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皇马与维戈塞尔塔历史交战: 用頭孢曲松制備治療和/或預防帕金森氏癥失智的醫藥品的用途.pdf

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頭孢 曲松 制備 治療 預防 帕金森氏癥 醫藥品 用途
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摘要
申請專利號:

CN201210154964.2

申請日:

2012.05.16

公開號:

CN103417547B

公開日:

2015.01.14

當前法律狀態:

有效性:

法律詳情: 專利權的轉移號牌文件類型代碼:1602號牌文件序號:101733380692IPC(主分類):A61K 31/546專利號:ZL2012101549642登記生效日:20160512變更事項:專利權人變更前權利人:何應瑞變更后權利人:何應瑞變更事項:地址變更前權利人:中國臺灣臺中市南區工學路146巷55號16樓之3變更后權利人:中國臺灣臺中市南區工學路146巷55號16樓之3變更事項:專利權人變更前權利人:江文舜變更后權利人:瑞金生物科技有限公司|||專利權的轉移變更后權利人:中國臺灣臺中市南區工學路146巷55號16樓之3變更事項:專利權人變更前權利人:江文舜變更后權利人:江文舜號牌文件類型代碼:1602號牌文件序號:101731603134IPC(主分類):A61K 31/546專利號:ZL2012101549642登記生效日:20160407變更事項:專利權人變更前權利人:嘉詠科技管理顧問有限公司變更后權利人:何應瑞變更事項:地址變更前權利人:中國臺灣臺中市霧峰區萊園路139巷2號|||專利權的轉移號牌文件類型代碼:1602號牌文件序號:101729060218IPC(主分類):A61K 31/546專利號:ZL2012101549642登記生效日:20160219變更事項:專利權人變更前權利人:中山醫學大學變更后權利人:嘉詠科技管理顧問有限公司變更事項:地址變更前權利人:中國臺灣臺中市南區建國北路1段110號變更后權利人:中國臺灣臺中市霧峰區萊園路139巷2號變更事項:專利權人變更前權利人:晉亞化工廠變更后權利人:江文舜|||授權|||實質審查的生效IPC(主分類):A61K 31/546申請日:20120516|||公開
IPC分類號: A61K31/546; A61P25/16 主分類號: A61K31/546
申請人: 中山醫學大學; 晉亞化工廠
發明人: 何應瑞
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法律狀態
申請(專利)號:

CN201210154964.2

授權公告號:

|||||||||103417547B||||||

法律狀態公告日:

2016.06.01|||2016.04.27|||2016.03.09|||2015.01.14|||2013.12.25|||2013.12.04

法律狀態類型:

專利申請權、專利權的轉移|||專利申請權、專利權的轉移|||專利申請權、專利權的轉移|||授權|||實質審查的生效|||公開

摘要

本發明揭示一種用頭孢曲松制備治療和/或預防帕金森氏癥失智的醫藥品的用途。

權利要求書

權利要求書
1.  一種用頭孢曲松制備治療和/或預防帕金森氏癥失智的醫藥品的用途,其特征在于:
該頭孢曲松的劑量范圍是落在從大約1.5mg/kg/天至大約35mg/kg/天內。

2.  如權利要求1所述的用途,其特征在于:
該頭孢曲松的劑量范圍是落在從大約1.62mg/kg/天至大約32.4mg/kg/天內。

3.  如權利要求2所述的用途,其特征在于:
該頭孢曲松的劑量范圍是落在從大約1.62mg/kg/天至大約16.2mg/kg/天內。

4.  如權利要求3所述的用途,其特征在于:
該頭孢曲松的劑量范圍是落在從大約1.62mg/kg/天至大約8.1mg/kg/天內。

5.  如權利要求1所述的用途,其特征在于:
該醫藥品是呈一種供非經腸道投藥的劑型。

6.  如權利要求1所述的用途,其特征在于:
該醫藥品是呈一種供口服投藥的劑型。

說明書

說明書用頭孢曲松制備治療和/或預防帕金森氏癥失智的醫藥品的用途
技術領域
本發明是有關于使用頭孢曲松(ceftriaxone)來治療和/或預防帕金森氏癥失智(Parkinson’s disease dementia,PDD),該頭孢曲松的劑量范圍是落在從大約1.5mg/kg/天至大約35mg/kg/天內。
背景技術
失智癥可依據腦部受到影響的位置而被區分為下面2大類型:(1)皮質失智癥(cortical dementia):例如,阿茲海默氏癥(Alzheimer′s disease,AD)、路易氏體失智(dementia with Lewy body,DLB)以及額顳葉失智癥(Frontal-temporal dementia,FTD)等;以及(2)皮質下失智癥(subcortical dementia):例如,帕金森氏癥失智(Parkinson’s disease dementia,PDD)以及亨廷頓氏舞蹈癥(Huntington’s disease,HD)等。
帕金森氏癥(Parkinson’s disease,PD)是一種常見的神經退化性疾病(neurodegenerative disease),它的臨床癥狀包括靜態性震顫(resting tremor)、僵硬(rigidity)、運動遲緩(bradykinesia)以及體勢不穩(postural instability),而它的病理機制可能與在黑質體致密區(substantia nigra pars compacta,SNc)中的多巴胺神經元(dopaminergic neuron)的退化以及路易氏體(Lewy body)的產生有關聯。帶有帕金森氏癥的病患除了會出現主要的運動癥狀(cardinal motor symptoms)外,有大約25-50%的病患還會發展出認知功能損傷(impairments of cognitive function)而導致失智癥(dementia)(也就是帕金森氏癥失智(Parkinson’s disease dementia,PDD))。帶有帕金森氏癥失智的病患所具有的認知功能損傷包括注意力(attention)、工作記憶(working memory)、執行功能(executive function)、建構能力(constructional abilities)以及視覺空間功能(visuospatial function)的損傷。
已有許多研究探討帶有阿茲海默氏癥或帕金森氏癥失智的病患在神經心理(neuropsychological)上的差異,特別是認知功能損傷的模式。例如,初始的記憶喪失(primacy of memory loss)是阿茲海默氏癥的典型癥狀,但不是帕金森氏癥失智的典型癥狀。而注意力、動機(motivation)以及存取與操作知識 (accessing and manipulating knowledge)的干擾(disturbance)以及心理運動緩慢(psychomotor slowing)皆是帕金森氏癥失智的典型癥狀(Song I.U.et al.(2008),Eur.Neurol.,59:49-54)。另有文獻報導:與帶有阿茲海默氏癥的病患相較下,在帶有帕金森氏癥失智的病患中工具性功能(instrumental functions),(諸如語言以及運用(praxis))的損傷較輕,而語言流暢性(verbal fluency)的損傷、視覺空間功能(諸如視知覺(visual perception))的障礙以及幻覺(hallucination)則較為嚴重,并且常見有人格改變與憂郁癥狀(depressive symptom)(Emre M.(2003),Lancet Neurology,2:229-237)。
目前臨床上常被用來治療帕金森氏癥失智的藥物是卡巴拉汀(rivastigmine)(商品名稱為然而卡巴拉汀只能治療輕度或中度的帕金森氏癥失智,并且可能會導致帕金森氏癥癥狀(特別是震顫)的惡化。另一方面,目前臨床上常被用來改善帕金森氏癥的運動癥狀的左旋多巴(Levodopa,L-dopa)在認知功能損傷上的治療效果也相當有限(Emre M.(2003),同上述)。因此,當今醫藥界有需要去發展出可以有效地治療帕金森氏癥失智并且不會產生非所欲的副作用的藥物。
頭孢曲松(ceftriaxone)是一種廣效型的β-內酰胺抗生素(β-lactam antibiotic),臨床上常被用來治療革蘭氏陽性以及革蘭氏陰性細菌(Gram-positive and Gram-negative bacteria)的感染。近年來,有關于利用頭孢曲松來治療神經退化性疾病(諸如帕金森氏癥以及失智癥)已開始受到關注。例如,在香港浸會大學(Hong Kong Baptist University)的Leung Cheuk Hung于2007年所著博士論文(名稱:“Glutamate Antagonism as a Potential Treatment of Parkinson′s Disease:A Study in a Rat Model”)中,Leung Cheuk Hung使用頭孢曲松來處理6-羥多巴胺-損傷的大鼠[6-hydroxydopamine(6-OHDA)-lesioned rat](一種帕金森氏癥的動物模型),而實驗結果顯示:頭孢曲松有利于運動癥狀的改善以及多巴胺神經元的神經?;?neuroprotection)。
US 2004/0191803 A1揭示一種治療在一種哺乳類動物中的經損傷的認知功能的方法,它包含有將一定治療有效量的頭孢曲松或者它的一種類似物或衍生物投藥給該哺乳類動物的步驟。該經損傷的認知功能可能與下面的疾病或障礙有關聯:輕度認知損傷(mild cognitive impairment,MCI)、與年齡有關的認知退化(age related cognitive decline,ARCD)、記憶喪失、老化(senility)、失智癥(例如,路易氏體失智、血管性失智癥(vascular dementia)、阿茲海默氏癥以及與HIV有關的失智癥(HIV associated dementia))。特別地,于此發明專利申請的實施 例中,經老化損傷的大鼠(aged-impaired(AI)rats)被處理以頭孢曲松(劑量為200mg/kg/天)歷時7天,而實驗結果顯示:頭孢曲松能夠改善經老化損傷的大鼠的認知損傷。
在Hota S.K.et al.(2008),Neurobiology of Learning and Memory,89:522-532中,Hota S.K.等人使用頭孢曲松來處理長期暴露于低壓低氧(hypobaric hypoxia)的大鼠,而實驗結果顯示,頭孢曲松能夠改善由低壓低氧所導致的認知損傷,并且降低在海馬回(hippocampus)中的氧化性壓力(oxidative stress)以及減少神經元退化(neuronal degeneration)與染色質濃縮(chromatin condensation)。因此,頭孢曲松被預期可用于治療阿茲海默氏癥以及與興奮性毒性(excitotoxicity)有關聯的缺血性與低氧性的病況(ischemic and hypoxic conditions)。
就申請人所知,目前尚未有文獻或在本申請日之前的專利案曾揭示頭孢曲松可被用來治療帕金森氏癥失智。經研究,申請人意外地發現使用呈一個劑量范圍落在10至200mg/kg/天內的頭孢曲松可以改善帶有帕金森氏癥失智的大鼠的認知功能(諸如工作記憶以及辨識能力(recognition ability))。申請人據此而推論:具有一個特定劑量范圍的頭孢曲松可供用于治療和/或預防在一人類個體中的帕金森氏癥失智。
發明內容
于是,本發明提供一種用于治療和/或預防人類個體的帕金森氏癥失智的藥學組合物,其包含有呈一個劑量范圍落在從大約1.5mg/kg/天至大約35mg/kg/天內的頭孢曲松。
本發明也提供一種用于治療具有或被懷疑具有帕金森氏癥失智的人類個體的方法,其包括對該人類個體投藥以呈一個劑量范圍落在從大約1.5mg/kg/天至大約35mg/kg/天內的頭孢曲松。
附圖說明
下面結合附圖及實施例來對本發明進行詳細說明,所以本發明在上述以及其他目的與特征,可通過參照下文的描述、隨文檢附的權利要求書和附圖而變得更為明顯,其中:
圖1是一T型迷宮的立體圖;
圖2是開放空間箱的俯視圖,顯示開放空間箱中放置有物件41、42與43;
圖3是開放空間箱的俯視圖,顯示開放空間箱放置有物件41、42與5;
圖4顯示在MPTP-HCl注射后的第10天,各組大鼠通過T型迷宮試驗所測得的正確反應率,其中“***”表示:當與假手術組1比較,p<0.001;“#”表示:當與病理對照組比較,p<0.05;以及“##”表示:當與病理對照組比較,p<0.01;
圖5顯示在MPTP-HCl注射后的第14天,各組大鼠通過物件識別試驗所測得的物件43以及物件5的探索時間的百分比值,其中“#”表示:當與物件43的探索時間的百分比值比較,p<0.05;以及“###”表示:當與物件43的探索時間的百分比值比較,p<0.001;
圖6顯示在MPTP-HCl注射后的第15天,所取得的各組大鼠的黑質體致密區通過免疫組織化學染色而被測得的經活化的小神經膠質細胞的密度,其中“***”表示:當與假手術組1比較,p<0.001;以及“###”表示:當與病理對照組比較,p<0.001;
圖7顯示在MPTP-HCl注射后的第15天,所取得的各組大鼠的海馬回CA1區域通過尼氏染色而被測得的錐體神經元的面積百分比值,其中“***”表示:當與假手術組1比較,p<0.001;以及“###”表示:當與病理對照組比較,p<0.001;
圖8顯示在MPTP-HCl注射后的第10天,各組大鼠通過T型迷宮試驗所測得的正確反應率,其中“***”表示:當與假手術組比較,p<0.001;以及“#”表示:當與病理對照組比較,p<0.05;以及
圖9顯示在MPTP-HCl注射后的第14天,各組大鼠通過物件識別試驗所測得的物件43以及物件5的探索時間的百分比值,其中“##”表示:當與物件43的探索時間的百分比值比較,p<0.01;以及“###”表示:當與物件43的探索時間的百分比值比較,p<0.001。
具體實施方式
在開發可用于治療和/或預防帕金森氏癥失智的藥物上,申請人意外地發現到:頭孢曲松具有這方面的產業應用潛力。于是,本發明揭示用頭孢曲松制備一種用來治療和/或預防人類個體的帕金森氏癥失智的醫藥品的用途。
特別地,申請人通過實驗結果證實:對帶有帕金森氏癥失智的大鼠投藥以呈一個劑量范圍落在10至200mg/kg/天內的頭孢曲松,可以有效地改善它們的認知功能(諸如活動記憶以及識別能力)。而該適用于大鼠的劑量范圍可參照Shannon R.S.et al.(2007),FASEB J.,22:659-661當中所述的基于體表面積(body surface area,BSA)的劑量轉換(dose translation)的公式而被換算為適用于人類或其他動物的劑量范圍。
因此,本發明提供一種用于治療和/或預防人類個體的帕金森氏癥失智的藥學組合物,其包含有呈一個劑量范圍落在從大約1.5mg/kg/天至大約35mg/kg/天內的頭孢曲松。
在本發明的一個較佳具體例中,該頭孢曲松的劑量范圍是落在從大約1.62mg/kg/天至大約32.4mg/kg/天內。在本發明的另一個較佳具體例中,該頭孢曲松的劑量范圍是落在從大約1.62mg/kg/天至大約16.2mg/kg/天內。在本發明的又另一個較佳具體例中,該頭孢曲松的劑量范圍是落在從大約1.62mg/kg/天至大約8.1mg/kg/天內。
如本文中所使用的,術語“治療(treating或treatment)”()意指減少(reducing)、減輕(alleviating)、改善(ameliorating)、緩解(relieving)或控制(controlling)一種疾病(disease)或障礙(disorder)的一個或多個臨床征兆(clinical sign),以及降低(lowering)、停止(stopping)或逆轉(reversing)一種正在被治療中的病況(condition)或癥狀(symptom)的嚴重性的進展(progression of severity)。
如本文中所使用的,術語“帕金森氏癥失智(Parkinson’s disease dementia,PDD)”意指一種在帶有帕金森氏癥的病患中所發展出的失智癥,該失智癥的癥狀包括下列認知功能損傷:注意力(attention)、工作記憶(working memory)、短期記憶(short-term memory)、執行功能(executive function)、識別能力(recognition ability)、建構能力(constructional abilities)、視覺空間功能(visuospatial function)以及語言流暢性(verbal fluency)的損傷。
依據本發明,該藥學組合物可利用熟悉本領域的技術人員所詳知的技術而被制造成一適合于非經腸道地(parenterally)或口服地(orally)投藥的劑型(dosage form),這包括,但不限于:注射品(injection)(例如,無菌的水性溶液(sterile aqueous solution)或分散液(dispersion))、無菌的粉末(sterile powder)、錠劑(tablet)、片劑(troche)、口含錠(lozenge)、丸劑(pill)、膠囊(capsule)、分散性粉末(dispersible powder)或細顆粒(granule)、溶液、懸浮液(suspension)、乳劑(emulsion)、糖漿(syrup)、酏劑(elixir)、濃漿(slurry)以及類似物。
依據本發明的藥學組合物可以選自于由下列所構成的群組中的非經腸道途徑(parenteral routes)來投藥:腹膜內注射(intraperitoneal injection)、胸膜內注射(intrapleural injection)、肌肉內注射(intramuscular injection)、靜脈內注射(intravenous injection)、動脈內注射(intraarterial injection)、關節內注射(intraarticular injection)、滑液內注射(intrasynovial injection)、椎管內注射(intrathecal injection)、顱內注射(intracranial injection)以及舌下投藥(sublingual  administration)。
在本發明的一個較佳具體例中,該藥學組合物被制成適于以腹膜內注射而被投藥的劑型。
依據本發明的藥學組合物可進一步包含有一種被廣泛地使用于藥物制造技術的藥學上可接受的載劑。例如,該藥學上可接受的載劑可包含一種或多種選自于由下列所構成的群組中的試劑:溶劑(solvent)、乳化劑(emulsifier)、懸浮劑(suspending agent)、分解劑(decomposer)、粘結劑(binding agent)、賦形劑(excipient)、安定劑(stabilizing agent)、螯合劑(chelating agent)、稀釋劑(diluent)、膠凝劑(gelling agent)、防腐劑(preservative)、潤滑劑(lubricant)、吸收延遲劑(absorption delaying agent)、脂質體(liposome)以及類似物。有關這些試劑的選用與數量是落在熟悉此項技術人士的專業素養與例行技術范疇內。
依據本發明,該藥學上可接受的載劑包含有一種選自于由下列所構成的群組中的溶劑:水、生理鹽水(normal saline)、磷酸鹽緩沖生理鹽水(phosphate buffered saline,PBS)、含糖溶液、含有醇的水性溶液(aqueous solution containing alcohol),以及它們的組合。
本發明也提供一種用于治療具有或被懷疑具有帕金森氏癥失智的人類個體的方法,其包括對該人類個體投藥以呈一個劑量范圍落在從大約1.5mg/kg/天至大約35mg/kg/天內的頭孢曲松。
依據本發明,頭孢曲松的投藥劑量與投藥次數會視下列因素而變化:要被治療的疾病的嚴重性,投藥途徑,以及要被治療的個體的年齡、身體狀況與反應。一般而言,依據本發明的藥學組合物可呈單一劑量或是分成數個劑量的形式而被口服地或非經腸道地投藥。
本發明將就下面的實施例來做進一步說明,但應了解的是,這些實施例只是供例示說明用,而不應被解釋為本發明的實施上的限制。
<實施例>
實驗材料:
1.實驗動物:
在下面實施例中所使用的雄性Wistar大鼠(male Wistar rats)(12周大,體重約為419.5±7.5g)是購自于國家實驗動物中心(National Laboratory Animal Center,R.O.C.)。所有的實驗動物個別地被飼養于一個光照與黑暗各為12小時(光線在早上7點開啟)、室溫維持在24±1℃以及相對濕度維持在60±5%的透明籠子中,而且水分與飼料被充分地供給。
在開始飼養后的第2至第4天的期間,各個動物每天被安撫(handled)歷時5 分鐘,以減低動物對于實驗操作者以及實驗環境的壓力反應。有關實驗動物的一切實驗程序是由中山醫學大學的動物管理委員會(Animal Care Committee of Chung Shan Medical University)所認可,并依據美國國家衛生研究院(National Institutes of Health,NIH)的實驗動物飼養管理及使用規范(Guide for the Care and Use of Laboratory Animals)來進行。
1.T型迷宮(T-maze):
在下面實施例中所使用的T型迷宮的結構被顯示于圖1中。該T型迷宮是由黑色的聚乙烯塑膠(polyvinyl plastic)所制成,并且該T型迷宮是呈T型地由1個起始臂1(start arm 1)(60cm長×15cm寬×30cm高)、2個對置的選擇臂2(opposed choice arms 2)(40cm長×10cm寬×30cm高)以及1個位于中心的中央區域3(central square 3)(15cm長×10寬cm×30cm高)所組成。該起始臂1具有一個遠離該中央區域3的起始端11(start end 11),而這些選擇臂2分別具有一個遠離該中央區域3的終端21(terminal end 21)。此外,這些選擇臂2分別具有一個滑門22(sliding door 22),當這些選擇臂2其中之一的滑門22被關閉時,實驗動物可以從該起始端11移動并且經過另一個選擇臂2的滑門22而到達終端21。另擇地,這些選擇臂2的滑門22可同時被開啟以容許實驗動物從該起始端11移動并且經過這些選擇臂2的任一個的滑門22而到達終端21。在各個實驗動物被測試前,該T型迷宮以20%乙醇予以徹底地清洗,繼而予以徹底地干燥。
1.開放空間箱(open box):
在下面實施例中所使用的開放空間箱(60cm長×60cm寬×60cm高)的結構被顯示于圖2以及圖3中。該開放空間箱是由黑色的聚乙烯塑膠所制成,并且在該開放空間箱的底部的3個角落被放置有3個在大小、顏色、形狀以及材質上皆相同并且無特殊氣味的物件,它們分別被標示為41、42以及43并且各自與該開放空間箱的角落61、62以及63具有27cm的一個距離(參見圖2),而角落64沒有放置任何物件。另外,物件43可被替代以1個在大小、顏色、形狀以及材質上皆不同于物件43并且無特殊氣味的物件5(參見圖3)。在實驗前,所有物件對于實驗動物而言是不熟悉的。而在各個實驗動物被測試前,該開放空間箱以及所有物件皆以20%乙醇予以徹底地清洗,繼而予以徹底地干燥。
實施例1.頭孢曲松(ceftriaxone)對于帶有帕金森氏癥失智(Parkinson’s disease dementia,PDD)的大鼠的治療效用的評估
在本實驗中,申請人使用1-甲基-4-苯基-1,2,3,6,-四氫吡啶鹽酸鹽(1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine hydrochloride,MPTP-HCl)來誘發大鼠產生帕金森氏癥失智,并且通過大鼠的行為測試(behavioral test)以及腦部 的組織病理學分析來評估頭孢曲松對于帕金森氏癥失智的治療效用。下面的實驗大體上是參照Ho Y.J.et al.(2011),Behav.Brain Resi.,219:280-290當中所述的方法來進行。
實驗方法:
A.帕金森氏癥失智的誘發:
將雄性Wistar大鼠隨機地分成1個病理對照組(n=48)、2個預防組(也就是預防組1(n=12)以及預防組2(n=12))、3個治療組(也就是治療組1(n=15)、治療組2(n=12)以及治療組3(n=12))以及3個假手術組(也就是假手術組1(n=38)、假手術組2(n=7)以及假手術組3(n=8)),其中病理對照組、預防組以及治療組的大鼠通過舒泰(zoletil,Virbac,Carros,France)(20mg/kg)的腹膜內注射(intraperitoneal injection)而被麻醉。接著,將配于生理鹽水中的0.5M 1-甲基-4-苯基-1,2,3,6,-四氫吡啶鹽酸鹽(1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine hydrochloride,MPTP-HCl)(劑量為0.21mg/側/只)緩慢地注射至大鼠的中腦(mesencephalon)的雙側黑質體致密區(bilateral substantia nigra pars compacta,bilateral SNc)中,以誘發大鼠產生帕金森氏癥失智。
之后,各個大鼠立即被注射以盤尼西林-G普魯卡因(Penicillin-G procaine)(0.2mL,20,000IU),以減低術后感染(post-operative infection)的機會。接著,將各個大鼠單獨地放入塑膠籠(plastic cages)中飼養并讓它們進行傷口愈合歷時大約7天,繼而將它們轉移至飼養籠(home cages)中。
另外,假手術組的大鼠被拿來進行相同的實驗,不同處在于:這些大鼠的中腦的雙側黑質體致密區被注射以等體積的生理鹽水。
B.頭孢曲松的投藥:
在MPTP-HCl注射(MPTP-HCl injection)的5天前,預防組1以及2的大鼠分別被腹膜內注射以頭孢曲松(購自于sigma)(劑量分別為100以及200mg/kg/天)。在MPTP-HCl注射后,治療組1、假手術組2以及3的大鼠分別立即被腹膜內注射以頭孢曲松(劑量分別為200mg/kg/天、100mg/kg/天以及200mg/kg/天),而病理對照組以及假手術組1的大鼠分別立即被腹膜內注射以生理鹽水(劑量皆為1mL/kg/天)。另外,在MPTP-HCl注射后的第3天,治療組2以及3的大鼠分別被腹膜內注射以頭孢曲松(劑量分別為100以及200mg/kg/天)。各組大鼠每天被投藥一次,直至在MPTP-HCl注射后的第14天結束時。
在MPTP-HCl注射后的第8天,對各組大鼠進行下面第C項的分析;在MPTP-HCl注射后的第12天,對各組大鼠進行下面第D項的分析;以及在 MPTP-HCl注射后的第15天,對治療組1、假手術組1以及病理對照組的大鼠進行下面第E項的分析。
C.T型迷宮試驗(T-maze test):
為了了解頭孢曲松對于帶有帕金森氏癥失智的大鼠的活動記憶(working memory)的影響,在MPTP-HCl注射后的第8天,從治療組1、假手術組1以及病理對照組的大鼠中分別隨機挑選11、32以及36只大鼠,并且對這些大鼠以及其余各組的所有大鼠進行T型迷宮試驗,整個實驗過程總共歷時3天。有關T型迷宮試驗主要是依照下列方式來進行:
(1)在進行試驗的前1天,令大鼠經歷23小時的禁食(fasting),并且在試驗當天所有測試結束后,令大鼠進食歷時1小時。
(2)第1天以及第2天的訓練期間(training session):將大鼠放在T型迷宮的起始端11的位置以進行9組測試(trials),每組測試依序包括1次強制路線(forced run)以及1次選擇路線(choice run),強制路線與選擇路線的測試的時間間隔皆是30秒。在強制路線的測試中,在2個選擇臂2其中之一的滑門22被關閉,而在另一個選擇臂2的終端21被放置有作為酬賞(reward)的食物,當大鼠獲得酬賞時,該次強制路線的測試即被結束。在選擇路線的測試中,2個選擇臂2的滑門22皆被開啟,其中滑門22被重新開啟的選擇臂2(也就是在強制路線的測試中滑門22被關閉的選擇臂2)的終端21被放置有作為酬賞的食物,當大鼠進入2個選擇臂2的任一個時,該次選擇路線的測試即被結束。在選擇路線的測試中,若大鼠進入滑門22被重新開啟的選擇臂2(也就是在強制路線的測試中滑門22被關閉的選擇臂2)時,該大鼠被定義為做出正確反應(correct response)。
(3)第3天的試驗期間(test session),將大鼠放在T型迷宮的起始端11的位置以進行3組測試,每組測試依序包括1次強制路線以及2次連續的選擇路線,并且記錄大鼠在6次選擇路線的測試中做出正確反應的次數。
大鼠的活動記憶是以第3天(也就是在MPTP-HCl注射后的第10天)的試驗期間的正確反應率來作評估,而該正確反應率(correct response rate)是通過將第3天所測得的正確反應的次數代入下列公式(1)而被計算出:
公式(1):A=(B/6)×100
其中:A=正確反應率(%)
B=正確反應的次數
所得到的實驗數據是以平均值±SEM來表示。所有數據是通過單因子變異 數分析(one-way analysis of variance,ANOVA),繼而以最小顯著差異(least-significant difference,LSD)來作分析,以評估假手術組2或3與假手術組1間的差異性、病理對照組與假手術組1間的差異性以及各個治療組或預防組與病理對照組間的差異性。若所得到的統計比對結果是p<0.05,代表有統計學顯著性(statistical significance)。
D.物件識別試驗(object recognition test):
為了了解頭孢曲松對于帶有帕金森氏癥失智的大鼠的識別和/或記憶能力的影響,在MPTP-HCl注射后的第12天,對各組的所有大鼠進行物件識別試驗,整個實驗過程總共歷時3天。
首先,將大鼠放在開放空間箱中靠近角落64(參見圖2)的位置以進行4次測試(trials),其中第1次與第2次測試分別是在MPTP-HCl注射后的第12天與第13天被進行,而第3次與第4次測試是在MPTP-HCl注射后的第14天被進行。每次的測試時間總共歷時5分鐘,而就第1、2以及3次的測試,各個測試的時間間隔是1天,至于第3次與第4次測試的時間間隔則是5分鐘。在第1、2以及3次的測試中,開放空間箱內被放置有物件41、42以及43以供大鼠探索,而在第4次的測試中則以物件5來替代物件43(參見圖3)。在整個測試的期間,使用一個被放置在開放空間箱上方的攝影機來監測大鼠的行為,并且記錄大鼠在各個測試的期間中探索各物件所花費的時間。一個物件的探索(exploration)被定義為大鼠接近一個物件并且以它的鼻子(snout)和/或前掌(forepaw)而與該物件有身體接觸(physical contact)。大鼠花費在探索物件43以及物件5上的時間的百分比值的差異被用來作為評估大鼠對于熟悉的物件的記憶能力以及對于新物件與舊物件間的差異的識別能力的指標。而物件43以及物件5的探索時間(exploration time)的百分比值是分別通過將在第3次測試以及第4次測試的期間中所測得的探索各物件所花費的總時間代入下列公式(2)而被計算出:
公式(2):C=(D/E)×100
其中:C=物件43或物件5的物件探索時間的百分比值(%)
D=探索物件43或物件5所花費的時間
E=探索所有物件所花費的總時間
所得到的實驗數據是以平均值±SEM來表示。所有的數據是通過成對的樣本t-試驗(paired-samples t-tests)來作分析,以評估各組大鼠在物件43以及物件5的探索時間的百分比值上的差異。若所得到的統計比對結果是p<0.05,代表有統計學顯著性。
E.組織病理學分析:
為了了解頭孢曲松是否具有改善帶有帕金森氏癥失智的大鼠的神經發炎(neuroinflammation)以及神經退化(neurodegeneration)的效用,在MPTP-HCl注射后的第15天,從治療組1、假手術組1以及病理對照組的大鼠中分別隨機挑選4只大鼠來進行組織病理學分析。
首先,通過CO2來犧牲大鼠,繼而以配于磷酸鹽緩沖生理鹽水(phosphate buffered saline,PBS)中的4%三聚甲醛(paraformaldehyde)予以灌流。接著,迅速取出大腦并于4℃下以含有4%三聚甲醛的30%蔗糖水溶液予以浸泡歷時至少3天。之后,將大腦置于冷凍切片機(Reserch Cryostst Lecia CM3050S,Leica)上進行冠狀切片(coronal section)(厚度約30μm)。
接著,具有黑質體致密區的組織切片被挑選出,繼而通過使用抗-MHC class II的OX-6抗體(anti-MHC class II OX-6 antibody)(BD Biosciences Pharmingen,CA)作為一級抗體以及使用生物素化的馬抗-小鼠IgG抗體(biotinylated horse anti-mouse IgG antibody)(Vector Laboratory,CA)作為二級抗體并且依據熟悉本技術的人員所詳知且慣用的技術來對這些組織切片進行免疫組織化學染色(immunohistochemistry stain)。經染色的組織切片是通過使用光學顯微鏡(AXioskop2,ZEISS)并在一為200X的放大倍數下來進行觀察,然后使用Image Pro Plus Software 6.0軟件(Media Cybernetics)來計算在一個為18,769μm2的面積下的經活化的小神經膠質細胞(activated microglia)的密度。
另外,具有海馬回CA1區域(hippocampal CA1 area)的組織切片被挑選出來并且依據熟悉本技術的人員所詳知且慣用的技術來進行尼氏染色(Nissl staining)。經染色的組織切片是通過使用光學顯微鏡并在200X的一個放大倍數下來進行觀察,然后使用Image Pro Plus Software 6.0軟件并且參照Xavier L.L.et al.(2005),Brain Research protocols,16:58-64當中所述的半定量方法(semi-quantitative method)來估算在2,354μm2的面積下的錐體神經元(pyramidal neuron)的一個面積百分比值。
所得到的實驗數據是以平均值±SEM來表示。所有數據是通過單因子變異數分析,繼而以最小顯著差異來作分析,以評估病理對照組與假手術組1間的差異性以及治療組1與病理對照組間的差異性。若所得到的統計比對結果是p<0.05,代表有統計學顯著性。
結果:
A.T型迷宮試驗:
圖4顯示在MPTP-HCl注射后的第10天,各組大鼠通過T型迷宮試驗所測得 的正確反應率。從圖4可見,假手術組2以及3的大鼠的正確反應率與假手術組1的大鼠所具者相較皆沒有呈現出統計顯著性,這表示頭孢曲松不會影響正常大鼠的活動記憶。另外,與假手術組1的大鼠相較下,病理對照組的大鼠的正確反應率有顯著地下降,這表示MPTP-HCl會成功地誘發大鼠產生帕金森氏癥失智并且造成它們在活動記憶上的缺陷。而與病理對照組的大鼠相較下,治療組1至3以及預防組1至2的大鼠的正確反應率皆有上升的趨勢。特別地,治療組1至3的大鼠的正確反應率與病理對照組的大鼠所具有的相較皆呈現出統計顯著性,甚至是近似于假手術組1的大鼠所具有的。這個實驗結果顯示:頭孢曲松可以治療帕金森氏癥失智并且改善帶有帕金森氏癥失智的大鼠的活動記憶。
B.物件識別試驗:
圖5顯示在MPTP-HCl注射后的第14天,各組大鼠通過物件識別試驗所測得的物件43以及物件5的探索時間的百分比值。從圖5可見,就假手術組1至3的大鼠而言,物件5的探索時間的百分比值與物件43所具者相較皆呈現出統計顯著性,這表示頭孢曲松不會影響正常大鼠的識別和/或記憶能力。而就病理對照組的大鼠而言,物件5的探索時間的百分比值與物件43所具有的相較沒有呈現出統計顯著性,這表示MPTP-HCl會成功地誘發大鼠產生帕金森氏癥失智并且造成它們在識別和/或記憶能力上的缺陷。相反地,就治療組1至3以及預防組1至2的大鼠而言,物件5的探索時間的百分比值與物件43所具有的相較皆呈現出統計顯著性。這個實驗結果顯示:頭孢曲松可以預防帕金森氏癥失智并且改善帶有帕金森氏癥失智的大鼠對于熟悉的舊物件的記憶能力以及對于新物件與舊物件間的差異的識別能力。
C.組織病理學分析:
圖6顯示在MPTP-HCl注射后的第15天,所取得的各組大鼠的黑質體致密區通過免疫組織化學染色而被測得的經活化的小神經膠質細胞的密度。從圖6可見,與假手術組1的大鼠相較下,病理對照組的大鼠的黑質體致密區中的經活化的小神經膠質細胞的密度有顯著地增加,這表示MPTP-HCl會成功地誘發大鼠產生帕金森氏癥失智并且造成它們的小神經膠質細胞的活化以及神經發炎。而與病理對照組的大鼠相較下,治療組1的大鼠的黑質體致密區中的經活化的小神經膠質細胞的密度有顯著地下降。這個實驗結果顯示:頭孢曲松具有抑制帶有帕金森氏癥失智的大鼠的小神經膠質細胞的活化以及神經發炎的效用。
圖7顯示在MPTP-HCl注射后的第15天,所取得的各組大鼠的海馬回CA1區域通過尼氏染色而被測得的錐體神經元的面積百分比值。從圖7可見,與假手 術組1的大鼠相較下,病理對照組的大鼠的海馬回CA1區域中的錐體神經元的面積百分比值有顯著地下降,這表示MPTP-HCl會成功地誘發大鼠產生帕金森氏癥失智并且造成它們的海馬回神經退化。而與病理對照組的大鼠相較下,治療組1的大鼠的海馬回CA1區域中的錐體神經元的面積百分比值有顯著地增加。這個實驗結果顯示:頭孢曲松具有改善帶有帕金森氏癥失智的大鼠的海馬回神經退化的效用。
綜合以上的實驗結果,申請人認為:頭孢曲松具有預防以及治療帕金森氏癥失智的效用。
實施例2.低劑量的頭孢曲松對于帶有帕金森氏癥失智的大鼠的治療效用的評估
為進一步了解低劑量的頭孢曲松是否也具有治療帕金森氏癥失智的效用,下面的實驗被進行。
實驗方法:
將雄性Wistar大鼠隨機地分成1個病理對照組(n=23)、2個治療組(也就是治療組1(n=15)以及治療組2(n=13))以及1個假手術組(n=27),并且依照上面實施例1的“實驗方法”的第A項“帕金森氏癥失智的誘發”當中所述方法來對各組大鼠進行處理。
在MPTP-HCl注射后,治療組1以及2的大鼠分別立即被腹膜內注射以頭孢曲松(劑量分別為10以及50mg/kg/天),而病理對照組以及假手術組的大鼠分別立即被腹膜內注射以生理鹽水(劑量為1mL/kg/天)。各組大鼠每天被投藥一次,直至在MPTP-HCl注射后的第14天結束時。
在MPTP-HCl注射后的第8天,從治療組2以及病理對照組的大鼠中分別隨機挑選12以及19只大鼠,并且依照上面實施例1的“實驗方法”的第C項“T型迷宮試驗”當中所述方法來對這些大鼠以及其余各組的所有大鼠進行T型迷宮試驗并且計算出各組大鼠的正確反應率,以評估病理對照組與假手術組間的差異性以及各個治療組與病理對照組間的差異性。
另外,在MPTP-HCl注射后的第12天,從假手術組的大鼠中隨機挑選23只大鼠,并且依照上面實施例1的“實驗方法”的第D項“物件識別試驗”當中所述方法來對這些大鼠以及其余各組的所有大鼠進行物件識別試驗,以評估各組大鼠在物件43以及物件5的探索時間的百分比值上的差異。
結果:
A.T型迷宮試驗:
圖8顯示在MPTP-HCl注射后的第10天,各組大鼠通過T型迷宮試驗所測得 的正確反應率。從圖8可見,與假手術組的大鼠相較下,病理對照組的大鼠的正確反應率有顯著地下降。而與病理對照組的大鼠相較下,治療組1以及2的大鼠的正確反應率皆有顯著地上升,甚至是近似于假手術組的大鼠所具有的。這個實驗結果顯示:低劑量的頭孢曲松可以治療帕金森氏癥失智并且改善帶有帕金森氏癥失智的大鼠的活動記憶。
B.物件識別試驗:
圖9顯示在MPTP-HCl注射后的第14天,各組大鼠通過物件識別試驗所測得的物件43以及物件5的探索時間的百分比值。從圖9可見,就病理對照組的大鼠而言,物件5的探索時間的百分比值與物件43所具者相較沒有呈現出統計顯著性。相反地,就治療組1以及2的大鼠而言,物件5的探索時間的百分比值與物件43所具有的相較皆呈現出統計顯著性。這個實驗結果顯示:低劑量的頭孢曲松可以治療帕金森氏癥失智并且改善帶有帕金森氏癥失智的大鼠對于熟悉的舊物件的記憶能力以及對于新物件與舊物件間的差異的識別能力。
綜合以上的實驗結果可知:使用呈一個劑量范圍落在從大約10mg/kg/天至大約200mg/kg/天內的頭孢曲松可以有效地治療以及預防帶有帕金森氏癥失智的大鼠。申請人依據這個結果并利用Shannon R.S.et al.(2007),FASEB J.,22:659-661當中所述的基于體表面積(body surface area,BSA)的劑量轉換(dose translation)的公式來進一步計算出適用于人類個體的劑量,并據此而認為:呈一劑量范圍落在從大約1.5mg/kg/天至大約35mg/kg/天內的頭孢曲松可供用于治療和/或預防人類個體的帕金森氏癥失智。
于本說明書中被引述的所有專利和文獻以其整體被并入本申請作為參考資料。若有所沖突時,本申請的詳細說明(包含界定在內)將占上風。
雖然本發明已參考上述特定的具體例被描述,明顯地在不背離本發明的范圍和精神下可作出很多的修改和變化。因此本發明只受如隨文檢附的權利要求書所示的方案的限制。

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