凝素9(野生型G9(S)或突變體G9NC(null))一起于37℃下在5%CO2培養箱中進行溫育處理。然后,象上述(b)那樣,進行凋亡·分析。即,將細胞于37℃下與50μg/ml的PI(Sigma)一起在暗處進行溫育處理。將染色細胞通過流式細胞儀(Sandstrom,K.et al.,J ImmunolMethods,240:55(2000)以及Zhang L.et al.,Cancer Lett,142:129(1999))進行解析。
對于非活化(靜息)T細胞與與重組體半乳凝素9(野生型G9(S)或突變體G9NC(null))一起于37℃下在5%CO2培養箱中進行溫育處理后,與上述同樣進行凋亡·分析。
(d)結果
將伴隨凋亡出現的DNA片段化通過瓊脂糖凝膠電泳和FACS進行研究,結果表明無論使用那一種方法,G9NC(null)都保持與G9(S)同等或在其以上的凋亡誘導活性(圖6,表1)。通過Chamber法研究ECA活性,結果表明G9NC(null)與G9(S)比較,表現出更高的活性(圖7)。
                                 表1                  已經凋亡的MOL-4細胞的比例(%)  對照  0.1μM  0.3μM  0.5μM  1μM  G9(M)  G9(S)  G9NC(null)  4.2  4.5  5.1  5.5  8.7  11.5  13.8  23.6  33.9  28.9  44.7  57.8  58.8  64.0  72.1
表1表示在野生型半乳凝素9(G9(S))和半乳凝素9突變體(G9NC(null))之間,對生物活性進行比較的結果,是對MOLT-4細胞的凋亡誘導活性(FACS分析)進行研究的結果。
實施例4
〔1.半乳凝素-9在風濕病(RA)關節滑膜中的表達〕
〔方法〕
患者組織使用滿足美國風濕病學會(ACR)分類基準的RA患者滑膜組織標本?;頰叩淖櫓甌鏡拿庖咦櫓舊靡韻碌姆椒ń?。標本切片的制備象下面那樣進行。(1)脫石蠟:二甲苯3次(各10分鐘),100%乙醇·90%乙醇·75%乙醇(各2分鐘)。(2)微波(MW)處理:用時制備10mM檸檬酸緩沖液(pH6.0)。預先進行MW照射,將切片浸入沸騰的緩沖液中,進行MW照射(500w電子范圍的場合,5分鐘×3次,計15分鐘)。于室溫放置20分鐘,慢慢冷卻。(3)內源性過氧化物酶的鈍化:用時制備0.3%過氧化氫·甲醇,浸30分鐘。PBS清洗5分鐘×3次。用巴斯德移液管加4滴5%BSA進行封閉。濕潤箱1小時室溫。
由標本切片的上方用巴斯德移液管加6滴一次抗體或控制抗體。濕潤箱過夜4℃。翌日,PBS清洗,5分鐘×3次。加6滴過氧化物酶標識二次抗體(DACO Envision+)。濕潤箱,1小時,室溫。PBS洗凈5分鐘×3次。
用DAB(3,3′-diaminobenzidine-tetrahydrochloride)試劑進行發色:用時制備DAB試劑。浸入切片,發色3分鐘。立刻用水管水停止發色反應。核染色,邁耶蘇木精,20秒。立刻流水洗凈,15分鐘。脫水,透徹,封入。75%乙醇·90%乙醇·100%乙醇(各2分鐘),二甲苯3次(各3分鐘)。
〔結果〕
結果如圖53所示。確認半乳凝素-9有選擇地在滑膜細胞和淋巴濾胞周圍的細胞群和濾胞內的樹枝狀血管的內皮細胞中表達。就OA(變形關節癥)來說,幾乎沒有看到半乳凝素-9陽性細胞(參照圖53)。半乳凝素9是可被RA滑膜組織增殖的原形的滑膜細胞和淋巴系細胞以及新生血管強烈誘導的分子。另外,在滑膜細胞和血管周圍細胞中檢測出半乳凝素-1,在整個RA滑膜構成細胞檢測出半乳凝素-3。
〔2.半乳凝素-9誘導滑膜細胞凋亡的活性〕
〔方法〕
對于半乳凝素-9對成為關節破壞原因的滑膜細胞的作用進行研究?;ぴ諼蘧虜扇》縭』頰叩幕ぷ櫓?,對細胞進行分離、培養。1~2次傳代后用于實驗。本實驗的組織是67歲女性、右膝RA。播種滑膜細胞后、培養過夜(overnight)。確認粘附后,按照最終濃度0,0.03,0.1,0.3,1.0μM添加rhGal-9(hG9NC(null),rhGal-9S,rhGal-9M)。72小時培養后于光學顯微鏡下觀察,再回收細胞,通過PI法測定凋亡(apoptosis)誘導活性。凋亡誘導活性的測定與實施例3同樣實施。
〔結果〕
光學顯微鏡觀察的結果如圖54所示。通過PI法進行的凋亡誘導活性的測定結果如圖55所示。
半乳凝素-9突變體(Gal-9(NC-Null))比天然型半乳凝素-9(Gal-9(M),Gal-9(S))的凋亡誘導活性更強。在所有的重組體中確認凋亡誘導活性依賴于濃度。該凋亡誘導活性可被乳糖(30mM)抑制,但不受蔗糖(30mM)的影響。
〔3.半乳凝素對滑膜細胞凋亡的誘導活性和增殖的抑制活性的比較〕
〔方法〕
對于人半乳凝素(Gal-1,Gal-3,Gal-8(M),Gal-9NC(null))對滑膜細胞的作用進行了研究。
對于半乳凝素-9對成為關節破壞原因的滑膜細胞的作用進行了研究。
滑膜在無菌下采取風濕病患者的滑膜組織,對細胞進行分離、培養。1~2次傳代后用于實驗。確認過夜播種的滑膜細胞粘附后,按照最終濃度0,0.03,0.1,0.3,1.0μM添加rhGal-9(hG9NC(null),rhGal-9S,rhGal-9M)。24小時培養后回收細胞,通過PI法測定凋亡誘導活性。抑制滑膜細胞增殖的效果按照人半乳凝素最終濃度為0,0.03,0.1,0.3,1.0μM那樣添加到96孔板的各個孔中,培養48小時。培養后用PBS清洗板內,使用細胞計數試劑盒-F(同仁化學、cat.no.343-07743),用熒光板式讀取儀測發出強熒光(λex=490nm、λem=515nm)的活細胞數。
〔結果〕
凋亡誘導活性測定的結果如圖56所示,抑制滑膜細胞增殖的活性的測定結果如圖57(圖中、hGalectin 1表示重組人半乳凝素1,hGalectin 3表示重組人半乳凝素3,hGalectin 8(M)表示重組人半乳凝素8M,hGalectin 9表示hGal-9NC null)所示。抑制滑膜細胞的增殖在風濕病治療中非常重要。
半乳凝素-9突變體(hGal-9NC null)由于誘導增殖的滑膜細胞的凋亡,抑制滑膜細胞的增殖,所以作為抗風濕病藥是有用的。其它的半乳凝素沒有看到這樣的作用。
研究了半乳凝素9突變體h-G9NC(null)在各種炎癥疾患、即急性·慢性、變態性、免疫系疾患的小鼠模型中的效果。
該結果表明半乳凝素9突變體對各種炎癥具有抑制或增強作用以及對各種細胞因子產生具有調控作用,所以可以控制炎癥反應。對該實施例進行了記載。
在以下的實施例〔實施例5~12中,G9NC(null)〔gal9NC(null)、h-gal9NC(null)、hG9NC(null)或h-G9NC(null):人·null·半乳凝素9(human null galectin-9)〕是Galpharma(株)(香川縣、日本)研究所制造的產品。地塞米松(dexamethasone;dexamethasone21-phosphate disodium salt,Sigma-Aldrich公司,MO,美國)可從供貨商購入。
實施例5
〔酵母多糖誘導胸膜炎模型〕
首先將小鼠用二乙基二乙醚(和光純藥)麻醉,將G9NC(null)〔或h-gal9NC(null)〕100μg、酵母多糖(SigmaAldrich公司)100μg、地塞米松(SigmaAldrich公司)30mg/kg單獨或混合后注射到小鼠的胸腔內。對照使用PBS。4小時后,向小鼠腹腔內注射0.2至0.3ml用PBS稀釋10倍的戊巴比妥注射液(商品名:戊巴比妥、大日本制藥株式會社),麻醉后,開腹由腹部大動脈采血,作為血液樣品。然后,脫血后使其安樂死,用PBS(1ml)將胸腔內清洗2次,回收作為胸腔洗凈液樣品。
血液樣品于常溫靜置后,經5000rpm離心10min,回收上清作為血清樣品,冷凍干燥保存。胸腔洗凈液樣品于特克液中對總細胞數進行計數。計數后,將一部分加到cytospin,進行風干,用Diff-Quik(國際試劑株式會社)或May-Gruewald氏染色液(武藤化學株式會社)和吉姆薩液(Merck,日本)進行染色、鏡檢、對總細胞數200個中的中性白細胞、嗜酸性細胞、巨噬細胞、淋巴細胞、其它的肥大細胞等進行計數。結果如圖9和圖10所示。
實施例6
〔PMA誘導皮炎模型〕
豆蔻酸佛波乙酯(phorbol 12-myristate 13-acetate;PMA,SigmaAldrich公司,MO,美國)從供貨商購入。為了投給動物,在全部的實驗中作為載體(vehicle)使用PBS(-),將化合物懸浮于該溶液后進行(以下的實施例中也同樣)。
Balb/c小鼠(7周齡)由SLC(靜岡,日本)購入。為了做到使動物能夠自由地攝取適當餌料和水,保持在12小時晝夜節奏的標準條件下。所有的動物按照國際的指導原則和國內法通過人工進行管理(以下的實施例中也同樣)。
象下面那樣誘導小鼠耳浮腫。
1將5mg的豆蔻酸佛波乙酯(PMA)溶解于30ml的丙酮中,用于各小鼠(BALB/c,♀,7~8周齡,SPF,SLC社)的右耳的內側和外側的表面。作為對照將丙酮用于左耳上。在PMA使用的30分鐘前i.p.(0.345ml/head)注入G9NC(null)、地塞米松、或載體。在PMA注射后0,2,4,8和24小時,使用校正厚度計(Mitsutoyo,東京,日本)在乙醚麻醉下測定耳的厚度。
耳浮腫用(R-L)-(R0-L0)表示。其中R0和L0分別表示實驗開始時(0h)的右耳厚度和左耳厚度,R和L分別表示各個時點的厚度值。
數據的統計處理如下進行。沒有特別指出時,數據用平均值±SEM表示。數據組的統計上的差異使用one-way ANOVA進行解析,而組之間的差異使用市售的統計軟件(GraphPad Software,Inc.,San Diego,USA)通過Bonferroni post-test評價。P值<0.05統計學上認為有意義。詳細如圖所示(在以下的實施例中也同樣)。結果如圖11所示。
實施例7
〔花生四烯酸誘導皮炎模型〕
花生四烯酸(AA,SigmaAldrich公司,MO,美國)從供貨商購入。其它同實施例6。
象下面那樣誘導小鼠耳浮腫。
將750mg的花生四烯酸(AA)溶解于30ml的丙酮中,用于各小鼠(BALB/c,♀,7~8周齡,SPF,SLC社)的右耳的內側和外側的表面。作為對照將丙酮用于左耳上。在AA使用的30分鐘前進行i.p.(0.345ml/head)注射G9NC(null)、地塞米松、或載體。在AA注射后第0,1,3和第6小時,使用校正厚度計(calibrated thickness gauge;Mitsutoyo、東京、日本)在乙醚麻醉下測定耳的厚度。用(R-L)-(R0-L0)表示耳浮腫。其中R0和L0分別表示實驗開始時(0h)的右耳厚度和左耳厚度,R和L分別表示各個時點的厚度值。數據的統計處理與實施例6同樣進行。結果如圖12所示。
實施例8
〔辣椒辣素誘導皮炎模型〕
cyproheptadine(Sigma Aldrich公司,MO,美國)和辣椒辣素(capsaicin,Nakarai社,東京,日本)從各供貨商購入。其它同實施例6
象下面那樣誘導小鼠耳浮腫。
將500mg的辣椒辣素溶解于30ml的丙酮/橄欖油(容量比=4/1)中,用于各小鼠(BALB/c,♀,7~8周齡,SPF,SLC社)的右耳的內側和外側的表面。作為對照將丙酮/橄欖油(容量比=4/1)用于左耳上。在辣椒辣素使用的30分鐘前i.p.(0.345ml/head)注射G9NC(null)、地塞米松、cyproheptadine或載體。在辣椒辣素注射后第0,0.5,1和2小時,使用校正厚度計(calibrated thickness gauge;Mitsutoyo、東京、日本)在乙醚麻醉下測定耳的厚度。用(R-L)-(R0-L0)表示耳浮腫。其中R0和L0分別表示實驗開始時(0h)的右耳厚度和左耳厚度,R和L表示各個時點的厚度值。數據的統計處理與實施例6同樣進行。結果如圖13所示
實施例9
〔DNFB誘導接觸皮炎模型〕
2,4-二硝基-1-氟苯(dinitro-fluoro-benzene(DNFB),SigmaAldrich公司,MO,美國)從供貨商購入。其它同實施例6。
象下面那樣誘導小鼠耳浮腫。在7日前(day-7)或6日前(day-6)將含有0.5%的2,4-二硝基-1-氟苯(DNFB)丙酮/橄欖油(容量比=4/1)液(30ml)適用于各小鼠的剃去毛的腹部,致敏后作為延遲型過敏癥(DTH)誘發的浮腫模型。在實驗開始日(day 0)將含有0.3%DNFB的丙酮/橄欖油(容量比=4/1)液(30ml)局部適用于各小鼠的右耳的內側以及外側的表面,進行誘發。作為對照將丙酮/橄欖油適用于左耳。從DNFB誘發的7日前(day-7)至實驗開始日(day 0),以及DNFB誘發24小時后或48小時后i.p.(0.345ml/head)注射G9NC(null)、地塞米松、或載體。DNFB誘發后、0,24,48及第72小時使用校正厚度計(calibrated thickness gauge;Mitsutoyo、東京、日本)在乙醚麻醉下測定耳的厚度。用(R-L)-(R0-L0)表示耳浮腫。其中R0和L0分別表示實驗開始時(0h)的右耳厚度和左耳厚度,R和L表示各個時點的厚度值。數據的統計處理與實施例6同樣進行。結果如圖14和15所示。
實施例10
〔FITC誘導特應性皮炎模型〕
異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate(FITC),SigmaAldrich公司,MO,美國)從供貨商購入。其它同實施例6。
象下面那樣誘導小鼠耳浮腫。在7日前(day-7)或6日前(day-6)將含有0.5%的異硫氰酸熒光素(FITC)的丙酮/鄰苯二甲酸二丁酯(容量比=1/1)溶液(400ml)適用于各小鼠的剃去毛的腹部,致敏后作為FITC誘發的浮腫模型。在實驗開始日(day 0)將丙酮/鄰苯二甲酸二丁酯(容量比=1/1)溶液(30ml)局所適用于各小鼠的右耳的內側以及外側的表面,進行誘發。作為對照將丙酮/鄰苯二甲酸二丁酯適用于左耳。
從FITC誘發的30分鐘前,以及FITC誘發24小時后或48小時后i.p.(0.345ml/head)注射G9NC(null)、地塞米松、或載體。FITC誘發后、0,24,48及第72小時使用校正厚度計(calibratedthickness gauge;Mitsutoyo、東京、日本)在乙醚麻醉下測定耳的厚度。用(R-L)-(R0-L0)表示耳浮腫。其中R0和L0分別表示實驗開始時(0h)的右耳厚度和左耳厚度,R和L表示各個時點的厚度值。數據的統計處理與實施例6同樣進行。結果如圖16所示。
實施例11
〔蕁麻疹模型〕
抗DNP IgE(anti-DNP IgE(SPE7),SigmaAldrich公司,MO,美國)和2,4-二硝基-1-氟苯(dinitro-fluoro-benzene(DNFB),SigmaAldrich公司,MO,美國)從各供貨商購入。其它同實施例6。
象下面那樣誘導小鼠耳浮腫。在1日前(day-7)將含有抗DNP IgE(5mg/小鼠)的PBS(-)液進行i.v.注射,致敏,做成2相性皮膚反應模型。在實驗開始日(day 0)將含有0.15%DNFB的丙酮/橄欖油(容量比=4/1)液(30ml)適用于各小鼠的右耳的內側以及外側的表面,進行誘發。作為對照將丙酮/橄欖油適用于左耳。
從DNFB誘發的30分鐘前,i.p.(0.345ml/head)注射G9NC(null)、地塞米松、或載體。DNFB誘發后、在第0,1,2,4,8和第24小時使用校正厚度計(calibrated thickness gauge;Mitsutoyo、東京、日本)在乙醚麻醉下測定耳的厚度。耳浮腫用(R-L)-(R0-L0)表示。其中R0和L0分別表示實驗開始時(0h)的右耳厚度和左耳厚度,R和L表示各個時點的厚度值。數據的統計處理與實施例6同樣進行。結果如圖17和18所示。
實施例12
〔關節炎模型〕
使用DBA/1J雌性小鼠(7周齡),將關節炎激發用單克隆抗體混合物(Chondrex社、No.62100)按照2mg/0.5mL/只注入動物的尾靜脈。注入3日后向動物的腹腔內注射預先混合了5μg/0.2mL的LPS(SIGMA,L6511)和各濃度的h-Gal9NC(null)的樣品100μL。注射樣品后,1日1次左右測定前后肢的關節腫脹,進行打分。結果を圖19所示。
研究h-G9NC(null)在作為急性炎癥模型的代表性的酵母多糖誘導胸膜炎模型(實施例5)和LPS誘導腹膜炎模型中的效果。在酵母多糖誘導胸膜炎模型中,通過腹腔內注射h-G9NC(null)100μg,看到了胸膜炎被抑制的效果。而如果單獨h-G9NC(null)特別是對小鼠沒有影響。另外h-G9NC(null)對角叉菜膠、fMLP誘導胸膜炎模型也有影響。
另外在LPS誘導腹膜炎模型中,由于h-G9NC(null)的作用,在炎癥時誘導的血清中細胞因子(IFN-γ和IL-4、IL-12、IL-10等)產生中確認有變化。例如、同時將LPS和h-G9N注入小鼠腹腔后,6小時、12小時、24小時后從小鼠眼窩采血,測定該血清中的IFN-γ值時,確認在LPS單獨給予組在炎癥時被誘導的IFN-γ暫時性的上升,在同時給予h-G9NC(null)組,IFN-γ的上升(誘導)被抑制依賴于h-G9NC(null)的給藥量。由此表明h-G9NC(null)調節細胞因子產生,因此可以進行炎癥的調節。
另外在類固醇敏感性(PMA誘導)和類固醇非敏感性(花生四烯酸誘導)炎癥模型(實施例6和7)和辣椒辣素誘導炎癥模型(實施例8)中也看到了h-G9NC(null)的抑制效果。
作為變態性炎癥,研究了h-G9NC(null)在DNFB誘導接觸皮炎模型、FITC誘導特應性皮炎模型、抗DNP單克隆IgE抗體致敏蕁麻疹模型中的效果。例如在實施例9的DNFB誘導接觸皮炎模型中,腹腔內注射h-G9NC(null),通過以耳殼浮腫作為指標的皮膚反應研究效果。結果看到使用h-G9NC(null)的1、10、100μg量的抑制效果,另外沒有看到由于給予地塞米松產生的顯著的體重減少。在實施例10的FITC誘導特應性皮炎模型中,通過腹腔內注射h-G9NC(null),在激發相中看到了h-G9NC(null)的效果。另外當向實施例11的抗DNP單克隆IgE抗體致敏蕁麻疹模型小鼠分別腹腔內注射h-G9NC(null)的1、10、100μg時,由抗原涂布(DNFB)導致的二層性皮膚反應被抑制。
作為自身免疫疾患模型之一,記錄了抗體混合物h-G9NC(null)對誘發關節炎的實施例。h-G9NC(null)對佐劑性關節炎、膠原關節模型等也有影響。例如、在實施例12中的h-G9NC(null)1μg中也看到了抑制。
實施例13
半乳凝素9突變體在腫瘤細胞中的凋亡(細胞損傷活性)誘導)
〔實驗方法〕
將懸浮于RPMI(SIGMA)10%FBS(JRH)的各細胞以3×103個/90μL加入到96孔板(FALCON),培養24小時(37℃、5%CO2)后、添加(10μl)最終濃度為0.03~1μM的半乳凝素9突變體(h-G9NC(null)),培養24小時。培養后、向孔添加10μL WST-1試劑(Roche,1 644 807),于37℃、5%CO2條件下反應2~4小時后,使用板式測讀儀測定450~600的吸光度,各腫瘤細胞中的凋亡(細胞損傷活性)誘導評價通過Viability(%)=[(檢體的吸光度-Blank/(陰性對照的吸光度-Blank))×100進行。
表2給出了使用的腫瘤細胞。
                                             表2
                表半乳凝素9突變體在腫瘤細胞中的凋亡(細胞損傷性)誘導數據  Cell name  Animal  1μM  killing  IC50(μM)                Tissue  L1210  Mouse(BDF1)  99  0.026  Spleen Lymph node,leukemia  EL-4  Mouse(C57BL/6  50  1.038  Spleen  P388 D1  Mouse(DBA/2)  78  0.626  Lymphoma,macrophage,monocyte  NS-1  Mouse(BALB/c)  92  0.062  Bcell(myeloma),derived from MOPC-21  Meth A  Mouse(BALB/c)  92  0.198  Fibrosarcoma,subcutaneous  MH134  Mouse(C3H/He)  91  0.262  Liver,ascites hepatoma  B16/BL6  Mouse(C57BL/6  0  Melanoma  B16/F10  Mouse(C57BL/6  0  Melanoma  B16/Fl  Mouse(C57BL/6  45  1.286  Melanoma  MM-RU  Human  58  0.899  Melanoma  MM-BP  Human  53  0.937  Melanoma  PK-1  Human  66  0.184  Pancreas  PK-9  Human  59  0.624  Pancreas  PANC-1  Human  58  0.866  Pancreatic carcinoma of ductal  origin  KLM-1  Human  55  0.883  Pancreas  Wi-Dr-Tc  Human  32  Colon adenocarcinoma  COLO205  Human  0  Colon adenocarcinoma  Colon26  Mouse(BALB/c)  30  Rectum carcinoma  HuO9N2  Human  26  Bone  HMC-1  Human  19  Human mast cell  MCF-7 K10  Human  17  Breast adenocarcinoma  SK-Br-3  Human  0  Breast  HT17  Human  70  0.214  Liver,low differentiated  HuH-7  Human  0  Liver,high differentiated  KATOIII  Human  89  0.210  Stomach
表2中,「Cell name」表示細胞名,「Animal」表示該腫瘤細胞來自的動物種類,「1μM killing 」表示添加1μM半乳凝素9突變體時的killing(%),「Tissue」表示該細胞來自的組織·器官部位。
〔結果〕
半乳凝素9突變體(h-G9NC(null))在培養細胞中引起的凋亡(細胞損傷活性)誘導測定的結果如表2所示。由該結果可判斷半乳凝素9突變體對
1)血球系腫瘤是有效果的
2)惡性黑色種和纖維肉腫等非上皮性惡性腫瘤也有效
3)胃癌、胰臟癌、肺癌等上皮性惡性腫瘤也有效。
實施例14
〔半乳凝素9突變體在皮下移植模型中的抗腫瘤活性(抗癌效果)〕
〔實驗方法〕
作為靶腫瘤細胞使用LLC細胞。將培養的細胞(1×106個/100μL)與半乳凝素9突變體(h-G9NC(null),100μg/100μL)或生理鹽水100μL于37℃反應1小時后,皮下注射到C57BL6小鼠的背中。測定腫瘤徑(長軸、短軸)。
然后切下移植5周后的給藥皮膚部位(腫瘤),在緩沖為10%中性的甲醛溶液中對組織病理檢查用樣品進行固定后,將石蠟包埋組織做成切片,用HE試劑染色。
〔結果〕
圖20給出了半乳凝素9突變體在皮下移植模型中的抑制腫瘤細胞增殖效果、即抗腫瘤活性(抗癌效果)測定的結果。另外在圖21中還給出了通過組織病理解析研究抗腫瘤活性(抗癌效果)的結果。圖中,Gal9(n)和Gal9表示半乳凝素9突變體(h-G9NC(null)),而5W表示5周。
如果在半乳凝素9突變體(h-G9NC(null))存在下對LLC進行培養,在相差顯微鏡下觀察到明顯的癌細胞的形態變化。此時,半乳凝素9突變體依賴于用量誘導LLC的活細胞數減少(MTT assay)、DNA合成能降低(3H-Thymidine攙入能)、培養上清中的LDH放出量亢進。由半乳凝素9突變體產生的這些抗腫瘤效果在人肺癌細胞株H226(扁平上皮癌)、A549(腺癌)、H69(小細胞癌)中同樣被確認。另外,在半乳凝素9突變體存在下,LLC的Annexin V表達量有意義增加。
另一方面,如果將LLC在半乳凝素9突變體共存下接種于同系統小鼠C57BL6的皮下,不生長腫瘤,在接種后5周時,看到與對照組有明顯差別。小鼠存活率在半乳凝素9突變體存在下有意義改善了。判明半乳凝素9突變體誘導癌細胞凋亡,發揮抗腫瘤效果。
在通過將人小細胞肺癌細胞株H69細胞靜脈注入裸鼠導致的肺癌多臟器轉移模型中,通過半乳凝素9突變體的腹腔注射也確認抑制轉移效果。
實施例15
〔半乳凝素9突變體對于培養腫瘤細胞的凋亡(細胞損傷活性)誘導〕
〔實驗方法〕
(1)Meth A細胞的凋亡
將懸浮于RPMI(SIGMA)10%FBS(JRH)的Meth A以4×104個/90μl加入到96孔板(FALCON),同時添加1~30μg/ml(10μl)半乳凝素9突變體(h-G9NC(null)),培養24小時(37℃、5%CO2)。24小時后,將細胞用PBS(-)200μl清洗一次,懸浮于Annexin vBinding Buffer(BD PharMingen),添加Annexin V-PE(BD PharMingen)和7-Amino-actinomycin D,暗中于室溫下反應15分鐘,通過FACScalibur(Becton,Dickinson)進行解析。
(2)B16/F10細胞的凋亡
將以1×104個/90μl懸浮于RPMI(SIGMA)10%FBS(JRH)的B16/F10加到96孔板(FALCON)中,培養24小時(37℃、5%CO2)后,添加(10μl)半乳凝素9突變體(h-G9NC(null))使最終濃度達到1~30μg/ml,培養24小時。24小時后,將細胞用PBS(-)200μl清洗1次,用0.05%Trypsin EDTA(GIBCO)處理后,用培養液清洗一次,再用PBS(-)清洗。然后懸浮于Annexin V Binding Buffer(BDPharMingen)中,添加A nnexin V-PE(BD PharMingen)和7-Amino-actinomycin,暗中于室溫下反應15分鐘,用FACS calibur(Becton,Dickinson)進行解析。
〔結果〕
結果如圖22和圖23所示。圖22是使用半乳凝素9突變體(h-G9NC(null))誘導Meth A細胞凋亡的解析結果。圖23是使用半乳凝素9突變體(h-G9NC(null))誘導B16/F10細胞凋亡的解析結果。
實施例16
〔半乳凝素9突變體在癌性腹膜炎模型中的抗腫瘤活性(抗癌效果)〕
〔實驗方法〕
(1)Meth A細胞:將用PBS(-)調制的細胞(5×105個/100μL)接種在BALB/c小鼠(SLC,6周齡雌性、n=3)的腹腔。
腹腔內接種細胞后連續18天注射半乳凝素9突變體(h-G9NC(null),100μg/300μL)。在開始注射時期,分為1)MethA細胞剛接種后、2)3日后、3)7日后、4)10日后4組(n=10),比較存活率。
(2)B16/F10細胞:將細胞(5×105個/100μL)接種到C57/BL6小鼠(SLC,6周齡雌性)的腹腔內。接種后立刻將各濃度的半乳凝素9突變體(h-G9NC(null),10、30、100μg/300μL)注入腹腔內,連續注入14天。比較存活率。接種后14日觀察臟器。
〔結果〕
結果如圖24~27和48所示。圖24為存活曲線,表示在通過MethA細胞做成的癌性腹膜炎模型中半乳凝素9突變體具有抗腫瘤效果。圖25表示顯示未給予半乳凝素9突變體(Gal9)組(上段)和給予組(下段)中小鼠狀態的照片。圖26為生存曲線,表示在通過B16/F10細胞做成的癌性腹膜炎模型中半乳凝素9突變體具有抗腫瘤效果。圖27表示比較給予和未給予半乳凝素9突變體(Gal-9)組中通過B16/F10細胞做成的癌性腹膜炎模型小鼠的狀態,給出了內臟組織照片。圖48表示在腹腔內(i.p.)接種了LLC細胞(1×106個)的小鼠中,每日i.p.注入半乳凝素9突變體(h-G9NC(null),100μg/小鼠)或載體(vehicle)的結果(從Day 0開始連日注入、各組7只小鼠)。在小鼠癌性腹膜炎模型(MethA、B16/F10細胞、LLC細胞)中確認注射G9NC(null)(i.p.)(癌細胞接種時同時注射和癌細胞接種后注射)產生延長壽命效果。
Meth A細胞、LLC細胞是通過半乳凝素9突變體誘導凋亡的細胞。而B16/F10細胞不能被半乳凝素9突變體誘導凋亡。
就B16/F10細胞來說,已闡明半乳凝素9突變體抑制癌細胞與細胞外基質的結合依賴于濃度。而在由B16/F10細胞做出的癌性腹膜炎模型中,就G9NC(null)注入組與對照組相比,腹腔液中的NK,NKT細胞增加。B16/F10黑素瘤細胞雖然是對由穩定化半乳凝素9引起的凋亡具有耐性,但可確認存活率改善和抑制黑素瘤細胞向腹壁的粘附。半乳凝素9突變體在癌性腹膜炎模型中的抗腫瘤效果也表明腫瘤細胞向細胞外基質的抑制粘附即炎癥細胞的浸潤抑制效果、NK、NKT細胞等擔當免疫細胞的參與。
實施例17
〔B16/F10腹腔內浸潤細胞的解析〕
〔實驗方法〕
在將以5×105個/200μl懸浮于PBS(-)的B16/F10移植到C57/BL6小鼠(SCL)的腹腔的同時,按照30μg/300μl向腹腔注入半乳凝素9突變體(h-G9NC(null)),24小時后采取腹腔細胞,懸浮于PBS(-)。在純化抗小鼠CD16/CD32(2.4G2)(BD PharMingen)中于4℃下反應5分鐘后,用各個抗體[PE抗小鼠CD122(TM-β-1)(BDPharMingen)、FITC抗小鼠TCRβ-chain(H57-597)(BDPharMingen)、PE抗小鼠CD11b(M1/70)(BD PharMingen)、APC-標識抗小鼠CD11c(HL3)(BD PharMingen)、APC抗小鼠CD8a(BDPharMingen)、FITC抗小鼠CD4(BD PharMingen)]于4℃下反應30分鐘,通過FACS calibur(Becton,Dickinson)進行解析。
〔結果〕
結果如圖28所示。與注入PBS組相比,就注入半乳凝素9突變體組(30μg)來說,在腹腔洗凈液中證實NK/NKT細胞等參與免疫的細胞的動員。
實施例18
〔半乳凝素9突變體抑制B16/F10細胞粘附的活性〕
〔實驗方法〕
將最終濃度為1~30μg/ml的半乳凝素9突變體(h-G9NC(null))按照每孔10μl預先加到用I型膠原、IV型膠原(collagentype I,IV),板蛋白(laminin),纖維結合素(fibronectin),?;岷纖?vitronectin)包被的6孔板(CHEMICON),在該板按照4×104個/well(90μl)接種用RPMI(SIGMA)0.02%BSA(Wako)懸浮的B16/F10,溫育1小時(37℃、5%CO2)。1小時后去除上清,用PBS(-)200μl清洗2次后,加入90μl RPMI 0.02%BSA和10μl WST-1(Roche),溫育2~3小時。最后使用板式測讀儀測定450~600的吸光度,按照粘附率(Adherence,%)=[(檢體的吸光度-Blank/(陰性對照的吸光度-Blank))×100進行計算。
〔結果〕
結果如圖29所示。B16/F10細胞與各細胞外基質(I型膠原、IV型膠原、板蛋白、纖維結合素、?;岷纖?的結合受到半乳凝素9突變體(圖中記為穩定化半乳凝素)抑制。證實該抑制作用與半乳凝素9突變體的濃度有關。
然后研究了半乳凝素9突變體對炎癥的生物活性。研究了半乳凝素9突變體對作為炎癥分類于I型的炎癥支氣管哮喘、分類于II型的炎癥自身免疫性溶血性貧血、分類于III型的炎癥阿蒂斯(Arthus)反應(血管炎)的活性。
實施例19
〔壁虱抗原誘發哮喘模型(Der f-induced AHR model)〕
〔實驗方法〕
地塞米松(地塞米松21-磷酸二鈉鹽、Sigma,MO,美國),氯醋甲膽堿(methacholine(MCh),Sigma,MO,USA)和變態性誘發性提取物混合壁虱抗原(Allergenic Extract mixed Insects MITE:コナヒヨウヒ壁虱(D.Farinae,Der f))可從此處給出的供貨商獲得。為了投給動物,在全部的實驗中作為載體(vehicle)使用PBS(-),將化合物懸浮于該溶液后進行。
Balb/c小鼠(7周齡)由SLC(靜岡,日本)購入。為了做到使動物能夠自由地攝取適當餌料和水,以每12小時為晝夜節奏的標準狀態飼養。所有的動物按照國際的指導原則和國內法通過人工進行管理。
小鼠中的哮喘性過敏反應(Asthmatic Hypersensitive Response:AHR)的誘導如下進行。
為了在小鼠的呼吸道組織誘發對氯醋甲膽堿和嗜酸性細胞浸潤的呼吸道過敏性,對雄小鼠致敏后,作為變態原使用上述壁虱抗原(Der f)進行誘發處理。濃度為Der f(0.5mg/ml),通過按照每次0.05ml,于第0日、第7日以及第20日投到鼻腔內(i.n.),免疫小鼠,然后使用噴霧器用做成1%氣霧的Der f處理30分鐘,激發過敏性。對照組的動物于第0日、第7日和第20日經由鼻腔內(i.n.)接受投給的通常PBS(0.05ml),然后使用噴霧器再用PBS處理30分鐘。
為了研究半乳凝素9突變體(h-G9NC(null))和地塞米松的作用效果,在用Der f誘發前和Der f誘發后,分別向小鼠腹腔內(i.p.)注入半乳凝素9突變體(h-G9NC(null)100μg/410μl(in PBS)/只、或地塞米松3mg/200μl(in PBS)/kg(體重)。
作為樣品,從各動物采取支氣管肺胞洗凈液(bronchoalveolarlavage fluid:BAL fluid)。通過無拘束呼吸功能解析裝置(unrestrained whole body plethysmograph;PULMOS-I;M.I.P.S,大阪,日本)測定具有無拘束的意識的小鼠的全肺氣流量。為了求比每分鐘的氣流量、換氣量、呼吸的頻率、以及比呼吸道阻力(specificairway resistance:sRAW),使用收容小鼠的箱子和對照用箱子之間的壓差。呼吸道阻力為無量綱的參數,是呼吸循環中的小鼠的全肺呼吸量的函數。通過做成氣霧的PBS(作為基礎測定值)或MCh(6-25mg/ml)再對小鼠處理2分鐘,進行測定,求噴霧療法處理后100次的呼吸的平均值。用Turk′s液對懸浮的細胞數(cells/ml)進行染色,用血球計(hemocytometer)再進行測定,得到cytospin調制物,使用Giemsa-May-Grunwald溶液賦予形態特征,測定細胞的差異。對各載玻片上的200-500個白細胞進行計數。
〔結果〕
結果如圖30、31和32所示。圖中各個值表示7只動物的平均±S.E.。統計上的差異使用one-way ANOVA進行解析。而組之間的差異使用Dunnett′s Multiple Comparison Test進行評價(*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001)。圖30表明通過給予h-G9NC(null)〔Gal-9〕,呼吸道過敏性的亢進改善了。圖31表明通過給予h-G9NC(null)〔Gal-9〕可抑制對BALF中嗜酸性細胞浸潤。圖32表明通過給予h-G9NC(null)〔Gal-9〕可抑制支氣管周圍的炎癥細胞浸潤。因此表明使用半乳凝素9,由于可抑制炎癥細胞對呼吸道的浸潤,所以呼吸道過敏性改善了。
實施例20
〔OVA誘發哮喘模型(OVA-induced AHR model)〕
〔實驗方法〕
作為動物使用小鼠和豚鼠。卵白白蛋白(Ovalbumin(OVA),Sigma,MO,美國)、甲吡酮(metopyrone,Sigma,MO,美國)、甲哌卡因(mepyramine,Sigma,MO,美國)可以由此處給出的供貨商買到。其它的化合物可以象實施例19那樣獲得。為了給予動物,在全部實驗中作為載體(vehicle)使用PBS(-),將化合物懸浮于該溶液中給予動物。Balb/c小鼠(7周齡)從SLC(靜岡,日本)購入,而豚鼠(5周齡)由Kudou Co.Ltd(熊本,日本)購入,象實施例19那樣進行飼養。
AHR在小鼠中的誘導如下進行。
為了在小鼠的呼吸道組織誘發對氯醋甲膽堿和嗜酸性細胞浸潤的呼吸道過敏性,對雄小鼠進行致敏后,將上述OVA作為變態原使用,進行誘發處理。用與硫酸鋁鉀形成復合體的OVA(0.5mg/ml),再按照每次0.2ml,于第0日和第14日,通過腹腔內(i.p.)注射對小鼠進行免疫。于第14日、第18日和第22日用經普通食鹽水稀釋的戊巴比妥(5.0mg/ml)的0.2-0.3ml麻醉小鼠。OVA致敏組的所有動物于第14日、第18日和第22日經由鼻腔內(i.n.)給予0.05ml普通食鹽水中的2.0mg/ml的OVA。對照組的動物于第0日和第14日,經由腹腔內(i.p.)注入加入了硫酸鋁鉀的通常PBS,然后于第14日、第18日和第22日經由鼻腔內(i.n.)注入通常的PBS(0.05ml)。
為了研究半乳凝素9突變體(h-G9NC(null))以及地塞米松的作用效果,于OVA誘發前和OVA誘發后第0,7,14,15,16,17,18,19,20,21,以及第22,將半乳凝素9突變體(h-G9NC(null)100μg/410μl(in PBS)/只、或地塞米松3mg/200μl(in PBS)/kg(體重)分別注入小鼠腹腔內(i.p.)。
作為樣品,從各動物采取BAL液。通過氣壓式呼吸功能解析裝置(whole body barometric plethysmograph;Buxco Electronics,Inc.,Sharon,CT)測定具有無拘束的意識的小鼠的全肺氣流量。通過該裝置,以作為增高的間歇(Pause(Penh))已知的呼吸圖形的變化進行測定,該參數與呼吸道阻力相關,在進行監測呼吸道阻力中使用。通過做成氣霧的PBS(作為基礎測定值)或MCh(6-25mg/ml)再對小鼠處理2分鐘,進行測定,求噴霧療法處理后100次的呼吸的平均值。用Turk′s液對懸浮的細胞數(cells/ml)進行染色,用血球計(hemocytometer)再進行測定,得到cytospin調制物,使用Giemsa-May-Grunwald溶液賦予形態特征,測定細胞的差異。對各載玻片上的200-500個白細胞進行計數。
AHR在豚鼠中的誘導如下進行。
為了在小鼠的呼吸道組織誘發對抗原和嗜酸性細胞浸潤的呼吸道過敏性,對雄小鼠進行致敏后,將上述OVA作為變態原使用,進行誘發處理。使用Omron超音波式噴霧器(Omron NE-U17 nebulizer,立石電氣(株)、東京、日本),于第0~第7日,對豚鼠用1%OVA的食鹽水液的氣霧進行10分鐘致敏。為了避免過敏性休克,所有動物在致敏處理30分鐘前和誘發處理30分鐘前給予甲哌卡因(10mg/kg)。
為了研究半乳凝素9突變體(h-G9NC(null))的作用效果,于OVA誘發前和OVA誘發后將半乳凝素9突變體(h-G9NC(null)1μg/4ml(PBS中)/kg注入豚鼠腹腔內(i.p.)。
作為樣品,從各動物采取BAL液。
在最初致敏后第3天,將動物置于備有可從箱籠脫離的口鼻式面罩的全身式呼吸功能解析箱子(PULMOS-I;M.I.P.S,大阪,日本),按照Agrawal′s法測定比呼吸道傳導率(SGaw)。氣流量與箱子容量的變化的關系(這可從箱子壓的變化計算出)可以以將箱子容量的變化對氣流量按照x-y作圖的斜率(slope)決定??梢越?次的呼吸循環中的斜率的平均用于計算Sgaw中。
在用OVA誘發前向豚鼠腹腔內(i.p.)注射10mg/kg的甲吡酮,然后使用Omron超音波式噴霧器(Omron NE-U17 nebulizer,立石電氣(株)、東京、日本),于2%OVA的食鹽水液的氣霧中以3l/min的流速再處理豚鼠5分鐘。然后于抗原處理1min前以及抗原處理后2,4,5,6,7,8以及第23小時監測SGaw的變化,進行測定,求各個時點后的100次呼吸的平均值。各SGaw值與免疫刺激前得到的值比較,以SGaw中的變化百分比表示。用Turk′s液對懸浮的細胞數(cells/ml)進行染色,用血球計再進行測定,得到cytospin調制物,使用Giemsa-May-Grunwald溶液賦予形態特征,測定細胞的差異。對各載玻片上的500個白細胞進行計數。
〔結果〕
圖33和34給出了小鼠中的結果、而圖35和36表示小鼠中的結果。圖中、各個值表示7只(圖33)、5~7只(圖34)、7或8只(圖35和圖36)動物的平均±S.E。統計上的差異使用one-way ANOVA進行解析。而組之間的差異使用Dunnett′s Multiple Comparison Test進行評價(*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001)。
圖33表示半乳凝素9突變體(h-G9NC(null))具有改善呼吸道過敏性的作用。圖34表示半乳凝素9突變體(h-G9NC(null))抑制BALF中的嗜酸性細胞的浸潤。
圖35表示半乳凝素9突變體(h-G9NC(null))對即時型哮喘(IAR)·延遲型哮喘(IAR)的作用。結果在給予半乳凝素9突變體組,IAR和LAR無論那一個與對照組比較,都看到有意義的差。即看到抑制效果。
圖36表示半乳凝素9突變體(h-G9NC(null))對呼吸道內炎癥性細胞浸潤的作用。結果在給予半乳凝素9突變體組,與對照組比較,對于總細胞數以及嗜酸性細胞都看到有意義差。在其它細胞中也看到浸潤抑制傾向。
半乳凝素9突變體通過按照1mg/只的用量在抗原致敏和激發前進行腹腔內注入,表明有可能抑制被動致敏豚鼠的抗原激發即時型·延遲型哮喘反應和呼吸道內細胞浸潤。
實施例21
〔自身免疫性溶血性貧血(RαMRC Ab-induced AIHA model)〕
〔實驗方法〕
環磷酰胺(cyclophosphamide(CY),Sigma,MO,美國)、硫唑嘌呤(azathioprine(AZ),Sigma,MO,美國)、氨甲蝶呤(methotrexate(MTX),Sigma,MO,美國)兔的抗小鼠赤血球抗體(RαMRC Ab)可以從此處提供的供貨商買到。其它的化合物象實施例19那樣獲得。為了給予動物,在全部實驗中作為載體(vehicle,V)使用PBS(-),將化合物懸浮于該溶液后給予動物。Balb/c小鼠(7周齡)由SLC(靜岡,日本)購入,象實施例19那樣飼育。
小鼠中的自身免疫性溶血性貧血(AIHA)的誘導象下面那樣進行。
將兔的αMRBC自身抗體注入小鼠靜脈內(i.v.),誘導溶血性貧血。在兔的αMRBC自身抗體注射30分鐘前和該自身抗體注射后1~4日內,將半乳凝素9突變體(h-G9NC(null))、地塞米松、其它藥物、或載體(vehicle)注入腹腔內(i.p.,0.345ml/head))。
將血液樣品采取到經肝素處理的微量血細胞比容毛細管中,用離心機于12,000rpm離心5分鐘??蠢胄暮籩苯影暗腞BCs的百分比決定血細胞比容。
統計學上的解析如下進行。
沒有特別指出時,數據用平均值±SEM表示。數據組的統計上的差異使用one-way ANOVA進行解析。而組之間的差異使用市售的統計軟件(GraphPad Software,Inc.,San Diego,USA)通過Dunnett′sMultiple Comparison Test進一步評價。P值<0.05被認為是統計學上有意義。
〔結果〕
結果如圖37所示。在半乳凝素9突變體組中,確認有抑制發癥傾向。圖中各個值表示5~6只的動物的平均值±SEM(*p<0.05,**p<0.01)。
實施例22
〔Arthus反應(血管炎)〕
〔實驗方法〕
研究了半乳凝素9突變體對免疫復合體誘發2相皮膚反應(Arthus反應)的作用效果。
抗OVA IgG由供貨商購入。其它的化合物象實施例20那樣獲得。為了給予動物,在全部實驗中作為載體(vehicle,V)使用PBS(-),將化合物懸浮于該溶液后給予動物。Balb/c小鼠(7周齡)由SLC(靜岡,日本)購入,象實施例19那樣飼育。
小鼠中耳殼浮腫的誘導如下進行。
對2相皮膚反應模型的小鼠的右耳皮內注射(i.d.)抗OVA IgG(50μg/小鼠),進行致敏,然后立刻靜脈內注入(i.v.)200μl的1%OVA的PBS。
在OVA注射30分鐘前和OVA注射后5小時,向腹腔內(i.p.,0.345ml/head))注射半乳凝素9突變體(h-G9NC(null))、地塞米松、或載體(vehicle)。在OVA注射后0,2,4,8和24小時,使用校正厚度計(Mitsutoyo,東京,日本)在乙醚麻醉下測定耳的厚度。
用(R-L)-(R0-L0)表示耳殼浮腫。其中R0表示實驗開始時(0h)的右耳厚度,而L0表示實驗開始時(0h)的左耳厚度,R表示各個時點得到的右耳厚度,而L表示左耳的厚度。
統計上的解析如下進行。
沒有特別指出時,數據用平均值±SEM表示。數據組的統計上的差異使用one-way ANOVA進行解析。而組之間的差異使用市售的統計軟件(GraphPad Software,Inc.,San Diego,USA)通過Dunnett′sMultiple Comparison Test進一步評價。P值<0.05被認為是統計學上有意義。
〔結果〕
結果如圖38所示。在半乳凝素9突變體組中,確認有抑制發癥傾向。圖中各個值表示5~6只的動物的平均值±SEM(*p<0.05,**p<0.01)。
實施例23
〔ARDS模型(LPS-induced ARDS model)〕
〔實驗方法〕
脂多糖(lipopolysaccharide,LPS,Sigma,MO,USA)由此處提供的供貨商購入。其它的化合物象實施例19那樣獲得。為了給予動物,在全部實驗中作為載體(vehicle,V)使用PBS(-),將化合物懸浮于該溶液后給予動物。Balb/c小鼠(7周齡)由SLC(靜岡,日本)購入,象實施例19那樣飼育。
小鼠中的ARDS的誘導如下進行。
為了激發小鼠的呼吸道組織呼吸困難癥和嗜中性細胞的浸潤,作為肺傷害模型使用LPS對雄小鼠進行處置。小鼠接受經鼻(i.n.)給予的LPS(0.6mg/ml,0.05-ml容量)。對照組經同樣的途徑接受給予通常的PBS(0.05ml)。
為了研究半乳凝素9突變體(h-G9NC(null))和地塞米松的作用效果,在LPS誘發30分鐘前和LPS誘發后6小時,分別向小鼠腹腔內(i.p.)注入半乳凝素9突變體(h-G9NC(null)100μg/410μl(inPBS)/只或地塞米松1~10mg/200μl(in PBS)/kg(體重)。
通過氣壓式呼吸功能解析裝置(whole body barometricplethysmography;Buxco Electronics,Inc.,Sharon,CT)和無拘束呼吸功能解析裝置(unrestrained wholebody plethysmograph;PULMOS-I;M.I.P.S,大阪,日本)在LPS誘發的1小時前和24小時后對小鼠的肺功能(pen h值和換氣量)進行解析。
對肺功能進行解析后,由各動物采取BAL液作為樣品。
通過無拘束呼吸功能解析裝置測定具有無拘束的意識的小鼠的全肺氣流量。為了求比每分鐘的氣流量、換氣量、呼吸的頻率、pen h值、以及比呼吸道阻力(sRAW),使用收容小鼠的箱子和對照用箱子之間的壓差。呼吸道阻力為無量綱的參數,是呼吸循環中的小鼠的全肺呼吸量的函數。
用Turk′s液對懸浮的細胞數(cells/ml)進行染色,用血球計再進行測定,得到cytospin調制物,使用Giemsa-May-Grunwald溶液賦予形態特征,測定細胞的差異。對各載玻片上的200-500個白細胞進行計數。
統計上的解析如下進行。
沒有特別指出時,數據用平均值±SEM表示。數據組的統計上的差異使用one-way ANOVA或two-way ANOVA進行解析。而組之間的差異使用市售的統計軟件(GraphPad Software,Inc.,San Diego,USA)通過Dunnett′s Multiple Comparison Test進一步評價。P值<0.05被認為是統計學上有意義。
〔結果〕
結果如圖39和圖40所示。圖中各個值表示5~6只的動物的平均值±SEM。數據組的統計上的差異使用one-wayANOVA進行解析。而組之間的差異使用Dunnett′s Multiple Comparison Test進行評價(*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001)。圖39表示半乳凝素9突變體(h-G9NC(null))對呼吸道過敏性的作用。證實有改善。圖40表示半乳凝素9突變體(h-G9NC(null))抑制BALF中的中性白細胞的浸潤。
實施例24
〔辣椒辣素誘導炎癥模型〕
〔實驗方法〕
賽庚啶(cyproheptadine,Sigma,MO,USA)和辣椒辣素(capsaicin,Nakarai,Tokyo,Japan)由此處提供的供貨商購入。其它的化合物象實施例19那樣獲得。為了給予動物,在全部實驗中作為載體(vehicle,V)使用PBS(-),將化合物懸浮于該溶液后給予動物。Balb/c小鼠(7周齡)由SLC(靜岡,日本)購入,象實施例19那樣飼育。
小鼠中的耳殼浮腫的誘導如下進行。
將500μg的辣椒辣素溶解于丙酮/橄欖油(4/1,30μl),適用于各小鼠(BALB/c,♀,7-8周齡,SPF,SLC Inc.)的右耳內側表面和外側表面。對于左耳作為對照適用丙酮/橄欖油。將半乳凝素9突變體(h-G9NC(null))、地塞米松、cyproheptadine、或載體(vehicle)在給予辣椒辣素30分鐘前注入到腹腔內(i.p.,0.345ml/head),而在10分鐘前進行靜脈內注射。在注射辣椒辣素后0,0.5,1和2小時,使用校正厚度計(Mitsutoyo,東京,日本)在乙醚麻醉下測定耳的厚度。
用(R-L)-(R0-L0)表示耳殼浮腫。其中R0表示實驗開始時(0h)的右耳厚度,而L0表示實驗開始時(0h)的左耳厚度,R表示各個時點得到的右耳厚度,而L表示左耳的厚度。
統計上的解析如下進行。
沒有特別指出時,數據用平均值±SEM表示。數據組的統計上的差異使用one-way ANOVA進行解析。而組之間的差異使用市售的統計軟件(GraphPad Software,Inc.,San Diego,USA)通過BonferroniPost-Test進一步評價。P值<0.05被認為是統計學上有意義。
〔結果〕
結果如圖41所示。在給予半乳凝素9突變體組(靜注注射),確認抑制發癥。圖中各個值表示5~6只的動物的平均值±SEM。數據組的統計上的差異使用one-way ANOVA進行解析。而組之間的差異通過Dunnett′s Multiple Comparison Test進行評價(*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001)。預期通過半乳凝素9突變體可以抑制起因于神經性、炎癥性的疼痛。
實施例25
〔半乳凝素9突變體對骨吸收和骨形成的作用〕
〔實驗方法〕
1.骨吸收
(破骨細胞形成)
在RANKL(50ng/ml)和M-CSF(50ng/ml)存在下,將外周血單核細胞(1×105cells)培養9天,比較半乳凝素9突變體(h-G9NC(null))添加(0.1~10nM)組和未添加組TRAP陽性多核細胞數(破骨細胞)。h-G9NC(null)抑制TRAP陽性多核細胞(破骨細胞)的形成依賴于濃度。有時也將h-G9NC(null)簡單地記為gal-9。
得到的結果如圖42所示。
對照組(cont.):500±13.2cells/well,給予半乳凝素9突變體組(h-G9NC(null),0.1nM):451±7.6cells/well、(h-G9NC(null),1.0nM):151±12.5cells/well、(h-G9NC(null),10nM):29±14.0cells/well。
2.骨形成
(成骨細胞增殖)
使用Tetra color-1assay通過吸光度研究h-G9NC(null)(0.1~100nM)對人成骨細胞(按照2×103/well將細胞播種到96孔板,過夜后加h-G9NC(null)刺激,于0小時、24小時、48小時時刻觀察)增殖的影響。
得到的結果如圖44所示。半乳凝素9突變體誘導成骨細胞的增殖依賴于濃度,其增殖受到乳糖抑制。半乳凝素9突變體誘導成骨細胞的增殖依賴于濃度,而受到乳糖(30mM)的抑制。吸光度在對照為0.21±0.01、在h-G9NC(null)(0.1nM)為0.22±0.01、在h-G9NC(null)(1.0nM)為0.24±0.01、在h-G9NC(null)(10nM)為0.25±0.01、在h-G9NC(null)(100nM)為0.26±0.02是24小時的值,48小時后,對照為0.22±0.01、h-G9NC(null)(0.1nM)為0.23±0.01、h-G9NC(null)(1.0nM)為0.26±0.01、h-G9NC(null)(10nM)為0.27±0.01、h-G9NC(null)(100nM)為0.31±0.04。
(成骨細胞分化)
使用流式細胞儀通過細胞內ALP和骨鈣蛋白研究半乳凝素9突變體(h-G9NC(null))(100nM)對人成骨細胞(按照2×103/well將細胞播種到6孔板,溫育24小時后,于1%FCS/DMEM饑餓過夜,加gal-9刺激,8小時后測定)分化的影響。
得到的結果如圖45所示。半乳凝素9突變體誘導成骨細胞中的骨形成標志ALP、骨鈣蛋白的表達。ALP與無刺激相比增加了400molecules/cell、而骨鈣蛋白與無刺激相比增加了800molecules/cell。而如果向成骨細胞中添加h-G9NC(null)(10nM),培養28天,與不添加組相比,ALP染色和von kossa染色被促進。
由以上試驗可知在半乳凝素9突變體添加后6小時,發生單核細胞的凝集。而半乳凝素9突變體抑制TRAP陽性多核細胞的形成依賴于濃度。半乳凝素9突變體誘導成骨細胞的增殖依賴于濃度。半乳凝素9突變體誘導成骨細胞中的ALP、骨鈣蛋白的表達。
以上結果表明半乳凝素9突變體和天然的半乳凝素9可能對骨吸收有抑制作用,而對骨形成有促進作用,認為作為具有骨形成促進作用的藥劑有可能應用于閉經后骨質疏松癥的治療。
實施例26
〔半乳凝素9突變體對間質性肺炎模型的作用〕
〔實驗方法〕
作為間質性肺炎模型使用小鼠。將C57BL/6小鼠(♀6周齡、使用時7~8周齡、20匹)按照參考文獻:Blood 2002;99:1289-98和Am J Respir Crit Care Med 2003;168:1075-83進行處理,誘導間質性肺炎。使用rhIL-2(PeproTech,5μg×10匹×2組×14日=1400μg=1.4mg)和rmIL-18(MBL,0.2μg×10匹×2組×14日=56μg)。
作為樣品組準備對照組以及半乳凝素9突變體(Gal-9)給予組。
(1)對照組(小鼠10匹)
每只小鼠,每日注射IL-2 5μg+IL-18 0.2μg,連續腹腔內注射0~13天。作為對照,每只小鼠,每日注射PBS 200μl,連續腹腔內注射0~13天。
(2)注射Gal-9組(小鼠10匹)
每只小鼠,每日注射IL-2 5μg+IL-18 0.2μg,連續腹腔內注射0~13天。半乳凝素9突變體(h-G9NC(null))做成100μg/300μl PBS,每只小鼠,連續腹腔內注射13天。麻醉無論那一只都通過戊巴比妥腹腔內注射進行。
效果判定的指標第一為存活率,就存活至14天得到的的例子研究肺組織。
小鼠取樣如下進行:
對于途中死亡例,死亡時解剖,取肺組織
對于生存至day 14的生存例,乙醚麻醉→從眼窩采血→頸椎脫臼→開胸→采取肺組織。
研究了該模型的rhGal-9null腹腔內注入的效果。將rhGal-9null給予組和未給予組各為14天的存活率作為判定效果的基準,然后比較在14天的組織照片。
得到的結果如圖46和47所示。圖46表示存活率。14天的存活率在非給予組為30%(10只中3只生存),在給予h-G9NC(null)(Gal-9)組中為90%(10只中9只生存),看到通過給予半乳凝素9突變體(h-G9NC(null):Gal-9)改善了存活率。
圖47表示14天存活例的肺組織(HE染色、照片)。在非給予組,即使在存活例中也可看到伴隨廣泛而且強度的細胞浸潤產生的肺間質的肥厚。在半乳凝素9突變體(h-G9NC(null):Gal-9)給予組,間質的肥厚、細胞浸潤都為輕度,看到的是大多殘存的正常組織。由此表明在本模型中半乳凝素9(Gal-9)具有抑制發癥的效果。在本試驗中雖然看到體重變化,但在非給予組死亡例、存活例都沒有看到有意義的體重變化。
實施例27
〔對于癌轉移模型的活性〕
〔實驗方法〕
使用B16/F10細胞,研究半乳凝素9突變體對癌轉移模型的作用。
將細胞(5×105個/200μL)接種在C57/BL 6小鼠(SLC,6周齡雌性)的尾靜脈。接種后立刻將半乳凝素9突變體(略記為h-G9NC(null)、「Gal-9」;100μg/300μL)或PBS(各N=15)注入尾靜脈,連續注入11日(注射次數12次)。在接種后第12天,解剖,對肺的結節數進行計數。
圖49給出了試驗的結果(模型動物肺的外觀)。圖50給出了肺結節數計數結果。通過對半乳凝素9突變體注入組(Gal-9組)和PBS注入組(PBS組)進行比較,確認了半乳凝素9突變體產生的抑制轉移效果。通過比較肺的結節數,各組的平均結節數,半乳凝素9突變體注入組(Gal-9)為231.3±20.87、PBS注入組(PBS)為122.1±13.61,P<0.0001,有意性被證實,確認了半乳凝素9突變體抑制癌轉移的效果。
實施例28
〔角叉菜膠誘發炎癥模型:Carrageenan-induced大鼠PawEdema〕
角叉菜膠(carrageenan,Izushi kaga0ku,Japan)由其供貨商購入。為了給予動物,在全部實驗中作為載體(vehicle,V)使用PBS(-),將化合物懸浮于該溶液后給予動物。雌性Lewis大鼠(5周齡)由SLC(靜岡,日本)購入,象實施例19那樣飼育。為了研究半乳凝素9突變體的作用效果,在角叉菜膠注射10分鐘前,按照30-300μg/只(inPBS)向大鼠靜脈內(i.v.)注射半乳凝素9突變體(略記為h-G9NC(null)、「gal-9」。作為陽性對照按照3mg/kg、7mg/kg注射地賽米松(Dex.)。
〔角叉菜膠足跖浮腫〕
按照Sugishita et al.(1981)方法在大鼠中進行角叉菜膠誘發足跖浮腫試驗,研究半乳凝素9突變體(human null galectin-9,h-G9NC(null))的抗炎癥活性。在向右后足的足底注射角叉菜膠(0.15ml;1%w/v in saline)10分鐘前靜脈內(i.v.)注射藥劑化合物(30,100 and 300μg/只)或載體(vehicle:PBS)。誘導浮腫后,使用水銀置換型呼吸功能解析裝置(mercury displacement plethysmography;Muromachi,Tokyo,Japan),測定-1,2,4,6,24,48和72h的注射了角叉菜膠側的足和另外的一側足(右后足注射食鹽水液(saline))的容積。對足體積的變化以-1h和各個小時之間的差異進行計算。對于由角叉菜膠誘導的浮腫以注射了角叉菜膠側的足和另外的一側足之間的差異表示。
統計上的解析如下進行。
沒有特別指出時,數據用平均值±SEM表示。數據組的統計上的差異使用one-way ANOVA進行解析。而組之間00的差異使用市售的統計軟件(GraphPad Software,Inc.,San Diego,USA)通過BonferroniPost-Test進一步評價。P值<0.05被認為是統計學上有意義。
〔結果〕
結果如圖41所示。在給予半乳凝素9突變體組(靜注注射),確認抑制發癥。圖中各個值表示5~6只的動物的平均值±SEM。數據組的統計上的差異使用one-way ANOVA或two-way ANOVA進行解析。而組之間的差異使用市售的統計軟件(GraphPad Software,Inc.,SanDiego,USA),通過Dunnett′s Multiple Comparison Test或Bonferroni Post-Test進一步評價。P值<0.05統計學上認為有意義。
〔結果〕
結果如圖51(半乳凝素9突變體)和圖52(地塞米松)所示。確認半乳凝素-9突變體即使30μg/mouse也有抑制發癥的抑制效果。
實施例29
1.半乳凝素-9突變體佐劑性關節炎模型中的鎮痛作用
〔方法〕
〔機械刺激引起的疼痛
(通過Randall-Selitto test=垂直加壓引起的痛覺閾值的測定)〕
丁酸分枝桿菌(Mycobacterium butyricum,Difco,Detroit,MI,USA)由其供貨商購入。為了給予動物,在全部實驗中作為載體(vehicle,V)使用PBS(-),將化合物懸浮于該溶液后給予動物。雌性Lewis大鼠(5周齡)由SLC(靜岡,日本)購入,象實施例19那樣飼育。為了研究半乳凝素9突變體的作用效果,在佐劑注射的前后0至22日,按照30-300μg/只(in PBS)向大鼠靜脈內(i.v.)注射半乳凝素9突變體(略記為h-G9NC(null)、「gal-9」。作為陽性對照按照3mg/kg注射吲哚美辛(Indo)。
〔佐劑性關節炎〕
測定雌性Lewis大鼠(5周齡)的體重,在尾部做標記,分為由9只動物組成的組。在佐劑注射前(day 0)、記錄體重和兩個后足的足跖的容積。然后向各個大鼠的右后足注射佐劑。將沒有注射佐劑的組作為正常對照組(normal age-matched controls(sham))。分別在佐劑注射后的不同日期記錄將大鼠殺死前各組大鼠的體重和足的容積。
〔佐劑的程序〕
將丁酸分枝桿菌(Mycobacterium butyricum)于乳缽中研碎,制備佐劑,與油混合,做成最終濃度10mg/ml。使用27-號針的0.5-英才針將0.2ml佐劑注射到大鼠右后足的足底。
〔因機械刺激導致疼痛的解析〕
改變Randall和Selitto的手法,對半乳凝素9突變體(human nullgalectin-9,h-G9NC(null))是否具有減輕對來自外部的押壓的在急性炎癥組織或非炎癥組織的末梢性過敏癥的鎮痛活性進行了研究。即向雌性Lewis大鼠(5周齡)的右后足s.c.注射弗氏完全佐劑(CompleteFreund′s Adjuvant),誘發急性和慢性炎癥。在佐劑注射的前2日和角叉菜膠注射5日后,通過Randall和Selitto測試測定對來自外部的押壓的在急性炎癥組織或非炎癥組織的末梢性過敏癥,然后一直監測到第25日(1time/week)。觀察者邊控制,邊用數字式福斯測定器(Imada,aichi,Japan)向已經有炎癥的一側的足跖以及另一側的非炎癥足跖兩方由外慢慢加押壓(0-200g)。將痛覺閾值定義為動物最初表現出感覺疼痛的前兆時的壓。所謂該前兆是指伸時和/或收縮足、發出哭聲的最初時刻表現出的苗頭。
統計上的解析象實施例28那樣進行。即沒有特別指出時,數據用平均值(mean)±SEM表示。數據組的統計上的差異使用one-way ANOVA或two-way ANOVA進行解析。而組之間的差異使用市售的統計軟件(GraphPad Software,Inc.,San Diego,USA)通過Dunnett′sMultiple Comparison Test或Bonferroni Post-Test進一步評價。P值<0.05統計學上被認為是有意義。
〔結果〕
結果如圖58(半乳凝素9突變體,Gal-9)和圖59(吲哚美辛)所示。圖中在分別表示各個值的點的動物(圖58:8-9匹(n=8-9)、圖59:9匹(n=9))的平均值±SEM。統計上的差異使用one-way ANOVA進行解析。而組之間的差異通過Bonferroni Post-Test進行評價(*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001)。給予半乳凝素-9突變體,不止是引起炎癥(依賴于濃度)的部位,即使在不引起炎癥的部位對痛覺刺激的閾值也上升(參照圖66Left)。即半乳凝素-9突變體使全身性痛覺的閾值提高。
2.角叉菜膠誘發急性炎癥模型:Carrageenan-induced PawEdema in rats
〔方法〕
角叉菜膠(carrageenan,Izushi kagaku,Japan)由其供貨商購入。為了給予動物,在全部實驗中作為載體(vehicle,V)使用PBS(-),將化合物懸浮于該溶液后給予動物。雌性Lewis大鼠(5周齡)由SLC(靜岡,日本)購入,象實施例19那樣飼育。為了研究半乳凝素9突變體的作用效果,在角叉菜膠注射10分鐘前,按照30-300μg/只(inPBS)向大鼠靜脈內(i.v.)注射半乳凝素9突變體(略記為h-G9NC(null)、「gal-9」)。作為陽性對照按照3mg/kg、7mg/kg注射地賽米松(Dex.)。
〔因機械刺激導致疼痛的解析〕
改變Randall和Selitto的手法,對半乳凝素9突變體(human nullgalectin-9,h-G9NC(null))是否具有減輕對來自外部的押壓的在急性炎癥組織或非炎癥組織的末梢性過敏癥的鎮痛活性進行了研究。即向雌性Lewis大鼠(5周齡)的右后足s.c.注射角叉菜膠,誘發急性和慢性炎癥。在角叉菜膠注射的前1日和角叉菜膠注射6小時后,通過Randall和Selitto測試測定對來自外部的押壓的在急性炎癥組織或非炎癥組織的末梢性的過敏癥,然后一直監測75h(1time/day)。觀察者邊控制,邊用數字式福斯測定器(Imada,aichi,Japan)向已經有炎癥的一側的足跖以及另一側的非炎癥足跖兩方由外慢慢加押壓(0-200g)。將痛覺閾值定義為動物最初表現出感覺疼痛的前兆時的壓力。所謂該前兆是通過指伸時和/或收縮足、發出哭聲的最初時刻表現出的苗頭。
統計上的解析象實施例28那樣進行。即沒有特別指出時,數據用平均值(mean)±SEM表示。數據組的統計上的差異使用one-way ANOVA或two-way ANOVA進行解析。而組之間的差異使用市售的統計軟件(GraphPad Software,Inc.,San Diego,USA)通過BonferroniPost-Test進一步評價。P值<0.05被認為是統計學上有意義。
〔結果〕
結果如圖60(半乳凝素9突變體,gal-9)和圖61(地塞米松)所示。圖中各個值在各示的點表示9匹(n=9)只的動物的平均值+SEM。統計上的差異使用one-way ANOVA或two-way ANOVA進行解析。而組之間的差異通過Bonferroni Post-Test進行評價(*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001)。給予半乳凝素-9突變體,不止是引起炎癥(依賴于濃度)的部位,即使在不引起炎癥的部位對痛覺刺激的閾值也上升。即半乳凝素-9突變體使全身性痛覺的閾值提高。
實施例30
〔半乳凝素-9突變體人關節液中的穩定性〕
反應條件
人風濕病關節液標本                160μL
G9NC(null)or G9(S)(5μL in PBS)   40μL
即在80%關節液中,使半乳凝素-9于37℃下溫育24小時或96小時(途中于6、24、48、72小時取樣)
SDS處理和Western blot
樣品                               4.5μL
H2O                              40.5μL
Sample buffer(4x,+2-ME)           15μL
SDS-PAGE 12.5%(10μL/lane)。
結果如圖62所示。表明即使在蛋白水解酶活性高的關節液中半乳凝素-9突變體〔G9NC(null)〕也比半乳凝素-9S〔G9(S)〕穩定。
實施例31
〔關節炎模型〕
1.抗體混合物激發模型:半乳凝素-9突變體(i.v.注射)
〔方法〕
使用DBA/1J雌性小鼠(7~8周齡),激發關節炎用單克隆抗體混合物(Chondrex公司、No.62100)按照2mg/0.5mL/只注入動物的尾靜脈。注入3日后腹腔內注射50μg/0.2mL的LPS(SIGMA,L6511)。再以30μg/200μL將半乳凝素-9突變體(略記為h-Gal9NC(null)、「Gal-9」)注入動物的尾靜脈。實驗組做成注入PBS組和注入h-Gal9NC(null)組,Day0(注入LPS日)1次注入組和從Day0連續注入組(直至Day10,注入次數11次)共計3組進行。各組1日1次左右測定前后肢的關節的腫脹,進行打分。
〔結果〕
結果如圖63所示。注入抗體混合物后,用LPS激發關節炎。關節炎也可以通過半乳凝素9突變體的i.v.注入被抑制。而且即使注入1次也可看到發癥被抑制的效果。
2-1.CIA(膠原致敏)模型:半乳凝素-9突變體(i.p.注入)
〔方法〕
將Bovine Collagen typeII(BCII:Chondrex公司catno 2002-1)溶解于完全佐劑(CFA:Difco cat no 263810),制作乳劑,向小鼠(DBA/1J 7~8周齡、雌)的尾根部皮內注射,每次100μL(BCII0.1mg/100μL/mouse)。致敏21日后進行加強注射,一周3次對四肢進行劃痕。加強后立刻向腹腔內注射半乳凝素-9突變體(略記為「Gal-9」;30μg/mouse)或PBS,以后連日注射。
參小鼠劃痕(關節炎所見)對各小鼠的四肢經多人觀察,算出四肢的合計分數(最高16分),算出平均分。
①指1個腫脹               :1分
②指2個以上腫脹           :2分
③腫脹至手(足)的甲        :3分
④劇烈腫脹、變形          :4分
〔結果〕
結果如圖64所示。確認半乳凝素-9突變體有抑制發癥效果。
2-2.CIA(膠原致敏)模型:半乳凝素-9突變體(i.v.注入)
〔方法〕
將Bovine Collagen typeII(BCII:Chondrex公司cat no 2002-1)溶解于預先加了Mycobacterium Tuberculosas H37Ra,desiccated.(H37 Ra:Difco)的imcomplete Freund′sAdjuvant(IFA:Difco),制作乳劑,向小鼠(DBA/1J 7~8周齡、雌)的尾根部皮內注射,每次100μL(BCII 0.2mg/H37 Ra 0.2mg/100μL/mouse)。致敏21日后進行加強注射,一周3次對四肢進行劃痕。小鼠劃痕(關節炎所見)經多人對各小鼠的四肢觀察,算出四肢的合計分數(最高16分),算出平均分數。
加強后、立刻向尾靜脈內注射半乳凝素-9突變體(略記為「Gal-9」と;30μg/mouse N=15)或PBS(N=10),以后連續注射28天。
參考文獻:Enhancement of collagen-induced arthritis inmice genetically deficient in extracellular superoxidedismutase.
Ross AD,Banda NK,Muggli M,Arend WP.Arthritis Rheum.2004Nov;50(11):3702-11.
〔結果〕
結果如圖65所示。即使在半乳凝素-9突變體的i.v.注入也可看到發癥被抑制。
3.佐劑性關節炎(AIA)模型:半乳凝素-9突變體(i.v.注射)
〔方法〕
丁酸分枝桿菌(Mycobacterium butyricum,Difco,Detroit,MI,USA)由其供貨商購入。為了給予動物,在全部實驗中作為載體(vehicle,V)使用PBS(-),將化合物懸浮于該溶液后給予動物。雌性Lewis大鼠(5周齡)由SLC(靜岡,日本)購入,象實施例19那樣飼育。為了研究半乳凝素9突變體的作用效果,在佐劑注射前后0至22日,按照30-300μg/只(in PBS)向大鼠靜脈內(i.v.)注射半乳凝素9突變體(略記為h-G9NC(null)、「gal-9」)。作為陽性對照按照3mg/kg、7mg/kg注射地賽米松(Dex.)。
〔佐劑性關節炎〕
測定雌性Lewis大鼠(5周齡)的體重,在尾部做標記,分為由9只動物組成的組。在佐劑注射前(day 0)、記錄體重和兩個后足的足跖的容積。然后向各個大鼠的右后足注射佐劑。將沒有注射佐劑的組作為正常對照組(normal age-matched controls(sham))。分別在佐劑注射后的不同日期記錄將大鼠殺死前各組大鼠的體重和足的容積。
〔足的容積〕
使用水銀置換型呼吸功能解析裝置(mercury displacementplethysmography;Muromachi,Tokyo,Japan)測定足的容積。將足的容積的變化以day 0與各個日期之間的差異進行計算。
〔臨床上評價〕
對于前肢或后肢的、1.指節骨關節和指、2.甲部或掌、3.踝骨關節或腕部象以下那樣分為0~3等級評價各足關節炎的程度:0,既沒有紅斑,也沒有腫脹;1,輕度的紅斑或腫脹;2,踝骨關節或腕部的中程度的紅斑或腫脹;3,重度的紅斑或腫脹。
在不同的大鼠組中進行了病狀打分。取等級化的足跖關節炎的分數的和,獲得各大鼠每日的關節炎分數的總分。
〔佐劑的程序〕
將丁酸分枝桿菌(Mycobacterium butyricum)于乳缽中研碎,制備佐劑,與混合混合,做成最終濃度10mg/ml。使用27-號的0.5-英才針將0.2ml佐劑注射到大鼠右后足的足底。
統計上的解析象實施例28那樣進行。即沒有特別指出時,數據用平均值(mean)±SEM表示。數據組的統計上的差異使用one-way ANOVA或two-way ANOVA進行解析。而組之間的差異使用市售的統計軟件(GraphPad Software,Inc.,San Diego,USA)通過Dunnett′sMultiple Comparison Test或Bonferroni Post-Test進一步評價。P值<0.05被認為是統計學上有意義。
〔結果〕
結果如圖66(半乳凝素9突變體,Gal-9)和圖67(吲哚美辛,Indo)所示。佐劑性關節炎主要是由自然免疫和T細胞參與的獲得免疫引起的炎癥。半乳凝素-9突變體雖然可抑制任一種炎癥,但主要是強烈抑制由獲得免疫引起的炎癥。另外體重的增減在吲哚美辛給予組和半乳凝素-9突變體給予組都表現出同樣的傾向。
實施例32
〔大鼠CIA(膠原致敏)模型:半乳凝素-9突變體(i.v.注入)〕
〔方法〕
將牛II型膠原(膠原技術研修會)溶解于不完全佐劑(IFA:Difco),制作乳劑,向大鼠(DA/Slc 11周齡:日本SLC公司)的背部皮膚內按照每次500μL進行皮內注射(膠原50μg/500μL/mouse),進行一次致敏。1周后將同膠原乳劑液(膠原50μg/500μL/mouse)注入動物的尾根部,進行二次致敏。每周3次對四肢進行劃痕。加強后立刻向靜脈內注入半乳凝素-9突變體(null human galectin-9=h-G9NC(null);3,10,30μg/1mL/mouse)、陰性對照物質PBS(1mL/mouse),陽性對照物質脫氫可的松(3mg/10mL/kg:SIGMA)經口給予,每日1次、進行到38天之前的第32天。
在膠原一次致敏日(0日)、一次致敏后7,15,18,22,26,30,35和39日測定左右后肢的足容積,按照下式算出浮腫率(%)。
浮腫率(swelling)(%)=[致敏后的足跖體積(mL)-致敏前的足跖體積(mL)]/[致敏前的足跖體積(mL)]×100
統計學上的處理如下進行。左右后肢的加算作為個體值、用浮腫率(%)的平均值和標準誤差表示。在PBS組和脫氫可的松組之間通過F檢定檢定等分散性,對于等分散的情況進行Student的t檢定,對不等分散的場合進行Aspin-Wech的t檢定。然后在PBS組和半乳凝素9突變體組之間通過Bartlet檢定檢定等分散性,對于等分散性的場合進行參數的Dunnett’s test,對于不等分散性的場合進行非參數的Dunnett’s test。無論那一種場合有意水準將5%以下(p<0.05)作為有意義,分成5%以下和1%以下(p<0.01)表示。得到的結果如圖68和表3所示。表3中各個值用平均值(mean)±SEM表示。##:來自對照的有意義差異(15,18,22Day:Student的t檢定、*p<0.05,**p<0.01:來自對照的有意義差異(18,22Day:參數的Dunnett,s test;15Day:非參數的Dunnett,s test)。確認半乳凝素9突變體抑制發癥。
                                         表3  組 劑量             給藥途徑      N                              在特定天數時的腫脹率(%)  7  15  18  22  對照,PBS  -  i.v.  8  0.8±0.2  129.1±5.8  149.0±6.3  137.0±5.9  null human galectin-9        0.03mg/只   0.1mg/只     0.3mg/只  i.v.   i.v.     i.v.  8   8     8  0.7±0.2   0.8±0.2     0.7±0.1  65.0±16.3  **  23.5±4.3   **   13.9±2.3  129.5±5.7  *  108.0±12.3   **   52.5±13.0  143.2±4.7   135.0±9.9   **   96.9±8.9   潑尼松龍   3mg/kg   p.o.     8   0.7±0.2  ##  13.5±7.2  ##  53.1±13.5  ##  87.4±10.1
本半乳凝素9突變體(穩定化半乳凝素9、例如、h-G9NC(null)等)由于表現出如下那樣的生物活性,所以可表現出預期的抗腫瘤效果
腫瘤細胞的凝集······在許多腫瘤細胞中的凝集效果
粘附抑制·········對細胞外基質的粘附抑制效果
凋亡、細胞損傷··在很多腫瘤細胞中的凋亡誘導
樹狀細胞(DC)的活化···DC分化誘導
NK、NKT活化····動員促進
疼痛的抑制········抑制由辣椒辣素引起的疼痛
本發明者等研究組研究了半乳凝素9在乳癌組織中的表達,通過半乳凝素9陽性例確認遠隔轉移頻率低。而且現在正在進行轉移予知診斷試劑盒的開發(Clin Cancer Res,2005 in press,Galectin-9 asa prognostic factor with anti-metastatic potential in breastcancer)。另外確認半乳凝素9基因導入人乳癌細胞株在體內表現出高的凝集性,在裸鼠體內也確認表現出同樣的凝集性。另外對包括血球系惡性腫瘤在內的很多細胞系的細胞損傷活性都被確認,確認其中很多活性是由于凋亡的誘導導致的(Int J Cancer.2002 20;99(6):809-816,Possible role of galectin-9 in cell aggregation anda poptosis of human melanoma cell lines and its clinicalsignificance;J immunol.2003 1;170(7d):3631-3636,Galectin-9induces apoptosis through the carcium-calpain-caspase-1pathway)。另外,在給予半乳凝素9的局部,NK/NKT細胞、Mφ系細胞等的動員被證實,表明細胞性癌免疫機構誘導的可能性。
由以上結果可以預期穩定化半乳凝素9(本發明的半乳凝素9突變體、例如、h-G9NC(null)等)具有通過對白血病等血球系惡性腫瘤、術后的釋放癌細胞的殺細胞效果、阻礙癌細胞的凝集·癌細胞的血管壁粘附和向其它組織的浸潤,抑制轉移、抑制癌性腹膜炎發癥的效果、以及通過效應細胞向腫瘤周邊部位的動員引起腫瘤免疫活性的亢進等效果、以及成為預期作用效果更理想,副作用更少的新的抗癌物質。
現在開發中的生物制劑(單克隆抗體等)以免疫細胞表面分子、細胞內功能分子或炎癥性細胞因子作為靶。即是具有抑制效果,做成藥理作用的藥劑。另外本穩定化半乳凝素9分子制劑是通過誘導滑膜細胞或活化T細胞的凋亡和抑制骨破壞的作用,預期生物體本來具有的免疫調節作用、抗炎癥作用和骨·軟骨組織也可再生的與抗細胞因子療法等完全不同的新想法的開發研究。疼痛是關節風濕病的主要所見,在上述實施例中使用的辣椒辣素是激發神經性炎癥的炎癥性疼痛的重要的介體,穩定化半乳凝素9抑制由于辣椒辣素涂布引起的耳殼腫脹。即預期可作為副作用少的新的全身性自身免疫疾患的治療藥。本穩定化半乳凝素9可成為由于新的作用機制引起副作用少的抗風濕病劑。本穩定化半乳凝素9具有抑制炎癥和關節組織的修復、抑制疼痛的臨床效果上的特征,預期(1)活化T細胞凋亡的誘導,(2)滑膜細胞的凋亡、(3)花生四烯酸級聯,(4)骨破壞抑制等機理有望作為風濕病治療藥。實際上關節炎(CIA、抗體混合物)模型的抑制發癥已被確認。
產業上利用的可能性
半乳凝素9突變體比野生型的半乳凝素對酶有抗性,所以在有效利用半乳凝素9表現出的多方面作用·功能中有重要作用。野生型半乳凝素9雖然通過對腫瘤細胞的直接作用(誘導誘導腫瘤細胞的細胞間粘附與凋亡的活性)和借助于免疫系的作用,表現出具有抑制癌的轉移和誘導萎縮,但半乳凝素9突變體是表現出同樣活性的更有好的活性物質,例如預期可作為抗腫瘤藥等。野生型半乳凝素9由于對非活化淋巴細胞沒有作用,而誘導活化T細胞、特別是誘導成為過剩免疫反應原因的CD4陽性T細胞凋亡,
本半乳凝素9突變體是表現出同樣活性的更有好的活性物質、例如預期可作為抗炎癥藥、抗變態性藥、骨質疏松藥。由于已闡明野生型半乳凝素9對與風濕病中關節的變形等有關的滑膜細胞具有強力凋亡誘導能力,所以本半乳凝素9突變體預期可作為表現出同樣活性的更有好的活性物質。因此可以在針對癌治療藥和難治的自身免疫疾患(包括風濕病)、變態性疾患、炎癥疾患、與骨代謝有關的疾患的治療藥的開發、半乳凝素9的功能闡明和研究開發中利用。
本發明除了上述說明以及實施例特別敘述的以外,顯然能夠實行。鑒于上述的示范,本發明的多種改變以及變形都是可能的,因此這些也都是本件附加的權利要求范圍的范圍內的內容。
<序列表free text>
SEQ ID NO:1,人工序列的描述:半乳凝素9突變體的多聚核苷酸,G9NC(null)
SEQ ID NO:2,人工序列的描述:半乳凝素9突變體的氨基酸
SEQ ID NO:5,半乳凝素9的M型同工型
SEQ ID NO:10,人工序列的描述:用作PCR引物的寡核苷酸
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SEQ ID NO:12,人工序列的描述:用作PCR引物的寡核苷酸
SEQ ID NO:13,人工序列的描述:用作PCR引物的寡核苷酸
                               序列表
<110>株式會社嘉爾藥物
<120>新的半乳凝素9突變體蛋白質及其用途
<130>GL 05PCT
<150>JP 2004-94401
<151>2004-03-29
<150>JP 2004-287005
<151>2004-09-30
<150>JP 2005-43156
<151>2005-02-18
<160>13
<170>Patentln version 3.1
<210>1
<211>891
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>半乳凝素9突變體的多核苷酸
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(891)
<223>G9NC(null)
<400>1
atg gcc ttc agc ggt tcc cag gct ccc tac ctg agt cca gct gtc ccc       48
Met Ala Phe Ser Gly Ser Gln Ala Pro Tyr Leu Ser Pro Ala Val Pro
1               5                   10                  15
ttt tct ggg act att caa gga ggt ctc cag gac gga ctt cag atc act       96
Phe Ser Gly Thr Ile Gln Gly Gly Leu Gln Asp Gly Leu Gln Ile Thr
            20                  25                  30
gtc aat ggg acc gtt ctc agc tcc agt gga acc agg ttt gct gtg aac      144
Val Asn Gly Thr Val Leu Ser Ser Ser Gly Thr Arg Phe Ala Val Asn
        35                  40                  45
ttt cag act ggc ttc agt gga aat gac att gcc ttc cac ttc aac cct      192
Phe Gln Thr Gly Phe Ser Gly Asn Asp Ile Ala Phe His Phe Asn Pro
    50                  55                  60
cgg ttt gaa gat gga ggg tac gtg gtg tgc aac acg agg cag aac gga      240
Arg Phe Glu Asp Gly Gly Tyr Val Val Cys Asn Thr Arg Gln Asn Gly
65                  70                  75                  80
agc tgg ggg ccc gag gag agg aag aca cac atg cct ttc cag aag ggg      288
Ser Trp Gly Pro Glu Glu Arg Lys Thr His Met Pro Phe Gln Lys Gly
                85                  90                  95
atg ccc ttt gac ctc tgc ttc ctg gtg cag agc tca gat ttc aag gtg      336
Met Pro Phe Asp Leu Cys Phe Leu Val Gln Ser Ser Asp Phe Lys Val
            100                 105                 110
atg gtg aac ggg atc ctc ttc gtg cag tac ttc cac cgc gtg ccc ttc      384
Met Val Asn Gly Ile Leu Phe Val Gln Tyr Phe His Arg Val Pro Phe
        115                 120                 125
cac cgt gtg gac acc atc tcc gtc aat ggc tct gtg cag ctg tcc tac      432
His Arg Val Asp Thr Ile Ser Val Asn Gly Ser Val Gln Leu Ser Tyr
    130                 135                 140
atc agc ttc cag cat atg act ccc gcc atc cca cct atg atg tac ccc      480
Ile Ser Phe Gln His Met Thr Pro Ala Ile Pro Pro Met Met Tyr Pro
145                 150                 155                 160
cac ccc gcc tat ccg atg cct ttc atc acc acc att ctg gga ggg ctg      528
His Pro Ala Tyr Pro Met Pro Phe Ile Thr Thr Ilc Leu Gly Gly Leu
                165                 170                 175
tac cca tcc aag tcc atc ctc ctg tca ggc act gtc ctg ccc agt gct      576
Tyr Pro Ser Lys Ser Ile Leu Leu Ser Gly Thr Val Leu Pro Ser Ala
            180                 185                 190
cag agg ttc cac atc aac ctg tgc tct ggg aac cac atc gcc ttc cac      624
Gln Arg Phe His Ile Asn Leu Cys Ser Gly Asn His Ile Ala Phe His
        195                 200                 205
ctg aac ccc cgt ttt gat gag aat gct gtg gtc cgc aac acc cag atc      672
Leu Asn Pro Arg Phe Asp Glu Asn Ala Val Val Arg Asn Thr Gln Ile
    210                 215                 220
gac aac tcc tgg ggg tct gag gag cga agt ctg ccc cga aaa atg ccc      720
Asp Asn Ser Trp Gly Ser Glu Glu Arg Ser Leu Pro Arg Lys Met Pro
225                 230                 235                 240
ttc gtc cgt ggc cag agc ttc tca gtg tgg atc ttg tgt gaa gct cac      768
Phe Val Arg Gly Gln Ser Phe Ser Val Trp Ile Leu Cys Glu Ala His
                245                 250                 255
tgc ctc aag gtg gcc gtg gat ggt cag cac ctg ttt gaa tac tac cat      816
Cys Leu Lys Val Ala Val Asp Gly Gln His Leu Phe Glu Tyr Tyr His
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Arg Leu Arg Asn Leu Pro Thr Ile Asn Arg Leu Glu Val Gly Gly Asp
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Ile Gln Len Thr His Val Gln Thr
    290                 295
<210>2
<211>296
<212>PRT
<213>人工序列
<220
<223>半乳凝素9突變體的氨基酸
<400>2
Met Ala Phe Ser Gly Ser Gln Ala Pro Tyr Leu Ser Pro Ala Val Pro
1               5                   10                  15
Phe Ser Gly Thr Ile Gly Gly Gly Leu Gln Asp Gly Leu Gln Ile Thr
            20                  25                  30
Val Asn Gly Thr Val Leu Ser Ser Ser Gly Thr Arg Phe Ala Val Asn
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Phe Gln Thr Gly Phe Ser Gly Asn Asp Ile Ala Phe His Phe Asn Pro
    50                  55                  60
Arg Phe Glu Asp Gly Gly Tyr Val Val Cys Asn Thr Arg Gln Asn Gly
65                  70                  75                  80
Ser Trp Gly Pro Glu Glu Arg Lys Thr His Met Pro Phe Gln Lys Gly
                85                  90                  95
Met Pro Phe Asp Leu Cys Phe Leu Val Gln Ser Ser Asp Phe Lys Val
            100                 105                 110
Met Val Asn Gly Ile Leu Phe Val Gln Tyr Phe His Arg Val Pro Phe
        115                 120                 125
His Arg Val Asp Thr Ile Ser Val Asn Gly Ser Val Gln Leu Ser Tyr
    130                 135                 140
Ile Ser Phe Gln His Met Thr Pro Ala Ile Pro Pro Met Met Tyr Pro
145                 150                 155                 160
His Pro Ala Tyr Pro Met Pro Phe Ile Thr Thr Ile Leu Gly Gly Leu
                165                 170                 175
Tyr Pro Ser Lys Ser Ile Leu Leu Ser Gly Thr Val Leu Pro Ser Ala
            180                 185                 190
Gln Arg Phe His Ile Asn Leu Cys Ser Gly Asn His Ile Ala Phe His
        195                 200                 205
Leu Asn Pro Arg Phe Asp Glu Asn Ala Val Val Arg Asn Thr Gln Ile
    2l0                 215                 220
Asp Asn Ser Trp Gly Ser Glu Glu Arg Ser Leu Pro Arg Lys Met Pro
225                 230                 235                 240
Phe Val Arg Gly Gln Ser Phe Ser Val Trp Ile Leu Cys Glu Ala His
                245                 250                 255
Cys Leu Lys Val Ala Val Asp Gly Gln His Leu Phe Glu Tyr Tyr His
            260                 265                 270
Arg Leu Arg Asn Leu Pro Thr Ile Asn Arg Leu Glu Val Gly Gly Asp
        275                 280                 285
Ile Gln Leu Thr His Val Gln Thr
    290                 295
<210>3
<211>148
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>3
Met Ala Phe Ser Gly Ser Gln Ala Pro Tyr Leu Ser Pro Ala Val Pro
1               5                   10                  15
Phe Ser Gly Thr Ile Gln Gly Gly Leu Gln Asp Gly Leu Gln Ile Thr
            20                  25                  30
Val Asn Gly Thr Val Leu Ser Ser Ser Gly Thr Arg Phe Ala Val Asn
        35                  40                  45
Phe Gln Thr Gly Phe Ser Gly Asn Asp Ile Ala Phe His Phe Asn Pro
    50                  55                  60
Arg Phe Glu Asp Gly Gly Tyr Val Val Cys Asn Thr Arg Gln Asn Gly
65                  70                  75                  80
Ser Trp Gly Pro Glu Glu Arg Lys Thr His Met Pro Phe Gln Lys Gly
                85                  90                  95
Met Pro Phe Asp Leu Cys Phe Leu Val Gln Ser Ser Asp Phe Lys Val
            100                 105                 110
Met Val Asn Gly Ile Leu Phe Val Gln Tyr Phe His Arg Val Pro Phe
        115                 120                 125
His Arg Val Asp Thr Ile Ser Val Asn Gly Ser Val Gln Leu Ser Tyr
    130                 135                 140
Ile Ser Phe Gln
145
<210>4
<211>146
<212>PRT
<213>智人
<400>4
Thr Pro Ala Ile Pro Pro Met Met Tyr Pro His Pro Ala Tyr Pro Met
1               5                   10                  15
Pro Phe Ile Thr Thr Ile Leu Gly Gly Leu Tyr Pro Ser Lys Ser Ile
            20                  25                  30
Leu Leu Ser Gly Thr Val Leu Pro Ser Ala Gln Arg Phe His Ile Asn
        35                  40                  45
Leu Cys Ser Gly Asn His Ile Ala Phe His Leu Asn Pra Arg Phe Asp
    50                  55                  60
Glu Asn Ala Val Val Arg Asn Thr Gln Ile Asp Asn Ser Trp Gly Ser
65                  70                  75                  80
Glu Glu Arg Ser Leu Pro Arg Lys Met Pro Phe Val Arg Gly Gln Ser
                85                  90                  95
Phe Ser Val Trp Ile Leu Cys Glu Ala His Cys Leu Lys Val Ala Val
            100                 105                 110
Asp Gly Gln His Leu Phe Glu Tyr Tyr His Arg Leu Arg Asn Leu Pro
        115                 120                 125
Thr Ile Asn Arg Leu Glu Val Gly Gly Asp Ile Gln Leu Thr His Val
    130                 135                 140
Gln Thr
145
<210>5
<211>972
<212>DNA
<213>智人
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(972)
<223>半乳凝素9的M型同工型(galectin-9 medium isoform)
<400>5
atg gcc ttc agc ggt tcc cag gct ccc tac ctg agt cca gct gtc ccc       48
Met Ala Phe Ser Gly Ser Gln Ala Pro Tyr Leu Ser Pro Ala Val Pro
1               5                   10                  15
ttt tct ggg act att caa gga ggt ctc cag gac gga ctt cag atc act       96
Phe Ser Gly Thr Ile Gln Gly Gly Leu Gln Asp Gly Leu Gln Ile Thr
            20                  25                  30
gtc aat ggg acc gtt ctc agc tcc agt gga acc agg ttt gct gtg aac      144
Val Asn Gly Thr Val Leu Ser Ser Ser Gly Thr Arg Phe Ala Val Asn
        35                  40                  45
ttt cag act ggc ttc agt gga aat gac att gcc ttc cac ttc aac cct      192
Phe Gln Thr Gly Phe Ser Gly Asn Asp Ile Ala Phe His Phe Asn Pro
    50                  55                  60
cgg ttt gaa gat gga ggg tac gtg gtg tgc aac acg agg cag aac gga      240
Arg Phe Glu Asp Gly Gly Tyr Val Val Cys Asn Thr Arg Gln Asn Gly
65                  70                  75                  80
agc tgg ggg ccc gag gag agg aag aca cac atg cct ttc cag aag ggg      288
Ser Trp Gly Pro Glu Glu Arg Lys Thr His Met Pro Phe Gln Lys Gly
                85                  90                  95
atg ccc ttt gac ctc tgc ttc ctg gtg cag agc tca gat ttc aag gtg      336
Met Pro Phe Asp Leu Cys Phe Leu Val Gln Ser Ser Asp Phe Lys Val
            100                 105                 110
atg gtg aac ggg atc ctc ttc gtg cag tac ttc cac cgc gtg ccc ttc      384
Met Val Asn Gly Ile Leu Phe Val Gln Tyr Phe His Arg Val Pro Phe
        115                 120                 125
cac cgt gtg gac acc atc tcc gtc aat ggc tct gtg cag ctg tcc tac      432
His Arg Val Asp Thr Ile Ser Val Asn Gly Ser Val Gln Leu Ser Tyr
    130                 135                 140
atc agc ttc cag cct ccc ggc gtg tgg cct gcc aac ccg gct ccc att      480
Ile Ser Phe Gln Pro Pro Gly Val Trp Pro Ala Asn Pro Ala Pro Ile
145                 150                 155                 160
acc cag aca gtc atc cac aca gtg cag agc gcc cct gga cag atg ttc      528
Thr Gln Thr Val Ile His Thr Val Gln Ser Ala Pro Gly Gln Met Phe
                165                 170                 175
tct act ccc gcc atc cca cct atg atg tac ccc cac ccc gcc tat ccg      576
Ser Thr Pro Ala Ile Pro Pro Met Met Tyr Pro His Pro Ala Tyr Pro
            180                 185                 190
atg cct ttc atc acc acc att ctg gga ggg ctg tac cca tcc aag tcc      624
Met Pro Phe Ile Thr Thr Ile Leu Gly Gly Leu Tyr Pro Ser Lys Ser
        195                 200                 205
atc ctc ctg tca ggc act gtc ctg ccc agt gct cag agg ttc cac atc      672
Ile Leu Leu Ser Gly Thr Val Leu Pro Ser Ala Gln Arg Phe His Ile
    210                 215                 220
aac ctg tgc tct ggg aac cac atc gcc ttc cac ctg aac ccc cgt ttt      720
Asn Leu Cys Ser Gly Asn His Ile Ala Phe His Leu Asn Pro Arg Phe
225                 230                 235                 240
gat gag aat gct gtg gtc cgc aac acc cag atc gac aac tcc tgg ggg      768
Asp Glu Asn Ala Val Val Arg Asn Thr Gln Ile Asp Asn Ser Trp Gly
                245                 250                 255
tct gag gag cga agt ctg ccc cga aaa atg ccc ttc gtc cgt ggc cag      816
Ser Glu Glu Arg Ser Leu Pro Arg Lys Met Pro Phe Val Arg Gly Gln
            260                 265                 270
agc ttc tca gtg tgg atc ttg tgt gaa gct cac tgc ctc aag gtg gcc      864
Ser Phe Ser Val Trp Ile Leu Cys Glu Ala His Cys Leu Lys Val Ala
        275                 280                 285
gtg gat ggt cag cac ctg ttt gaa tac tac cat cgc ctg agg aac ctg      912
Val Asp Gly Gln His Leu Phe Glu Tyr Tyr His Arg Leu Arg Asn Leu
    290                 295                 300
ccc acc atc aac aga ctg gaa gtg ggg ggc gac atc cag ctg acc cat      960
Pro Thr Ile Asn Arg Leu Glu Val Gly Gly Asp Ile Gln Leu Thr His
305                 310                 315                 320
gtg cag aca tag                                                      972
Val Gln Thr
<210>6
<211>323
<212>PRT
<213>智人
<400>6
Met Ala Phe Ser Gly Ser Gln Ala Pro Tyr Leu Ser Pro Ala Val Pro
1               5                   10                  15
Phe Ser Gly Thr Ile Gln Gly Gly Leu Gln Asp Gly Leu Gln Ile Thr
            20                  25                  30
Val Asn Gly Thr Val Leu Ser Ser Ser Gly Thr Arg Phe Ala Val Asn
        35                  40                  45
Phe Gln Thr Gly Phe Ser Gly Asn Asp Ile Ala Phe His Phe Asn Pro
    50                  55                  60
Arg Phe Glu Asp Gly Gly Tyr Val Val Cys Asn Thr Arg Gln Asn Gly
65                  70                  75                  80
Ser Trp Gly Pro Glu Glu Arg Lys Thr His Met Pro Phe Gln Lys Gly
                85                  90                  95
Met Pro Phe Asp Leu Cys Phe Leu Val Gln Ser Ser Asp Phe Lys Val
            100                 105                 110
Met Val Asn Gly Ile Leu Phe Val Gln Tyr Phe His Arg Val Pro Phe
        115                 120                 125
His Arg Val Asp Thr Ile Ser Val Asn Gly Ser Val Gln Leu Ser Tyr
    130                 135                 140
Ile Ser Phe Gln Pro Pro Gly Val Trp Pro Ala Asn Pro Ala Pro Ile
145                 150                 155                 160
Thr Gln Thr Val Ile His Thr Val Gln Ser Ala Pro Gly Gln Met Phe
                165                 170                 175
Ser Thr Pro Ala Ile Pro Pro Met Met Tyr Pro His Pro Ala Tyr Pro
            180                 185                 190
Met Pro Phe Ile Thr Thr Ile Leu Gly Gly Leu Tyr Pro Ser Lys Ser
        195                 200                 205
Ile Leu Leu Ser Gly Thr Val Leu Pro Ser Ala Gln Arg Phe His Ile
    210                 215                 220
Asn Leu Cys Ser Gly Asn His Ile Ala Phe His Leu Asn Pro Arg Phe
225                 230                 235                 240
Asp Glu Asn Ala Val Val Arg Asn Thr Gln Ile Asp Asn Ser Trp Gly
                245                 250                 255
Ser Glu Glu Arg Ser Leu Pro Arg Lys Met Pro Phe Val Arg Gly Gln
            260                 265                 270
Ser Phe Ser Val Trp Ile Leu Cys Glu Ala His Cys Leu Lys Val Ala
        275                 280                 285
Val Asp Gly Gln His Leu Phe Glu Tyr Tyr His Arg Leu Arg Asn Leu
    290                 295                 300
Pro Thr Ile Asn Arg Leu Glu Val Gly Gly Asp Ile Gln Leu Thr His
305                 310                 315                 320
Val Gln Thr
<210>7
<211>61
<212>PRT
<213>智人
<400>7
Asn Pro Arg Thr Val Pro Val Gln Pro Ala Phe Ser Thr Val Pro Phe
1               5                   10                  15
Ser Gln Pro Val Cys Pho Pro Pro Arg Pro Arg Gly Arg Arg Gln Lys
            20                  25                  30
Pro Pro Gly Val Trp Pro Ala Asn Pro Ala Pro Ile Thr Gln Thr Val
        35                  40                  45
Ile His Thr Val Gln Ser Ala Pro Gly Gln Met Phe Ser
    50                  55                  60
<210>8
<211>29
<212>PRT
<213>智人
<400>8
Pro Pro Gly Val Trp Pro Ala Asn Pro Ala Pro Ile Thr Gln Thr Val
1               5                   10                  15
Ile His Thr Val Gln Ser Ala Pro Gly Gln Met Phe Ser
            20                  25
<210>9
<211>17
<212>PRT
<213>智人
<400>9
Thr Gln Thr Val Ile His Thr Val Gln Ser Ala Pro Gly Gln Met Phe
1               5                   10                  15
Ser
<210>10
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用作PCR引物的寡核苷酸
<400>10
cgtcctcaata tggccttcag cggttcccag                                     30
<210>11
<211>33
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用作PCR引物的寡核苷酸
<400>11
cgaccgcata tgctggaagc tgatgtagga cag                                  33
<210>12
<211>33
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用作PCR引物的寡核苷酸
<400>12
cgtcctcata tgactcccgc catcccacct atg                                  33
<210>13
<211>33
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用作PCR引物的寡核苷酸
<400>13
cgaccgggat ccctatgtct gcacatgggt cag                                  33

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