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维戈塞尔塔赫罗纳: A型口蹄疫重組疫苗株及其制備方法和應用.pdf

摘要
申請專利號:

维戈塞尔塔vs皇家社会 www.vmyqew.com.cn CN201310175324.4

申請日:

2013.05.14

公開號:

CN103266091B

公開日:

2015.01.14

當前法律狀態:

有效性:

法律詳情: 授權|||實質審查的生效IPC(主分類):C12N 7/01申請日:20130514|||公開
IPC分類號: C12N7/01; C12N15/86; A61K39/135; A61P31/14; C12R1/93(2006.01)N 主分類號: C12N7/01
申請人: 中國農業科學院蘭州獸醫研究所
發明人: 劉湘濤; 鄭海學; 楊帆; 靳野; 郭建宏; 曹偉軍; 張克山; 田宏; 何繼軍; 董海聚; 才學鵬
地址: 730046 甘肅省蘭州市城關區鹽場堡徐家坪1號
優先權: 2012.07.30 CN 201210266252.X
專利代理機構: 北京鑫浩聯德專利代理事務所(普通合伙) 11380 代理人: 呂愛萍
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法律狀態
申請(專利)號:

CN201310175324.4

授權公告號:

103266091B||||||

法律狀態公告日:

2015.01.14|||2013.09.25|||2013.08.28

法律狀態類型:

授權|||實質審查的生效|||公開

摘要

本發明涉及一種利用反向遺傳操作技術制備的A型口蹄疫重組疫苗株及其制備方法和應用,一種是效價高、抗原匹配性和免疫?;ぢ矢叩腁型口蹄疫重組疫苗株,另一種是效價高、抗原匹配性、免疫?;ぢ矢咔葉運拗魑拗虜⌒緣腁型口蹄疫重組無致病性疫苗株,疫苗株的抗原核苷酸序列為SEQIDNO:1所示,利用反向遺傳操作系統能夠拯救出病毒的真核質粒,用制備的重組疫苗株制成滅活苗,免疫豬和牛后可有效刺激機體產生免疫應答,并提供豬和牛體免疫?;ぷ饔?,對A型AISA拓撲型毒株的10000倍牛半數感染劑量(BID50)攻毒實驗,免疫?;ぢ蝕?00%,50%?;ぜ亮浚≒D50)為10.81~13.59,可用于我國及其周邊國家A型口蹄疫病毒的預防和控制。

權利要求書

權利要求書
1.   一種A型口蹄疫重組疫苗株,其特征在于:所述A型口蹄疫重組疫苗株具有高滴度、與流行病毒的抗原匹配性高,免疫?;ぢ矢叩奶卣?,該疫苗株的抗原核苷酸序列為SEQ ID NO:1所示。

2.   一種A型口蹄疫重組無致病性疫苗株,其特征在于:在上述A型口蹄疫重組疫苗株的基礎上將L基因進行突變,所述A型口蹄疫重組無致病性疫苗株具有高滴度、與流行病毒的抗原匹配性高,免疫?;ぢ矢?、并且對豬和牛無致病性、不形成血毒癥、不排毒,且能誘導宿主產生早期免疫應答等特征,該疫苗株的L基因序列為SEQ ID NO:2所示。

3.   一種如權利要求1所述的A型口蹄疫重組疫苗株的制備方法,其特征在于:(1)、A型口蹄疫重組疫苗株真核轉錄質粒的構建,該真核轉錄質粒在病毒全長cDNA兩側嵌有榔頭錘酶(hammerhead ribozyme,HamRz) 和戊型肝炎酶(hepatitis delta ribozyme,HdvRz),在其外側的5'端添加有聚合酶I和聚合酶II轉錄啟動子,在3'端有終止子;以O型口蹄疫病毒拯救系統為骨架,通過AflII和SgrAI限制性內切酶,用A/WH/CHA/09毒株含有部分L和P1基因的序列SEQ ID NO:1替換相應基因,得到prA?FMDV的重組質粒;所用A/WH/CHA/09毒株是2009年1月分離于湖北武漢,經BHK?21傳代培養10代,保藏于農業部獸醫局指定保存單位:國家口蹄疫參考實驗室,使用RNAeasy Mini Kit提取A/WH/CHA/09毒株的總RNA,用引物oligNot I反轉錄合成病毒第一鏈cDNA,以合成的第一鏈cDNA為模板,用引物AP1?F和AP1?R擴增獲得A/WH/CHA/09毒株部分L和P1的基因片段,上述三條針對A/WH/CHA/09株的特異性引物分別是:
oligNot I: 5`?ttttctagagcggccgct38?3'
AP1?F:5'?ttttccttaagggacaggaacatgctgtgtttgcctgcgt?3'
AP1?R: 5'?tattttcaccggtgcaataattttctgcttgtgtctgt c?3',
在以上的特異性引物中,擴增A/WH/CHA/09毒株部分L和P1基因序列所用上游引物AP1?F中含AflII限制性酶切位點;下游引物AP1?R中含下劃線部分的SgrAI限制性酶切位點,用上述特異性引物進行擴增,得到A/WH/CHA/09毒株部分L和P1基因片段,大小為2400 bp,構建50μL反應體系,擴增條件為:94℃ 5min,94℃ 30s,57℃ 30s,68℃ 2min30s,go to 2,35個循環,72℃ 8min,PCR擴增產物經0.8%瓊脂糖凝膠電泳核實后進行純化回收并送交測序,獲得上述基因片段的DNA;
prO/CHA/99是本實驗室前期構建的含有O/CHA/99毒株全長cDNA的質粒,其中,O/CHA/99毒株是O型口蹄疫毒株,1999年分離于中國香港,現保存于國家口蹄疫參考實驗室,prO/CHA/99質粒組成是在病毒基因組5'端上游含人巨細胞病毒RNA聚合酶II啟動子及編碼牛生長素多聚苷酸化信號的修飾剪切序列,在其兩者間含鼠源RNA聚合酶I啟動子;在病毒基因組3'端下游含鼠源聚合酶終止子I和聚合酶終止子II序列;及嵌合在O型口蹄疫病毒O/CHA/99全長cDNA基因組兩端的榔頭錘酶和戊型肝炎酶的核心序列,其中戊型肝炎酶共有88個核糖核酸,自我剪切修飾位點在5'末端G處;榔頭錘酶核心序列共有58個核糖核酸,自我剪切修飾位點在3'末端C處,將含O型口蹄疫病毒O/CHA/99基因組的感染性克隆轉染至受體細胞中,通過RNA聚合酶II啟動子和RNA聚合酶I啟動子調控元件分別轉錄包裝出病毒RNA前體,再經HamRz 和HdvRz的修飾剪切產生具有感染性的病毒RNA,將O型口蹄疫病毒O/CHA/99株拯救系統的質粒prO/CHA/99與上述得到的A/WH/CHA/09毒株部分L和P1片段,分別用AflII和SgrAI雙酶切后,連接轉化至JM109感受態細胞中,測序鑒定陽性克隆,獲得含A/WH/CHA/09毒株部分前導蛋白L和結構蛋白P1的重組質粒,將重組質粒命名為prA?FMDV,且僅位點1與流行毒株有差異;
(2)、A型口蹄疫重組質粒prA?FMDV轉染口蹄疫病毒敏感細胞,具體為BHK?21細胞或IBRS?2細胞,拯救獲得所述的與流行毒株抗原匹配的A型口蹄疫重組病毒;該真核轉錄質粒在適應細胞、乳鼠和豬體內均能夠拯救出相應病毒。

4.   根據權利要求3所述的A型口蹄疫重組疫苗株的制備方法,其特征在于:用所述重組質粒prA?FMDV直接轉染口蹄疫病毒敏感細胞BHK?21細胞或IBRS?2細胞,得到與流行毒株抗原匹配的A型口蹄疫重組病毒。

5.   一種如權利要求2所述的A型口蹄疫重組無致病性疫苗株的制備方法,其特征在于:(1)、A型口蹄疫重組無致病性疫苗株真核轉錄質粒的構建,在上述重組質粒prA?FMDV的基礎上,將L基因SAP區域(SAF?A/B, Acinus, and PIAS)突變,其構建過程是:將表達質粒pCDNA3.1(+)用特異性引物進行擴增,得到含有PacI和AflII酶切位點的基因片段,上述引物分別是:
pCD?AflII?ApaI?F:5'?ttttccttaaggggcccgtttaaacccgctgat?3'
pCD?PacI?NheI?R:5'?cttacttaattaagctagccagcttgggtctcccta?3'
同時將重組質粒prA?FMDV,經PacI和AflII雙酶切后,與上述得到的含有PacI和AflII酶切位點的pCDNA基因片段連接轉化至JM109感受態細胞中,測序鑒定陽性克隆,獲得含5’UTR和部分L基因的重組質粒,將重組質粒命名為pCD?OL;以鑒定正確的重組質粒pCD?OL為模板,用磷酸化突變引物F?P和SAP?P進行PCR擴增,上述5'磷酸化的點突變引物分別是:
F?P:5'?gacctcacagggcttgaactgcacga?3'
SAP?P:5'?ctccgcctgcttggcggctgcaagcgtg?3', 
在以上的磷酸化的點突變引物中,將L基因中SAP區域進行突變,用此對引物進行平末端擴增,純化回收PCR產物,經室溫連接5min后,轉化大腸桿菌JM109,測序鑒定點突變后的陽性克隆,將得到的定點突變重組質粒命名為pCD?OL?SAP;
將已獲得的重組質粒prA ?FMDV與上述得到的L基因中SAP區域進行突變后的重組質粒pCD?OL?SAP,分別用PacI和AflII雙酶切后,連接轉化至JM109感受態細胞中,測序鑒定陽性克隆,獲得含A/WH/CHA/09毒株的P1基因和L基因中SAP區域突變的重組質粒,將重組質粒命名為prA?SAP?FMDV;
(2)、A型口蹄疫重組無致病性疫苗株真核轉錄質粒prA?SAP?FMDV轉染口蹄疫病毒敏感細胞,BHK?21細胞或IBRS?2細胞,拯救獲得所述的與流行毒株抗原匹配且無致病性的A型口蹄疫重組病毒。

6.   根據權利要求5所述的A型口蹄疫重組無致病性疫苗株的制備方法,其特征在于:在重組質粒prA?FMDV的基礎上,對L基因的SAP進行突變,將重組質粒prA? SAP?FMDV直接轉染口蹄疫病毒敏感的細胞BHK?21細胞或IBRS?2細胞,得到重組病毒rA?SAP?FMDV對豬和牛都沒有致病性,并且不形成血毒癥,不排毒,能夠產生較強和較早的免疫應答。

7.   一種根據權利要求1所述的A型口蹄疫重組疫苗株制成的疫苗,其特征在于:培養的A型口蹄疫重組疫苗株用二乙烯亞胺(Binary ethylenimine, BEI)滅活,濃縮純化后與ISA206佐劑以1:1體積比混合制備疫苗,免疫豬和牛后有效刺激機體產生免疫應答,并提供豬和牛體免疫?;ぷ饔?,對A型AISA譜系毒株的10000倍牛半數感染劑量(BID50)攻毒實驗,免疫?;ぢ誓艽?00%,半數?;ぜ亮浚≒D50)為10.81~13.59。

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口蹄疫 重組 疫苗 及其 制備 方法 應用
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